具体实施方式
实施例一薄荷素油对ANIT诱导的大鼠胆汁淤积性肝病的治疗作用
动物
SD大鼠,SPF级,6~8周龄,体重180~250g,雄性;合格证号均为:SCXK(川)2008-24,由四川省医学科学院实验动物研究所提供。
药品与试剂
薄荷素油,淡黄色油状液体,南通薄荷厂有限公司,批号20090414,薄荷酮含量19.4%,薄荷脑含量37.2%,成人以60kg计临床日用量2.7g/60kg,即0.045g/kg。
实验时将薄荷素油设为高、中、低三个剂量组:大鼠高、中、低剂量组的给药剂量分别为人用量的14、7、3.5倍,实际给药量为630mg/kg、315mg/kg、157.5mg/kg,给药容积为10ml/kg·d。
熊去氧胆酸胶囊,Dr.falk Pharma GmbH公司,批号09012683L,规格:250mg。成人以60kg计临床日用量60mg/60kg,即10mg/kg。本研究大鼠给药剂量为人用量的7倍,实际给药量为70mg/kg,给药容积为10ml/kg·d。
a-萘异硫氰酸酯(ANIT),sigma公司,货号:N4525,批号:551-06-4;
TBA(血清总胆汁酸)测定试剂盒,德国HUMAN公司,批号H101A;
TBIL(总胆红素)试剂盒、DBIL(直接胆红素)试剂盒、AST(天门冬氨酸氨基转移酶)试剂盒和ALT(丙氨酸氨基转移酶)试剂盒,均为北京北化康泰临床试剂有限公司生产,批号:20090522。
主要仪器
Spectra Max M5全功能微孔板检测仪,USA Molecular Devices公司;
电热恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司;
Anke TDL-40B离心机,上海安亨科学仪器有限公司。
实验方法[徐小微、李兰娟、吕芳芳等,熊去氧胆酸治疗大鼠肝内淤胆的实验研究,中华肝病学杂志,2003,11(4):244-245]
SD大鼠,SPF级,体重180~250g,雄性。除正常组外,各组大鼠灌胃3%的ANIT香油溶液,首剂量为150mg/kg,24h后再给予50mg/kg,造模48h后各鼠随机分为:模型对照组、熊去氧胆酸组、薄荷素油高、中、低剂量组,每组12只,另取12只作为正常对照组。各组按10mL/kg灌胃连续给药5天,正常对照组和模型对照组给予等容积蒸馏水,末次给药前大鼠禁食16h后,每组取6只股动脉采血,37℃保温30min,3000转/min离心10min,分离血清,测定血清生化指标中TBA、TBIL、DBIL、ALT、AST含量。每组余下6只给药1h后以乌来糖1g/kg腹腔注射麻醉,仰位固定,打开腹腔,在十二指肠降部肠系膜中找到胆管,做胆汁分流术,收集3h胆汁量,并进行统计。
实验结果
表1薄荷素油对ANIT诱导胆汁淤积性肝病大鼠胆汁流量、流速的影响
模型对照与正常对照相比:△△P<0.01;治疗组与模型对照相比:*P<0.05,**P<0.01;
表1结果显示:薄荷素油在630mg/kg、315mg/kg和157.5mg/kg剂量下能明显增加大鼠ANIT诱导性胆汁淤积性肝病的胆汁流量和胆汁流速(P<0.01~0.05)。
表2薄荷素油对ANIT诱导胆汁淤积性肝病大鼠血清TBIL、DBIL、TBA的影响
模型对照与正常对照相比:△△P<0.01;治疗组与模型对照相比:*P<0.05,**P<0.01;
表3薄荷素油对ANIT诱导胆汁淤积性肝病大鼠血清ALT、AST的影响
模型对照与正常对照相比:△△P<0.01;治疗组与模型对照相比:*P<0.05,**P<0.01;
表2和表3结果表明:薄荷素油在630mg/kg和315mg/kg剂量下对ANIT诱导胆汁淤积性肝病大鼠血清TBIL、DBIL、ALT、AST、TBA均有明显降低作用(P<0.01~0.05)。
由表1、2和3结果可知,薄荷素油能够抑制ANIT诱导肝内胆汁淤积性肝病大鼠血清TBIL、DBIL、ALT、AST、TBA等生化指标,促进胆汁分泌与排泄,对ANIT诱导大鼠肝内胆汁淤积性肝病有明显治疗作用。
实施例二薄荷素油对乙炔雌二醇诱导的大鼠胆汁淤积性肝病治疗作用
