CN102190724A - 十氯酮抗原、抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种十氯酮抗原、抗体及其制备方法。该抗原是以N,N-羰基二咪唑为连接剂，将单羟基十氯酮的羟基与血蓝蛋白或牛血清白蛋白中的氨基连接而得到的免疫抗原；再将该抗原制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化而获得的其抗体。本发明通过抗原抗体高效特异性竞争结合的特性，不需要繁琐的前处理过程，整个检测过程可以在5-8小时内完成，检测十氯酮的检测阈为6.25μg/ml-0.312μg/ml。与现有的仪器检测相比，更快速、廉价，可用于十氯酮样品的分析检测、定量测定、质量标准、纯化、以及阻断十氯酮的生物效应。实现了对该类物质的高效、快速、廉价的检测分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种十氯酮抗原、抗体及其制备方法。
背景技术
十氯酮(Chlordecone)是斯德哥尔摩公约(Stockholm Convention)公认禁止的一种持久性有机污染物(POPs, Persistent Organic Pollutants), 它们在50-70年代作为有机氯农药被广泛的应用于农业.由于该类物质具有高毒性、高稳定性和生物蓄积性, 十氯酮及其类似物对环境及农作物等已经产生巨大的影响,乃至威胁到了人类正常的生活状况. 由于该物质地巨大危害性, 提高对该物质的检测监控力度、改善对该物质的检测方法变得尤为迫切。
对于十氯酮及灭蚁灵等的检测分析技术, 目前只有仪器分析技术,如:高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、气相色谱-电子俘获检测器(GC-ECD)及气相色谱-二级质谱联用技术(GC-MS-MS). 但是仪器分析技术要求昂贵而精密的仪器,需要专门的技术人员,而且需要非常漫长的样品前处理过程.此外，灭蚁灵及十氯酮有许多衍生物，各衍生物在结构及极性方面等方面相差不大，而且，十氯酮衍生物羟基十氯酮（Chlordecone Hydrate）及克来范（Kelevan）很容易热解还原，所以在很大程度上加大了分离提取及仪器分析的难度。由于以上种种原因，使得现存针对灭蚁灵及十氯酮的分析技术存在种种的缺陷与不足。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种十氯酮抗原。
本发明的目的之二在于提供该抗原的抗体。
本发明的目的之三在于提供该抗体的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的机理为：
在硼氢化钠的还原作用下，十氯酮的酮基被还原成羟基，从而形成能与连接剂连接的官能基团。
以羰基二咪唑（N,N'-carbonyldiimidazole，CDI）为连接剂，将十氯酮半抗原羟基分别与牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)及血蓝蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH）载体的氨基连接，合成免疫复合物。
根据上述机理，本发明采用如下技术方案：
一种十氯酮抗原，其特征在于该抗原是以N,N-羰基二咪唑为连接剂，将单羟基十氯酮的羟基与血蓝蛋白或牛血清白蛋白中的氨基连接而得到的免疫抗原及包被抗原。
一种十氯酮抗体，采用上述的十氯酮抗原，其特征在于该抗体是利用所述的抗原制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化而获得。该抗体属于IgG亚类。
一种制备上述的十氯酮抗体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 十氯酮抗原的制备，其具体步骤为：
a-1. 以氰基硼氢钠为还原剂，合成单羟基十氯酮；
a-2. 将N,N-羰基二咪唑与单羟基十氯酮反应，得到活化半抗原；
a-3. 将活化半抗原分别与牛血清白蛋白载体和血蓝蛋白载体在偶联剂N,N-羰基二咪唑的作用下连接,合成抗原，即为十氯酮抗原；
