ES2390278T3 - Procedimientos de tratamiento del cáncer usando tratamiento con IL-21 y anticuerpos monoclonales - Google Patents

Abstract

Rituximab y un polipéptido de IL-21 o un fragmento de un polipéptido de IL-21 como se muestra en la SEQ IDN.º: 2 desde el residuo de aminoácido 30 hasta el residuo 162, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto,en el que el rituximab y el polipéptido de IL-21 son para su administración una vez por semana durante hasta ochosemanas consecutivas.

Description

Procedimientos de tratamiento del cáncer usando tratamiento con IL-21 y anticuerpos monoclonales

Antecedentes de la invención

En general, las citocinas estimulan la proliferación o diferenciación de células del linaje hematopoyético o participan en los mecanismos de respuesta inmunitaria e inflamatoria del organismo. Las interleucinas son una familia de citocinas que median respuestas inmunológicas. Son cruciales en la respuesta inmunitaria los linfocitos T, que producen muchas citocinas y efectúan la inmunidad adaptativa frente a los antígenos. Las citocinas producidas por los linfocitos T se han clasificado como TH1 y TH2 (Kelso, A. Immun. Cell. Biol. 76:300-317, 1998). Las citocinas de tipo 1 incluyen IL-2, IFN-y, LT-a, y participan en respuestas inflamatorias, inmunidad vírica, inmunidad frente a parásitos intracelulares y rechazo de aloinjertos. Las citocinas de tipo 2 incluyen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 y participan en respuestas humorales, inmunidad frente a helmintos y respuesta alérgica. Las citocinas compartidas entre las citocinas de tipo 1 y 2 incluyen IL-3, GM-CSF y TNF-a. Existen algunas pruebas que indican que las poblaciones de linfocitos T productoras de tipo 1 y tipo 2 migran de forma preferente a tipos diferentes de tejidos inflamados.

Los linfocitos citolíticos naturales (NK) tienen una célula progenitora común con los linfocitos T y los linfocitos B y desempeñan un papel en la vigilancia inmunitaria. Los linfocitos NK, que constituyen hasta el 15 % de los linfocitos de la sangre, no expresan receptores antigénicos y son un componente de la inmunidad innata. Los linfocitos NK participan en el reconocimiento y la destrucción de células tumorales y células infectadas por virus. Se cree que, in vivo, los linfocitos NK requieren activación, sin embargo, se ha demostrado que, in vitro, los linfocitos NK destruyen algunos tipos de células tumorales sin activación.

Se ha demostrado que la IL-21 es un potente modulador de linfocitos T citotóxicos y linfocitos NK. (Parrish-Novak, et al. Nature 408:57-63, 2000; Parrish-Novak, et al., J. Leuk. Bio. 72:856-863, 2002; Collins et al., Immunol. Res. 28:131-140, 2003; Brady, et al. J. Immunol.:2048-58, 2004.) Se ha demostrado que la IL-21 coestimula la expansión de linfocitos NK y se ha demostrado que potencia las funciones efectoras de estos linfocitos. Las respuestas de linfocitos T incluyen la potenciación de la respuesta a antígeno primaria como la modulación de las funciones de linfocitos T de memoria (Kasaian et al., Immunity 16:559-569, 2002.)

El tratamiento con anticuerpos usa antígenos que se expresan selectivamente en determinados tipos celulares. El tratamiento con anticuerpos ha sido especialmente exitoso en el tratamiento del cáncer debido a que determinados tumores presentan antígenos únicos, antígenos específicos de linaje o antígenos presentes en cantidades en exceso con relación a las células normales. El desarrollo del tratamiento con anticuerpos monoclonales (AcM) ha evolucionado a partir de la tecnología de hibridoma de ratón (Kohler et al., Nature 256:495-497, 1975), que tenía una utilidad terapéutica limitada debido a la incapacidad para estimular la actividad de células efectoras inmunitarias humanas y la producción de anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA; Khazaeli et col., J. Immunother. 15:42-52, 1994). La preparación de anticuerpos quiméricos que eran menos antigénicos se logró usando regiones constantes humanas y regiones variables de ratón. Estos anticuerpos tenían funciones efectoras aumentadas y repuestas HAMA reducidas (Boulianne et al., Nature 312:643-646, 1984). Se han desarrollado anticuerpos monoclonales humanos usando tecnología de presentación en fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990) y, más recientemente, se han usado ratones transgénicos portadores de locus de Ig humanas para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos (Green, J. Immunol. Methods 231:11-23, 1999). Para una revisión del tratamiento con anticuerpos monoclonales, véase Brekke et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2:52-62, 2002.

El documento WO 03/103589 describe el uso de IL-21 en cáncer y otras aplicaciones terapéuticas.

El documento WO 2004/032857 describe combinaciones de anticuerpos anti-ACE y un agente terapéutico.

Clegg et al., European Cytokine Network, vol. 14 (3), septiembre de 2003, página 28, describe posibilidades terapéuticas para la IL-21.

El documento WO 2005/037306 describe un tratamiento combinado de IL-21.

La presente invención permite potenciar la actividad antitumoral del tratamiento con anticuerpos monoclonales con IL-21. La combinación de IL-21 y anticuerpos monoclonales terapéuticos proporciona mejoras con respecto al tratamiento con anticuerpos monoclonales solo, en particular para pacientes que no responden al tratamiento con anticuerpos monoclonales solo o en combinación con otros regímenes de tratamiento. Estos y otros usos deberían resultar evidentes para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas del presente documento.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento del cáncer en un sujeto, en particular sujetos humanos, que comprende coadministrar una cantidad terapéuticamente eficaz de rituximab y una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de IL-21 o un fragmento de un polipéptido de IL-21 como se muestra en la SEQ ID N.º: 2 desde el residuo de aminoácido 30 hasta el residuo 162. El anticuerpo monoclonal es rituximab. En otra realización, la

presente invención es para el tratamiento de linfoma no hodgkiniano. En la presente invención, se administran el anticuerpo monoclonal rituximab y el polipéptido de IL-21 una vez por semana durante hasta ocho semanas consecutivas. Otra realización de la presente invención establece que la dosis de polipéptido de IL-21 es de 10 a 500 Ig/kg/dosis. En determinadas realizaciones de la presente invención, se ha tratado al paciente anteriormente con rituximab y no mostró remisión o regresión tumoral apreciable. En otras realizaciones, el paciente ha recaído después de recibir tratamiento con rituximab.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento del cáncer en un sujeto que comprende coadministrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-CD20 y una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de IL-21 o un fragmento de un polipéptido de IL-21 como se muestra en la SEQ ID N.º: 2 desde el residuo de aminoácido 30 hasta el residuo 162, en el que la administración de IL-21 da como resultado una respuesta inmunológica óptima.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento del cáncer en un sujeto que comprende la coadministración de un anticuerpo monoclonal que se une a un receptor de Her-2/neu y un polipéptido de IL-21 o un fragmento de un polipéptido de IL-21 como se muestra en la SEQ ID N.º: 2 desde el residuo de aminoácido 30 hasta el residuo 162. En una realización, el sujeto es un paciente humano. En otra realización, el anticuerpo monoclonal es trastuzumab.

Un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento del cáncer en un sujeto que comprende la coadministración de un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y un polipéptido de IL-21 o un fragmento de un polipéptido de IL-21 como se muestra en la SEQ ID N.º: 2 desde el residuo de aminoácido 30 hasta el residuo 162. En determinadas realizaciones, el sujeto es un paciente humano. En otra realización de la presente invención, se administra el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 a una dosis de 3 mg/kg cada tres semanas durante cuatro ciclos y se administra el polipéptido o fragmento de IL-21 de una a cinco veces por semana, durante hasta ocho semanas. La presente invención también proporciona realizaciones donde la dosis de polipéptido de IL-21 es de 10 a 500 Ig/kg/dosis.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra curvas de supervivencia para ratones con depleción de macrófagos que fueron significativamente diferentes de las de ratones sin depleción.

La Figura 2 ilustra que los ratones con depleción de granulocitos por inyecciones de AcM anti-Gr-1 muestran una supervivencia reducida en comparación con ratones sin depleción.

La Figura 3 ilustra que la combinación de anti-CTLA4 + IL21 tiene efectos antitumorales en el modelo RENCa.

Descripción de la invención

Antes de exponer la invención en detalle, puede ser útil para su comprensión definir los términos siguientes:

El término "marca de afinidad" se usa en el presente documento para designar un segmento de polipéptido que puede estar unido a un segundo polipéptido para permitir la purificación o detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios de unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, puede usarse como marca de afinidad cualquier péptido o proteína para los que esté disponible un anticuerpo u otro agente de unión específica. Las marcas de afinidad incluyen una extensión de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67: 31, 1988), una marca de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), sustancia P, péptido FlagTM (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988), péptido de unión a estreptavidina u otros dominios de unión o epítopos antigénicos. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. ADN que codifican las marcas de afinidad están disponibles de proveedores comerciales (p. e., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

El término "variante alélica" se usa en el presente documento para designar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural a través de la mutación y puede dar lugar a polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser sinónimas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos modificada. El término variante alélica también se usa en el presente documento para designar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.

Los términos "aminoterminal" y "carboxiterminal" se usan en el presente documento para designar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos términos se usan con referencia a una secuencia o porción de un polipéptido en particular para designar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una determinada secuencia situada en carboxiterminal con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido está situada próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

El término "cáncer" o "célula cancerosa" se usa en el presente documento para designar un tejido o célula que se encuentra en una neoplasia que posee características que la diferencian de tejidos o células tisulares normales. Entre tales características se incluyen entre otras: grado de anaplasia, irregularidad en la forma, poca definición del contorno celular, tamaño del núcleo, cambios en la estructura de núcleo o el citoplasma, otros cambios fenotípicos, presencia de proteínas celulares indicadoras de un estado canceroso o precanceroso, aumento del número de mitosis y capacidad de metastatizar. Las palabras pertinentes al "cáncer" incluyen carcinoma, sarcoma, tumor, epitelioma, leucemia, linfoma, pólipo y escirro, transformación, neoplasia y similares.

El término "coadministración" se usa en el presente documento para designar que pueden administrarse un polipéptido o proteína de IL-21 y un anticuerpo monoclonal terapéutico simultáneamente o en momentos diferentes. La coadministración puede ser una única coadministración de IL-21 y anticuerpo monoclonal o varios ciclos de coadministración. La coadministración no es necesariamente el único momento en que se administra la IL-21 o el anticuerpo monoclonal a un paciente y puede administrarse cualquier agente solo o en una combinación con agentes terapéuticos distintos de IL-21.

El término "tratamiento combinado" se usa en el presente documento para designar que a un sujeto se le administra al menos una dosis terapéuticamente eficaz de una composición de IL-21 ("IL-21") y un anticuerpo monoclonal terapéutico. La composición de IL-21 puede ser un polipéptido maduro, uno de sus fragmentos, una fusión o un conjugado que demuestra actividad biológica de IL-21.