动物Wister大鼠,SPF级,6-8周龄,体重180-220g,雄性;合格证号均为:SCXK(川)2008-24;由四川省医学科学院实验动物研究所提供。
药品与试剂
薄荷素油,淡黄色油状液体,南通薄荷厂有限公司提供,批号20090414,薄荷酮含量19.4%,薄荷脑含量37.2%,成人以60kg计临床日用量2.7g/60kg,即0.045g/kg,实验时将薄荷素油设为高、中、低3个剂量组,大鼠高、中、低剂量组的给药剂量分别为人用量的14、7、3.5倍,实际给药量为630mg/kg、315mg/kg、157.5mg/kg,给药容积为10ml/kg;熊去氧胆酸胶囊,Dr.falkPharma GmbH公司,批号:09012683L,规格:250mg;吐温-80,天津市博迪化学有限公司,批号:20060508;17a-乙炔雌二醇,sigma公司,货号:46263,批号:551-06-4;总胆汁酸(TBA)测定试剂盒,德国HUMAN公司,批号H119A;总胆红素(TBIL)试剂盒,北京北化康泰临床试剂有限公司,批号:20091014;总胆固醇(CHO)测定试剂盒,批号:20091201;丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒,北京北化康泰临床试剂有限公司,批号:20090513;碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒,北京北化康泰临床试剂有限公司,批号:20091117;丙二醇,成都天华科技股份有限公司,批号:20010918;乌来糖,成都科龙化工试剂厂,批号:20060727。
主要仪器
Spectra Max M5全功能微孔板检测仪,USA Molecular Devices公司,编号:0201010;电热恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司,编号:0201040;德国eppendorf微量可调移液器,上海富众仪器有限公司,编号:Anke TDL-40B离心机,上海安亨科学仪器有限公司,编号:020147。
方法与结果
选取健康SPF级雄性Wister大鼠,随机分为:空白对照组、模型对照组、熊去氧胆酸组、薄荷素油高、中、低剂量组。除空白对照组外,各组按文献[María L.Ruiz,et al.Drug Metabolismand Disposition,2007,35(11):2060-2066]方法:每日5.0mg/kg颈后部皮下注射乙炔雌二醇进行造模(乙炔雌二醇用丙二醇溶解,注射容积1.0ml/kg),空白对照组注射等容积丙二醇溶液,初次造模后给药,造模与给药连续5天。第6天,大鼠末次给药前禁食禁水16h,给药1h后大鼠以乌来糖1g/kg腹腔注射麻醉,仰位固定,打开腹腔,在十二指肠降部肠系膜中找到胆管,做胆汁分流术,收集1h胆汁量,并进行股动脉采血,37℃保温30min,3000转/min离心10min分离血清,测定胆汁和血清生化指标中TBA、TBIL、ALP、ALT、AST含量,同时根据1h内胆汁流量和胆汁中TBA含量,计算出TBA排出量,并进行统计学处理。
实验结果
1、薄荷素油对乙炔雌二醇诱导的胆汁淤积性肝病大鼠胆汁流量和流速的影响
表4薄荷素油对乙炔雌二醇诱导胆汁淤积性肝病大鼠胆汁流量、流速的影响
模型对照组与空白对照组相比:△P<0.05;治疗组与模型对照组相比:**P<0.01;
表4结果显示,薄荷素油在630mg/kg、315mg/kg、157.5mg/kg三个剂量下均能明显增加乙炔雌二醇诱导的胆汁淤积性肝病大鼠的胆汁流量与流速(P<0.01),表明薄荷素油有较强的利胆作用。
2、对乙炔雌二醇诱导的胆汁淤积性肝病大鼠血清TBIL、ALP、ALT、AST、TBA的影响
表5薄荷素油对乙炔雌二醇诱导胆汁淤积性肝病大鼠血清TBIL、ALP、TBA的影响
模型对照组与空白对照相比:△P<0.05,△△P<0.01;治疗组与模型对照组相比:P>0.05;
表6薄荷素油对乙炔雌二醇诱导胆汁淤积性肝病大鼠血清ALT、AST的影响