b.制备十氯酮抗体：制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化，获得十氯酮单克隆抗体。
上个述的步骤a-1的具体步骤为：
a-1-1.将量十氯酮和硼氢化钠按1:1～1:3的摩尔比溶解于正丙醇中,于37℃下搅拌反应24h；
a-1-2.去除溶剂，剩余物用10%的H2SO4溶液洗涤，再用苯萃取，得有机相；
a-1-3.将有机相去除溶剂后纯化，所得晶体即为单羟基十氯酮。
上述的步骤a-2的具体步骤为：将单羟基十氯酮与N,N-羰基二咪唑按1:5～1:10的摩尔比溶于N,N-羰基二咪唑中，在37℃下反应2h，得到活化半抗原。
上述的步骤a-3的具体步骤为：
a-3-1.将浓度为1-10mg/ml的血蓝蛋白溶液或牛血清白蛋白溶液于浓度为0.1M,pH=9.5的碳酸盐缓冲液中透析24h,每4小时更换缓冲液，得到载体透析液；
a-3-2. 将活化半抗原,逐滴加入载体透析液中4℃中反应48h（或室温下24h）；所述的活化半抗原与载体透析液的体积比为1:4～2:3，得到混合液；
a-3-3将混合液于0.1M,pH=7.4的磷酸缓冲液中透析，除去未反应的小分子，既得十氯酮免疫抗原及包被抗原。
上述的步骤b的具体步骤为：体外通过次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）选择性培养基筛选十氯酮阳性杂交瘤细胞；通过ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液中抗体效价，选择较高效价孔进行扩大化培养；将抗体阳性细胞进行有限稀释克隆筛选；将阳性孔杂交瘤细胞用HAT筛选培养基稀释成100个/200ul/孔，10个/200ul/孔，1个/200ul/孔,接种于96孔培养板中，在5%CO2，37℃培养箱中培养、观察；选出只有一个克隆生长的孔，扩大培养，同样方法筛选三次以上，得到稳定分泌抗体的阳性细胞株。
本发明的阳性杂交瘤细胞通过体外无血清培养、富集，得到单克隆抗体。该抗体与十氯酮的亲和力常数为6.25ug/ml-0.312ug/ml，经过六个月连续传代，冻存六个月，复苏四次，该单克隆抗体的分泌能力没有明显的变化。该抗体亚类为IgG,，本发明通过抗原抗体高效特异性竞争结合的特性，不需要繁琐的前处理过程，整个检测过程可以在5-8小时内完成，检测十氯酮的检测阈为6.25ug/ml-0.312ug/ml。与现有的仪器检测相比，更快速、廉价，可用于十氯酮样品的分析检测、定量测定、质量标准、纯化、以及十氯酮的生物效应。实现了对该类物质的高效、快速、廉价的检测分析。
附图说明
图1为抗血清滴度曲线测定。
图2为十氯酮单克隆抗体IgG种属及效价的测定。
图3为间接ELISA方法测定待测十氯酮标准样品抑制曲线。
具体实施方式
实施例一：十氯酮免疫抗原及包被抗原的制备
一、半抗原的合成：十氯酮在硼氢化钠的催化下,能转化成含羟基的单羟基十氯酮.操作步骤如下：
1) 称取十氯酮0.05g溶解于正丙醇当中,将0.012g硼氢化钠溶于正丙醇中，并缓慢滴加至十氯酮的正丙醇溶液中，于37℃下搅拌反应24h；
2) 用旋转蒸发仪旋干正丙醇，所得物质用5ml 10%的H2SO4溶液水洗，所得酸性溶液用苯液萃取；
3) 将苯液蒸发干燥后用正己烷重结晶，所得晶体即为单羟基十氯酮，4℃冰箱中保存，待用。
二、免疫抗原及包被抗原的制备：将单羟基十氯酮分别与血蓝蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH）载体在偶联剂羰基二咪唑（N,N'-carbonyldiimidazole，CDI）的作用下连接,合成包被抗原及免疫抗原。具体步骤为：
1) 量取血蓝蛋白溶液(1-10mg/ml)于碳酸盐缓冲液（0.1M,pH=9.5）中透析24h,每4小时更换缓冲液，得到载体透析液，准确测量体积及吸光度，4℃冰箱保存待用；
2) 将制得的单羟基十氯酮0.010g在37℃下与0.032g的羰基二咪唑在无水二甲基亚砜溶液反应2h，得到活化半抗原；
3) 移取500ul活化半抗原,逐滴加入1ml载体透析液中4℃中反应48h（或室温下24h）；