El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, designa que se ha sacado el polinucleótido de su medio genético natural y, por tanto, no tiene otras secuencias codificantes exógenas o no deseadas y está en una forma adecuada para su uso en sistemas de producción de proteínas genéticamente modificadas. Tales moléculas aisladas son aquellas que están separadas de su entorno natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención no tienen otros genes con los que se asocian normalmente, pero pueden incluir regiones de 5' y 3' no traducidas naturales, tales como promotores y terminadores. La identificación de regiones asociadas resultará evidente para un experto en la técnica (véase por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

Un polipéptido o proteína "aislado/a" es un polipéptido o proteína que se encuentra en condiciones distintas a las de su entorno natural, tal como separado de la sangre y los tejidos animales. En una forma preferida, el polipéptido aislado no tiene, sustancialmente, otros polipéptidos, en particular otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es decir, con una pureza mayor del 95 %, más preferentemente una pureza mayor del 99 %. Cuando se usa en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas glucosiladas o derivatizadas de forma alternativa.

El término "nivel" al hacer referencia a células inmunitarias, tales como linfocitos NK, linfocitos T, en particular linfocitos T citotóxicos, linfocitos B y similares, un aumento del nivel es o bien un aumento del número de células o la potenciación de la actividad de la función celular.

El término "nivel" al hacer referencia a infecciones víricas se refiere a un cambio en el nivel de infección vírica e incluye, entre otros, un cambio en el nivel de LTC o linfocitos NK (como se describe anteriormente), una disminución de la carga vírica, un aumento de la valoración de anticuerpos antivíricos, la disminución de los niveles séricos de alanina aminotransferasa o la mejora determinada mediante examen histológico de un tejido u órgano objetivo. Las determinación de si estos cambios en el nivel son diferencias o cambios significativos está dentro del conocimiento del experto en la técnica.

El término "neoplásico", al hacer referencia a células, indica células que sufren una proliferación nueva y anómala, en particular en un tejido donde la proliferación es descontrolada y progresiva, dando lugar a una neoplasia. Las células neoplásicas puede ser malignas, es decir, invasivas y metastásicas, o benignas.

La expresión "dosis inmunológica óptima" se define como la dosis de IL-21 o IL-21 en combinación con un anticuerpo monoclonal que logra la respuesta inmunológica óptima.

La expresión "respuesta inmunológica óptima" se refiere a un cambio en una respuesta inmunológica después de la administración de IL-21 o la combinación de IL-21 + AcM con respecto a la observada cuando se administra el AcM solo, y puede ser (1) un aumento del número de linfocitos T CD8 específicos de tumor o activados, (2) un aumento del número de linfocitos T CD8 específicos de tumor o activados que expresan niveles más altos de granzima B o perforina o IFNy, (3) regulación por incremento del receptor Fcy (CD16, CD32 o CD64) en linfocitos NK, monocitos o neutrófilos, (4) un aumento de CD25 soluble en suero, (5) disminución del nivel sérico de proteínas liberadas por células tumorales (véase, Taro et al., J. Cell Physiol 203 (1): 1-5. 2005), por ejemplo, antígeno carcinoembrionario (ACE), IgG, CA-19-9 o antígeno de cáncer de ovario (CA125), (6) un aumento del número de linfocitos NK que expresan niveles más altos de granzima B, perforina o IFNy, (7) aumento de los niveles de citocinas de activación tales como IL-18, IL-15, IFNy y quimiocinas que permiten la migración de células efectoras al tumor, tales como IP10, RANTES, IL-8, MIP1a o MIP1b, (8) un aumento del número de macrófagos activados en la periferia o en el sitio tumoral, donde puede detectarse la activación por la expresión de un aumento de MHC de clase I o Clase II, la

producción de IL-15, IL-18, IFNy o IL-21, o (9) actividad de macrófagos indicada por una disminución del recuento de glóbulos rojos (gravedad de la anemia).

Un "polinucleótido" es un polímero mono- o bicatenario de bases de desoxirribonucleótido o ribonucleótido leído desde el extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN y pueden aislarse a partir de fuentes naturales, sintetizarse in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de polinucleótidos se expresan como pares de bases (abreviado como "pb"), nucleótidos ("nt") o kilobases ("kb"). Cuando el contexto lo permite, los dos últimos términos pueden describir polinucleótidos que son monocatenarios o bicatenarios. Cuando se aplica el término a moléculas bicatenarias se usa para designar la longitud total y se entenderá como equivalente al término "pares de bases". Los expertos en la técnica reconocerán que las longitudes de las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente y que sus extremos pueden ser escalonados como consecuencia de la escisión enzimática; por tanto, puede que no todos los nucleótidos de una molécula polinucleotídica bicatenaria estén apareados.

Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácido unidos por enlaces peptídicos, ya sea producido de forma natural o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácido se denominan comúnmente "péptidos".

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidrato. Los hidratos de carbono y otros sustituyentes no peptídicos pueden añadirse a una proteína por la célula en la cual se produce la proteína y variarán con el tipo de célula. Las proteínas se definen en el presente documento en términos de las estructuras de sus esqueletos de aminoácidos; en general, no se especifican sustituyentes tales como grupos carbohidrato, aunque pueden estar presentes.

El término "receptor" designa una proteína asociada a una célula que se une a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) y media en el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores unidos a la membrana se caracterizan por una estructura multipeptídica que comprende un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio efector intracelular que normalmente participa en la transducción señales. La unión del ligando al receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor que provoca una interacción entre el dominio efector y otra(s) molécula(s) de la célula. Esta interacción da lugar a su vez a una modificación del metabolismo de la célula. Los acontecimientos metabólicos que están relacionados con interacciones receptor-ligando incluyen transcripción génica, fosforilación, desfosforilación, aumentos de la producción de AMP cíclico, movilización del calcio celular, movilización de los lípidos de membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos. En general, los receptores pueden ser unidos a la membrana, citosólicos o nucleares; monoméricos (p. ej., receptor de hormona estimulante de la tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (p. ej., receptor de PDGF, receptor de hormona de crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6).

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se define como una cantidad de una composición de IL-21 o una composición de IL-21 en combinación con un anticuerpo monoclonal que da como resultado una respuesta completa, una respuesta parcial o una enfermedad estable con un aumento del tiempo hasta la progresión con respecto a la mediana de la duración de la respuesta para el tratamiento con anticuerpos monoclonales sin IL-21.

La expresión "antígeno asociado a tumor" se refiere a un péptido o polipéptido o complejo peptídico que tiene un perfil de expresión diferente del antígeno que se encuentra en células no tumorales. Por ejemplo, un antígeno no tumoral puede expresarse con mayor frecuencia o densidad por células tumorales que por células no tumorales. Un antígeno tumoral puede diferir de un antígeno no tumoral estructuralmente, por ejemplo, el antígeno podría expresarse como un polipéptido truncado, tener alguna mutación en la secuencia de aminoácidos o en la secuencia de polinucleótidos que codifica el antígeno, presentar un plegamiento incorrecto o modificaciones postraduccionales incorrectas. De forma similar a los antígenos que están presentes en células normales no tumorales del organismo huésped, permiten a las células tumorales escapar de los mecanismos de vigilancia inmunológica del huésped.

Se entenderá que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros determinados por procedimientos analíticos imprecisos (p. ej., electroforesis en gel) son valores aproximados. Cuando un valor de este tipo se expresa como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, se entenderá que el valor indicado de X tiene una precisión del ±10 %.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la administración de IL-21 en combinación con anticuerpos monoclonales terapéuticos da como resultado una actividad antitumoral que es más potente que al administrar anticuerpos monoclonales solos.

A. Descripción de IL-21.

Originalmente, la IL-21 humana (SEC ID N.º: 1 y SEQ ID N.º: 2) se denominó ligando zalpha11 y se describe en las patentes de EE. UU. de propiedad conjunta N.º 6.307.024 y 6.686.178. El receptor de IL-21 (denominado anteriormente zalpha11) denominado actualmente IL-21 R (SEC ID N.º: 5 y SEC ID N.º: 6), y el receptor heterodimérico IL-21R/IL-2Ry se describen en las publicaciones de la OMPI de propiedad conjunta N.º WO 0/17235

y WO 01/77171. Como se describe en estas publicaciones, la IL-21 se aisló a partir de una colección de ADNc generada a partir de células de sangre periférica humanas activadas (hPBC), que se seleccionaron para CD3. El CD3 es un marcador de superficie celular exclusivo de células de origen linfoide, en particular de linfocitos T.

La secuencia de aminoácidos para el IL-21R indicó que el receptor codificado pertenecía a la subfamilia de receptores de citocinas de clase I, que incluye, entre otros, los receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF y G-CSF (para una revisión véase, Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" en Cytokine 5(2): 95-106, 1993). Se ha identificado el receptor de IL-21 sobre linfocitos NK, linfocitos T y linfocitos B, lo que indica que la IL-21 actúa sobre células de linaje hematopoyético, en particular, células progenitoras linfoides y células linfoides. Otras citocinas de haz de cuatro hélices conocidas que actúan sobre células linfoides incluyen IL-2, IL-4, IL-7 e IL

15. Para una revisión de citocinas de haz de cuatro hélices, véase, Nicola et al., Advances in Protein Chemistry 52:165, 1999 y Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76:300-317, 1998.

Para la IL-21, una secuencia señal de secreción está constituida por los residuos de aminoácido del 1 (Met) al 29 (Ser), y un polipéptido maduro está constituido por los residuos de aminoácido del 30 (Gln) al 162 (Ser) (como se muestra en SEQ ID N.º: 2). La secuencia polinucleotídica correspondiente se muestra en la SEC ID N.º: 1. Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia divulgada en la SEC ID N.º: 1 representa un sólo alelo de la IL21 humana y que es de esperar que se produzcan variación alélica y ayuste alternativo.

En el presente documento se divulgan polipéptidos de IL-21 aislados que tienen una identidad de secuencia sustancialmente similar a los polipéptidos de SEC ID N.º: 2 o sus ortólogos. La expresión "identidad de secuencia sustancialmente similar" se usa en el presente documento para designar polipéptidos que comprenden una identidad de secuencia de al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o mayor del 95 % con las secuencias mostradas en la SEC ID N.º: 2 o sus ortólogos. La presente divulgación incluye también polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o mayor del 95 % con la secuencia de residuos de aminoácido del 1 al 162 o del 30 al 162 de la SEC ID N.º: 2. La presente divulgación incluye además moléculas de ácido nucleico que codifican tales polipéptidos. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para determinar el porcentaje de identidad.

En general, al diseñar modificaciones de moléculas o identificar fragmentos específicos, la determinación de la estructura irá acompañada de la evaluación de la actividad de las moléculas modificadas. Para un análisis extenso de modificaciones del polinucleótido y el polipéptido de IL-21, véanse las patentes de EE. UU N.º 6.307.024 y

6.686.178.

