CN102188704B - 使用il-21和单克隆抗体疗法治疗癌症的方法 - Google Patents
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Abstract
描述了通过共施用治疗性单克隆抗体和IL-21治疗癌症的方法。可使用的示例性单克隆抗体是利妥昔单抗、曲妥单抗和抗CTLA-4抗体。对于对单克隆抗体疗法具有抗性的、在用单克隆抗体治疗后复发的或其中增强的IL-21抗肿瘤效果减少毒性(该毒性和使用单克隆抗体的治疗法相关)的患者群体,所述组合疗法的增强的抗肿瘤性特别有用。
Description
本申请是申请日为2005年5月20日、申请号为200580021262.5、发明名称为“使用IL-21和单克隆抗体疗法治疗癌症的方法”的发明专利申请的分案申请。
发明背景
细胞因子一般刺激造血谱系的细胞的增殖或分化,或参与身体的免疫和炎性反应机制。白细胞介素是介导免疫反应的细胞因子的家族。免疫反应的核心是T细胞,该细胞产生许多细胞因子和影响对抗原的适应性免疫。已将T细胞产生的细胞因子分类为TH1和TH2(Kelso,A.Immun.Cell Biol. 76:300-317,1998)。1型细胞因子包括IL-2、IFN-γ、LT-α,其参与炎症反应、病毒性免疫、细胞内寄生虫免疫和同种异体移植物排斥。2型细胞因子包括IL-4,IL-5,IL-6,IL-10和IL-13,其参与体液反应、蠕虫免疫和过敏性反应。1型和2型之间共享的细胞因子包括I L-3,GM-CSF和TNF-α。一些证据显示1型和2型生产性T细胞群体优先地迁移入不同类型的炎症组织。
天然杀伤(NK)细胞和T细胞以及B细胞具有共同的祖细胞,在免疫监督中发挥作用。NK细胞,其占血液淋巴细胞的高达15%,不表达抗原受体,是先天免疫的组成部分。NK参与识别和杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞。在体内,据认为NK细胞需要激活,然而,在体外,已显NK细胞杀伤一些类型的肿瘤细胞而无需激活。
已显示IL-21是细胞毒性T细胞和NK细胞的有效调节剂。(Parrish-Novak,等人Nature 408:57-63,2000;Parrish-Novak,等人,J.Leuk.Bio. 72:856-863,2002;Collins等人,Immunol. Res. 28:131-140,2003;Brady,等人J.Immunol.:2048-58,2004.)。已显示IL-21共刺激NK细胞的扩增,已证明其增强这些细胞的效应器功能。T细胞应答包括调节记忆T细胞功能以及增强初级抗原反应(Kasaian等人,Immunity 16:559-569,2002)。
抗体疗法使用选择性地在某些细胞类型中表达的抗原。抗体疗法在癌症的治疗中已取得了显著的成功,因为某些肿瘤细胞展现独特的抗原、谱系特异性抗原,或相对于正常细胞存在过量的抗原。单克隆抗体(MAb)疗法的发展已从小鼠杂交瘤技术(Kohler等人,Nature 256:495-497,1975)发展而来,由于不能刺激人免疫效应器细胞的活性和产生人抗小鼠的抗体(HAMA;Khazaeli等人,J.Immunother. 15:42-52,1994),因此该单克隆抗体具有有限的治疗功效。使用人恒定区和小鼠可变区获得抗原性较低的基因工程改造的嵌合型抗体。这些抗体具有增加的效应器功能和减少的HAMA反应(Boulianne等人,Nature 312:643-646,1984)。已使用噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature 348:552-554,1990)来发展人单克隆抗体,最近以来,已使用携带人Ig基因座的转基因小鼠生产完全人单克隆抗体(Green,J.Immunol.Methods 231:11-23,1999)。关于单克隆抗体疗法,参见,Brekke等人,Na t.Rev.Drug Discov. 2:52-62,2002。
本发明提供了用IL-21增强单克隆抗体疗法的抗肿瘤活性的方法。IL-21和治疗性单克隆抗体的组合提供了超过单独使用单克隆抗体的改善,尤其适用于对于对单独的单克隆抗体治疗或和其他治疗方案组合的单克隆抗体治疗不产生反应的患者。根据此处的教导,这些和其他用途对于本领域技术人员来说应当是很明显的。
发明概述
本发明提供了在受治疗者中,特别是人受治疗者中治疗癌症的方法,其包括共施用治疗上有效量的单克隆抗体和治疗上有效量的IL-21多肽或IL-21多肽的片段,如SEQ ID NO:2中显示的从氨基酸残基30至残基162的片段。在一个实施方案中,所述单克隆抗体是抗CD20单克隆抗体。在另一实施方案中,单克隆抗体是利妥昔单抗。在另一个实施方案中,本发明的方法治疗非何杰金氏淋巴瘤。本发明的其他实施方案提供了这样的方法,在该方法中,长达连续8周每周一次地施用单克隆抗体利妥昔单抗和IL-21多肽。在另一个实施方案中,长达连续8周,每周一次地施用利妥昔单抗,每周高达5次地施用IL-21多肽。本发明的另一个实施方案提供了从10至500μg/kg/剂的IL-21多肽剂量。在本发明的某些实施方案中,以前曾用利妥昔单抗治疗患者,但未显示明显的肿瘤减缓或消退。在其他实施方案中,在接受利妥昔单抗治疗后,患者复发疾病。
在另一个方面,本发明提供了在受治疗者中治疗癌症的方法,其包括共施用治疗上有效量的抗CD20单克隆抗体和治疗上有效量的IL-21多肽或IL-21多肽的片段,如SEQ ID NO:2中显示的从氨基酸残基30至残基162的片段。其中,施用IL-21导致最佳免疫学应答。
在另一个方面,本发明提供了在受治疗者中治疗癌症的方法,其包括共施用结合Her-2/neu受体的单克隆抗体和IL-21多肽或IL-21多肽的片段,如SEQ ID NO:2中显示的从氨基酸残基30至残基162的片段。在一个实施方案中,受治疗者是人患者。在另一个实施方案中,单克隆抗体是曲妥单抗。
本发明的一个方面提供了在受治疗者中治疗癌症的方法,其包括共施用结合细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的单克隆抗体和IL-21多肽或IL-21多肽的片段,如SEQ ID NO:2中显示的从氨基酸残基30至残基162的片段。在某些实施方案中,受治疗者是人患者。在本发明的另一实施方案中,以每三周3mg/kg的剂量施用抗CTLA-4单克隆抗体,进行4个循环,和以每周5次,长达8周地施用IL-21多肽或片段。本发明也提供了这样的实施方案,在该实施方案中,IL-21多肽的剂量是从10至500μg/kg/剂。
附图概述
图1-举例说明去除了巨噬细胞的小鼠显示不同于非去除小鼠的存活曲线。
图2-举例说明通过抗Gr-1MAb的注射去除了粒细胞的小鼠,当和非去除小鼠比较时,显示减少的存活率。
图3-举例说明抗CTLA4+IL21的组合在RENCa模型中具有抗肿瘤效果。
发明描述
在详细地描述本发明之前,定义下列术语可有助于理解其:
此处所用的术语“亲和标签”是指可附着至第二多肽以提供第二多肽的纯化或检测或提供用于第二多肽与底物的附着的位点的多肽片段。原则上,任何可获得其相应的抗体或其他特异性结合试剂的肽或蛋白可用作亲和标签。亲和标签包括多组氨酸片段、A蛋白(Nilsson等人,EMBO J.4:1075,1985;Nilsson等人,Methods Enzymol,198:3,1991)、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Johnson,Gene 67:31,1988)、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:7952-4,1985)、P物质、FlagTM肽(Hopp等人,Biotechnology 6:1204-10,1988)、链霉抗生物素蛋白结合性肽或其他抗原表位或结合结构域。一般参见Ford等人,Protein Expression and Purification 2:95-107,1991。可从商业提供商(例如,PharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)商购获得编码亲和标签的DNA。
此处使用的术语“等位基因变体”是指占据相同染色体位点的任何两个或多个可选择的基因的形式。等位基因变异天然地通过突变发生,其可导致群体内的表型多态性。基因突变可以是沉默的(被编码的多肽上未发生改变)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语等位基因变体此处也可用于表示由基因的等位变体编码的蛋白。
此处所用的术语“氨基末端”和“羧基末端”是指多肽内的位置。在上下文允许的情况下,针对多肽的特定序列或部分,这些术语用于表示临近或相对位置。例如,位于多肽内参照序列的羧基末端的某一序列位于靠近该参照序列的羧基端,但不一定位于完整多肽的羧基端。
此处所用的术语“癌症”或“癌细胞”是指在赘生物中发现的、具有使其和正常组织或组织细胞区分开的特征的组织或细胞。在这些特征中包括但不限于:退行性变化的程度、形状上的不规则、细胞轮廓的不可分辨性、细胞核大小、细胞核或细胞质的结构上的改变、其他表型改变、预示癌症或前癌状态的细胞蛋白的存在、增加的有丝分裂次数和转移的能力。和“癌症”有关的术语包括癌、肉瘤、肿瘤、上皮癌、白血病、淋巴癌、息肉,以及硬癌、转化、赘生物等。
此处所用的术语“共施用”表示IL-21多肽或蛋白和治疗性单克隆抗体可以同时给药或在不同时间给药。共施用也可以是I L-21和单克隆抗体的单次共施用或共施用的多个循环。共施用不必只限于给患者施用IL-21或单克隆抗体时候,可单独地或和除了IL-21以外的治疗剂一起施用药剂。
此处所用的术语“组合治疗”是指给受治疗者施用至少一种治疗有效剂量的IL-21组分(“IL-21”)和治疗性单克隆抗体。所述IL-21组分可以是展示IL-21的生物学活性的成熟的多肽、其片段、融合物或缀合物。
术语“分离的”,当用于多核苷酸时,是指已将该多核苷酸从其天然遗传背景中取出,从而不含有其他外来或不想要的编码序列,其以适合在经遗传工程改造的蛋白生产系统中使用的形式存在。这样的分离的分子是从其天然环境中分离的分子,包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含通常和其相关的其他基因,但可包含天然发生的5′和3′非翻译区例如启动子和终止子。相关区域的鉴定对于本领域技术人员来说是很明了(参见例如,Dynan和Tijan,Nature 316:774-78,1985)。
“分离的”多肽或蛋白是在除了其天然环境外,例如除了血液和动物组织外的条件下发现的多肽或蛋白。在优选的形式中,分离的多肽基本上不含有其他多肽,特别是动物来源的其他多肽。优选地以高度纯化的形式,即大于95%的纯度、更优选地大于99%的纯度提供多肽。当用于本说明书中时,术语“分离的”不排除相同的多肽以可选择的物理形式存在,例如以二聚体或可选择地糖基化或衍生的形式存在。
术语“水平”,当指免疫细胞,例如NK细胞、T细胞、特别是细胞毒性T细胞、B细胞等时,增加的水平是指增加的细胞数目或增强的细胞功能的活性。
术语“水平”,当用于指病毒感染时,是指病毒感染水平上的改变,其包括,但不限于,CTLs或NK细胞(如上面所描述的)的水平上的变化、病毒载量上的减少、增加的抗病毒的抗体的滴度、如通过靶组织或器官的组织学检查所确定的丙氨酸氨基转移酶的血清学水平上的降低或提高。确定这些水平上的改变是否具有显著的差异或改变对本领域技术人员来说是熟知的。
术语“赘生性”,当指细胞时,表示在组织中特别是这样的组织中正进行新的和不正常增殖的细胞,在所述组织中,扩增是不受控制的和累进的,从而导致赘生物。所述赘生性细胞可以是恶性的,即侵袭性的和转移性的,或可以是良性的。
术语“最佳免疫剂量”定义为获得最佳免疫反应的IL-21或IL-21和单克隆抗体的剂量。
术语“最佳免疫反应”是指在施用IL-21或IL-21+MAb的组合后,在免疫反应上的改变超过当单独地施用MAb时观察到的改变,其可以是(1)被激活的或肿瘤特异性CD8T细胞的数量上的增加,(2)表达更高水平的粒酶B或穿孔素或IFN γ受体的活化的或肿瘤特异性CD8T细胞的数量上的增加,(3)NK细胞、单核细胞或中性粒细胞上的Fcγ受体(CD16、CD 32或CD64)的上调,(4)血清中可溶性CD25的增加,(5)通过肿瘤细胞释放的蛋白例如癌胚抗原(CEA)、IgG、CA-19-9或卵巢癌抗原(CA125)的血清水平上的减少(参见,例如,Taro等人,J.Cell Physiol 203(1):1-5,2005),(7)激活性细胞因子例如IL-18、I L-15、IFN γ和能够使效应器细胞寻找到肿瘤的趋化因子例如IP-10、RANTES、IL-8、MIP1a或MIP1b的水平上的增加,(8)在肿瘤位点外周或其上的被活化的巨噬细胞的数量上的增加,其中可通过增加的MHC I型或II型的表达,IL-15、IL-18、IFN γ或IL-21的产生来检测激活,或(9)通过红细胞计数的下降(贫血的严重度)表示的巨噬细胞活性。
“多核苷酸”是从5′至3′末端阅读的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA,其可从天然来源分离,体外合成,或从天然和合成的分子的组合制备。多核苷酸的大小表示为碱基对(编写为“bp”)、核苷酸(“nt”)或千碱基(“kb”)。在上下文允许的情况下,后两个术语可描述单链的或双链的多核苷酸。当所述术语用于双链分子时,其用于表示总的长度,理解为和术语“碱基对”的意思相同。本领域技术人员认识到双链多核苷酸的两条链可在长度上稍微不同,其末端可以因为酶的切割而产生交错,因此双链多核苷酸分子内的核苷酸可以不配对。
“多肽”是由肽键连接的氨基酸残基的多聚体,无论是天然产生的还是合成的。少于大约10个氨基酸的多肽通常称为“肽”。
“蛋白”是包含一个或多个肽链的大分子。蛋白也可包含非肽成分,例如糖基。可通过产生该蛋白的细胞向蛋白加入糖和其他非肽取代物,糖和非肽取代物随细胞的类型不同而不同。此处根据蛋白的氨基酸主链结构来定义蛋白;取代物例如糖基一般不具体指明,但是可以存在。