4) 将以上反应液于磷酸缓冲液（0.1M,pH=7.4）中透析，除去未反应的小分子，既得完全免疫原，准确测量体积及吸光度。计算复合物浓度。
以同样的方法制备十氯酮-牛血清白蛋白包被抗原。
实施例二：十氯酮抗体的制备：
一、将实施例二得到的十氯酮抗原制备成PBS溶液,与弗氏完全佐剂（CFA, Complete Freund’s Adjuvant）1:1等体积混合；取5只8周龄雌性Balb/c小鼠，做背部皮下多点免疫注射（0.05mg/0.5ml/只～0.2mg/0.5ml/只）免疫复合物与佐剂混合液；三周后大腿肌肉静脉免疫同等剂量复合物与弗氏不完全佐剂（IFA，Incomplete Freund’s Adjuvant）混合物；两周后再次大腿肌肉静脉加强免疫同等剂量复合物与弗氏不完全佐剂混合物，断尾取血，测定小鼠血清效价，选取效价最高者小鼠做细胞融合实验；细胞融合前3天，大腿肌肉静脉注射免疫复合物纯PBS溶液，做融合前加强免疫。
二、取小鼠脾细胞悬浮液，在50ml离心管中，移取108个脾细胞与107个处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞混合均匀，1000rpm离心10min，去掉上清液。向所得细胞匀浆中逐滴加入1ml经过37℃预热的50%聚乙二醇（PEG, Polyethylene Glycol），2分钟内加完，同时一边加边轻轻扣动离心管，使细胞均匀融合。逐滴加入20ml无蛋白IMDM培养基终止融合反应，每加5ml培养基后轻轻晃动离心管，再追加20ml IMDM培养基彻底终止反应。1000rpm离心10min，去掉上清液。加入100mlHAT(次黄嘌呤（H）,氨基蝶呤(A),胸腺嘧啶核苷（T）)选择性培养基，轻轻吹打均匀后接种于5块96孔培养板中(200ul/well)，在5%CO2，37℃培养箱中培养、观察。两周后通过ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液中抗体效价，选择较高效价孔进行扩大化培养。
三、将阳性孔杂交瘤细胞用HAT筛选培养基稀释成100个/200ul/孔，10个/200ul/孔，1个/200ul/孔,接种于96孔培养板中，在5%CO2，37℃培养箱中培养、观察。选出只有一个克隆生长的孔，扩大培养，同样筛选三次以上，得到稳定分泌抗体的阳性细胞株。
用含10%胎牛血清培养基体外扩大富集培养筛选得的细胞株，改换无血清培养基培养，收集上清液，分管冷冻干燥，-20℃冷冻保存，既得本发明的十氯酮单克隆抗体。
实施例三：
1.包被：用0.1M pH9.5碳酸盐包被缓冲液将包被抗原（十氯酮-牛血清白蛋白复合物）稀释至蛋白质含量为10μg／ml。在每个ELISA酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液洗3次。(简称洗涤，下同)。
2.封闭：每孔加0.3ml PBST+0.3%Gelatin，置37℃孵育1小时。然后洗涤。
3.加样：加一定稀释度的待检抗血清0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
4.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜1/4000稀释的酶标抗体0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
5.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的OPD底物0.1M pH5.0醋酸缓冲液0.1ml，室温反应3-5分钟。
6.终止反应：于各反应孔中加入2M盐酸0.1ml。
7.结果判定：在ELISA检测仪上，于490nm处测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
参见图1，由图1可知，包被抗原与免疫血清能够很好的特异结合，以大于阴性血清吸光度值2.1倍计（P/N≥2.1），所得抗血清效价（以10ug/ml Hapten CD-BSA作为包被原），抗血清效价达12800.