La presente divulgación también incluye la administración de moléculas que tienen la actividad funcional de IL-21. Así, la administración de fragmentos funcionales y polipéptidos modificados funcionales de polipéptidos de IL-21 y moléculas de ácido nucleico que codifican tales fragmentos funcionales y polipéptidos modificados se engloban en la presente divulgación. Una IL-21 "funcional" o uno de sus fragmentos como se definen en el presente documento se caracteriza por su actividad proliferativa o de diferenciación, por su capacidad para inducir o inhibir funciones celulares especializadas, en particular para células efectoras inmunitarias, tales como linfocitos NK, linfocitos T, linfocitos B y células dendríticas. La IL-21 funcional incluye también la capacidad para presentar efectos antineoplásicos y antivíricos in vitro o in vivo, o a través de su capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo anti-IL-21 o un receptor IL-21 (bien soluble o bien inmovilizado).

También pueden usarse una variedad de fusiones polipeptídicas (y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones polipeptídicas). Por ejemplo, puede prepararse un polipéptido de IL-21 como una fusión con una proteína que dimeriza divulgada en las patentes de EE. UU. N.º 5.155.027 y 5.567.584. A este respecto, las proteínas que dimerizan preferidas incluyen dominios de regiones constantes de inmunoglobulinas. Las fusiones de inmunoglobulina-polipéptido de IL-21 pueden expresarse en células manipuladas genéticamente (para producir una variedad de análogos multiméricos de IL-21). Pueden fusionarse dominios auxiliares a polipéptidos de IL-21 para dirigirlos a células, tejidos o macromoléculas específicos. Por ejemplo, podría dirigirse una proteína o un polipéptido de IL-21 a un tipo celular predeterminado fusionando un polipéptido de IL-21 a un ligando o anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un receptor de la superficie de la célula objetivo. De este modo, pueden dirigirse polipéptidos y proteínas para fines terapéuticos o de diagnóstico. Puede fusionarse un polipéptido de IL-21 a dos o más restos, tales como una marca de afinidad para purificación y un dominio dirigido. Las fusiones polipeptídicas pueden comprender también uno o más sitios de escisión, en particular entre dominios. Véase, Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996.

Independientemente de la secuencia de nucleótidos concreta de un polinucleótido de IL-21 variante, el polinucleótido codifica un polipéptido que se caracteriza por su actividad proliferativa o de diferenciación, su capacidad para inducir

o inhibir funciones celulares especializadas o por la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo anti-IL-21

o un receptor de IL-21. Más específicamente, los polinucleótidos de IL-21 variantes codificarán polipéptidos que presentan al menos el 50 %, y en ciertas realizaciones, más del 70 %, el 80 % o el 90 %, de la actividad del polipéptido mostrado en la SEQ ID N.º: 2.

Para cualquier polipéptido de IL-21, incluidas variantes y proteínas de fusión, un experto en la técnica puede generar fácilmente una secuencia polinucleotídica totalmente degenerada que codifique esa variante usando el código

genético y procedimientos conocidos en la técnica.

Los polipéptidos de IL-21 usados en la presente pueden producirse en células huésped manipuladas genéticamente de acuerdo con técnicas convencionales. Células huésped adecuadas son aquellos tipos celulares que pueden transformarse o transfectarse con ADN exógeno y hacerse crecer en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas y células eucariotas superiores cultivadas. Se prefieren células eucariotas, en particular células cultivadas u organismos pluricelulares. Se divulgan técnicas para manipular moléculas de ADN clonado e introducir ADN exógeno en una variedad de células huésped por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. Se describen construcciones de expresión y procedimientos para producir IL-21 en la patente de EE. UU. N.º 6.686.178 y en el documento PCT US03/39764.

Conjugados de IL-21 usados para tratamiento pueden comprender restos poliméricos solubles en agua farmacéuticamente aceptables. Polímeros solubles en agua adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-alcoxi(C1-C10)-PEG, ariloxi-PEG, poli(N-vinil pirrolidona)PEG, tresil monometoxi PEG, propionaldehído de PEG, bis-succinimidil carbonato PEG, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (p. ej., glicerol), alcohol polivinílico, dextrano, celulosa u otros polímeros a base de hidratos de carbono. Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular de desde aproximadamente 600 hasta aproximadamente 60.000, incluidos, 5.000, 12.000, 20.000 y 25.000. Un conjugado de IL-21 también puede comprender una mezcla de tales polímeros solubles en agua.

B. Uso de IL-21 y anticuerpos monoclonales en tratamiento combinado.

Uno de los mecanismos relacionados con la actividad antitumoral del tratamiento con anticuerpos monoclonales es la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA). En la CCDA, los anticuerpos monoclonales se unen a una célula objetivo (p. ej., célula cancerosa) y células efectoras específicas que expresan receptores para el anticuerpo monoclonal (p. ej., linfocitos NK, monocitos y granulocitos) se unen al complejo de anticuerpo monoclonal/célula objetivo, dando como resultado la muerte de la célula objetivo. La IL-21 potencia la función de las células efectoras, aumentando de este modo la eficacia del tratamiento con anticuerpos monoclonales. La dosis y la pauta de administración de IL-21 en combinación con AcM se basa en la capacidad de la IL-21 para elevar parámetros relacionados con la diferenciación y la actividad funcional de poblaciones de células que median la CCDA, incluidas, entre otras, linfocitos NK, macrófagos y neutrófilos. Estos parámetros pueden evaluarse usando ensayos de citotoxicidad celular, CCDA, de NK, macrófagos y neutrófilos (fracción de linfocitos NK o células mononucleares totales, o moléculas efectoras esenciales para la capacidad de las células de provocar la CCDA (p. ej., FasL, granzimas y perforina). La IL-21 también aumenta la producción de citocinas y quimiocinas por linfocitos NK cuando se combina con AcM y células tumorales (p. ej. IFNy). También se ha demostrado la importancia de las células de Kupffer para la "eliminación" de linfocitos B recubiertos de rituximab (Gong et al., J. Immunol. 174:817826, 2005). Otro mecanismo relacionado con la actividad antitumoral es la fagocitosis de células tumorales recubiertas de AcM. Esto también depende de los receptores de Fc y se ha demostrado influye en la depleción de B por anticuerpos anti-CD20 (Uchida et al. J. Exp. Med. 199 (12): 1659-69, 2004). La dosis y la pauta de administración de los AcM se basa en propiedades farmacocinéticas y toxicocinéticas adscritas al anticuerpo específico coadministrado y deberían optimizar estos efectos, al mismo tiempo que minimizan cualquier toxicidad que pueda asociarse con la administración de IL-21.

Basándose en los resultados con rituximab y trastuzumab descritos en detalle en el presente documento, otros anticuerpos monoclonales que usan mecanismos mediados por células efectoras inmunitarias para la actividad antitumoral por células efectoras también se potenciarán cuando se usa IL-21 en combinación con el anticuerpo. Además, debido a que la IL-21 potencia la actividad antitumoral mediada por células efectoras inmunitarias, determinados anticuerpos monoclonales que han tenido una eficacia antitumoral limitada cuando se usan solos serán buenos candidatos para el tratamiento combinado con IL-21.

El tratamiento combinado con IL-21 y un anticuerpo monoclonal puede estar indicado cuando ha fracasado una primera línea de tratamiento y puede considerarse como una segunda línea de tratamiento. Sin embargo, basándose en la actividad antitumoral potenciada de IL-21 en combinación con un anticuerpo monoclonal, la presente divulgación también proporciona el uso de la combinación como primera línea de tratamiento en poblaciones de pacientes que estén recién diagnosticados y no han sido tratados anteriormente con agentes antineoplásicos "pacientes de novo" y pacientes que no han recibido anteriormente ningún tratamiento con anticuerpos monoclonales "pacientes sin tratamiento previo".

La IL-21 también es útil en el tratamiento combinado con anticuerpos monoclonales en ausencia de cualquier CCDA mediada por anticuerpos directa de células tumorales. Los anticuerpos que bloquean una señal inhibidora en el sistema inmunitario pueden dar lugar a respuestas inmunitarias aumentadas. Los ejemplos incluyen (1) anticuerpos frente a moléculas de la familia B7R que tienen función inhibidora tales como, antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), muerte programada-1 (PD-1), atenuador de linfocitos B y T (BTLA); (2) anticuerpos frente a citocinas inhibidoras como IL-10, TGF�; y (3) anticuerpos que provocan depleción o inhiben funciones de células supresoras como anti-CD25 o CTLA-4. Por ejemplo, se cree que los AcM anti-CTLA4 tanto en ratones como en seres humanos suprimen la función de linfocitos T reguladores inmunosupresores (Treg) o inhiben la señal inhibidora

transmitida a través de la unión del CTLA-4 sobre linfocitos T a moléculas B7-1 o B7-2 sobre CPA o células tumorales. El CTLA-4 se expresa de forma transitoria sobre la superficie de linfocitos T activados y se expresa de forma constitutiva sobre linfocitos Treg. El entrecruzamiento del CTLA-4 da lugar a una señal inhibidora en linfocitos T activados y los anticuerpos frente al CTLA-4 bloquean la señal inhibidora en linfocitos T, dando lugar a la 5 activación sostenida de los linfocitos T (Phan et al., PNAS, 100:8372-8377, 2003). En modelos de ratón, el tratamiento anti-CTLA4 da lugar a un aumento del número de linfocitos NK y linfocitos T CD8 específicos de tumor activados, dando como resultado respuestas antitumorales potentes. El receptor para IL-21 (IL-21R) se expresa en estas células efectoras y la IL-21 puede aumentar su función efectora adicionalmente mediante la activación de estas células a través del IL-21R. Esto puede dar lugar a una actividad antitumoral más potente. Están en curso

10 ensayos clínicos en melanoma y cáncer de ovario y próstata en los que se administran anticuerpos bloqueantes frente a CTLA-4 a pacientes. Sin embargo, se ha relacionado la eficacia con acontecimientos adversos graves (véase el documento US 2004/0241169) y sería ventajoso un tratamiento combinado que diera como resultado un tratamiento menos tóxico.

La tabla 1 es una lista no exclusiva de anticuerpos monoclonales aprobados o que se están probando para los que 15 es posible el tratamiento combinado con IL-21.