术语“受体”是指这样的细胞结合的蛋白,该蛋白结合生物活性分子(即,配体)和介导该配体对细胞的作用。膜结合受体的特征在于包含细胞外配体结合结构域和一般参与信号转导的细胞内效应器结构域的多个肽结构。配体和受体的结合导致受体的构象变化,该变化导致效应器结构域和细胞内的其他分子之间产生相互作用。该相互作用依次导致细胞的代谢上的改变。和受体-配体相互作用关联的代谢事件包括基因的转录、磷酸化、去磷酸化、环AMP产量的增加、细胞钙的动员、膜脂的动员、细胞粘附、肌醇脂类的水解和磷脂的水解。一般地,受体可以是膜结合的、存在于细胞溶质或细胞核中的、单体的(例如,促甲状腺激素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚体的(例如,PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、促红细胞生成素受体和IL-6受体)。
术语“治疗上有效的量”被定义为这样的IL-21组分或IL-21组分和单克隆抗体的量,该量导致完全的反应、部分反应、或稳定的疾病,这些反应或稳定的疾病具有增加的超过在无IL-21的情况下单克隆抗体疗法的中等反应持续时间的进程时间。
术语“肿瘤相关抗原”是指具有不同于非肿瘤细胞中发现的抗原的表达特征谱的肽或多肽或肽复合物。例如,和非肿瘤细胞相比,肿瘤细胞可以更高的频率或密度表达非肿瘤抗原。肿瘤抗原可在结构上与非肿瘤抗原不同,例如,肿瘤抗原可作为截短的多肽表达,在编码该抗原的氨基酸序列或多核苷酸序列上具有一些突变,翻译后错误折叠或不正确修饰。和存在于宿主生物中的正常的、非肿瘤细胞上的抗原相似,其可使肿瘤细胞逃避宿主免疫监视机制。
通过不精确分析方法(例如,凝胶电泳)确定的多聚体的分子量和长度应理解为近似值。当这样的值表示为“大约”X或“近似”X时,所述的X值要理解为精确值±10%。
此处引用的所有文献以其全文在此引用作为参考。
本发明基于这样的发现,即I L-21和治疗性单克隆抗体的一起施用导致比单独施用单克隆抗体更有效的抗肿瘤活性。
A.IL-21的描述。
人I L-21(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)最初被称为zalphall配体,在共同拥有的美国专利号6,307,024和6,686,178中对其进行了描述,该专利在此引用作为参考。在共同拥有的WIPO公开号WO 0/17235和WO01/77171中描述了IL-21受体,(以前称为zalpha11)现称为IL-21R(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)、异二聚体受体IL-21R/IL-2R γ,该文献在此引用作为参考。如在这些出版物中所描述的,IL-21分离自从激活的用CD3筛选的人外周血细胞(hPBCs)产生的cDNA文库。CD3是对于淋巴来源的细胞特别是T细胞是独特的细胞表面标志物。
IL-21R的氨基酸序列显示被编码的受体属于I类细胞因子受体亚家族,该家族包括,但不限于,IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、EPO、TPO、GM-CSF和G-CSF的受体(综述参见,Cosman,“The HematopoietinReceptor Superfamily”in Cytokine 5(2):95-106,1993)。已在NK细胞、T细胞和B细胞上鉴定了IL-21受体,这表明IL-21对造血谱系细胞特别是淋巴祖细胞和淋巴样细胞起作用。其他已知的对淋巴样细胞起作用的四-螺旋-束(four-helical-bundle)的细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7和IL-15。关于四-螺旋-束细胞因子,参见,Nicola等人,Advances in Protein Chemistry 52:1-65,1999和Kelso,A.,Immunol.Cell Biol. 76:300-317,1998。
对于IL-21,分泌信号序列由氨基酸残基1(Met)至29(Ser)组成,成熟的多肽由氨基酸残基30(Gln)至162(Ser)(如SEQ ID NO:2中所示)组成。对应的多核苷酸序列示于SEQ ID NO:1中。本领域技术人员承认SEQ ID NO:1中公开的序列代表人IL-21的单个等位基因,预期可发生等位基因变异和可变剪接。
本发明也提供了具有和SEQ ID NO:2的多肽或其直向同源物基本上相似的序列同一性的分离的IL-21多肽。术语“基本上相似的序列同一性”此处是指多肽包含和SEQ ID NO:2中显示的序列或其直向同源物至少80%、至少90%、至少95%或大于95%的序列同一性。本发明也包括包含这样的氨基酸序列的多肽,该氨基酸序列和SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至162或30至162的序列具有至少80%、至少90%、至少95%或超过95%的序列同一性。本发明还包括编码这些多肽的核酸分子。用于确定同一性百分比的方法对本领域技术人员来说是已知的。
一般地,当设计针对分子的修饰或鉴定特异性片段时,通过对经修饰的分子的活性的评估来进行结构确定。关于IL-21多核苷酸和多肽的修饰的详细描述,参见,美国专利号6,307,024和6,686,178,在此引用其作为参考。
本发明也包括施用具有IL-21的功能活性的分子。因此,本发明包括施用IL-21多肽的功能性片段和经功能性修饰的多肽以及编码这些功能性片段和经修饰的多肽的核酸分子。此处定义的“功能性”IL-21或其片段的特征在于其增殖或分化活性,在于其诱导或抑制特化的细胞功能的能力,特别是对于免疫效应器细胞例如NK细胞、T细胞、B细胞和树突细胞。功能性IL-21也包括展现体内或体外抗癌和抗病毒作用的能力,或特异性结合抗IL-21的抗体或IL-21受体(可溶性的或被固定的)的能力。
也可使用各种多肽融合物(和相关的包含一种或多种多肽融合物的多聚体蛋白)。例如,可将IL-21多肽与二聚化蛋白制备为融合物,如美国专利号5,155,027和5,567,584中所公开的。在该方面,优选的二聚化蛋白包含免疫球蛋白的恒定区结构域。可在经遗传工程改造的细胞中表达免疫球蛋白-IL-21多肽融合物(以产生各种多聚体IL-21类似物)。可将辅助结构域融合至IL-21多肽以将其靶向特定的细胞、组织或大分子。例如,可将IL-21多肽或蛋白靶向预先确定的细胞类型,通过将IL-21多肽融合至这样的配体或单克隆抗体来将IL-21多肽靶向预先确定的细胞类型,所述配体或单克隆抗体特异性地结合该靶细胞的表面上的受体。这样,为了治疗或诊断目的,可靶向多肽或蛋白。可将I L-21多肽融合至两个或更多个部分,例如用于纯化的亲和标签和靶向性结构域。多肽融合物也可包含一个或多个切割位点,特别是在结构域之间。参见,Tuan等人,Connective Tissue Research 34:1-9,1996。
不论变体I L-21多核苷酸的特定的核苷酸序列如何,该多核苷酸编码这样的多肽,该多肽的特征在于其增殖或分化活性,在于其诱导或抑制特化的细胞功能的能力,或在于特异性结合抗IL-21的抗体或IL-21受体的能力。更明确地,变体IL-21多核苷酸编码这样的多肽,该多肽表现至少50%,在某些实施方案中,大于70%、80%或90%的SEQ I DNO:2中显示的多肽的活性。
对于任何IL-21多肽,包括变体和融合蛋白,本领域技术人员可容易地使用遗传密码子和本领域内已知的方法产生完全简并的编码该变体的多核苷酸序列。
根据常规技术可在经遗传工程改造的宿主细胞中生产用于本发明的I L-21多肽。合适的宿主细胞是可用外源DNA转化或转染和在培养物中培养的细胞类型,包括细菌、真菌细胞和培养的高等真核细胞。真核细胞,特别是多细胞生物的培养细胞是优选的。用于操作克隆的DNA分子和将外源DNA导入各种宿主细胞的技术公开于Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,和Ausubel等人,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley and Sons,Inc.,NY,1987。用于产生IL-21的表达构建体和方法描述于美国专利号6,686,178和PCT US 03/39764,在此引用作为参考。
用于治疗的I L-21缀合物包含药物可接受的水溶性聚合物部分。合适的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、单-(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)PEG、三氟乙磺酰单甲氧PEG、PEG丙醛、二琥珀酰亚胺碳酸PEG、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的多元醇(例如,甘油)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素或其他基于糖类的聚合物。合适的PEG可具有从大约600至大约60,000的分子量,包括,例如,5,000、12,000、20,000和25,000。IL-21缀合物也可包含这些水溶性聚合物的混合物。
B.在组合疗法中使用IL-21和单克隆抗体。
和单克隆抗体疗法的抗肿瘤活性相关的一个机制是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在ADCC中,单克隆抗体结合靶细胞(例如,癌细胞)和表达该单克隆抗体受体的特异性效应器细胞(例如,NK细胞、单核细胞和粒细胞)结合单克隆抗体/靶细胞复合物导致靶细胞死亡。IL-21增强效应器细胞功能,从而增加单克隆抗体治疗的功效。和MAbs组合的IL-21的施用剂量和方案基于IL-21提高这样的参数的能力,所述参数和介导ADCC的细胞群体的分化和功能活性关联,所述细胞包括但不限于NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。可使用NK、巨噬细胞和中性粒细胞的细胞毒性、ADCC(NK细胞级分或总的单核细胞、或细胞进行ADCC的能力所需的效应器分子(例如,FasL、粒酶和穿孔素))的测定法估计这些参数。当和MAb+肿瘤细胞组合时,IL-21也通过NK细胞增加细胞因子(例如IFN γ)和趋化因子的产量。也已证明Kupffer细胞“清除”利妥昔单抗包被的B细胞的重要性(Gong等人,J.Immunol. 174:817-826,2005)。和抗肿瘤活性相关的另一个机制是MAb包被的肿瘤细胞的吞噬作用。这也是Fc受体依赖性的,已显示影响通过抗CD20的抗体进行的B细胞去除(Uchida等人J.Exp.Med.199(12):1659-69,2004)。MAbs的剂量和给药方案基于归于共施用的特定抗体的药物动力学和毒性动力学特征,应当最优化这些效果,同时使任何可能和IL-21施用相关的毒性降至最低。
基于此处详细描述的关于利妥昔单抗和曲妥单抗的结果,当IL-21和利用免疫效应器细胞介导的抗肿瘤活性的机制的其他单克隆抗体一起使用时,所述单克隆抗体的抗肿瘤活性也得到了增强。此外,因为IL-21增强免疫效应器细胞介导的抗肿瘤活性,某些单独使用时具有有限的抗肿瘤功效的单克隆抗体将成为用于和IL-21一起使用的组合疗法的优良候选者。
当第一线治疗失败时,可使用IL-21和单克隆抗体的组合疗法,可将其当作第二线疗法。然而,基于和单克隆抗体组合的IL-21的增强的抗肿瘤活性,本发明也提供了使用该组合作为患者群体中的第一线疗法,所述患者群体是最新被诊断的并且是以前未接受过抗癌药治疗的“新患者(de novo patients)”和以前未接受过任何单克隆抗体治疗的“未曾服药的患者”。
在任何直接的抗体介导的肿瘤细胞的ADCC不存在的情况下,也可将IL-21和单克隆抗体一起用于组合疗法。在免疫系统中阻断抑制信号的抗体可导致提高的免疫应答。示例包括(1)抗B7R家族的分子例如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、编程性死亡-1(PD-1)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)的抗体,该家族分子具有抑制性功能;(2)抗抑制性细胞因子如IL-10、TGFβ的抗体;和(3)去除或抑制抑制性细胞的功能的抗体如抗CD25或CTLA-4。例如,据认为小鼠和人中的抗CTLA4mAbs都抑制免疫抑制性调节T细胞(Tregs)的功能或抑制抑制性信号,该信号通过T细胞上的CTLA-4和APCs或肿瘤细胞上的B7-1或B7-2分子结合来传递。CTLA-4在被激活的T细胞表面短暂表达而在Treg细胞上组成型地表达。交联CTLA-4导致对激活的T细胞的抑制性信号,抗CTLA-4的抗体阻断对T细胞的抑制性信号,从而导致持续的T细胞活化(Phan等人,PNAS,100:8372-8377,2003.)。在小鼠模型中,抗CTLA4治疗导致被激活的肿瘤特异性CD8T细胞和NK细胞的数目增加,从而导致有效的抗肿瘤反应。IL-21的受体(IL-21R)在这些效应器细胞上表达,IL-21可通过IL-21R激活这些效应器细胞来进一步增强其效应器功能。这可以导致更有效的抗肿瘤活性。正在黑色素瘤、卵巢癌和前列腺癌中进行这样的临床试验,在该试验中,给患者施用抗CTLA-4的阻断性抗体。然而,功效和一系列副作用相关联(参见,US2004/0241169),产生更低毒性治疗的组合疗法是有利的。
表1是经批准或经检验可能和I L-21一起用于组合疗法的单克隆抗体的非排它性目录。
Table 1
1.IL-21和抗CD20单克隆抗体
CD20是人B淋巴细胞限制的分化抗原,其作为B细胞表面抗原Bp35(35kD蛋白)表达。CD20发现于外周B细胞,可在浆细胞阶段之前在成熟B细胞中鉴定其(Reff等人,Blood 83:435-445,1994)。抗CD20单克隆抗体(MAbs)已在临床中接受检验,已批准至少一种人源化的抗CD20MAb即利妥昔单抗用于治疗非何杰金淋巴瘤(NHL)。利妥昔单抗结合淋巴瘤细胞,可在体外直接诱导编程性死亡,同时也能诱导各种效应器机制例如补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(Shan等人,Blood 91:1644-1652,1998)。利妥昔单抗通常用作NHL的第一线治疗(Maloney等人,Blood 90:2188-2195,1997;美国专利号5,736,137)。