实施例四：单克隆抗体种类确定
选取ELISA酶标板，包被100ul（5ug/ml）Goat Anti Mouse IgG(H+L)，置于4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液洗3次。用0.3ml PBST+0.3%Gelatin封闭反应孔，置37℃孵育1小时。加100ul待测试杂交瘤细胞细胞培养液(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)；37℃孵育1小时后加100ul 酶标二抗Goat Anti Mouse IgG(H+L)-HRP。加底物显色后用HCl终止反应，在490nm下测定吸光光度值。
参见图2，由图2可见，所得杂交瘤细胞培养上清液能与Mouse IgG 特异性结合，说明该杂交瘤细胞分泌针对十氯酮单克隆抗体属于IgG类，且效价都较高。
实施例五：竞争ELISA检测待测十氯酮标准样品
1.包被：用0.1M pH9.5碳酸盐包被缓冲液将包被抗原（十氯酮-牛血清白蛋白）稀释至蛋白质含量为10μg／ml。在每个ELISA酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液洗3次。(简称洗涤，下同)。
2.封闭：每孔加0.3ml PBST+0.3%Gelatin，置37℃孵育1小时。然后洗涤。
3.加样：于酶标板的1 2、3 4、5 6、7 8、9 10、11 12。十二列孔中，加入不同梯度浓度的待检测十氯酮PBS溶液50μL/孔，同时加入等体积的稀释倍数为（400倍）的本发明所得抗体各50μL/孔，于37℃温育2h.然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
4.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜1/4000稀释的Goat Anti-Mouce IgG(H+L)-HRP酶标抗体0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
5.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的OPD底物0.1M pH5.0醋酸缓冲液0.1ml，室温反应3-5分钟。
6.终止反应：于各反应孔中加入2M盐酸0.1ml。
7.结果判定：在ELISA检测仪上，于490nm处测各孔OD值，以十氯酮浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，其中抑制率=（对照孔的吸光度值-不同十氯酮浓度孔吸光度值）/（对照孔的吸光度值）×100%。
参见图3，由图3可见随着十氯酮的浓度不断变化，抗原抗体竞争结合出现变化，十氯酮对本发明反应体系半数抑制浓度IC50约为0.00125mg/ml,该检测方法对十氯酮的检测阈为6.25ug/ml-0.312ug/ml，与现有的仪器检测相比，更快速、廉价，可用于十氯酮样品的现场快速检测。
Claims (7)
1.一种十氯酮抗原，其特征在于该抗原是以N,N-羰基二咪唑为连接剂，将单羟基十氯酮的羟基与血蓝蛋白或牛血清白蛋白中的氨基连接而得到的免疫复合物。
2.一种十氯酮抗体，采用根据权利要求1所述的十氯酮抗原，其特征在于该抗体是将所述的抗原制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化而获得的；该抗体属于IgG亚类。
3.一种制备根据权利要求2所述的十氯酮抗体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
十氯酮抗原的制备，其具体步骤为：
a-1. 以氰基硼氢钠为还原剂，合成单羟基十氯酮；
a-2. 将N,N-羰基二咪唑与单羟基十氯酮反应，得到活化半抗原；
a-3. 将活化半抗原分别与牛血清白蛋白载体和血蓝蛋白载体在偶联剂N,N-羰基二咪唑的作用下连接,合成抗原，即为十氯酮抗原；
b.制备十氯酮抗体：制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化，获得十氯酮单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的十氯酮抗原的制备方法，其特征在于所述的步骤a-1的具体步骤为：
a-1-1.将十氯酮和硼氢化钠按1:1～1:3的摩尔比溶解于正丙醇中,于37℃下搅拌反应24h；
a-1-2.去除溶剂，剩余物用10%的H2SO4溶液洗涤，再用苯萃取，得有机相；
a-1-3.将有机相去除溶剂后纯化，所得晶体即为单羟基十氯酮。
5.根据权利要求3所述的十氯酮抗原的制备方法，其特征在于所述的步骤a-2的具体步骤为：将单羟基十氯酮与N,N-羰基二咪唑按1:5～1:10的摩尔比溶于N,N-羰基二咪唑中，在37℃下反应2h，得到活化半抗原。
6.根据权利要求3所述的十氯酮抗原的制备方法，其特征在于所述的步骤a-3的具体步骤为：
a-3-1.将浓度为1-10mg/ml的血蓝蛋白溶液或牛血清白蛋白溶液于浓度为0.1M,pH=9.5的碳酸盐缓冲液中透析24h,每4小时更换缓冲液，得到载体透析液；
a-3-2. 将活化半抗原,逐滴加入载体透析液中4℃中反应48h（或室温下24h）；所述的活化半抗原与载体透析液的体积比为1:4～2:3，得到反应液；
a-3-3将反应液于0.1M,pH=7.4的磷酸缓冲液中透析，除去未反应的小分子，既得十氯酮抗原。
7.根据权利要求3所述的十氯酮抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤b的具体步骤为：体外通过次黄嘌呤H、氨基蝶呤A和胸腺嘧啶核苷T选择性培养基筛选十氯酮阳性杂交瘤细胞；通过ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液中抗体效价，选择较高效价孔进行扩大化培养；将抗体阳性细胞进行有限稀释克隆筛选；将阳性孔杂交瘤细胞用HAT筛选培养基稀释成100个/200ul/孔，10个/200ul/孔，1个/200ul/孔,接种于96孔培养板中，在5%CO2，37℃培养箱中培养、观察；选出只有一个克隆生长的孔，扩大培养，同样方法筛选三次以上，得到稳定分泌抗体的阳性细胞株，即得到十氯酮抗体。
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