Tabla 1

Objetivo

Nombre del fármaco Indicación clínica Empresa

IL-2Ra(CD25)

Zenapax trasplante de riñón Roche

IL-1R

AMG108 osteoartritis Amgen

RANK-L

AMG162 osteoporosis Amgen

Blys

LympoSTAT-B LES, AR HGS

CD40L (CD39)

initiatedAID Celltech/IDEC

TRAIL-R1

HGS-ETR1 cánceres HGS

TRAIL-R2

HGS-ETR2 tumores sólidos HGS

CD30

SGN30 linfoma hodgkiniano, LNH Seattle Genetics

CD40

SGN40 MM Seattle Genetics

HER2

Herceptin Cáncer de mama Genentech

EGF-R

ABX-EGF CCR, CPNM, CCR Abgenix

EMD72000

tumores sólidos Merck

MDX-214

tumores positivos para EGF-R Medarex

Erbitux

CCR Imclone

VEGF-R

CDP791 tumores sólidos Celltech

PDGF-R

CDP860 tumores sólidos Celltech/ZymoGenetics

CD11a(aL)

Raptiva psoriasis Genentech

integrina a4

Antegrin EC, EM PDL, Biogen-IDEC

integrina a4 7

MLM02 EC, CU Millenium

integrina a5 3

Vitaxina psoriasis, cáncer de próstata AME/Lilly

CD2 (LFA3/Fc)

Amevive psoriasis Biogen/IDEC

CD152

CTLA-4/Ig AR Bristol Meyers

CD152

CTLA-4 cánceres Medarex

CD49a

Integrina a1 AR/Lupus Biogen/IDEC

CD49e

Integrina a5 cánceres Protein Design Labs

MUC1

Theragyn

MUC18 (tipo TIM)

ABX-MA1 melanoma

Mucina TAG-72

Anatumomab cánceres

(continuación)

Objetivo

Nombre del fármaco Indicación clínica Empresa

CD3

Ecromeximab melanoma Kyowa Hakko

TRX4

DMID tipo I TolerRx

Nuvion

CU PDL

OrthoCloneOKT3

trasplante de órganos Ortho biotech

CD4

HuMax-CD4 Linfoma de linfocitos T GenMab

CD19

MT103 LNH Medimmune

CD64 (Fc GR1)

AntiCD64 cánceres Medarex

SIGLECs:

CD33

MyloTarg LMA Celltect/Wyeth

ZAmyl

LMA Protein Design Labs

CD22

lymphocide LNH, EAI Immunomedics

CEA

CEA-Cide cánceres Immunomedics

CD20

Rituxan LNH Genentech

CD52

Campath EM, LNH, linf. de linfocitos T Genzyme, IDEX

CD44

Bivatuzumab cánceres Boehringer Ingelheim

CD23 (Fc Ep R)

IDEC152 asma alérgica, rinitis Biogen/IDEC

LRR:

CD14

ICOSIC14 sepsis ICOS

EpCAM

Panorex cáncer colorrectal Centocor

Lewis-Y-Ag

SGN15 cánceres Seattle Genetics

CD80

B7,1 psoriasis/LNH Biogen/IDEC

1. IL-21 y anticuerpos monoclonales anti-CD20

El CD20 es un antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B humanos y se expresa como el antígeno de superficie de linfocitos B Bp35, una proteína de 35 kD. El CD20 se encuentra en linfocitos B periféricos y puede 5 identificarse sobre linfocitos B en maduración hasta la etapa de células plasmáticas (Reff et al., Blood 83:435-445, 1994). Se han probado anticuerpos monoclonales (AcM) anti-CD20 en la práctica clínica y, al menos un AcM anti-CD20 humanizado, el rituximab, se ha aprobado para el tratamiento del linfoma no hodgkiniano (LNH). El rituximab (RITUXAN®) se une a células de linfoma y puede inducir la apoptosis directamente in vitro, pero también puede inducir una variedad de mecanismos efectores tales como la citotoxicidad dependiente del complemento y la

10 citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (Shan et al., Blood 91:1644-1652, 1998). El rituximab se usa comúnmente como una primera línea de tratamiento para LNH (Maloney et al., Blood 90:2188-2195, 1997; en la patente de EE. UU N.º 5.736.137).

El rituximab es un AcM manipulado genéticamente con regiones variables de cadena ligera y pesada murinas y regiones constantes de cadena pesada gamma I y cadena ligera kappa humanas (en la patente de EE. UU. N.º 15 6.455.043). El anticuerpo quimérico está compuesto por dos cadenas pesadas de 451 aminoácidos y dos cadenas ligeras de 213 aminoácidos y tiene un peso molecular aproximado de 145 kD. En experimentos preclínicos, el anticuerpo inhibió el crecimiento celular en las líneas de linfocitos B FL-18, Ramos y Raji, e indujo la apoptosis en la línea DHL-4 de linfoma de linfocitos B humano de manera dependiente de dosis (Demidem et al. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 12:177-186, 1997). Se ha demostrado que el AcM tiene una semivida en suero

20 relativamente larga y que el perfil de toxicidad es relativamente bajo.

Sin embargo, una población de pacientes significativa es resistente o se vuelve resistente con el tiempo al tratamiento con anticuerpos anti-CD20, incluso cuando se combina con otros tratamientos, tales como trasplante de médula ósea o trasplante de células madre, radioterapia y quimioterapia. En general, estos pacientes no presentan remisión o regresión tumoral apreciables después de la administración de anticuerpos anti-CD20 y se beneficiarían 25 de nuevos tratamientos que potenciarían su capacidad de respuesta a los anticuerpos. Además, la potenciación de la actividad antitumoral también beneficiará a poblaciones de pacientes recién diagnosticados y que no habían sido

tratados anteriormente con agentes antineoplásicos "pacientes de novo" y a pacientes que no han recibido anteriormente ningún tratamiento con anticuerpos monoclonales "pacientes sin tratamiento previo".

Como se ha indicado anteriormente, se ha demostrado que la IL-21 expande el número de linfocitos NK y potencia los efectos citotóxicos de los linfocitos NK y los linfocitos T. Además, se han identificado receptores para IL-21 en monocitos, células dendríticas, linfocitos B, linfocitos T y linfocitos NK (Parrish-Novak et al., J. Leuk. Biol. 72:856863, 2002). Pruebas adicionales han demostrado que la IL-21 afecta a la proliferación y/o la diferenciación de linfocitos T y linfocitos B in vivo. Muchas líneas tumorales de linfocitos B humanos pueden injertarse en ratones IDCG y crecer de manera localizada o diseminada. En estos modelos, la medida del crecimiento tumoral o el tiempo de supervivencia del ratón huésped proporciona un medio para evaluar la eficacia terapéutica potencial contra cánceres de linfocitos B (Bonnefoix et al., Leukemia and Lymphoma 25:169-178, 1997).

Cuando los anticuerpos median un efecto antitumoral a través de CCDA por células de base inmunitaria (incluidos linfocitos NK, macrófagos y neutrófilos) las células efectoras inmunitarias destruyen las células cancerosas que están unidas por el complejo de anticuerpo. La IL-21 puede usarse para potenciar la eficacia del tratamiento con anticuerpos debido, en parte, a su actividad inmunomoduladora. Se ha investigado el tratamiento combinado con rituximab y una citocina usando IL-2, IL-12 o IFN-a para el tratamiento de linfoma hodgkiniano y no hodgkiniano (Keilholz et al., Leuk. Lymphoma 35:641-2,. 1999; Ansell et al., Blood 99:67-74, 2002; Carson et al., Eur. J. Immunol. 31:3016-25, 2001; y Sacchi et al., Haematologica 86:951-8., 2001).

Basándose en la capacidad de la IL-21 para activar y diferenciar efectores de CCDA, especialmente linfocitos NK, in vitro e in vivo, se realizaron estudios que combinaban IL-21 con anticuerpos y evaluaban la producción de citocinas, la citotoxicidad y la eliminación de tumores. Los estudios in vitro sometieron a ensayo la producción de citocinas y la lisis de células tumorales por linfocitos NK humanos tras la exposición a IL-21 y anticuerpo. Por ejemplo, puede evaluarse la lisis de células tumorales usando linfocitos NK aislados a partir de leucocitos de sangre periférica. Se cargan líneas de linfoma de linfocitos B humano, tales como DOHH2, Raji o Ramos, con calceína-AM o 51Cr, se exponen a IL-21 durante de 1-7 días y se mide la lisis celular mediada por linfocitos NK. Otro ensayo mide la producción de citocinas. Normalmente, en estos ensayos se exponen linfocitos NK purificados a IL-21 y se cultivan in vitro con IgG adherida a las placas. Se mide la presencia de citocinas tales como INF-y, TNF-a e IL-10. En la sección de ejemplos puede encontrarse la descripción detallada de estos tipos de ensayos. En el presente documento se enseñan estudios in vivo que monitorizan la supervivencia de los ratones después de la exposición del tumor. Otros posibles criterios de valoración para estudios in vivo pueden incluir pérdida de peso, disminución de la masa del tumor o parálisis de las extremidades posteriores (HLP, por sus siglas en inglés). Como se muestra en detalle en la sección de ejemplos, los resultados de estos experimentos demostraron que la actividad antitumoral contra tumores de linfocitos B CD20+ fue significativamente mayor para la combinación de rituximab e IL-21 que para rituximab o IL-21 solos. Otros experimentos en modelos animales adicionales, incluidos primates, proporcionan pruebas adicionales de la potenciación de IL-21 de la eficacia mediada por rituximab y constituyen la base para probar la combinación en pacientes con linfoma.

Los linfocitos, que incluyen linfocitos B, linfocitos T, linfocitos NK y células dendríticas y sus progenitores, tienen un ciclo de vida que implica la migración hacia o desde diversos tejidos linfoides y no linfoides. Se cree que todos los linfocitos maduran a partir de un progenitor linfoide multipotente que reside en la médula ósea. Los linfocitos indiferenciados circulan entre la sangre y tejidos linfoides secundarios hasta que las células mueren o se activan por antígenos. Cuando los linfocitos B o T se activan por antígeno, las células activadas recirculan a la sangre. Existen pruebas que indican que las quimiocinas desempeñen un papel importante en el tráfico de linfocitos. Se cree que la expresión de quimiocinas específicas, tales como CXCR3, promueve el tráfico de linfocitos B malignos desde un sitio a otro, desempeñando un papel en la migración de linfomas de linfocitos B a la sangre periférica, los ganglios linfáticos, la médula ósea y otros órganos (Trentin et al., J. of Clinical Invest. 104:115-121, 1999.) Se ha demostrado que el rituximab provoca la depleción de los linfocitos B presentes en la sangre periférica y los ganglios linfáticos periféricos (Reff et al. Blood 83:435-445, 1994) y la administración de un agente que conduzca los linfocitos CD20+ a estos tejidos proporcionaría un mecanismo para hacer a las células malignas previamente inaccesibles más sensibles a la destrucción mediada por rituximab. Se ha demostrado que la IL-21 tiene efectos tanto directos como indirectos sobre los linfocitos B (Parrish-Novak et al., J. Leukoc. Biol. 72:856-863, 2002; Mehta et al., J. Immunol 170:4111-4118, 2003; Ozaki et al., J. Immunol. 173:5361-5371, 2004.) y se sabe que afecta al proceso de maduración en determinadas células inmunitarias (Sivakumar et al., Immunol. 112:177-182, 2004.)