利妥昔单抗是用鼠类轻链和重链可变区和人γI重链和κ轻链恒定区通过基因工程制备的MAb(U.S.Patent 6,455,043)。嵌合型抗体由2条451个氨基酸的重链和2条213个氨基酸的轻链组成,其具有大约145kD的分子量。在临床前实验中,抗体抑制B细胞系FL-18、Ramos和Raji中的细胞生长和以剂量依赖性方式在DHL-4人B细胞淋巴瘤细胞系中诱导编程性死亡(Demidem等人Cancer Biotherapy& Radiopharmaceuticals 12:177-186,1997)。已显示MAb在血清中具有相对长的半衰期并且毒性特征谱相对较低。
然而,相当大的患者群体是不顺从的或在用抗CD20抗体治疗一段时间后变得具有抵抗性,甚至在和其他疗法例如骨髓或干细胞移植、放射疗法和化疗法结合治疗时也如此。这些患者一般在施用抗CD20抗体后未表现出可感觉到的肿瘤的减缓或消退,其可从可增强对该抗体的反应性的新疗法中获得益处。此外,增强的抗肿瘤活性也有益于这样的患者群体,所述患者群体是新诊断的和以前从未接受抗癌药治疗的“新患者(de novo patients)”和以前未接受过任何单克隆抗体治疗的“未曾服药的患者(patient)”。
如前面所提到的,已显示IL-21增加NK细胞的数目和加强NK细胞和T细胞的细胞毒功效。此外,已在单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞和NK细胞上鉴定了IL-21的受体(Parrish-Novak等人,J.Leuk. Biol. 72:856-863,2002)。其他的证据已显示IL-21在体内影响T细胞和B细胞的增殖和/或分化。可将许多人B细胞肿瘤细胞系移植入SCID小鼠中并以局部或散布的方式生长。在这些模型中,肿瘤生长的测量或宿主小鼠的存活时间提供了用于评估有效的抗B细胞癌的治疗功效的方法(Bonnefoix等人,Leukemia and Lymphoma 25:169-178,1997)。
当抗体通过基于免疫的细胞(包括NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)产生的ADCC介导抗肿瘤效应时,被这些抗体复合物结合的癌细胞被免疫效应器细胞杀死。部分因为I L-21的免疫调节活性的原因,IL-21可用于增强抗体疗法的功效。就何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤的治疗使用IL-2、IL-12或IFN-α调查了利妥昔单抗和细胞因子的组合疗法(Keilholz等人,Leuk.Lymphoma 35:641-2,.1999;Ansell等人,Blood 99:67-74,2002;Carson等人,Eur.J.Immunol. 31:3016-25,2001;和Sacchi等人,Haematologica 86:951-8.,2001)。
基于IL-21激活和分化ADCC的效应器特别是NK细胞的能力,进行将IL-21和抗体组合并确定细胞因子产量、细胞毒性和肿瘤清除的体内和体外研究。体外研究测定细胞因子的产量,在暴露于IL-21和抗体后,肿瘤细胞被人NK细胞裂解。例如,可使用从外周血白细胞分离的NK细胞估量肿瘤细胞裂解。用钙黄绿素AM或51Cr加载人B细胞淋巴瘤细胞系例如DOHH2、Raji或Ramos,将其暴露于IL-21进行1-7天,测量NK细胞介导的细胞裂解。另一种测定法测量细胞因子的产量。在这些测定法中,一般将纯化的NK细胞暴露于IL-21,和用附着至板的IgG进行体外培养。测量这些细胞因子如INF-γ、TNF-α和IL-10的存在。可在实施例部分找到这些种类的测定法的详细描述。此处教授了在肿瘤攻击后,监控小鼠的存活的体内研究。其他可能的体内研究的参数可包括体重的减轻、肿瘤团块的减小或后肢麻痹(HLP)的减轻。如在实施例部分详细显示的,这些实验的结果表明利妥昔单抗和IL-21的组合的抗CD20+B细胞肿瘤的抗肿瘤活性高于单独的利妥昔单抗或IL-21的抗肿瘤活性。在另外的动物模型包括灵长类动物模型中的其他实验提供了IL-21增强利妥昔单抗介导的功效的其他证据,所述实验是在淋巴瘤患者中检验所述组合的基础。
包括B细胞、T细胞、NK细胞和树突细胞和其祖细胞的淋巴细胞具有包括迁移至和迁移出各种淋巴和非淋巴组织的生命周期。据认为所有淋巴细胞从存在于骨髓中的多能淋巴祖细胞发育成熟而来。原初淋巴细胞在血液和二级淋巴组织之间循环直至细胞死亡,或被抗原激活。当B或T细胞被抗原激活时,被激活的细胞再循环至血液。有证据显示趋化因子在淋巴细胞的运输过程中起着重要的作用。据认为特定趋化因子例如CXCR3的表达促进了恶性B细胞从一个位点至另一个位点的运输,从而在B细胞淋巴瘤迁移至外周血、淋巴节、骨髓和其他器官中起作用(Trent i n等人,J.of Clinical Invest. 104:115-121,1999.)。已显示利妥昔单抗清除B细胞在外周血和外周淋巴节中的存在(Reff等人Blood 83:435-445,1994),驱动CD20+细胞进入这些组织的试剂的施用提供了使以前难以到达的恶性细胞对利妥昔单抗介导的杀伤更易感的机制。已显示IL-21具有直接和间接的对B细胞的作用(Parrish-Novak等人,J.Leukoc.Biol. 72:856-863,2002;Mehta等人,J.Immunol 170:4111-4118,2003;Ozaki等人,J.Immunol. 173:5361-5371,2004.),并且已知IL-21在某些免疫细胞中影响成熟过程(Sivakumar等人,Immunol. 112:177-182,2004.)。
此处公开的实验描述了本发明的发现,即IL-21的施用最初减少循环性B细胞、T细胞和NK细胞,然后在下一个循环周期前,所述细胞持续地增加和分解。淋巴细胞减少和淋巴样滤泡清除的快速逆转可理解为和增加的从淋巴组织至血液的再循环结合的激活的淋巴细胞的短暂迁移。当施用IL-21和利妥昔单抗时,外周B细胞的增加减少了,相应地观察到比当单独地施用IL-21或利妥昔单抗时观察到的B细胞最低值更低的B细胞最低值。因此,IL-21增强了通过利妥昔单抗减少B细胞的效能,从而促进了对清除易感的B细胞的再循环。此外,IL-21的施用导致增强的ADCC活性,当进行ADCC测定时,存在增加的NK细胞和表达Fc γRI和FcγRIII的吞噬细胞的数量。
已显示中性粒细胞对异种B淋巴瘤模型中的利妥昔单抗的抗肿瘤活性非常重要(Hernandez-Ilizaliturri Clin.Cancer Re s. 9(16Pt. 1):5866-73,2003)。粒细胞在mIL-21+利妥昔单抗的抗肿瘤活性中的作用通过使用抗GR-1MAb进行清除来显示。如实施例10中所描述的,用Raji细胞攻击去除粒细胞的或非去除的SCID小鼠组,然后用单独的利妥昔单抗或用利妥昔单抗和mIL-21进行处理。粒细胞的清除减少了单独用利妥昔单抗和用利妥昔单抗加mIL-21处理的SCID小鼠的存活率。比较用组合疗法治疗的组,对于去除了粒细胞的动物,125天后存活的比例从0.67减少至0.0。然而,粒细胞的去除不完全消除I L-21加利妥昔单抗的存活益处,因为相对载体对照组,平均死亡时间(TTD)的显著延迟是很明显的。
近来已显示巨噬细胞表达I L-21受体(Pelletier等人J. Immunol.173(12):7521-30,2004)并在通过抗CD20Mabs的B细胞清除中发挥作用(Uchida等人J.Exp.Med. 199(12):1659-69,2004)。使用氯膦酸脂质体在SCID小鼠中去除巨噬细胞,在散布型的Raj i淋巴瘤模型中检验IL-21和利妥昔单抗。使用氯膦酸脂质体在肝脏中消除了95%的F4/80+细胞,在脾脏的红髓中消除了90%的F4/80+细胞。在注射Raji细胞后3天除去巨噬细胞,通过反复的氯膦酸脂质体注射保持巨噬细胞清除直至肿瘤细胞注射后至少27天。巨噬细胞的清除也降低mIL-21+利妥昔单抗的功效。对于氯膦酸脂质体处理的组,平均TTD显著减少。当和对应的非去除小鼠组相比,单独用利妥昔单抗处理的去除巨噬细胞的SCID小鼠的平均存活时间也急剧下降。
如其他人所报道的(Hernandez-Ilizaliturri,ibid.2003),用抗Gr-1去除中性粒细胞显著地降低了单独的利妥昔单抗的功效,实验显示其将用IL-21+利妥昔单抗处理后的小鼠存活比例从0.67下降至0.0。IL-21可直接作用影响小鼠中性粒细胞,该细胞依次可吞噬肿瘤细胞,影响ADCC或产生细胞毒性氧中间物。但IL-21对中性粒细胞的直接作用没有受到人中性粒细胞的研究(Pelletier,同上)的支持,在该研究中,没有检测到IL-21Rα,IL-21不调节中性粒细胞反应,所述反应包括过氧化物的产生、吞噬作用、趋化性和细胞因子的产生。相反地,这些作者发现IL-21通过人巨噬细胞诱导IL-8的产生,其可导致中性粒细胞趋化性和活化。然而,当进行支持本发明的实验时,使用氯膦酸脂质体进行的巨噬细胞的去除只导致由IL-21和利妥昔单抗的组合展示的协同抗肿瘤活性的部分丧失。这些结果暗示着在SCID小鼠中,中性粒细胞和巨噬细胞在使用组合治疗的情况下在延长存活上起作用。最近的用抗CD20MAbs去除正常B细胞的研究(Uchida等人,同上)也显示小鼠巨噬细胞是所需的主要效应器细胞,NK细胞不是必需的,然而,在该研究中没有研究中性粒细胞。
这些发现证明了IL-21和利妥昔单抗的组合在异种B淋巴瘤模型中具有协同的抗肿瘤活性,证明先天性免疫效应器细胞帮助介导IL-21和利妥昔单抗的协同效应。这些结果表明在SCID小鼠中,在使用组合疗法的情况下,中性粒细胞和巨噬细胞在延长存活时间上起作用。IL-21提高利妥昔单抗对NHL的抗肿瘤活性,IL-21对巨噬细胞、NK细胞、T细胞和淋巴瘤肿瘤的作用自身提高了对利妥昔单抗治疗的反应。
因此本发明提供了通过在患者中施用IL-21和利妥昔单抗来治疗患有淋巴瘤的患者的方法,在所述患者中,恶性细胞从组织中的释放是利妥昔单抗介导的抗肿瘤活性所必需的。此外,在利妥昔单抗存在于患者的外周血的同时保持IL-21的水平的给药方案是有利的,该方案属于本发明。在某些实施方案中,本发明提供了在需要其的患者中治疗淋巴瘤的方法,其包括在确定利妥昔单抗存在于患者的外周血的治疗期间施用IL-21。在另一个实施方案中,本发明提供了在需要其的患者中治疗淋巴瘤的方法,其包括在该患者接受利妥昔单抗治疗的同时每周施用IL-21一至三次。
最常使用的非何杰金氏淋巴瘤分类是REAL分类系统(Ottensmeier,Chemico-Biological Interactions 135-136:653-664,2001)。已鉴定了用于淋巴瘤分类的特异性免疫标志物。例如,滤泡性淋巴瘤标志物包括CD20+、CD3-、CD10+、CD5-;小淋巴细胞淋巴瘤标志物包括CD20+、CD3-、CD10-、CD5+、CD23+;缘带B细胞淋巴瘤(marginal zone Bcell lymphoma)标志物包括CD20+、CD3-、CD10-、CD23-;弥漫性大B细胞淋巴瘤标志物包括CD20+、CD3-;套细胞淋巴瘤标志物包括CD20+、CD3-、CD10-、CD5+、CD23+;外周T细胞淋巴瘤标志物包括CD20-、CD3+;原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(primary mediastinal large Bcell lymphoma)标志物包括CD20+、CD3-;原淋巴细胞淋巴瘤标志物包括CD20-、CD3+、Tdt+;伯基特淋巴瘤标志物包括CD20+、CD3-、CD10+、CD5-(Decision Resourses,Non-Hodgkins Lymphoma,Waltham,MA.,Feb.2002)。
International Working Formulation提供的非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的临床分类法将疾病分为亚型:(1)低级(无痛)疾病,其包括小淋巴细胞的,对应于慢性淋巴细胞性白血病(SC);滤泡的,主要是小卵裂细胞(FSC);滤泡的,混合型小卵裂细胞和大细胞(FM);(2)中级疾病,其包括滤泡的,主要是大细胞(FL);弥漫性的小卵裂细胞(DSC);弥散性混合型小细胞和大细胞(DM);弥散性大卵裂或非卵裂细胞(DL);和(3)高级疾病,其包括成免疫细胞的,大细胞(IBL);原淋巴细胞的曲折核细胞或非曲折核细胞(LL);小非卵裂细胞,伯基特或非伯基特细胞(SNC;(The Non-Hodgkin′s Lymphoma PathologicClassification Project,Cancer 49(10):2112-35,1982)。一般使用Ann Arborstaging系统对患有NHL的患者进行分类。I期表示涉及单个淋巴结区域或区域性涉及单个淋巴外器官或位置。II期表示涉及在隔膜同侧的两个或多个淋巴节区域或区域性涉及核外位置或器官和在隔膜同侧的一个或多个淋巴节区域。III期是指涉及在隔膜两侧的淋巴节区域,可能伴随区域性涉及核外器官或位置。IV期是指弥散性或散布性涉及一个或多个远距离的核外器官的伴随或不伴随涉及相关的淋巴节(“Lymphoid neoplasms.”In:American Joint Committee on Cancer.:AJCC Cancer Staging Manual.第6版,New York,NY:Springer,2002,pp 393-406)。已显示利妥昔单抗在治疗无痛和滤泡性淋巴瘤上是有效的(Boye等人,Annals of Oncol. 14:520-535,2003)。
可在体内测量IL-21和抗CD20抗体对产生自人血液恶性肿瘤的肿瘤细胞的生长和扩散的活性。已发展了几个小鼠模型,在所述小鼠模型中,人肿瘤细胞被移植入免疫缺陷性小鼠(一起被称为异种移植物模型);参见,例如,Cattan等人,Leuk.Res. 18:513-22,1994和Flavell,Hematological Oncology 14:67-82,1996。疾病模型的特征随被转移至小鼠的细胞的种类和数量的不同而不同,在本领域已知几种疾病模型。例如,可使用本领域技术人员已知的模型,用MAbs和IL-21治疗在SCID小鼠中生长和扩散的人B细胞淋巴瘤(例如RL,Raji,TU2C)以延长存活时间。关于示例性模型,参见,Funakoshi等人,J.Immunotherapy 19:93-101,1996;Funakoshi等人,Blood 83:2787-94,1994;Cattan等人,Leukemia Res. 18:513-522,1994。可选择地,可移植小鼠B细胞淋巴瘤细胞系(A20,BCL,A31)和用MAbs和IL-21对其进行治疗以延长存活时间(French等人,Nat.Medicine 5:548-553,1999;Tutt等人,J.Immunol. 161:3176-3183,1998)。在一个模型中,将肿瘤细胞(例如Raji细胞(ATCC No.CCL-86))培养传代,将大约1X106个细胞经静脉内途径注射入严重的合并型免疫缺陷(SCID)小鼠。这些肿瘤细胞在动物体内快速繁殖,可发现其在血液中循环和移居至许多器官系统。通过给带肿瘤细胞的小鼠施用IL-21和MAbs来检验这样的疗法,该疗法经设计使用IL-21和抗CD20MAbs来杀死或减少肿瘤细胞生长。测量治疗的功效,以一段时间内在受治疗的群体中增加的存活率来在统计学上评估治疗的功效。也可使用熟知的方法例如流式细胞仪(或PCR)在一段时间内来监控肿瘤负荷,对存在于外周血样品中的肿瘤细胞的数目进行定量。
