CN102212504B - 兔小肠上皮细胞系及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的兔小肠上皮细胞系，取新生未哺乳仔兔回肠段，机械剪碎，胶原酶IV消化，获得原代培养的兔小肠上皮细胞，联合应用相差消化法和相差贴壁法对兔小肠上皮细胞进行初步；然后应用单克隆方法进一步纯化，得到的细胞株生长状态良好，稳定；细胞形状规则，成铺路石状，角蛋白8鉴定结果为阳性；经过继代培养，筛选获得的一株细胞系，继代培养一直稳定。兔小肠上皮细胞系，来源于新生未哺乳的日本大耳白兔回肠段，保藏编号：CGMCC No.4784；可用于肠道内营养物质吸收通路，抗营养物质的作用，微生态营养，细胞间的信号转导以及隐窝-绒毛系统中各种细胞增殖和分化机制等的研究。

Description

兔小肠上皮细胞系及其制备方法

技术领域

本发明属生物技术领域，确切地说是兔小肠上皮细胞系及其制备方法。 

背景技术

小肠是体内营养物质选择性消化吸收的重要部位，整个胃肠道的吸收90％发生在小肠。小肠粘膜上皮是高度动力学系统，反映了重要的生物学现象，如细胞的增殖、迁移、分化和凋亡等。小肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells，IEC)是肠道消化吸收的专职细胞，维持着整个绒毛上皮的代谢更新。由于小肠粘膜上皮细胞表面密集大量的微绒毛，有利于酶的活动及营养物质的吸收；除此以外IEC还主要参与了肠道内外分泌和免疫屏障等功能。肠上皮细胞是研究细胞增殖和分化调控机制及药物的转运和代谢的理想模型。因此，体外培养小肠上皮细胞对于研究IEC的生理功能、营养物质的消化吸收机制、药物作用下的病理及生理改变都具有重要意义。 

目前，尽管人和家禽小肠上皮细胞的培养已经获得成功，但是国内未见有关兔肠道细胞培养的详细报道，国外对兔肠上皮细胞分离培养的研究也较少，主要是关于结肠上皮细胞的培养，该细胞的转运特性，酶的表达以及跨膜电阻等指标相对更能反映结肠细胞而非小肠细胞。 

发明内容

本发明的目的是提供兔小肠上皮细胞系，建立兔小肠上皮细胞体外培养模型，用于体外研究兔小肠营养机制及抗营养机制的研究。 

兔小肠上皮细胞系，它来源于新生未哺乳日本大耳白仔兔回肠，保藏编号：CGMCC No.4784。 

兔小肠上皮细胞系的制备方法： 

1)取新生未哺乳日本大耳白仔兔断颈处死，置于75％酒精中浸泡消毒5min，无菌剖开腹腔，取出回肠段并去除周边结缔组织，PBS洗涤数次，以除去肠内容物；纵向剖开肠道，用PBS洗涤数次，将肠段剪碎，400g离心5min。弃上清，胶原酶IV消化液重悬沉淀并转移到6孔培养板内，37℃，饱和湿度，5％CO₂环境孵育过夜，500g离心5min；弃上清，PBS洗涤3次，细胞生长培养基(DMEM/F12+5％FBS)重悬细胞和组织，并移至6孔板中；37℃，5％CO₂，饱和湿度环境培养； 

2)采用相差消化法和相差贴壁法相结合的方法，在细胞传代时先用胰酶消化后在倒置显微镜下观察，当大部分成纤维细胞变小漂浮上来，吸去培养液，用PBS清洗后再次用胰酶 消化，此时消化下来的细胞大部分是小肠上皮细胞；在单细胞悬液接种后1.5h后将上清转移到新的培养瓶中，此瓶中大部分为上皮细胞；如此反复几次，以去除成纤维细胞，得到纯化的兔小肠上皮细胞；然后通过单克隆方式对上述纯化细胞进一步纯化。 

本发明提供的兔小肠上皮细胞系，取新生未哺乳仔兔回肠段，机械剪碎，胶原酶IV消化，获得原代培养的兔小肠上皮细胞，联合应用相差消化法和相差贴壁法对兔小肠上皮细胞进行初步；然后应用单克隆方法进一步纯化，得到的细胞株生长状态良好，稳定；细胞形状规则，成铺路石状，角蛋白8鉴定结果为阳性；经过继代培养，筛选获得的一株细胞系，继代培养一直稳定。免小肠上皮细胞系，来源于新生未哺乳的日本大耳白兔回肠段，保藏编号：CGMCCNo.4784。 

小肠是营养物质消化吸收的主要场所，小肠上皮细胞是吸收营养物质的主要功能性细胞，兔小肠上皮细胞体外培养模型的建立，可用于肠道内营养物质吸收通路，抗营养物质的作用，微生态营养，细胞间的信号转导以及隐窝-绒毛系统中各种细胞增殖和分化机制等的研究。 