Los experimentos divulgados en el presente documento describen el descubrimiento de los presentes inventores de que la administración de IL-21 reducía inicialmente los linfocitos B, los linfocitos T y los linfocitos NK en circulación, seguido de un aumento sostenido y la resolución antes del siguiente ciclo de administración. La rápida inversión de la linfopenia y la depleción de folículos linfoides puede entenderse como la marginación transitoria de linfocitos activados combinada con un aumento de la recirculación desde los tejidos linfoides a la sangre. El aumento de linfocitos B periféricos se mitigó cuando se administraron IL-21 y rituximab y, de forma coherente, se observó una concentración mínima de linfocitos B más baja que la observada cuando se administraron IL-21 o rituximab solos. Por tanto, la IL-21 incrementa el potencial de depleción de linfocitos B por el rituximab, promoviendo la recirculación de linfocitos B que son susceptibles a la depleción. Además, la administración de IL-21 dio como resultado la potenciación de la actividad CCDA, con un aumento del número de linfocitos NK y células fagocíticas que expresan FcyRI y FcyRIII presentes cuando se realizaron ensayos de CCDA.

Se ha demostrado que los neutrófilos son importantes para la actividad antitumoral del rituximab en modelos de linfoma B xenogénico (Hernandez-Ilizaliturri Clin. Cancer Res. 9(16 Pt. 1):5866-73. 2003). El papel de los granulocitos en la actividad antitumoral de mIL-21+rituximab se muestra por depleción con un AcM anti-Gr-1. Se expusieron grupos de ratones IDCG con y sin depleción de granulocitos a células Raji y después se trataron con rituximab solo o rituximab más mIL-21 como se describe en el ejemplo 10. La depleción de granulocitos redujo la supervivencia de ratones IDCG tratados con rituximab solo y con rituximab más mIL-21. Comparando grupos tratados con tratamiento combinado, la fracción superviviente después de 125 días se redujo de 0,67 a 0,0 para los animales con depleción de granulocitos. Sin embargo, la depleción de granulocitos no eliminó totalmente el beneficio de supervivencia de la IL-21 más rituximab, dado que resulta evidente un retraso significativo en el tiempo medio hasta la muerte (TTD) frente al grupo de control de vehículo.

Recientemente se ha demostrado que los macrófagos expresan receptores de IL-21 (Pelletier et al. J. Immunol 173 (12): 7521-30, 2004) y desempeñan un papel en la depleción de linfocitos B por AcM anti-CD20 (Uchida et al. J. Exp. Med. 199 (12): 1659-69, 2004). La depleción de macrófagos en ratones IDCG se realizó usando liposomas de clodronato y se probó IL-21 más rituximab en el modelo de linfoma de Raji diseminado. La depleción con liposomas de clodronato eliminó el 95 % de las células F4/80+ del hígado y el 90 % de las células F4/80+ de la pulpa roja del bazo. Se realizó la depleción de macrófagos tres días después de inyectar células Raji y se mantuvo la depleción de macrófagos hasta al menos de 27 días después de la inyección de células tumorales mediante inyección de liposomas de clodronato repetidas. La depleción de macrófagos también redujo la eficacia de la mIL-21 más rituximab. El TTD medio se redujo significativamente para los grupos tratados con liposomas de clodronato. Asimismo, se produjo una caída drástica de la mediana del tiempo de supervivencia en ratones IDCG con depleción de macrófagos tratados con rituximab solo en comparación con el grupo de ratones sin depleción correspondiente.

La depleción de neutrófilos con anti-Gr-1 redujo drásticamente la eficacia del rituximab solo como ya han comunicado otros autores (Hernandez-Ilizaliturri, ibíd. 2003) y los experimentos mostraron que reducía la fracción de ratones supervivientes después del tratamiento con IL-21 más rituximab de 0,67 a 0,0. La IL-21 pueda actuar directamente afectando a los neutrófilos de ratón que, a su vez, pueden fagocitar células tumorales, efectuar la CCDA o producir intermedios de oxígeno citotóxicos. Pero la acción directa de la IL-21 sobre neutrófilos no está respaldada por estudios de neutrófilos humanos (Pelletier, ibíd.) donde no se detectaba el IL-21Ra y la IL-21 no modulaba las respuestas de neutrófilos, incluidas la producción de superóxido, la fagocitosis, la quimiotaxis y la producción de citocinas. En su lugar, estos autores descubrieron que la IL-21 inducía la producción de IL-8 por macrófagos humanos que pueden dar lugar a quimiotaxis y activación de neutrófilos. Sin embargo, cuando se realizaron experimentos que respaldaban la presente invención, la depleción de macrófagos usando liposomas de clodronato dio como resultado una pérdida sólo parcial de la actividad antitumoral sinérgica presentada por IL-21 y rituximab. Estos resultados indicaron que en ratones IDCG tanto los neutrófilos como los macrófagos desempeñan un papel en la prolongación de la supervivencia con tratamiento combinado. Estudios recientes (Uchida et al., ibíd.) de depleción de linfocitos B normales con AcM anti-CD20 murinos también muestran que los macrófagos de ratón son la principal célula efectora necesaria y que los linfocitos NK no son esenciales, aunque en ese estudio no se investigaron los neutrófilos.

Estos hallazgos demuestran que la IL-21 en combinación con rituximab posee actividad antitumoral sinérgica en modelos de linfoma de linfocitos B xenogénico y que las células efectoras de la inmunidad innata colaboran en la mediación de los efectos sinérgicos de la IL-21 y el rituximab. Estos resultados indican que en ratones IDCG tanto los neutrófilos como los macrófagos desempeñan un papel en la prolongación de la supervivencia con tratamiento combinado. La IL-21 promueve la actividad antitumoral del rituximab en LNH y la acción de la IL-21 sobre macrófagos, linfocitos NK, linfocitos T y los propios tumores de linfoma, mejora la respuesta al tratamiento con rituximab.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento de pacientes con linfoma mediante la administración de IL-21 en combinación con rituximab en pacientes donde la liberación de células malignas desde los tejidos es necesaria para la actividad antitumoral mediada por rituximab. Además, serán ventajosas pautas de administración que mantienen los niveles de IL-21 cuando el rituximab está presente en la sangre periférica del paciente y se incluyen en la presente invención. En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento del linfoma en un paciente que lo necesita que comprende administrar IL-21 durante el periodo de tratamiento cuando se determina que el rituximab está presente en la sangre periférica del paciente. En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento del linfoma en un paciente que lo necesita que comprende administrar IL-21 de una a tres veces por semana mientras el paciente recibe tratamiento con rituximab.

La clasificación de linfomas no hodgkinianos usada más comúnmente es el sistema de clasificación REAL (Ottensmeier, Chemico-Biological Interactions 135-136:653-664, 2001.) Se han identificado marcadores inmunológicos específicos para la clasificación de linfomas. Por ejemplo, los marcadores de linfoma folicular incluyen CD20+, CD3-, CD10+, CD5-; los marcadores de linfoma linfocítico microcítico incluyen CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+; los marcadores de linfoma de linfocitos B de la zona marginal incluyen CD20+, CD3-, CD10-, CD23-; los marcadores de linfoma difuso de linfocitos B grandes incluyen CD20+, CD3-; los marcadores de linfoma de células del manto incluyen CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+; los marcadores de linfoma periférico de linfocitos T incluyen CD20-, CD3+; los marcadores de linfoma de linfocitos B grandes del mediastino primario incluyen CD20+,

CD3-; los marcadores de linfoma linfoblástico incluyen CD20-, CD3+, Tdt+; y los marcadores de linfoma de Burkitt incluyen CD20+, CD3-, CD10+, CD5- (Decision Resourses, Non-Hodgkins Lymphoma, Waltham, MA., feb. 2002).

La clasificación clínica de linfoma no hodgkiniano (LNH) de la International Working Formulation divide la enfermedad en subtipos: (1) enfermedad de grado bajo (de escasa malignidad) que incluye linfocítico microcítico, consistente con leucemia linfocítica crónica (SC); folicular, predominantemente de células pequeñas hendidas (FSC); folicular, de células pequeñas hendidas y grandes mezcladas (FM); (2) enfermedad de grado intermedio que incluye folicular, predominantemente de células grandes (LF); difuso, de células pequeñas hendidas (DSC); difuso mixto, de células pequeñas y grandes (DM); difuso, de células grandes hendidas o no hendidas (DL); y (3) enfermedad de grado alto que incluye immunoblástico, de células grandes (IBL); linfoblástico, de células convolutas o no convolutas (II); y de células pequeñas no hendidas, burkittiano o no burkittiano (SNC); (The Non-Hodgkin’s Lymphoma Pathologic Classification Project, Cancer 49 (10):2112-35, 1982). El sistema de estadificación de Ann Arbor se usa comúnmente para estadificar a pacientes con LNH. El estadio I significa la implicación de una sola región de ganglio linfático o implicación localizada de un sólo órgano o sitio extralinfático. El estadio II significa la implicación de dos o más regiones de ganglio linfático del mismo lado del diafragma o implicación localizada de un sitio u órgano extranganglionar y una o más regiones de ganglio linfático del mismo lado del diafragma. El estadio III significa la implicación de regiones de ganglio linfático de ambos lados del diafragma, posiblemente acompañada de implicación localizada de un órgano o sitio extraganglionar. El estadio IV significa implicación difusa o diseminada de uno o más órganos extraganglionares alejados con o sin implicación de ganglios linfáticos asociada ("Lymphoid neoplasms". En: American Joint Committee on Cancer: AJCC Cancer Staging Manual. 6ª ed. Nueva York, NY: Springer, 2002, pág. 393-406). Se ha demostrado que el rituximab es eficaz en el tratamiento de linfomas de escasa malignidad y foliculares (Boye et al., Annals of Oncol. 14:520-535, 2003).