可用于证明使用IL-21和抗CD20MAbs的组合疗法的功效的模型包括去除B细胞的非人灵长类动物模型。例如,通过用载体、0.05mg/kg或10.0mg/kg利妥昔单抗处理短尾猴(Cynomolgus monkey),各种B细胞CD20、CD40和CD21群体经鉴定在研究抗CD20治疗剂上非常有用(Vugmeyster等人,Internat.Immuno l. 3:1477-1481,2003)。
无痛疾病的利妥昔单抗疗法通常由4次每周一次375mg/m2的输注组成。开始时的输注率是50mg/hr,然后以每30分钟50mg的增率逐渐增加至400mg/hr的最大值(McLaughlin等人,Clinical Oncol. 16:2825-2833,1998)。然而,已显示8周的延长治疗在治疗难治愈的或复发性的低级NHL或滤泡性NHL上具有一定的功效(Piro等人,Ann. Oncol. 10:619-621,1999)。
使用多种方法为IL-21和抗CD20MAb组合疗法建立最佳剂量水平和给药方案,包括组合的药物动力学和药物代谢动力学、人B细胞淋巴瘤细胞系和原发性淋巴瘤样品在体外对IL-21和抗CD20MAbs的组合的敏感性、动物模型中有效的剂量以及组合的毒性。可在灵长类动物中进行直接的药物动力学测量。此外,IL-21和抗CD20MAb刺激各种正常淋巴细胞内的反应,这样,可在正常的动物模型中测量临床功效。另外,可使用替代标志在患者中测量IL-21和抗CD20MAb的组合对效应器细胞的生物学活性。替代标志包括,但不限于,B细胞群体的显著减少,NK细胞群体的增加,单核细胞/巨噬细胞的激活,FcRIII的增加、在抗-CD20抗体存在的情况下NK或T细胞对CD20+细胞的毒性的增加。替代标志作为功效的指示剂是有价值的,因为治疗性肿瘤反应例如存活时间的增加可能需要数月至数年的时间确定。
使用研究安全性和有效性的临床研究验证使用IL-21和利妥昔单抗的组合的淋巴瘤例如NHL或慢性原淋巴性白血病(CLL)的治疗。首先,在第I阶段研究中验证安全性,该研究阶段是剂量的开放标签(open-label)研究,在该研究中逐渐增加剂量直至最大耐受剂量(MTD)或最佳免疫剂量被确定。最佳免疫剂量被鉴定为获得最佳免疫反应的IL-21的剂量或IL-21+单克隆抗体的剂量。最佳免疫反应是指在施用IL-21或IL-21+MAb组合后的免疫反应上的变化,该变化超过单独施用MAb时观察到的免疫反应上的变化,可如此处所描述的,测量最佳免疫反应。
最初的第I阶段研究的参与者是患有复发性或难治愈的CD20+NHL的受治疗者。在标准的3+3剂量增加方案中,在3至6个受治疗者的群体中估量剂量的增加。在第4周结束前就任何剂量限制性毒性(DLT)的发生评估由3个受治疗者组成的组。在DLT不存在的情况下,剂量增加。如果观察到3个受治疗者中的一个具有剂量限制性毒性,那么在该剂量水平上招募另外3个受治疗者。如果在给定的组中超过1个受治疗者经历了剂量限制性毒性,那么减少剂量,以安全监察委员会(SafetyMonitoring Committee)(SMC)确定的中等剂量治疗3个受治疗者。剂量可以在引起DLT的剂量和下一个较低的剂量之间。如果3个受治疗者中在中等剂量上没有1个经历DLT,那么停止招募,该中等剂量被称为MTD。如果3个受治疗者中≥1个在中等剂量上经历DLT,那么停止招募,低于该剂量的剂量水平称为MTD。
每周一次连续4或8周以375mg/m2经静脉内(IV)途径给受治疗者施用利妥昔单抗。通过IV、肌内(IM)或皮下(SC)施用途径注射提供IL-21。以至少1μg/kg给第一组施用,剂量以逐步的方式逐渐增加至MTD或最佳免疫剂量,例如从3-10、10-100、100-300、300-500、500-900和增加至高达1000μg/kg,从每周一次增加至每周5次。本发明提供了IL-21组合物,其中各剂量在大约1μg/kg至1000μg/kg的范围内。在某些实施方案中,IL-21的剂量在10至300μg/kg范围内。
使用肿瘤反应评估主要的临床活性。为评估抗肿瘤反应,使用例如针对非何杰金氏淋巴瘤的International Workshop to StandardizeResponse Criteria(Cheson等人,J.Clin.Oncol. 17:1244-1253,1999)在第4、8和12周进行再分期。I L-21的药物代谢动力学标志用作临床活性的第二指标。
使用不良事件和标准安全实验室评估来评价安全性。进行抗IL-21的抗体的血清分析以确定免疫原性。
使用Common Terminology Criteria for Adverse Events(CTCAE)第3版(日期为2003年12月12日)将剂量限制性毒性定义为下列的任一种:
·可能或明确地和研究试剂相关的任何第4级或第5级不良事件
·非血液方面第3级不良事件,所述事件可能或明确地涉及研究试剂,但是排除那些与少于7天持续时间的淋巴细胞减少、肿瘤发红、发烧、不适或无生命威胁的第3级实验室异常相关的。
在II期和III期临床研究中进一步评估功效和安全性。在这些研究中,可表征另外的药物动力学、药物代谢动力学、遗传药理学(pharmacogenetics)、药物基因组学、免疫原性。根据针对非何杰金氏淋巴瘤的International Workshop to Standardize ResponseCriteria(Cheson等人,同上)和根据管理指南确定第一终点(primaryendpoint)。第二终点可包括不良事件的发生率和严重度、进程的时间、完全反应者的复发的时间、总存活数和针对IL-21的任何抗体的发生率。研究可以是随机的、对臂研究(two-arm study),该研究在不能耐受或不接受化学疗法的患者中比较利妥昔单抗单一疗法和利妥昔单抗和IL-21的组合疗法。受治疗者将接受连接4周或8周、每周一次的经静脉内(IV)途径施用375mg/m2利妥昔单抗。以在同一天相继输注的方式经静脉内或皮下途径施用IL-21,给药长达连续5天,IL-21的剂量在1-3、3-10、10-100、100-300、300-500、500-900和高达1000μg/kg的范围之内。可选择地,可进行随机的三臂研究,使用试验设计的类似标准来评估IL-21和利妥昔单抗的组合对单独的IL-21对单独的利妥昔单抗的安全性和有效性。临床试验设计对于本领域技术人员来说是熟知的,由食品与药品管理局(FDA)提供指导,例如在FDAOncology Tools网址上提供指导。
在IFN-γ产物的细胞毒性和增殖性方面(Parrish-Novak等人,J. Leuk.Biol. 72:856-863,2002),IL-21和IL-15或IL-2在体外对NK细胞的影响上表现出协同作用。然而,高剂量的IL-2治疗是高度毒性的并且需要悉心的住院治疗。已对许多IL-2的低剂量方案进行了检验,发现具有更好的耐受性,但只显示很低的抗肿瘤功效(Atkins,Semin. Oncol. 29(3Suppl.7):12,2002)。WO 03/049694中描述了IL-2和利妥昔单抗的组合疗法,其中以更高的“起始”剂量施用IL-2,然后以一种或更多种更低的“维持”剂量施用IL-2。对IL-2的继续给药的需要基于维持比正常水平更高的NK细胞水平,但由于IL-2的毒性的原因,可要求其中不施用IL-2的休息期。抗CD20MAbs和IL-2和IL-21的组合的施用可维持NK细胞和允许IL-2的更低剂量或更少频率的给药。当已施用IL-21时,没有显示在高剂量IL-2的情况下看到的某些副作用。例如,当在报道的在小鼠中导致血管渗漏综合征的IL-2的剂量和给药方案下给小鼠施用IL-21时,不存在血管渗漏综合征。结果清楚地显示IL-21不会在小鼠中引起和基于相等质量的r IL-2剂量相关的细胞因子释放和血管炎(Heipel等人,Blood 102(11):No.2845,2003)。因此,低剂量IL-2和IL-21以及抗CD20MAbs的组合可具有临床用途的原因在于其增强了低剂量IL-2的免疫系统刺激而不产生由更高的IL-2剂量造成的某些副作用。
使用本发明的方法施用IL-21和抗CD20MAb s例如利妥昔单抗的组合,将导致抗肿瘤效应,也称作肿瘤抑制作用。评估对NHL的治疗的反应的标准指导方针对本领域技术人员来说是熟知的。Cheson等人,J. of Clinical Oncol. 17:1244-1253,1999中描述了示例性的成套统一标准。国际工作小组(The International Working Group)提出了反应测量的建议和定义。表2概述了反应标准。
表2
也可使用替代标志指示增强的抗肿瘤活性。例如,血清中酶的变化和活组织检查可显示肿瘤负荷的减少。
可用作抗肿瘤作用的替代标志的生物学活性的一个量度是在这样的水平上的NK细胞水平的维持,在该水平上,NK细胞增强抗CD20MAb的抗肿瘤作用(Friedberg等人,Br.J.Hematol. 117:828-834,2002)。另一种替代是T细胞数量的增加(Parrish-Novak等人,同上,2002)。特别地,T细胞亚群的增加的数量已和增加的细胞毒性活性或抗肿瘤效应关联。可用作抗肿瘤作用的替代的生物学活性的另一种量度是B细胞的去除(Reff等人,Blood 83:435-445,1994)。
2.IL-21和抗Her-2/neu单克隆抗体在组合疗法中的应用
Her-2/neu基因产物是185kDa、和表皮生长因子受体关联的磷酸糖蛋白。Her-2/neu用作生长因子受体,其通常由肿瘤例如乳腺癌、卵巢癌和肺癌表达。Her-2/neu受体在25-30%的人乳腺癌中过量表达(Slamon等人Science 235:177-182,1987;Slamon等人,Science 244:707-712,1989),并和这些患者中的预后不良相关。
有许多靶向Her-2/neu的单克隆抗体,但即曲妥单抗(Genentech,Inc.,San Francisco,CA)的商品名,是目前唯一经批准用于治疗Her-2/neu阳性癌症患者的治疗剂。在许多正常细胞类型中发现少量Her-2/neu,癌细胞已改变表达,导致过量表达、与癌症细胞表型相关的增加的细胞增殖和分化。然而,使用曲妥单抗的成功的治疗要求Her-2/neu的表达是高度过量表达。可使用经固定的和经免疫组织学染色的活组织检查样品来确定Her-2/neu的表达水平。这些种类的测定法在本领域是熟知的,其包括使用4D5单克隆抗体(LabCorp,Research Triangle Park,NC)、(DAKO,Glos trup,Denmark)和Vysis PathVysionTMHER-2DNA Probe试剂盒(FujisawaHealthcare,Inc.,North Deerfield,IL)的免疫组织化学评估。Her-2/neu的水平一般是0(正常)至3+,已显示曲妥单抗疗法对具有2+或更高表达水平的患者是有效的。
已证明(例如,实施例6)IL-21在体外和体内模型中都促进免疫效应器T细胞和NK细胞中的裂解活性,所述模型使用表达更高或更低的Her-2/neu受体水平的人乳腺癌细胞系。IL-21介导的增强的效应器功能导致即使在癌细胞表达更低Her-2/neu受体的水平时,曲妥单抗疗法仍然有效。例如,用IL-21和曲妥单抗治疗的具有1+或2+过量表达水平的患者将是接受治疗的候选者,该治疗为以前未接受治疗的患者群体提供了有价值的疗法。可使用负荷Her-2/neu表达性鼠癌的小鼠检验IL-21和抗Her-2/neu MAbs的组合(Penichet,等人,Lab Anim.Sci. 49:179-188,1999)。
尽管各方案在定义肿瘤反应评估法上可能存在差异,但可在Clinical Research Associates Manual,Southwest Oncology Group,CRAB,Seattle,WA,October 6,1998,updated August 1999中发现示例性指导方针。根据CRA Manual(参见,第7章“ResponseAccessment”),肿瘤反应是指所有可测量的病灶或转移的减少或消除。如果疾病包含二维的可测量的病灶,该病灶具有通过医学照片或X射线、计算机控制轴向断层扫描术(CT)、磁共振成象(MRI)或触诊明确确定的边界,那么该疾病一般被认为是可测量的。可估值的疾病是指疾病包含在一维上可测量的病灶、具有模糊界定的边界的肿块、两条直径都小于0.5cm的病灶、在扫描中任一直径小于切口之间距离的病灶、直径小于2cm的可触诊的病灶、或骨病。不可估值的疾病包括胸腔积液、腹水和通过间接证据证明的疾病。以前照射的、没有发展的病灶通常也被认为是不可估值的。
确定实体癌反应的方案需要客观状态的标准。代表性的标准包括下列:(1)完全反应(CR),定义为所有可测量的和可估值的疾病的完全消失。无新的病灶。无疾病相关症状。无不可估值的疾病的证据;(2)部分反应(PR),定义为在所有可测量的病灶的垂直直径的乘积的和上和基线相比,大于或等于50%的减少。无可估值的疾病进展。无新的病灶。用于具有至少一种可测量的病灶的患者;(3)进展,定义为在可测量的病灶的乘积的和上超过使用和基线中所用的技术相同的技术观察到的最小的和50%或10Gm2的增加、或任何可估值的疾病的明显恶化、或任何已消失的病灶的复发、或任何新的病灶的出现、或由于死亡或恶化状况(除非与该癌症无关)导致的不能对评估作出回答(return);(4)稳定的或无反应性,定义为不符合CR、PR或进展的状况。(参见,Clinical Research Associates Manual,同上)
通过下列非限定性实施例进一步举例说明本发明。
实施例
实施例1
IL-21增强抗体依赖性NK细胞活性
A.