附图说明

图1为胶原酶消化法分离得到的IEC照片(×100)； 

图2为成纤维细胞与上皮细胞混杂生长照片(×100)； 

图3为纯化的兔IEC照片(×100)； 

图4为纯化的兔IEC照片(×400)； 

图5为角蛋白8抗体鉴定阳性照片(×400)； 

图6为角蛋白8抗体阴性对照片(×400)； 

图7为原代培养新生仔兔IEC生长曲线图。 

具体实施方式

实施例1 

实验动物新生未哺乳的日本大耳白兔，购于吉林大学实验动物中心。 

仪器及试剂 

二氧化碳培养箱(SELECTA，西班牙)，倒置显微镜(Olympus，日本)，超净台(SANYO，日本)，高压蒸汽灭菌锅(SANYO，日本)，鼓风干燥箱(上海申贤恒温设备厂)，96孔细胞培养板(COSTAR)DMEM/F12培养基(GIBCO)，胎牛血清(PAA)，细胞角蛋白8单克隆抗体，DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司，谷氨酰胺，胰蛋白酶均为AMRESCO产品，胶原酶IV，青霉素，链霉素均为Sigma产品。 

1)兔IEC分离及培养 

新生未哺乳仔兔断颈处死，置于75％酒精中浸泡消毒5min，无菌剖开腹腔，取出小肠回肠段并去除周边结缔组织，PBS洗涤数次，以除去肠内容物；纵向剖开肠道，用PBS洗涤数次，将肠段剪碎，400g离心5min。弃上清，胶原酶IV消化液重悬沉淀并转移到6孔培养板内，37℃，饱和湿度，5％CO₂环境孵育过夜，500g离心5min，弃上清，PBS洗涤3次，细胞生长培养基(DMEM/F12+5％FBS)重悬细胞和组织，并移至6孔板中。37℃，5％CO2，饱和湿度环境培养。成纤维细胞与上皮细胞混杂生长显微镜(×100)下照片，见图2。 

2)兔IEC的纯化 

采用相差消化法和相差贴壁法相结合的方法，在细胞传代时先用胰酶消化后在倒置显微镜下观察，当大部分成纤维细胞变小漂浮上来，吸去培养液，用PBS清洗后再次用胰酶消化，此时消化下来的细胞大部分是小肠上皮细胞；在单细胞悬液接种后1.5h后将上清转移到新的培养瓶中，此瓶中大部分为上皮细胞。如此反复几次，以去除成纤维细胞，得到纯化的小肠上皮细胞。在倒置显微镜下观察细胞在2-3d贴壁并有少量迁出，6-8d明显增殖，见图1，9-11d细胞汇合成片。纯化的IEC生长状态如图3，上皮细胞呈多角形或卵圆形，细胞紧密连接，边界清晰。 

3)单克隆继代筛选 

取初步纯化的细胞，吸去培养液，用PBS清洗后再次用胰酶消化，细胞变圆时加入生长培养基，轻轻吹打，使细胞脱落。取适量细胞悬液进行细胞计数。调整细胞浓度为10³个/ml。并用有限稀释法在96孔板中梯度稀释。直到获得单个细胞为止。37℃、5％CO₂、饱和湿度培养并定期观察。选择单细胞生长的孔继续培养。获得一株单细胞生长集落，并进行继代培养。 

继代培养基组成：DMEM/F12+5％fetal bovine serum；pH 7.04；37℃。 

经继代培养后，获得1株(RIEC-311)，经传代培养50代后生长状态仍然良好、稳定、分裂速度快，没发现退化和癌变现象，照片如图4，并于2011年04月26日，送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4784。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 

实施例2采用MTT法进行生长曲线的测定。 

将生长状况良好的IEC悬液接种于96孔细胞培养板中，接种密度为1×10⁵个/mL，每孔200μL，每天6个重复，连续测定7天。每天向待测的每孔细胞中加入20μLMTT溶液，继续培养4h后终止培养，吸除培养液，每孔加入150μLDMSO震荡10min，用酶联免疫检测仪测定OD₅₇₀值。空白调零孔中只加培养液，不加细胞。IEC生长曲线见图7. 

实施例3细胞角蛋白8单克隆抗体鉴定 

将细胞爬片放入4％的多聚甲醛固定1h，然后PBST漂洗3次，每次5min。用柠檬酸修复液修复10min，95℃，3％过氧化氢的水溶液处理10min，以消除内源性的过氧化物酶，BSA封闭30min，蒸馏水漂洗3次，每次5min，加入抗角蛋白抗体孵育30min。加入羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育30min。再加入显色剂，显色10min。其中每步骤结束后都用PBST漂洗3次，每次5min。纯化IEC用细胞角蛋白8单克隆抗体鉴定，结果呈现阳性，见图5，细胞呈褐色排列，该结果显示所获得的细胞是小肠上皮细胞。阴性对照组IEC没被染色，见图6。 

Claims (1)

1.兔小肠上皮细胞系，其特征在于：它来源于新生未哺乳日本大耳白兔回肠，保藏编号：CGMCC No.4784。

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