La actividad de la IL-21 en combinación con anticuerpos anti-CD20 sobre el crecimiento y la diseminación de células tumorales derivadas de neoplasias malignas hematológicas humanas puede medirse in vivo. Se han desarrollado varios modelos de ratón en los que se implantan células tumorales humanas en ratones inmunodeficientes (denominados en conjunto modelos de xenoinjerto); véanse, por ejemplo, Cattan et al., Leuk. res. 18:513-22, 1994 y Flavell, Hematological Oncology 14:67-82, 1996. Las características del modelo de enfermedad varían con el tipo y la cantidad de células administradas al ratón y se conocen varios modelos de enfermedad en la técnica. Por ejemplo, pueden tratarse linfomas de linfocitos B humanos (p. ej. LR, Raji, TU2C) hechos crecer y diseminados en ratones IDCG con AcM e IL-21 para prolongar la supervivencia usando modelos conocidos por los expertos en la técnica. Para modelos ejemplares, véanse Funakoshi et al., J. Immunotherapy 19:93-101, 1996; Funakoshi et al., Blood 83:2787-94, 1994; Cattan et al., Leukemia Res. 18:513-522, 1994. De forma alternativa, pueden implantarse líneas celulares de linfoma de linfocitos B de ratón (A20, BCL, A31) y tratarse con AcM e IL-21 para prolongar la supervivencia (French et al., Nat. Medicine 5:548-553, 1999; Tutt et al., J. Immunol. 161:3176-3183, 1998). En un modelo, se pasan células tumorales (p. ej., células Raji (ATCC N.º CCL-86)) en cultivo y se inyectan aproximadamente 1x106 células por vía intravenosa en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (IDCG). Tales células tumorales proliferan rápidamente dentro del animal y pueden encontrarse circulando en la sangre y poblando numerosos sistemas de órganos. Se prueban tratamientos diseñados para destruir o reducir el crecimiento de células tumorales usando IL-21 y AcM anti-CD20 mediante la administración de IL-21 y AcM a ratones portadores de las células tumorales. La eficacia del tratamiento se mide y se evalúa estadísticamente como un aumento de la supervivencia en la población tratada con el tiempo. También puede monitorizarse la carga tumoral a lo largo del tiempo usando procedimientos bien conocidos tales como citometría de flujo (o PCR) para cuantificar el número de células tumorales presentes en una muestra de sangre periférica.

Los modelos animales que pueden usarse para demostrar la eficacia del tratamiento combinado usando IL-21 y AcM anti-CD20 incluyen modelos de primates no humanos de depleción de linfocitos B. Por ejemplo, mediante el tratamiento de macacos cangrejeros con vehículo o 0,05 mg/kg o 10,0 mg/kg de rituximab se identificaron diversas poblaciones de linfocitos B CD20, CD40 y CD21 como útiles para el estudio de tratamientos anti-CD20 (Vugmeyster et al., Internat. Immunol. 3:1477-1481, 2003).

En general, el tratamiento con rituximab para enfermedades de escasa malignidad consiste en cuatro infusiones de 375 mg/m2 una vez por semana. La velocidad de infusión inicial es de 50 mg/h y aumenta hasta un máximo de 400 mg/h en incrementos de 50 mg cada 30 minutos (McLaughlin et al., Clinical Oncol. 16:2825-2833, 1998). Sin embargo, el tratamiento prolongado de ocho semanas ha demostrado cierta eficacia en el tratamiento para LNH de grado bajo o foliculares resistentes al tratamiento o en recidiva (Piro et al., Ann. Oncol. 10:619-621, 1999).

El establecimiento de la dosis y la pauta de administración óptimas para el tratamiento combinado de IL-21 y AcM anti-CD20 se realiza usando varios medios, incluidos la farmacocinética y farmacodinámica de la combinación, la sensibilidad de líneas de linfoma de linfocitos B humano y de muestras de linfoma primario a una combinación de IL21 y AcM anti-CD20 in vitro, las dosis eficaces en modelos animales y la toxicidad de la combinación. Las medidas farmacocinéticas directas pueden realizarse en primates. Además, la IL-21 y los AcM anti-CD20 estimulan una variedad de respuestas en linfocitos normales, de modo que puede medirse la eficacia clínica en modelos animales normales. Además, pueden emplearse marcadores sustitutos para medir la actividad biológica de la combinación de IL-21 y AcM anti-CD20 sobre células efectoras en pacientes. Los marcadores sustitutos incluyen, entre otros, disminuciones significativas de las poblaciones de linfocitos B, aumentos en la población de linfocitos NK, activación de monocitos/macrófagos, aumento de FcRIII, aumento de la citotoxicidad de linfocitos T o NK sobre células CD20+

en presencia de anticuerpos anti-CD20. Los sustitutos son valiosos como indicadores de eficacia porque determinar respuestas tumorales terapéuticas tales como un aumento de la supervivencia puede requerir meses o años.

El tratamiento del linfoma, tal como el LNH o la leucemia linfoblástica crónica (LLC), usando una combinación de IL21 y rituximab se demuestra usando estudios clínicos donde se investigan la seguridad y la eficacia. Inicialmente, se demuestra la seguridad en un estudio de fase I, que es un estudio abierto de dosis que aumentan hasta que se identifica una dosis máxima tolerada (DMT) o una dosis inmunológica óptima. Una dosis inmunológica óptima se define como la dosis de IL-21 o IL-21 en combinación con un anticuerpo monoclonal que logra la respuesta inmunológica óptima. Una respuesta inmunológica óptima se refiere a un cambio de una respuesta inmunológica después de la administración de IL-21 o la combinación de IL-21 + AcM con respecto a la observada cuando se administra el AcM solo y puede medirse como se describe en el presente documento.

Los participantes en un estudio de fase I inicial son sujetos con LNH CD20+ en recidiva o resistente al tratamiento. El aumento de la dosis se evalúa en cohortes de 3 a 6 sujetos en un esquema de aumento de dosis de 3 más 3 estándar. Se evalúan cohortes de 3 sujetos para determinar cualquier toxicidad limitante de la dosis (TLD) que se produzca al final de la cuarta semana. En ausencia de TLD, se produce el aumento de la dosis. Si en 1 de cada 3 se observa toxicidad limitante de la dosis, se incluyen 3 sujetos adicionales a ese nivel de dosis. Si > 1 sujetos en una cohorte dada experimentan toxicidad limitante de la dosis, entonces se produce una disminución de la dosis y se trata a 3 sujetos a una dosis intermedia que debe especificar el comité de vigilancia de datos y seguridad (CVDS). La dosis se encontraría entre la dosis que provocó la TLD y la siguiente dosis más baja. Si 0 de cada 3 pacientes experimentan una TLD a la dosis intermedia, entonces se interrumpe la inclusión y la dosis intermedia se declararía la DTM. Si �1 de cada 3 sujetos experimenta TLD a la dosis intermedia, entonces se interrumpe la inclusión y el nivel de dosis por debajo de ese se declararía la DMT.

A los sujetos se les administra rituximab, por vía intravenosa (IV) a 375 mg/m2, una vez por semana y se les administra durante cuatro u ocho semanas consecutivas. La IL-21 se administra por inyección, bien por vía de administración IV, o intramuscular (IM) o subcutánea (SC). A la primera cohorte se le administra al menos 1 µg/kg y las dosis aumentan hasta la DMT o una dosis inmunológica óptima, de una manera gradual, por ejemplo, aumentando desde 3-10, 10-100, 100-300, 300-500, 500-900 y hasta 1000 µg/kg de una a cinco veces por semana. La presente divulgación proporciona composiciones de IL-21 en las que cada dosis está en un intervalo de aproximadamente 1 µg/kg a 1000 µg/kg. En determinadas realizaciones, la dosis de IL-21 está en el intervalo de 10 a 300 Ig/kg.

La respuesta tumoral se usa para evaluar la actividad clínica primaria. Para evaluar la respuesta antitumoral, se produce la reestadificación en las semanas 4, 8 y 12 usando, por ejemplo, el seminario internacional para la normalización de los criterios de respuesta para linfomas no hodgkinianos (Cheson et al, J. Clin. Oncol. 17:12441253, 1999). Los marcadores farmacodinámicos de la IL-21 se usan como indicadores secundarios de actividad clínica.

Los acontecimientos adversos y las evaluaciones analíticas de seguridad estándar se usan para evaluar la seguridad. El análisis del suero para detectar anticuerpos frente a IL-21 se realizará para evaluar la inmunogenicidad.

La toxicidad limitante de la dosis se define usando los criterios terminológicos comunes para acontecimientos adversos (CTCAE, por sus siglas en inglés), versión 3, con fecha del 12 de diciembre de 2003, como cualquiera de los siguientes:

•

Cualquier acontecimiento adverso de grado 4 o 5 probable o definitivamente relacionado con el agente en estudio

•

Acontecimientos adversos de grado 3 no hematológicos probable o definitivamente relacionados con el agente en estudio, EXCEPTO aquellos relacionados con linfopenia de � 7 días de duración, reagudización de tumores, fiebre, malestar general o anomalías analíticas que no son potencialmente mortales de grado 3 que son clínicamente insignificantes.

La eficacia y la seguridad se evalúan más a fondo en estudios clínicos de fase II y fase III. En estos estudios pueden caracterizarse farmacocinética, farmacodinámica, farmacogenética, farmacogenómica e inmunogenicidad adicionales. Un criterio de valoración principal se identifica de acuerdo con el seminario internacional para la normalización de los criterios de respuesta para linfomas no hodgkinianos (Cheson et al., ibíd.) y de acuerdo con las directrices reguladoras. Los criterios de valoración secundarios pueden incluir la incidencia y la gravedad de los acontecimientos adversos, el tiempo hasta la progresión, el tiempo hasta la recidiva de pacientes con respuesta completa, la supervivencia global y la incidencia de desarrollo de cualquier anticuerpo frente a IL-21. El estudio puede ser un estudio aleatorizado de dos ramas que compara el tratamiento con rituximab solo y con rituximab combinado con IL-21 en pacientes que no toleran o eligen no recibir quimioterapia. Los sujetos recibirán rituximab, administrado IV a 375 mg/m2, una vez por semana y administrado durante cuatro u ocho semanas consecutivas. La IL-21 se administra IV o SC como una infusión secuencial en el mismo día y hasta cinco días de forma consecutiva, y las dosis de IL-21 estarán en el intervalo de 1-3, 3-10, 10-100, 100-300, 300-500, 500-900 y hasta 1000 µg/kg. De

forma alternativa, puede iniciarse un estudio aleatorizado de tres ramas para evaluar la seguridad y la eficacia de la IL-21 en combinación con rituximab frente a la IL-21 sola frente a rituximab solo usando criterios similares para el diseño del ensayo. El diseño de ensayos clínicos es bien conocido por los expertos en la técnica y las directrices proporcionadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés), por ejemplo en la página web de herramientas de oncología de la FDA.