获取外周血,通过菲可离心(ficoll centrifugation)制备单核细胞(MNC’S)。使用StemSepTM Human NK Cell Stem CellTechnologies (Vancouver,British Columbia)human NK cellnegative enrichment试剂盒,通过负富集从MNC群体中纯化天然杀伤(NK)细胞。简而言之,用谱系特异性抗体(不包括NK谱系)标记MNC,依次对其进行磁性标记。然后将标记的MNC通过磁柱,其中标记的细胞被保留,而非标记的NK细胞则流过磁柱。
以5x105细胞/mL的密度将NK细胞涂板,在αMEM/10%自体血清/50μMβ-巯基乙醇和0、1、10或100ng/mL hIL-21(A794F)或10ng/mL IL-12(阳性对照)中培养3天,所有事件都在Fc刺激存在或不存在的情况下进行。通过在37℃将100μg/mL PBS中的hIgG涂板在塑料板上进行1小时,然后除去PBS/抗体溶液,将NK培养在该表面来提供Fc刺激。在3天培养期后,收集上清液。使用BD OptEI A human IFN-γELISA试剂盒(BDBiosciences,SanJose,CA)对上清液中的IFN-γ进行定量。以直方图的形式绘制结果,表示为每样品ng/mL IFN-γ。
在Fc刺激存在的情况下,IL-21在IFN-γ产量上产生剂量依赖性增加。在本实验中受试L-21的最大剂量(100ng/mL)上,存在超过背景大约18倍的增加。在Fc刺激不存在的情况下,在IL-21存在的情况下,IFN-γ的产量没有增加。
B.
通过白细胞分离法从捐献计划(donor program)中获得外周血白细胞。通过菲可离心从血液成分部分清除的血液(apheresed blood)制备单核细胞(MNC’s)。使用Stem Cell Technologies human NK cellnegative enrichment试剂盒,通过负富集作用从MNC群体纯化天然杀伤(NK)细胞。简而言之,用谱系特异性抗体(不包括NK谱系)标记MNC,依次对其进行磁性标记。然后将标记的MNC通过磁柱,其中标记的细胞被保留,而非标记的NK细胞则流过磁柱。
在0.2、1、5、25或100ng/mL人IL-21存在或不存在的情况下,以1x106/mL的密度将NK细胞涂板并在αMEM/10%热失活的人AB血清/50μM β巯基乙醇/ITS(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA)/150μg/ml补充的转铁蛋白/5mg/mL BSA中培养1、2、4、6或7天。在各培养期结束时,收获NK细胞,洗涤细胞、对细胞计数,使用淋巴瘤细胞系(Ramos,CRL 1596,American Type Culture Collection,Manassas,VA)作为细胞裂解靶,将NK细胞置于抗体依赖性细胞毒性裂解(ADCC)测定中。测定前,通过在37℃下在含有5%FBS(HBSSF)和10μM钙黄绿素AM(Molecular Probes,cat no C1430)的Hanks缓冲盐溶液(不含Ca或Mg)中温育60分钟来标记靶细胞。靶细胞吸收了荧光染料(钙黄绿素AM)并在细胞质中将其转变成活性荧光染料,该染料只在细胞裂解后才从细胞中释放。裂解的细胞将荧光染料释放入上清液中,然后收获上清液,在荧光计中对荧光进行定量。在不同量的NK细胞(效应器)存在或不存在的情况下温育3小时后,根据存在于上清液中的荧光量计算出细胞裂解的百分比。为进行ADCC测定法,使用未加入抗体的靶、靶和1μg/mL无关的IgG、或靶和1μg/mL利妥昔单抗。
检验2个供体。将供体A NK细胞培养在0、1、5、25或100ng/mL人工L-21中,时间点为第1、2、3、4和7天。将供体B NK细胞培养在0、0.2、1、5或25ng/mL人IL-21中,时间点为第1、2、3、4、6和7天。当和无关的I gG对照相比,在利妥昔单抗存在的情况下,在两个供体中都存在抗靶细胞的细胞裂解活性的增强(3-10倍)。当在测定前在IL-21存在的情况下培养NK细胞时,细胞裂解活性上的该增强获得进一步增加(2-10倍)。
但供体A培养物显示,在受试IL-21的剂量中(1、5、25或100ng/mL),除了第7天(1ng/mL IL-21NK培养物具有显著低于其他剂量的ADCC增强活性)外,在ADCC的增加上没有显著差异。但供体B培养物显示,在第4天以前(和继续通过剩余的时间点)在受试IL-21的剂量中(0.2、1、5或25ng/mL),在ADCC的增强上没有显著差异,但是在第4天,包含0.2ng/mL IL-21的培养物具有显著低于其他受试IL-21剂量的ADCC增强活性。在所有受试时间点上,两个供体都显示了IL-21ADCC的增强,相对于无关的IgG,最大增强出现在第6或第7天。
C.
如实施例1A中所述从捐赠计划中获得外周血。以8.1-11x105/mL的密度将NK细胞涂板,在20ng/mL人IL-21存在或不存在的情况下,在αMEM/10%自体血清/50μM β巯基乙醇中培养3天。在培养期结束时,收获NK细胞,洗涤细胞、对细胞计数,将NK细胞用于抗体依赖性细胞毒性裂解(ADCC)测定法,使用淋巴瘤细胞系DOHH2(Kluin-Nelemans,H.C.等人Leukemia 5:221-224,1991;Drexler,H.G.等人,DSMZ Catalogue of Cell Lines,第7版,Braunschweig,Germany,1999)作为细胞裂解靶。在测定前,通过在37℃下在含有5%FBS(HBSSF)和25μM钙黄绿素AM(Molecular Probes)的Hanks缓冲盐溶液中温育30分钟来标记DOHH2细胞。靶细胞吸收了荧光染料(钙黄绿素AM)并通过细胞质将其转变成活性荧光染料,该染料只在细胞裂解后才从细胞释放。裂解的细胞将荧光染料释放入上清液中,然后收获上清液,在荧光计中对荧光的量进行定量。在不同量的NK细胞(效应器)存在或不存在的情况下温育3小时后,根据存在于上清液中的荧光量计算细胞裂解的百分比。为进行ADCC测定法,使用未加入抗体的靶、靶和2μg/mL无关的IgG、或靶和0.002、0.02、0.2或2μg/mL利妥昔单抗。
结果产生自两个供体,表示为效应器∶靶(E∶T)比例和裂解百分比。当和未加入抗体的或加入无关的I gG对照相比,在2μg/mL利妥昔单抗存在的情况下,在两个供体中,抗DOHH2细胞的细胞毒性活性得到明显增强(在E∶T=3时,6-11倍)。在2μg/mL和0.2μg/mL下,利妥昔单抗的增强作用相同,在0.02μg/mL时,在最高的受试E∶T(4或6)下,增强开始减少,在0.002μg/mL时,在所有受试E∶T下,增强显著更低。当NK细胞在细胞裂解测定前,在IL-21存在的情况下培养3天,利妥昔单抗依赖性细胞裂解活性的增强作用在所有受试利妥昔单抗剂量上获得增加(在E∶T=3时超过利妥昔单抗增加的活性1.5-3倍)。
实施例2
IL-21在人NK细胞中上调粒酶B的表达
使用磁珠分离试剂盒(Miltenyi Biotech,CA),通过负选择从经Ficoll-Paque纯化的单核细胞中分离人NK细胞。然后单独地在培养基中或在20ng/mL人 IL-21存在的情况下在培养基中培养纯化的NK细胞。收获细胞、洗涤细胞,然后用表面标志物对细胞进行染色。在表面标志物染色后,洗涤细胞,然后用Cytofix/CytopermTM缓冲液(BDBiosciences,San Jose,CA)透化细胞20分钟。然后用Perm/Wash缓冲液中的APC标记的抗人粒酶B抗体或同种型对照抗体(Caltag,Burlingame,CA)对细胞进行染色。洗涤细胞,然后在FACSCaliburTM流式细胞仪上读数。使用CellquestTM软件(BD Biosciences)分析数据。
图1显示,在IL-21存在的情况下温育人NK导致在粒酶B(NK细胞杀伤的重要介导者)的表达上产生巨大的增加。这表明,通过上调粒酶B,IL-21增强了NK细胞杀死其靶细胞的能力。
实施例3
IL-21+利妥昔单抗增加了用HS Sultan淋巴瘤细胞注射的小鼠的
存活率
进行研究以评估在这样的CB-17SCID小鼠中,肿瘤的生长是否被延缓,所述小鼠是用HS-Sultan细胞注射的、经利妥昔单抗、小鼠IL-21(mIL-21)或mIL-21和利妥昔单抗的组合处理的小鼠。设计研究以表征各处理组中负荷HS-Sultan的小鼠的存活率。
所述实验方案和本领域已知的实验方案(参见,Cattan等人Leuk Res. 18(7):513-522,1994;Ozaki等人,Blood 90 (8):3179-86,1997)相似。给CD17-SCID小鼠施用20μg的利妥昔单抗(每4天给一次药,总共5次注射)、100μg mIL-21(进行5天给药)或通过腹膜内途径注射施用利妥昔单抗和mIL-21的组合(每次处理给药5次)。
就濒死或非存活的病症例如麻痹或快速体重减轻监控小鼠。在研究期间,每周两次采集体重。记录所有小鼠的存活时间,通过绘制卡普兰-迈耶存活曲线和计算对数秩统计量(log rank statistics)(Statview,SAS Institute,Cary,NC)来比较处理组之间的存活时间。
使用下列组:
组1(n=10)从第1天开始,每4天20μg利妥昔单抗,总共5次注射。
组2(n=10)从第3天开始,每4天20μg利妥昔单抗,总共5次注射。
组3(n=10)从第6天开始,每4天20μg利妥昔单抗,总共5次注射。
组4(n=10)第1-5天,通过腹膜内途径施用载体对照(PBS)。
组5(n=10)从第1天开始,每天通过腹膜内途径施用100μgmIL-21,进行5天。
组6(n=10)从第1天开始,每天施用100μg mIL-21,进行5天,从第3天开始,每4天20μg利妥昔单抗,总共5次注射。
将小鼠(雌性,C.B-17SCID,9周大小;Harlan,Madison,WI)分成6组。在第0天,从培养物中收获HS-Sultan细胞(ATCC No.CRL-1484),通过尾静脉,将其经静脉内途径注射入所有小鼠(每只小鼠1,000,000细胞)。然后使用上面的处理组描述中所描述的剂量和给药方案用利妥昔单抗、mIL-21或这两种试剂的组合处理小鼠。以0.1mL的体积通过腹膜内注射进行所有处理。
在用利妥昔单抗处理的小鼠的组中,当在第1天或第3天而不是第6天开始给药时,观察到显著的存活益处。单独的鼠类I L-21没有给荷瘤小鼠提供存活益处。用mIL-21(100ug/天,第1-5天)和利妥昔单抗(20ug/天,第3、7、11、15、19天)的组合处理的小鼠具有高度显著的存活益处(P<0.0001,和载体对照相比,P<0.02;和第3天开始的利妥昔单抗相比;Logrank检验)。在研究的第120天,和只施用利妥昔单抗的组中的20%的累积存活率相比,mIL-21+利妥昔单抗组中的累积存活率为70%。
实施例4
IL-21+利妥昔单抗增加用Raji肿瘤细胞注射的小鼠的存活率
进行研究以评估在这样的CD-17SCID小鼠中,肿瘤生长是否被延缓,所述小鼠是用Raji细胞注射的、经利妥昔单抗、mIL-21或mIL-21和利妥昔单抗的组合处理的小鼠。设计研究以表征各处理组中负荷Raji的小鼠的存活率。
实验方案描述于实施例3中。
使用下列组:
组1(n=8)第3-7天,通过腹膜内途径施用载体对照PBS。
组2(n=8)从第1天开始,每天通过腹膜途径施用100μg mIL-21,进行5天。
组3(n=8)从第3天开始,每天100μg mIL-21,进行5天。
组4(n=9)从第3天开始,每4天20μg利妥昔单抗,总共5次注射。
组5(n=9)从第5天开始,每4天20μg利妥昔单抗,总共5次注射。
组6(n=9)从第1天开始,每天经腹膜内途径注射100μg mIL-21,从第3天开始,每隔4天20μg利妥昔单抗,总共5次注射。