模型对照组与空白对照相比:△P<0.05;治疗组与模型对照组相比:*P<0.05;
由表5和表6结果显示:大鼠造模后血清ALP、AST、TBA明显升高(P<0.05~0.01)。薄荷素油对大鼠乙炔雌二醇诱导胆汁淤积性肝病血清ALP、AST、TBA、ALT和TBIL有降低作用。
3、对乙炔雌二醇诱导的胆汁淤积性肝病大鼠胆汁TBIL、ALP、TBA、的影响
表7薄荷素油对乙炔雌二醇诱导胆汁淤积性肝病大鼠胆汁TBIL、ALP、TBA的影响
模型对照组与空白对照相比:△△P<0.01;治疗组与模型对照组相比:*P<0.05;
由表7的结果显示,大鼠造模后胆汁中ALP明显升高(P<0.01),TBA排出量明显降低(P<0.01),也能降低胆汁中的TBIL。薄荷素油在315mg/kg、157.5mg/kg剂量下能降胆汁中ALP含量(P<0.05);在630mg/kg、157.5mg/kg剂量下能增加TBA的肝内排出。
综上,薄荷素油能增加乙炔雌二醇诱导的胆汁淤积性肝病大鼠胆汁流量与流速,促进胆汁中TBA的排出,并降低血清TBA含量;降低胆汁中ALP的含量,并能降低血清ALP含量;同时也能降低血清和胆汁中TBIL,降低血清中的ALT、AST。
实施例三对CCL4诱导的小鼠肝损伤的影响
动物
昆明种小鼠,普通级,6~8周龄,18~22g,雌雄各半;小鼠的合格证号为:SCXK(川)2008-24,由四川省医学科学院实验动物研究所提供。
药品与试剂
薄荷素油,淡黄色油状液体,南通薄荷厂有限公司,批号20090414,薄荷酮含量19.4%,薄荷脑含量37.2%,成人以60kg计临床日用量2.7g/60kg,即0.045g/kg。
实验时将薄荷素油设为高、中、低三个剂量组:小鼠高、中、低剂量组的给药剂量分别为人用量的20、10、5倍,实际给药量为0.90g/kg、0.45g/kg、0.225g/kg,给药容积为20ml/kg·d。
联苯双酯滴丸,规格:1.5mg/250丸,浙江医药股份有限公司新昌制药厂,批号:080201。成人以60kg计临床日用量45mg/60kg,即0.75mg/kg。本研究小鼠给药剂量为人用量的10倍,实际给药量为7.5mg/kg,给药容积为20ml/kg·d。
四氯化碳溶液,分析纯,天津市化学六厂三分厂,批号:20070501;
橄榄油,上海嘉里食品工业有限公司,许可证号:QS310002012787;
AST试剂盒和ALT试剂盒,均购自北京北化康泰临床试剂有限公司,批号:20090522。
主要仪器
SpectraMax M5全功能微孔板检测仪,USAMolecularDevices公司,编号:0201010;
电热恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司,编号:0201040;
Anke TDL-40B离心机,上海安亨科学仪器有限公司,编号:020147。
实验方法
健康昆明种小鼠,体重18~22g,雌雄各半,随机分为正常对照组、模型对照组、联苯双酯组、薄荷素油高、中、低剂量组。各组小鼠按20mL/kg灌胃给药连续5天,正常对照组、模型对照组给予等容积蒸馏水,于第5天末次给药1h后按10mL/kg腹腔注射浓度0.2%CC L4(浓度0.2%CCL4溶于橄榄油中),禁食禁水16h后小鼠摘眼球取血,37℃保温30min,3000转/min离心10min,分离血清,测定血清ALT、AST含量,记录并进行统计。
实验结果
表8薄荷素油对CCL4诱导的肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响
模型对照与正常对照相比:△△P<0.01;治疗组与模型对照相比:*P<0.05,**P<0.01;
由表8结果显示:薄荷素油在900mg/kg、450mg/kg、225mg/kg剂量下对CCL4肝损伤小鼠血清ALT均有明显降低作用(P<0.01~0.05);在225mg/kg剂量下对小鼠血清AST也有降作用(P<0.05)。表明薄荷素油对小鼠CCL4肝损伤有明显保护作用。