La DLT-21 y la IL-15 o la IL-2 presentan sinergia en sus efectos sobre los linfocitos NK in vitro con respecto a la producción de IFN-y, citotoxicidad y proliferación (Parrish-Novak et al., J. Leuk. Biol. 72:856-863, 2002). Sin embargo, el tratamiento con IL-2 con dosis altas es altamente tóxico y requiere hospitalización prolongada. Se han probado muchos regímenes con dosis bajas de IL-2 y se ha descubierto que se toleran mejor, pero con pocas pruebas de eficacia antitumoral (Atkins, Semin. Oncol. 29 (3 supl. 7): 12, 2002). El tratamiento combinado de IL-2 y rituximab se describe en el documento WO 03/049694, donde se administra IL-2 a una dosis de "carga" mayor, seguida de una o más dosis de "mantenimiento" más bajas. La necesidad de continuar la administración de IL-2 se basa en mantener los niveles de linfocitos NK a niveles más altos de lo normal, pero debido a la toxicidad de la IL-2, puede ser necesario un periodo de descanso en el que no se administre IL-2. La administración de la combinación de IL-2 e IL-21 además de AcM anti-CD20 mantendrá los linfocitos NK y permitirá una administración más baja o menos frecuente de IL-2. Algunos de los efectos secundarios observados con dosis altas de IL-2 no se han demostrado al administrar IL-21. Por ejemplo, cuando se administró IL-21 a ratones a la dosis y la pauta de IL-2 que se ha comunicado que provocan síndrome de filtración capilar en ratones, no se presentó el síndrome de filtración capilar. Los resultados muestran claramente que la IL-21 no provoca la liberación de citocinas y la vasculitis asociadas con una dosis equivalente en masa de rIL-2 en ratones (Heipel et al., Blood 102 (11): N.º 2845, 2003). Por lo tanto, la combinación de dosis bajas de IL-2 con IL-21 y AcM anti-CD20 puede ser clínicamente útil aumentando la estimulación del sistema inmunitario de dosis bajas de IL-2 sin determinados efectos secundarios provocados por dosis mayores de IL-2.

La administración de IL-21 en combinación con AcM anti-CD20, tales como rituximab, usando los procedimientos de la presente divulgación dará como resultado un efecto antitumoral, denominado también respuesta tumoral. Las directrices normalizadas para la evaluación de la respuesta al tratamiento para el LNH son conocidas por los expertos en la técnica. Un conjunto de criterios normalizados ejemplares se describe en Cheson et al., J. of Clinical Oncol. 17:1244-1253, 1999. El International Working Group expuso recomendaciones y definiciones de medidas de respuesta. La tabla 2 resume los criterios de respuesta.

Tabla 2

Categoría de la respuesta

Exploración física Ganglios linfáticos Masas de los ganglios linfáticos Médula ósea

Respuesta completa (RC)

Normal Normal Normal Normal

Respuesta completa no confirmada (RCnc)

Normal Normal Normal Indeterminado

Respuesta parcial (RP)

Normal Normal Normal Positivo

RP

Normal 50 % de reducción 50 % de reducción Irrelevante

RP

Disminución en hígado/bazo 50 % de reducción 50 % de reducción Irrelevante

Recidiva/Progresión

Aumento del tamaño del hígado/bazo; sitios nuevos Nuevos o aumentados Nuevos o aumentados Reaparición

Asimismo, pueden usarse marcadores sustitutos para indicar una actividad antitumoral potenciada. Por ejemplo, un cambio en las enzimas séricas y la biopsia puede demostrar una disminución de la carga tumoral.

Una medida de bioactividad que puede usarse como sustituta del efecto antitumoral es el mantenimiento de los niveles de linfocitos NK a un nivel que potencia el efecto antitumoral de un AcM anti-CD20 (Friedberg et al., Br. J. Hematol. 117:828-834, 2002). Otro sustituto es el aumento del número de linfocitos T (Parrish-Novak et al., ibíd. 2002). En particular, el aumento del número de células para un subconjunto de linfocitos T se ha correlacionado con el aumento de la actividad citotóxica o el efecto antitumoral. Otra medida de bioactividad que puede usarse como sustituta para el efecto antitumoral es la depleción de linfocitos B (Reff et al., Blood 83:435-445, 1994).

2. Uso de IL-21 y anticuerpos monoclonales anti-Her-2/neu en tratamiento combinado

El producto del gen Her-2/neu es una fosfoglucoproteína de 185 kDa que está relacionada con el receptor del factor

de crecimiento epidérmico. Her-2/neu funciona como un receptor del factor de crecimiento y se expresa frecuentemente en tumores tales como cáncer de mama, cáncer de ovario y cáncer de pulmón. El receptor Her2/neu se sobreexpresa en el 25-30 % de los cánceres de mama humanos (Slamon et al. Science 235: 177-182, 1987; Slamon et al., Science 244:707-712, 1989) y se asocia con un pronóstico malo en estos pacientes.

Existen una serie de anticuerpos monoclonales que se dirigen a Her-2/neu, pero el HERCEPTIN®, el nombre comercial para el trastuzumab (Genentech, Inc., San Francisco, CA) es actualmente el único agente terapéutico autorizado para el tratamiento de pacientes con cáncer positivo para Her-2/neu. Pueden encontrarse cantidades pequeñas de Her-2/neu en muchos tipos de células normales, y las células cancerosas tienen una expresión modificada que da lugar a la sobreexpresión y el aumento de la proliferación celular y la diferenciación asociadas con el fenotipo de la célula cancerosa. Sin embargo, el tratamiento satisfactorio con trastuzumab requiere que la expresión de Her-2/neu esté altamente sobreexpresada. Los niveles de expresión de Her-2/neu pueden determinarse usando muestras de biopsia fijadas y teñidas inmunohistológicamente. Estos tipos de ensayos son bien conocidos en la técnica e incluyen evaluaciones inmunohistoquímicas usando el anticuerpo monoclonal 4D5 (LabCorp, Research Triangle Park, NC), HerceptTest® (DAKO, Glostrup, Dinamarca) y el kit de sondas de ADN de HER-2 Vysis PathVysionTM (Fujisawa Profesional, Inc., North Deerfield, IL). En general, los niveles de Her-2/neu son de 0 (normal) a 3+ y se ha demostrado que el tratamiento con trastuzumab es eficaz en pacientes con niveles de expresión 2+ o superiores.

Se ha demostrado que la IL-21 (p. ej., en el ejemplo 6) promueve la actividad lítica en linfocitos NK y linfocitos T efectores inmunitarios en modelos tanto in vitro como in vivo con líneas celulares de cáncer de mama humano que expresan niveles del receptor Her-2/Neu altos o más bajos. La función efectora mediada por IL-21 potenciada da como resultado que el tratamiento con trastuzumab sea eficaz incluso cuando las células cancerosas expresan niveles bajos del receptor de Her-2/neu. Por ejemplo, pacientes con niveles de sobreexpresión 1+ o 2+ tratados con IL-21 y trastuzumab serán candidatos para el tratamiento, proporcionando una tratamiento valioso para poblaciones de pacientes no tratados anteriormente. Pueden usarse ratones portadores de carcinomas murinos que expresan Her-2/neu para probar IL-21 en combinación con AcM antiHer-2/neu (Penichet, et al., Lab Anim. Sci. 49:179-188, 1999).

Aunque cada protocolo puede definir de forma diferente las evaluaciones de la respuesta tumoral, pueden encontrarse directrices ejemplares en el Clinical Research Associates Manual, Southwest Oncology Group, CRAB, Seattle, WA, 6 de octubre, 1998, actualizado en agosto de 1999. De acuerdo con el manual de la CRA (véase, el capítulo 7 "Response Accessment"), la respuesta tumoral significa una reducción o eliminación de todas las lesiones

o metástasis medibles. En general, la enfermedad se considera medible si comprende lesiones medibles en dos dimensiones con márgenes claramente definidos mediante fotografía médica o rayos X, tomografía axial computerizada (TAC), formación de imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN) o palpación. Enfermedad evaluable significa que la enfermedad comprende lesiones medibles en una dimensión, masas con márgenes no definidos claramente, lesiones con ambos diámetros inferiores a 0,5 cm, lesiones en escáner con cualquiera de los diámetros menores que la distancia entre los cortes, lesiones palpables con diámetros menores de 2 cm o enfermedades óseas. Enfermedad no evaluable incluye derrames pleurales, ascitis y enfermedades documentadas por pruebas indirectas. En general, también se consideran no evaluables las lesiones irradiadas con anterioridad que no han progresado.

Los criterios para el estado objetivo son necesarios para protocolos de evaluación de la respuesta de tumores sólidos. Un criterio representativo incluye los siguientes: (1) Respuesta completa (RC) definida como la desaparición completa de la totalidad de la enfermedad medible y evaluable. Ausencia de lesiones nuevas. Ausencia de síntomas relacionados con la enfermedad. Ausencia de enfermedad no evaluable; (2) Respuesta parcial (RP) definida como una disminución igual o superior al 50 % con respecto al valor inicial de la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones medibles. Ausencia de progresión de enfermedad evaluable. Ausencia de lesiones nuevas. Se aplica a pacientes con al menos una lesión medible; (3) Progresión definida como un aumento del 50 % o de 10 cm2 de la suma de los productos de las lesiones medibles con respecto a la suma más pequeña observada usando las mismas técnicas como valor inicial, o un empeoramiento claro de cualquiera de las enfermedades evaluables, o reaparición de cualquier lesión que había desaparecido, o aparición de cualquier lesión nueva, o incapacidad de retorno para la evaluación debido a la muerte o el deterioro del estado general (a menos que no esté relacionado con este cáncer); (4) Estable o sin respuesta definido como que no cumple los requisitos de RC, RP o Progresión. (véase, Clinical Research Associates Manual, supra.)

La invención se ilustra adicionalmente con los ejemplos no limitantes siguientes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

La IL-21 potencia la actividad dependiente de anticuerpos de los linfocitos NK

A.

Se obtuvo sangre periférica y se prepararon células mononucleares (CMN) mediante centrifugación en Ficoll. Se

purificaron linfocitos citolíticos naturales (NK) a partir de la población de CMN mediante enriquecimiento negativo, usando el kit de enriquecimiento negativo de linfocitos NK humanos StemSep™ Human NK Cell de Stem Cell Technologies (Vancouver, Columbia Británica). Brevemente, se marcaron las CMN con anticuerpos específicos de linaje (excluyendo el linaje NK) y a su vez se marcaron magnéticamente. Después, se pasaron las CMN marcadas por una columna magnética donde las células marcadas se retuvieron y los linfocitos NK fluyeron a su través.

Se plaqueraron los linfocitos NK a una densidad de 5x105 células/ml y se cultivaron durante 3 días en aMEM/suero autólogo al 10 %/ -mercaptoetanol 50 µM, con 0, 1, 10 o 100 ng/ml de hIL-21 (A794F) o 10 ng/ml de IL-12 (control positivo), todo en presencia o ausencia de estimulación de Fc. La estimulación de Fc se proporcionó plaqueando 100 µg/ml de hIgG en PBS sobre plástico a 37 °C durante 1 hora, después se retiró la solución de PBS/anticuerpo y se cultivaron los NK sobre esa superficie. Después del periodo de cultivo de tres días, se recogieron los sobrenadantes. Se cuantificó el IFN-y de los sobrenadantes usando el kit de ELISA de IFN-y humano OptEIA de BD (BD Biosciences, San José, CA). Se representaron los resultados en forma de histograma, expresando ng/ml de IFN-y por muestra.

En presencia de estimulación de Fc, la IL-21 provocó un aumento dependiente de la dosis de la producción de IFN-y. A la dosis máxima de IL-21 probada en este experimento (100 ng/ml) se produjo un aumento de aproximadamente 18 veces con respecto al nivel basal. En ausencia de estimulación de Fc, no se observó un aumento de la producción de IFN-y en presencia de IL-21.