组7(n=9)从第3天开始,每天经腹膜内途径注射100μg mIL-21,进行5天,从第5天开始,每4天20μg利妥昔单抗,总共5次注射。
将小鼠(雌性,C.B-17SCID,9周大小;Harlan,Madison,WI)分成7组。在第0天,从培养物中收获Raji细胞(ATCC No.CCL-86),通过尾静脉将其经静脉内途径注射入所有小鼠(每只小鼠1,000,000细胞)。然后使用上面的处理组描述中所描述的剂量和给药方案用利妥昔单抗、mIL-21或这两种试剂的组合处理小鼠。以0.1mL的体积通过腹膜内注射进行所有处理。
在用利妥昔单抗处理的小鼠的组中,当在第3天或第5天开始给药时,观察到显著的存活益处。单独的鼠类IL-21没有给荷瘤小鼠提供存活益处。用mIL-21(100ug/天,第3-7天)和利妥昔单抗(20ug/天,第5、9、13、17、21天)的组合处理的小鼠具有高度显著的存活益处(P<0.0001,和载体对照相比;P<0.03,和第5天开始的利妥昔单抗相比;Logrank检验)。在研究的第100天,和只施用利妥昔单抗的组中的10%的累积存活率相比,mIL-21+利妥昔单抗组中累积存活率为55%。
实施例5
非人灵长类动物中的IL-21+利妥昔单抗研究
通过静脉内途径给由3只雄性短尾猴组成的组群共施用利妥昔单抗和rIL-21,进行由每个给药周期1周组成的3个给药周期。在给药的第2个周和第3个周之间有1周没有给药。在各给药周期的第1天施用利妥昔单抗,从各给药周期的第1天开始,施用rIL-21,进行3天。给药的例外是用对照药品0.9%氯化钠给药的对照组,只用利妥昔单抗给组3给药,组2只接受rIL-21。只在各给药周期的第1天用rIL-21给组5给药,然而总的周剂量和接受rIL-21的其他组的剂量相等。用rIL-21经皮下而不是经静脉内给组7给药。在第3个给药周期期间没有给组4给药;在第10天接受最后的给药。对于所有其他组,最后的给药是在第24天。使用静脉内注射,注射入头部静脉、隐静脉或其他合适的静脉;皮下注射,注射入肩胛区域或其他合适的位点来给动物施药。
表3
研究日程表和组
a在使用rIL-21和Rituxan共施用的组中,在rIL-21之前施用Rituxan。
b基于最近的体重计算单个动物的给药体积(mL)。将剂量体积四舍五入至注射器的下一个稍大的读数。
c施用Rituxan剂量后,再用3.0ml/kg的盐水冲洗。
使用流式细胞仪分析外周血细胞亚型。在第8天的适应期间一次,在第1、8和22天给药前和给药后6小时,将大约1.3ml收集的血液置于用EDTA-2K处理的管中。在第3、10和24天采集给药前的样品。在第7、14、17和42天采集样本一次。将大约0.5ml的样品等分以用于血液学分析,剩下的样品保持在室温下直至进行流式细胞仪分析。
在第8和第4天的适应期,将大约2.0ml全血收集入装有肝素锂的管中。也在第3、10、22和24天给药之前收集样品,和在第7天和第14天采集样本一次。将样品贮存在室温下直至进行流式细胞仪分析和ADCC活性分析。
表4
IL-21处理对循环的白细胞的表型和数量具有明显的作用。在用IL-21处理后很短的时间内,所有淋巴细胞群体减少。B细胞比T细胞和N细胞恢复更快。在给药后4-6天,T细胞恢复至基线水平,在第二轮IL-21处理后4-6天,T辅助细胞稍微提高。NK细胞在所有组中都降低,只在给药周期之间部分恢复。在IL-21处理后,循环的单核细胞的数量增加,单核细胞和粒细胞都增加Fc受体的表达。
A.淋巴细胞效应
利妥昔单抗的亚临床剂量在给药的6小时内将循环的B细胞的数量减少至最低值,比基线下降70%。单独使用rIL-21的处理一开始减少循环的B细胞、T细胞和NK细胞,然后在第二次给药周期之前,持续地增加和溶解。基于淋巴细胞减少的快速逆转和以前的使用rIL-21的淋巴样滤泡去除的观察资料,该效应解释为增加的从淋巴组织至血液的循环和激活的淋巴细胞的短暂迁移(margination)。外周B细胞的增加在用rIL-21和利妥昔单抗处理的动物中大大减少,相对于单独用利妥昔单抗或rIL-21处理的组,观察到相应的更低的B细胞最低值。利妥昔单抗处理不改变由rIL-21诱导的其他淋巴细胞亚型中的变化。
B.ADCC效应
通过菲可密度梯度制备MNC制剂。在本研究的过程中,就免疫表型和离体ADCC活性表征来自所有经处理的动物的MNC制剂。在测定前,用钙黄绿素AM装载靶细胞,以在3小时温育期间细胞内染料的特异性释放作为测定终点。
用rIL-21处理短尾猴导致外周血中NK细胞计数上的改变和MNC制剂中NK细胞的百分比改变。最初,在处理后,NK细胞减少,在给药周期之间朝向基线方向减少。
来自用IL-21、或利妥昔单抗和rIL-21一起处理的短尾猴的MNC,和来自载体对照和只用利妥昔单抗处理的动物的MNC相比,显示增加的离体ADCC活性。在第3天的裂解活性较低,这与MNC制剂中非常少的NK细胞关联。在第7和第10天,在rIL-21处理的动物中ADCC增加超过基线,在用rIL-21+利妥昔单抗处理的动物中观察到类似的趋势。尽管MNC制剂中存在较少数量的NK细胞,但在第14天每个NK细胞的裂解活性仍然保持着。
表10
NK细胞,表示为总MNC制剂中的百分比
C.其他终点
在rIL-21给药后,可溶性IL-2R α(sCD25)即免疫活化标志,迅速增加,细胞内穿孔素即裂解性粒酶,较慢地增加,在第二次剂量给药间隔后具有最高的表达。在单核细胞和粒细胞中FcγRI(CD64)和FcγRIII(CD16)都被上调。
通过流式细胞仪测量MNC制剂中的穿孔素。为测量s CD25,在第8天适应期间和第17、29、37和42天收集血液一次。也在第1、8和22天给药前、给药后5分钟、30分钟、2小时和6小时采集血液。在第3、10和24天,在给药后30分钟采集血液。
将大约0.75ml的血液转移至SST凝结管中。使样品在室温下凝结大约40-60分钟。通过离心(在2-8℃下、2000x g下进行大约15分钟)获得血清,将血清在-70℃下冷冻贮存。使用鼠类单克隆抗sCD25的抗体捕获存在于血清中的可溶性CD25,用生物素化的山羊多克隆抗sCD25的抗体检测。链霉抗生物素蛋白-HRP和底物TMB允许对存在于样品和标准中的sCD25进行比色定量。
实施例6
IL-21和曲妥单抗介导的对表达Her-2/neu的乳腺癌细胞系的杀
伤
A.
从捐赠计划中获得200mL人血液。将180mL血液收集在柠檬酸葡萄糖管中,将来自相同供体的20mL收集在凝结管(BD Biosciences)中。将凝结管中的血液在2800rpm下离心30分钟。从上部收集血清并将其用于培养基(参见下面)。将ACD管中的180mL血液汇合,在磷酸盐缓冲溶液(PBS)、2%牛血清白蛋白(FBS)中以1∶2稀释。将30mL的血液等分放入50mL的管中。12mL Ficoll-Paque PLUS(AmershamBiosciences)在各50mL管的血液的底部铺层。在1800rpm下离心成管的血液30分钟。从各50mL管收集棕黄层界面并混合在一起。用总共100x细胞体积的PBS,2%FBS洗涤混合物2-3次。将最终洗涤的沉淀重悬浮于2mL PBS,2%FBS中。在血细胞计数器上对细胞进行计数。
在37℃下,在加入或不加入20ng/mL人IL-21的情况下,将如上所述纯化的MNC细胞以.5x106细胞/mL在含有4%自体血清的SFComplete(αMEM和核苷,50μMβ-巯基乙醇,1∶100胰岛素,transferring,硒母液(Invitrogen),150μg/mL其他转铁蛋白,5mg/mL牛血清白蛋白)中培养4天。第4天,收获细胞,在血细胞计数器上进行计数,在含有5%胎牛血清(FBS)的Hank’s缓冲盐溶液(不含Ca或Mg的HBSS,现称为HBSSF)中进行洗涤。将细胞沉淀重悬浮于HBSSF,达到.5x106细胞/mL的密度。
在37℃下用10μM HBSSF中的钙黄绿素标记乳腺癌靶细胞系1小时,包括BT-474(ATCC No.HTB-20)、SK-BR-3(ATCC No.HTB-30)或MCF-7(ATCC No.HTB-22)。然后在1100rpm下在10倍体积的HBSSF中洗涤靶8分钟。将细胞沉淀重悬浮于HBSSF中,达到50,000细胞/mL。将如上所述用或不用人IL-21预处理4天的MNC效应器细胞在1100rpm下离心8分钟,将细胞沉淀重悬浮于HBSSF中,达到大约.5x106细胞/mL。将效应器在96孔圆底板中以1∶3进行系列稀释,重复两份。在2μg/mL人IgG、或2.5μg/mL曲妥单抗存在的情况下向各小孔中加入100μl靶。在500rpm下离心96孔板3分钟。将板在37℃下温育3小时,然后在1000rpm下离心5分钟。将来自各孔的100μl上清液转移至96孔平底板中,在Wallac荧光计(Wallac)上在485/535处,使用1秒的间隔读数。
和高水平表达Her-2/neu抗原的BT-474细胞系相比,MCF-7乳腺癌细胞系以低水平表达该抗原。在上述的ADCC测定法中,当以效应器∶靶(E∶T)为3的比例使用MCF-7靶时,在该测定中,在曲妥单抗存在的情况下未处理的效应器具有不超过使用IgG的未处理的效应器的细胞裂解活性。在曲妥单抗存在的情况下,在E∶T为10的情况下,用IL-21预处理的效应器具有超过未处理的效应器4倍的细胞裂解活性。在E∶T为10时,在IgG存在的情况下,经IL-21预处理的效应器在细胞裂解活性上超过未处理的效应器0.5倍。当BT-474细胞为靶时,在曲妥单抗存在的情况下,在E∶T为10时,测定中,和未处理的并处于I gG存在的情况下的效应器相比,未处理的效应器在细胞裂解活性上具有7倍的增长。在E∶T为10时,IL-21预处理增强该细胞裂解活性2倍。这些结果支持这样的事实,即MCF-7细胞系是低抗原表达者,因为单独的曲妥单抗在增强对该细胞系的效应器细胞裂解活性上无效。单独的曲妥单抗在增强效应器对BT-474靶的细胞裂解活性上有效。IL-21预处理进一步增加了效应器对这两种细胞系的细胞裂解活性。
表18
NK细胞抗乳腺癌靶的ADCC活性。终点是在E∶T比例为3时的裂解百分比。
供体 | 靶 | 对照 | rIL-21预处理 |
A74 | MCF-7 | 11.2943 | 22.71177 |
A74 | SKBr3 | 12.12149 | 39.34667 |
A74 | MCF-7 | 0 | 25.9 |
B202 | HCC1428 | 27.76922 | 54.18124 |
B202 | HCC38 | 27.4133 | 43.12007 |
B202 | HCC38 | 9.00991 | 40.34685 |
B202 | MCF7 | 13.73884 | 45.35621 |
B202 | MCF7 | 8.487321 | 39.9608 |
B202 | MCF7 | 8.739211 | 41.61529 |
B202 | SKBR3 | 28.50026 | 53.7579 |
B202 | SKBR3 | 14.84613 | 26.45897 |
C025 | HCC1428 | 18.60837 | 50.02053 |
C025 | HCC1428 | 14.20742 | 27.40921 |
C025 | HCC38 | 16.89381 | 32.41753 |
C025 | HCC38 | 7.033291 | 28.39438 |
C025 | MCF7 | 14.40028 | 45.16213 |
C025 | MCF7 | 6.009641 | 27.19668 |
C025 | MCF7 | 8.491816 | 23.90491 |
C025 | MCF7 | 11.2943 | 22.71177 |
C025 | SKBR3 | 26.61171 | 48.15062 |
C025 | SKBR3 | 18.33489 | 34.07056 |
C025 | SKBR3 | 12.12149 | 39.34667 |
B.
从捐赠计划中获得200mL人血液。将180mL血液收集在柠檬酸葡萄糖管中,将来自相同供体的20mL收集在凝结管(BD Biosciences)中。将凝结管中的血液在2800rpm下离心30分钟。从上部收集血清并将其用于培养基(参见下面)。将ACD管中的180mL血液汇合,以1∶2在磷酸盐缓冲溶液(PBS)、2%胎牛血清(FBS)中稀释。将30mL血液等分放入50mL的管中。12mL Ficoll-Paque PLUS (AmershamBiosciences)在各50mL管的血液的底部铺层。在1800rpm下离心成管的血液30分钟。从各50mL管收集棕黄层界面并混合在一起。用总共100x细胞体积的PBS,2%FBS洗涤混合物2-3次。将最终洗涤的沉淀重悬浮于2mL PBS,2%FBS中。在血细胞计数器上对细胞进行计数。
将MNC以5-10x 107细胞/mL稀释于PBS,2%FBS中。使用StemCellTechnologies Enrichment of Human NK Cell试剂盒纯化NK细胞。在1100rpm下离心NK细胞8分钟,重悬浮于.5mL PBS、2%FBS中并在血细胞计数器上计数。
将BT-474细胞(ATCC No.HTB-20)在12孔板中以.125x106细胞/mL培养在DMEM(Gibco),10%FBS中,并让其附着3小时。将如上所述纯化的NK细胞在SF Complete(αMEM和核苷,50μM β-巯基乙醇,1∶100胰岛素,transferring,硒贮存液(Invitrogen)150μg/mL其他转铁蛋白,5mg/mL牛血清白蛋白)和4%热失活的人AB血清中稀释至1-2x106细胞/mL。将培养基吸离BT-474细胞,向BT-474细胞中加入2mL稀释的NK细胞,建立共培养。向共培养物中不加入东西、加入2μg/ml曲妥单抗、加入20ng/ml人IL-21或2μg/mL+20ng/ml人IL-21。将共培养物在37℃下温育过夜。在过夜共培养后,收获细胞并在血细胞计数器上进行计数。在HBSSF(参见下面)中洗涤细胞,将细胞沉淀重悬浮于1mL HBSSF。
向100μL HBSSF中的100,000-200,000个NK细胞中加入20μg/mL小鼠γ球蛋白(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.WestGrove,PA)和1∶100缀合的抗体。抗体组合包括CD25FITC、CD56PE、CD16Cychrome和CD8APC(BD Pharmingen)。同种型对照包括100,000至200,000个混合的细胞,所述细胞来自单独地具有各缀合的抗体的NK共培养物。将细胞在黑暗处在4℃下温育30分钟。在PBS,2%FBS中洗涤细胞1次,置于200μL PBS,2%FBS中。加入多聚甲醛至0.2%以固定细胞,将细胞保持在4℃直至准备进行FACS分析。在进行固定的3至4天内在Becton Dickinson FACS Calibur上进行FACS分析。使用Cellquest软件分析流式数据。通过将每mL的细胞数目乘以培养物体积来计算总细胞数目。
在所有4个受试的供体中,当曲妥单抗和IL-21存在于NK细胞和乳腺癌细胞系BT-474的共培养物中时,细胞的CD56+/CD25+群体增加。明确地,当和只具有培养基的共培养物(如上所述)相比,单独的曲妥单抗导致2-20倍的增加,单独的IL-21导致2-4倍的增加,当IL-21和曲妥单抗同时存在时,CD56+/CD25+群体增加4-50倍。在所有供体中,在IL-21和曲妥单抗存在的情况下,CD56+/CD25+群体的增加超过所有其他共培养条件。
C.
从室内(in house)捐赠计划中获得200mL人血液。将180mL血液收集在ACD管中,将来自相同供体的20mL收集在凝结管中。将凝结管中的血液在2800rpm下离心30分钟。从上部收集出血清并将其用于培养基(参见下面)。混合ACD管中的180mL血液,以1∶2在磷酸缓冲溶液(PBS)、2%胎牛血清(FBS)中稀释。将30mL血液等分放入50mL的管中。12mL Ficoll-Paque PLUS(Amer sham Biosciences cat.No.17-1440-03)在各50mL管的血液的底部铺层。在1800rpm下离心成管的血液30分钟。从各50mL管收集棕黄层界面并混合在一起。用总共100x细胞体积的PBS,2%FBS洗涤混合物2-3次。将最终洗涤的沉淀重悬浮于2mL PBS,2%FBS中。在血细胞计数器上对细胞进行计数。
在37℃下,在加入或不加入20ng/mL人I L-21的情况下,将如上所述纯化的MNC细胞以0.5x106细胞/mL在含有4%自体血清的SFComplete(αMEM和核苷,50μMβ-巯基乙醇,1∶100胰岛素,transferring,硒母液(Gibco),150μg/mL其他转铁蛋白,5mg/mL牛血清白蛋白)中培养4天。第4天,收获细胞,在血细胞计数器上进行计数,在含有5%胎牛血清(FBS)的Hank’s缓冲盐溶液(不含Ca或Mg的HBSS,现称为HBSSF)中进行洗涤。将细胞沉淀重悬浮于HBSSF,达到.5x106细胞/mL。
在37℃下用10μM HBSSF中的钙黄绿素标记乳腺癌靶细胞系,包括BT-474或MCF-7。然后在1100rpm下在10倍体积的HBSSF中洗涤靶8分钟。将细胞沉淀重悬浮于HBSSF中,达到50,000细胞/mL。将如上所述用或不用人I L-21预处理4天的MNC效应器细胞在1100rpm下离心8分钟,将细胞沉淀重悬浮于HBSSF中,达到大约0.5x106细胞/mL。将靶在96孔圆底板中按1∶3进行系列稀释,进行双份试验。在2μg/mL人IgG、或10、5、2.5、1.25、.62、.31μg/mL曲妥单抗存在的情况下,向各小孔中加入100μl靶。在500rpm下离心96孔板3分钟。将板在37℃下温育3小时,然后在1000rpm下离心5分钟。将来自各孔中的100μl上清液转移至96孔平底板中,在Wallac荧光计上在485/535处,使用1秒的间隔读数。
使用BT-474或MCF-7细胞系作为ADCC测定中的靶,在所有受试的曲妥单抗浓度上,用IL-21预处理的MNC具有比未处理的MNC更高的活性或比当I gG存在于测定中时的活性更高。在效应器∶靶(E∶T)为3时,当使用BT-474时,细胞裂解活性在5μg/mL曲妥单抗处为最大值。当使用MCF-7时,在E∶T为3时,细胞裂解活性在1.25μg/mL处为最大值。
D.
从短尾猴采集外周血,放入具有肝素锂的5ml管中,并在室温下贮存直至进行样品处理。用包含1mM EDTA的PBS稀释样品,通过在95%的菲可中离心收集单核细胞(MNC)级分。洗涤后,在含有IL-2120ng/ml的培养基中或对照培养基中培养所述细胞3天。温育后,洗涤细胞并进行计数,对等分进行染色以通过流式细胞仪确定免疫表型。如下使用细胞等分进行抗体依赖性细胞毒性测定。在37℃下,用钙黄绿素AM染料装载BT-474乳腺癌靶细胞60分钟,洗涤细胞,将1000个靶细胞置于含有2μg/ml曲妥单抗和50,000、25,000、12,500、6250、3125、1563或781个MNC的小孔中。在37℃下在黑暗中温育测定物3小时。该温育后,测量钙黄绿素AM至上清液中的释放,基于通过总(去垢剂)裂解产生的释放和在任何MNC效应器细胞不存在的情况下产生的非特异性释放来计算特异性裂解。对8只短尾猴供体中的每一只重复实验2次。基于流式细胞仪分析,数据表示为在E∶T比例为25时,每MNC的特异性裂解百分比,或将数据标准化以反映MNC群体中实际的NK细胞数目。为获得受NK调整的数据,使用4参数S型曲线使E∶T比例针对裂解百分比进行拟合,使用希尔方程确定在E∶T比例为3时每BT-474靶的裂解百分比。
使用r IL-21的短尾猴的体外处理在使用BT-474乳腺癌靶的曲妥单抗介导的ADCC测定法中增加了ADCC活性。一些动物比其它动物对rIL-21具有更大的反应,该可变反应在重复的实验中对动物来说是一致的。使用(Littell等人SAS System for Mixed Models;SASInstitute,1996)中的Proc MI XED使混合效应模型拟合作为供体的固定效应和随机效应的处理和通过供体相互作用进行的处理。使用中的Kenward Roger选项确定计算处理的P值的分母自由度。处理项(treatment term)是高度显著的。
表19
来自抗BT-474乳腺癌靶的短尾猴MNC制剂的ADCC活性。
终点是E∶T比例为25时的裂解百分比。
对照-无处理 | rIL-21预处理 | |||
动物 | Cont-run1 | Cont-run2 | rIL21-run1 | rIL21-run2 |
A | 15.10089 | 34.57907 | ||
B | 4.576255 | 6.457869 | 17.69686 | 15.00928 |
C | 12.60543 | 4.191629 | 29.77582 | 20.20712 |
D | 25.48322 | 16.04117 | 32.51966 | 32.08234 |
E | 20.77167 | 6.569754 | 32.82285 | 26.04751 |
F | 15.85598 | 4.479947 | 22.39635 | 12.16969 |
G | 31.07411 | 18.44403 | 54.5077 | 37.00462 |
H | 26.21558 | 7.980985 | 29.85094 | 20.00046 |
表20
来自抗BT-474乳腺癌靶的短尾猴MNC制剂的ADCC活性。
终点是受NK调节的E∶T比例为3时的裂解百分比。
对照-无处理 | rIL-21预处理 | |||
动物 | Cont | Cont | IL-21 | IL-21 |
A | 17.56976 | 36.4764 | ||
B | 5.349258 | 7.43626 | 22.17732 | 17.10627 |
C | 13.51977 | 3.109 | 31.55683 | 26.31246 |
D | 24.98626 | 15.87297 | 31.02951 | 31.07489 |
E | 19.4483 | 6.177042 | 38.98066 | 24.94877 |
F | 16.14824 | 4.779288 | 24.31473 | 15.74664 |
G | 31.54203 | 17.95528 | 53.47342 | 35.68798 |
H | 23.98745 | 8.451089 | 32.60043 | 16.41115 |
实施例7
去除CD4/CD8的小鼠模型
多年来一直使用利用抗细胞表面受体的抗体进行的细胞去除来了解这些细胞在免疫机制中的特定作用。当将抗T淋巴细胞上的CD4和CD8抗原的抗体注射入小鼠时,其通过涉及ADCC和补体的机制去除特定的T细胞亚型。将低剂量的抗体注射入小鼠中以去除20至50%的CD4或CD8T细胞。给成组的小鼠施用IL-21,通过流式细胞仪跟踪T细胞来研究其增强去除的能力。增加的使用IL-21的T细胞的去除表明IL-21在体内增强抗体介导的细胞去除的能力。
使用大鼠抗小鼠CD4(克隆GK1.5,ATCC)或大鼠抗小鼠CD8(克隆53-6.72,ATCC)进行去除研究。在第0天用对照抗体、5-50μg抗CD4或抗CD8mAb经腹膜内途径注射成组的8-12周大小的C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories)。从放血前2天开始,成组的小鼠腹膜内接受PBS或25μg mI L-21,直至第1天。在第1、4和7天给小鼠放血。通过流式细胞仪测定血液CD4和CD8T细胞数目。
增加的使用IL-21的T细胞的去除显示IL-21在体内增强抗体介导的去除细胞的能力,表明IL-21可增强抗体介导的效应。
实施例8
肺清除测定法
肺清除测定法已被用来在体内研究NK细胞的功能。将铬-51(51Cr)标记的RAJI细胞经静脉内途径注射入小鼠。成组的小鼠接受PBS、mIL-21、单独的利妥昔单抗或利妥昔单抗+IL-21。在经静脉内途径注射后5-8小时杀死小鼠,使用γ计数器就放射性的量对肺进行测定。肺内放射性的降低是通过NK细胞获得的增加的肿瘤细胞的清除(杀死)的指示。在利妥昔单抗存在的情况下,IL-21增强肿瘤细胞的清除的能力表示IL-21在体内增强抗体介导的裂解活性的能力。
在37℃下用100μCi51Cr标记RAJ I细胞2小时。用PBS洗涤细胞2次,重悬浮于无菌PBS,pH 7.2。在时间0(t=0)时,用1千万个标记的RAJI细胞经静脉内(i.v.)途径注射入小鼠。在t=10分钟时,成组的小鼠经腹膜内途径接受20μg对照抗体或利妥昔单抗。在t=-24小时、t=0小时和t=4小时,成组的小鼠接受PBS或25μg mIL-21。在肿瘤注射后5至8小时之间杀死小鼠,分离肺并在γ计数器上进行计数。将放射性标绘为对照注射(单独的标记的细胞)的百分比。
肺中减少的放射性表示通过NK细胞产生的增加的肿瘤细胞的清除(杀死)。在利妥昔单抗存在的情况下,IL-21增强肿瘤细胞的清除的能力表示IL-21在体内增强抗体介导的裂解活性的能力。
实施例9
去除Raji/SCID巨噬细胞的研究
IL-21+利妥昔单抗(利妥昔单抗)的组合在扩散型Raji/SCID肿瘤模型中具有协同的抗肿瘤活性。据认为ADCC在利妥昔单抗的体内抗肿瘤活性中起着重要作用,巨噬细胞在该过程中是非常重要的效应器细胞。IL-21可在小鼠中影响巨噬细胞的ADCC活性,导致和利妥昔单抗的协同作用。为了检验巨噬细胞在IL21+利妥昔单抗的抗肿瘤作用中的重要性,使用氯膦酸脂质体(Sigma,St.Louis,MO)在小鼠中去除巨噬细胞。实验通过证明去除巨噬细胞群体的小鼠相对于未去除的小鼠具有缩短的存活时间来证明巨噬细胞对于IL21+利妥昔单抗的协同的抗肿瘤活性是至关重要的。
为研究巨噬细胞在IL21+利妥昔单抗抗SCID小鼠中的Raji细胞的抗肿瘤活性中的重要性,进行下列实验。延缓使用利妥昔单抗的处理以减少其功效(Funakoshi,Longo et al.Blood,83(10):2787-94,1994),连续5天注射mIL-21,包括第1次利妥昔单抗注射。使用HS-Sultan和Raji细胞,因为其不通过STAT1或STAT3进行信号传导和其生长在体内或体外不受IL-21抑制。
在研究的第0天经静脉内途径注射1x 106Raji细胞
在第3-7天经腹膜内途径施用100μgIL-21。
在第5、9、13、17和21天经腹膜内途径施用20μg利妥昔单抗。
经静脉内途径施用脂质体:
第3天-0.2ml 100%脂质体
第9天-0.2ml 50%脂质体
第15天-0.2ml 50%脂质体
第21-0.2ml 50%脂质体
图1显示,当和用PBS脂质体注射的小鼠相比时,使用氯膦酸脂质体(例如Clod.IL21+R)的巨噬细胞去除显著地减少了荷Raji淋巴瘤细胞的小鼠的存活益处。和非去除小鼠(分别使用PBS.IL21+R和PBS.R)相比,使用IL-21+利妥昔单抗(Clod.IL21+R)或利妥昔单抗(Clod.R)处理的巨噬细胞去除小鼠具有显著缩短的存活时间(平均死亡时间)。
实施例10
IL-21+利妥昔单抗处理后,去除了粒细胞的SCID小鼠中的肿瘤清
除
IL-21和利妥昔单抗一起能够在体内比单独的利妥昔单抗更有效地清除RAJ I肿瘤细胞。将RAJ I细胞注射入已去除粒细胞的CB17 SCID小鼠中。研究单独的利妥昔单抗或和IL-21组合的利妥昔单抗的作用。
经静脉内途径用1x 106个Raji细胞注射CB17-scid小鼠。此外,用单克隆抗体Gr-1(BD Biosciences,Palo Alto,CA)注射其中一些小鼠。通过腹膜内途径注射的方式用20μg Rituxan、100μgmIL-21或Rituxan和mIL-21的组合处理小鼠。
就这些方面监控小鼠,所述方面是1)体重保持恒定或20%的快速体重减轻,2)麻痹或不能保持直立位或运动,3)呼吸沉重-特别是伴随着鼻涕或青紫时,4)嗜眠或不能对温和的刺激产生反应。对满足上面标准的小鼠实施无痛致死术。
在第5、9、13、17和21天对组1-6给药以进行Ab处理。在第12、19、26、33和40天处理组7-10。对于组1-6在第3-7天施用蛋白,在第10-14天对组7-10施用蛋白。
图2显示,IL-21+利妥昔单抗的协同性抗肿瘤活性受到使用抗Gr-1MAb的粒细胞去除的削弱。对于去除粒细胞的SCID小鼠(虚线),当和非去除小鼠(实线)相比,荷Raji的SCID小鼠的存活时间(在第100天时的存活比例)显著降低。
实施例11
IL-21和抗CTLA4的抗体组合
A.RENCA细胞肿瘤模型
为检验IL-21和抗CTLA4mAb一起对小鼠中肿瘤的生长是否具有作用,使用RENCA细胞肿瘤模型。已显示使用Renca细胞注射的肾细胞癌小鼠模型建立了这样的肾细胞转移性肿瘤,该肿瘤对使用免疫治疗剂例如I L-12和I L-2的治疗具有反应(Wigginton等人,J.of Nat. Cancer Ins t. 88:38-43,1996)。在第0天用RENCA肿瘤经皮下途径注射成组的小鼠。然后用单独的载体、50ug或100ug抗CTLA4MAb(克隆9H10,eBiosciences,San Diego,CA)、单独的25ug mIL-21、或50ug或100ug抗CTLA4和25ug mIL-21的组合注射小鼠。使用在该模型中通常不具有有效的抗肿瘤效果的25ug的低剂量mIL-21。
在第0天用0.1x 106个RENCA细胞在右胁腹经皮下途径注射10周大小的雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)。在第5-9、19-23天,成组的小鼠接受单独的载体(PBS,pH 7.2)或25ug mIL-21。在第0、4和8天,其它组分别接受50ug或100ug单独的抗CTLA-4MAb,或在第0、4和8天接受抗CTLA4MAb(50ug或100ug)和在第5-9、19-23天接受抗CTLA4MAb和25ug mIL-21的组合。所有注射通过腹膜内途径施用。使用卡尺测量法监控肿瘤生长,每周3次,进行5周。使用公式1/2*(B)2*L(mm3)计算肿瘤体积。
单独的mIL-21或单独的两种浓度的抗CTLA4MAb的注射对肿瘤的生长没有显著的影响。相反地,和对照相比(图1),mIL21和两种浓度中任一浓度的抗CTLA4MAb的组合显示在肿瘤的体积上具有显著的减小。这些数据表明IL21和抗CTLA4MAb的组合具有协同的抗肿瘤活性,是针对癌症的可能的组合疗法。
B.和抗小鼠CTLA4组合的小鼠IL-21的治疗性施用在RENCA模型中抑制肿瘤生长。
为检验当使用治疗方案进行施用时,将IL-21和抗CTLA4mAb组合是否对肿瘤的生长具有影响,在第0天,用RENCA肿瘤注射成组的小鼠。然后从肿瘤体积为60-80mm3开始,用单独的载体、50ug或100ug抗CTLA4mAb(克隆9H10,eBiosciences)、单独的25ug mIL-21、或50ug或100ug抗CTLA4MAb和25ug mIL-21的组合注射小鼠。使用在该模型中通常不具有有效的抗肿瘤效果的25ug的低剂量mIL-21。在已达到60-80mm3的肿瘤体积后的第1、5、9和13天,施用抗CTLA4mAb。在肿瘤体积已达到60-80mm3后的第5-9、19-23天或从第1至10天注射mIL-21。在组合mIL-21和抗CTLA4MAb的组中看到的抗肿瘤效果表明当按治疗方案施用时,在该模型中存在协同性的抗肿瘤作用。
在第0天用0.1x 106个RENCA细胞在右胁腹经皮下途径注射10周大小的雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)。成组的小鼠在肿瘤体积已达到60-80mm3后的第5-9、19-23天或从第1至第10天接受单独的载体(PBS,pH 7.2)或25ug mIL-21。在第1、5、9和13天其它组分别接受50ug或100ug单独的抗CTLA-4MAb,或在肿瘤体积已达到60-80mm3后的第1、5、9和13天接受抗CTLA4MAb(50ug或100ug),在第5-9、19-23天或在第1至10天接受25ug mIL-21的组合。所有注射都通过腹膜内途径施用。使用卡尺测量法监控肿瘤生长,每周3次,进行5周。使用公式1/2*(B)2*L(mm3)计算肿瘤体积。
在组合mIL-21和抗CTLA4MAb的组中看到的抗肿瘤效果表明当按治疗方案施用时,在该模型中存在协同性的抗肿瘤作用。这些数据表a明IL21和抗CTLA4MAb的组合具有协同的抗肿瘤活性,是针对癌症的可能的组合疗法。
C.使用mIL-21和抗小鼠CTLA4C的组合治疗在E.G7胸腺瘤模型中抑制肿瘤生长
为检验mIL-21和抗CTLA4MAb的组合是否诱导抗肿瘤活性,在第0天使用E.G7肿瘤经皮下途径注射成组的小鼠(Shrikant,P和Mescher,M,.J.Immunology 162:2858-2866,1999)。然后用单独的载体、50ug或100ug抗CTLA4mAb(克隆9H10,eBiosciences)、单独的25ug mI L21、或50ug或100ug抗-CTLA4和25ug mIL21的组合注射小鼠。使用在该模型中通常不具有有效的抗肿瘤效果的25ug的低剂量mIL-21。在第0、4和8天施用抗CTLA4mAb。在第5-9、19-23天或在第2-20天每隔一天(EOD)注射mIL21。在组合mIL-21和抗CTLA4的组中看到的抗肿瘤效果表明在该模型中存在协同的抗肿瘤作用。
在第0天用0.4x 106个E.G 7细胞(ATCC No.CRL-2113)在右胁腹经皮下途径注射10周大小的雌性C 57BL/6小鼠(Charles RiverLaboratories)。然后用单独的载体、50ug或100ug抗CTLA4mAb(克隆9H10,eBiosciences)、单独的25ug mIL21、或50ug或100ug抗CTLA4和25ug mIL21的组合注射小鼠。使用在该模型中通常不具有有效的抗肿瘤效果的25ug的低剂量mIL-21。在第0、4和8天施用抗CTLA4mAb。在第5-9、19-23或在第2-20天每隔一天(EOD)注射mIL-21。以200ul的总体积进行腹膜内注射。通过腹膜内注射施用所有试剂。使用卡尺测量法监控肿瘤生长,每周3次,进行5周。使用公式1/2*(B)2*L(mm3)计算肿瘤体积。
在组合mIL-21和抗CTLA4MAb的组中看到的抗肿瘤效果表明在该模型中存在协同的抗肿瘤作用。这些数据表明IL21和抗CTLA4mAb的组合具有协同的抗肿瘤活性,是针对癌症的可能的组合疗法。
D.使用mIL-21和抗小鼠CTLA4MAb的组合疗法在B16黑色素瘤模型中抑制肿瘤生长。
为检验mIL-21和抗CTLA4MAb的组合是否在其它肿瘤中诱导抗肿瘤活性,在第0天使用B16-F10黑色素瘤细胞(ATCC No.CRL-6475)经皮下途径注射成组的小鼠。然后用单独的载体、50ug或100ug抗CTLA4mAb(克隆9H10,eBiosciences)、单独的25ug mIL-21、或50ug或100ug抗CTLA4和25ug mIL-21的组合注射小鼠。在第0、4和8天施用抗CTLA4mAb。在第5-9、19-23天或在第2-20天每隔一天(EOD)注射mIL21。在组合mIL-21和抗CTLA4MAb的组中看到的抗肿瘤效果表明在该模型中存在协同的抗肿瘤作用。
在第0天用0.5x106个B16黑色素瘤细胞在右胁腹经皮下途径注射10周大小的雌性C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories)。然后用单独的载体、50ug或100ug抗CTLA4mAb(克隆9H10,eBiosciences)、单独的25ug mIL21、或50ug或100ug抗CTLA4mAb和25ug mIL21的组合注射小鼠。在第0、4和8天施用抗CTLA4mAb。在第5-9、19-23或在第2-20天每隔一天(EOD)注射mIL-21。以200ul的总体积进行腹膜内注射。通过腹膜内注射施用所有试剂。使用卡尺测量法监控肿瘤生长,每周3次,进行4周。使用公式1/2*(B)2*L(mm3)计算肿瘤体积。
在组合mIL-21和抗CTLA4MAb的组中看到的抗肿瘤效果表明在该模型中存在协同的抗肿瘤作用。这些数据表明IL21和抗CTLA4mAb的组合具有协同的抗肿瘤活性,是针对癌症的可能的组合疗法。
根据上面的内容,要理解,尽管为了举例说明,已在此描述了本发明的特定实施方案,但可进行各种改变而不偏离本发明的精神和范围。因此,本发明,除了如所附的权利要求所限定的外,是非限定性的。
Claims (7)
1.在受治疗者中治疗癌症的药物,其包括利妥昔单抗和IL-21多肽或IL-21多肽的片段,该片段为SEQ ID NO:2中所示的从氨基酸残基30至残基162的片段,其中每周一次施用利妥昔单抗和IL-21多肽,进行长达连续8周。
2.权利要求1的药物,其中所述癌症是非何杰金氏淋巴瘤。
3.权利要求1或2的药物,其中所述受治疗者是人患者。
4.权利要求3的药物,其中所述患者以前曾用利妥昔单抗治疗过但没有显示明显的肿瘤缓减或消退。
5.权利要求3的药物,其中所述患者在接受利妥昔单抗治疗后复发。
6.权利要求1的药物,其中施用IL-21导致最佳的免疫反应。
7.利妥昔单抗和IL-21多肽或IL-21多肽的片段在制备用于在受治疗者中治疗癌症的药物中的用途,该片段为SEQ ID NO:2中所示的从氨基酸残基30至残基162的片段,其中每周一次施用利妥昔单抗和IL-21多肽,进行长达连续8周。
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Patent Citations (1)
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