B.

Se obtuvieron leucocitos de sangre periférica por leucoféresis de un programa de donantes. Se prepararon células mononucleares (CMN) a partir de sangre sometida a aféresis mediante centrifugación en Ficoll. Se purificaron linfocitos citolíticos naturales (NK) a partir de la población de CMN mediante enriquecimiento negativo, usando el kit de enriquecimiento negativo de linfocitos NK humanos de Stem Cell Technologies. Brevemente, se marcaron las CMN con anticuerpos específicos de linaje (excluyendo el linaje NK) y a su vez se marcaron magnéticamente. Después, se pasaron las CMN marcadas por una columna magnética donde las células marcadas se retuvieron y los linfocitos NK fluyeron a su través.

Se plaqueraron los linfocitos NK a una densidad de 1x106/ml y se cultivaron durante 1, 2, 3, 4, 6 o 7 días en aMEM/suero AB humano inactivado por calor al 10 %/beta mercaptoetanol 50 µM/ITS (GibcoBRL de Invitrogen, Carlsbad, CA)/150 µg/ml de transferrina complementaria/5 mg/ml de BSA, en presencia o ausencia de 0,2, 1, 5, 25 o 100 ng/ml de IL-21 humana. Al final de cada periodo de cultivo, se recogieron los linfocitos NK, se lavaron, se contaron y se colocaron en un ensayo citolítico de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA), usando una línea celular de linfoma (Ramos, CRL 1596, American Type Culture Collection, Manassas, VA) como el objetivo citolítico. Las células objetivo se marcaron antes del ensayo incubándolas durante 60 minutos a 37 °C en solución salina tamponada de Hank (sin Ca o Mg) con FBS al 5 % (HBSSF) y calceína AM 10 µM (Molecular Probes, n.º de cat C1430). Las células objetivo incorporan la tinción fluorescente (calceína AM) y la convierten en el citoplasma en el fluorocromo activo, que sólo se libera de la célula tras la lisis. Las células lisadas liberan el fluorocromo al sobrenadante, que después se recoge y se cuantifica la cantidad de fluorescencia en un fluorímetro. El porcentaje de lisis celular se calculó a partir de la cantidad de fluorescencia presente en el sobrenadante después de una incubación de 3 horas en presencia o ausencia de cantidades variables de linfocitos NK (efectores). Durante el ensayo de CCDA, se usaron objetivos sin anticuerpo añadido, con 1 µg/ml de IgG no pertinente o con 1 µg/ml de rituximab.

Se probaron dos donantes. Los linfocitos NK del donante A se cultivaron en 0, 1, 5, 25 o 100 ng/ml de IL-21 humana, con puntos temporales en los días 1, 2, 3, 4 y 7. Los linfocitos NK del donante B se cultivaron en 0, 0,2, 1, 5 o 25 ng/ml de IL-21 humana, con puntos temporales en los días 1, 2, 3, 4, 6 y 7. En ambos donantes se observó una potenciación (3-10 veces) de la actividad citolítica frente a las células objetivo en presencia de rituximab, en comparación con el control de IgG no pertinente. Esta potenciación de la actividad citolítica aumentó adicionalmente (2-10 veces) cuando se cultivaron los linfocitos NK en presencia de IL-21 antes del ensayo.

Los cultivos del donante A no mostraron ninguna diferencia significativa en la potenciaron de la CCDA entre las dosis de IL-21 probadas (1, 5, 25 o 100 ng/ml) excepto en el día 7, cuando el cultivo de NK con 1 ng/ml de IL-21 mostró significativamente menos potenciación de la CCDA que las otras dosis. Los cultivos del donante B no mostraron ninguna diferencia significativa en la potenciación de la CCDA entre las dosis de IL-21 probadas (0,2, 1, 5 o 25 ng/ml) hasta el día 4 (y continuó a lo largo de los puntos temporales restantes) cuando los cultivos que contenían 0,2 ng/ml de IL-21 mostraron una actividad potenciadora de la CCDA significativamente menor que las otras dosis de IL21 probadas. Ambos donantes mostraron una potenciación de la CCDA por IL-21 en todos los puntos temporales probados, con la mayor potenciación con respecto a la IgG no pertinente en los días 6 o 7.

C.

Se obtuvo sangre periférica de un programa de donantes como se describe en el ejemplo 1A. Se plaquearon linfocitos NK a una densidad de 8,1-11 x 105/ml y se cultivaron durante 3 días en aMEM/suero autólogo al 10 %/beta-mercaptoetanol 50 µM, en presencia o ausencia de 20 ng/ml de IL-21 humana. Al final del periodo de

cultivo, se recogieron los linfocitos NK, se lavaron, se contaron y se colocaron en un ensayo citolítico de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA), usando la línea celular de linfoma DOHH2 (Kluin-Nelemans, H.C. et al. Leukemia 5: 221-224, 1991; Drexler, H.G. et al., DSMZ Catalogue of Cell Lines, 7ª ed., Braunschweig, Alemania, 1999) como el objetivo citolítico. Las células DOHH2 se marcaron antes del ensayo incubándolas durante 30 minutos en solución salina tamponada de Hank con FBS al 5 % (HBSSF) con calceína AM 25 µM (Molecular Probes). Los objetivos incorporan la tinción fluorescente (calceína AM) y la convierten en el citoplasma en el fluorocromo activo, que sólo se libera de la célula tras la lisis. Las células lisadas liberan el fluorocromo al sobrenadante, que después se recoge y se cuantifica la cantidad de fluorescencia en un fluorímetro. El % de lisis celular se calculó a partir de la cantidad de fluorescencia presente en el sobrenadante después de una incubación de 3 horas en presencia o ausencia de cantidades variables de linfocitos NK (efectores). Durante el ensayo de CCDA, se usaron objetivos sin anticuerpo añadido, con 2 µg/ml de IgG no pertinente o con 0,002, 0,02, 0,2 o 2 µg/ml de rituximab.

Se generaron resultados a partir de dos donantes y se expresaron como proporciones de efector:objetivo (E:O) frente a porcentaje de lisis. En ambos donantes, se observó una clara potenciación (6-11 veces a una E:O=3) de la actividad citolítica contra células DOHH2 en presencia de 2 µg/ml de rituximab, en comparación con anticuerpo no añadido o control de IgG no pertinente. La potenciación del rituximab fue igual a 2 µg/ml y a 0,2 µg/ml, comenzó a disminuir a la E:O más alta probada (4 o 6) a 0,02 µg/ml y fue claramente inferior a todas las E:O probadas a 0,002 µg/ml. La potenciación de la actividad citolítica dependiente de rituximab aumentó a todas las dosis de rituximab probadas (1,5-3 veces con respecto a la actividad potenciada por rituximab a una E:O=3) cuando se cultivaron los linfocitos NK durante 3 días en presencia de IL-21 antes del ensayo citolítico.

Ejemplo 2

La IL-21 regula por incremento la expresión de granzima B en linfocitos NK

Se aislaron linfocitos NK humanos a partir de células mononucleares purificadas en Ficoll-Paque mediante selección negativa usando un kit de separación de perlas magnéticas. (Miltenyi Biotech, CA). Después, se cultivaron los linfocitos NK durante 48 horas en medio solo o en 20 ng/ml de IL-21 humana. Se recogieron las células, se lavaron y después se tiñeron con marcadores de superficie. Tras la tinción con marcadores de superficie, se lavaron las células y después se permeabilizaron con tampón Cytofix/Cytoperm™ (BD Biosciences, San José, CA) durante 20 minutos. Después, se tiñeron las células con un anticuerpo marcado con CPA anti-granzima B humana o de control de isotipo (Caltag, Burlingame, CA) en tampón Perm/Wash. Se lavaron las células y después se leyeron en un citómetro de flujo FACSCalibur™. Los datos se analizaron usando el programa informático Cellquest™ (BD Biosciences).

La figura 1 muestra que la incubación de linfocitos NK humanos en presencia de IL-21 provoca un gran aumento de la expresión de granzima B, un importante mediador de la destrucción de linfocitos NK. Esto indica que, mediante la regulación por incremento de la granzima B, la IL-21 potencia la capacidad de los linfocitos NK de destruir sus células objetivo.

Ejemplo 3

IL-21 + rituximab aumentan la supervivencia de ratones inyectados con células de linfoma HS Sultan

Se realizó un estudio para evaluar si el crecimiento tumoral se retrasaba en ratones IDCG CB-17 inyectados con células HS-Sultan tratados con rituximab, IL-21 de ratón (mIL-21) o una combinación de mIL-21 y rituximab. El estudio se diseñó para caracterizar la supervivencia de ratones portadores de HS-Sultan en los diversos grupos de tratamiento.

Los protocolos fueron similares a los conocidos en la técnica (véase, Cattan et al. Leuk Res. 18 (7):513-522, 1994; Ozaki et al, Blood 90 (8):3179-86, 1997). A los ratones CD17-IDCG se les administraron 20 µg de rituximab (administrado cada cuatro días durante un total de 5 inyecciones), 100 µg de mIL-21 (administrada cinco días) o una combinación de rituximab y mIL-21 mediante inyecciones IP (administradas cinco veces para cada tratamiento).

Se monitorizó a los ratones para detectar condiciones de agonía o no superables tales como parálisis o pérdida de peso rápida. Durante el periodo de estudio se tomaron los pesos corporales dos veces por semana. Se registró el tiempo de supervivencia para todos los ratones y se compararon entre grupos de tratamiento mediante la representación de curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y calculando estadísticas de orden logarítmico (Statview, SAS Institute, Cary, NC).

Se usaron los siguientes grupos:

Grupo 1 (n=10) 20 µg de rituximab cada 4 días durante un total de 5 inyecciones comenzando el día 1.

Grupo 2 (n=10) 20 µg de rituximab cada 4 días durante un total de 5 inyecciones comenzando el día 3.

Grupo 3 (n=10) 20 µg de rituximab cada 4 días durante un total de 5 inyecciones comenzando el día 6.

Grupo 4 (n=10) control de vehículo (PBS) administrado IP en los días 1-5.

Grupo 5 (n=10) 100 µg de mIL-21 IP a diario durante 5 días comenzando el día 1.

Grupo 6 (n=10) 100 µg de mIL-21 durante 5 días comenzando el día 1 + 20 µg de rituximab cada 4 días durante un total de 5 inyecciones comenzando el día 3.

Se repartieron los ratones (hembras, C.B-17 IDCG, de 9 semanas de edad; Harlan, Madison, WI) en 6 grupos. En el día 0, se recogieron células HS-Sultan (ATCC N.º CRL-1484) del cultivo y se inyectaron a todos los ratones por vía intravenosa, a través de la vena de la cola (1.000.000 células/ratón). Después, se trató a los ratones con rituximab, mIL-21 o una combinación de los dos agentes, usando las dosis y las pautas descritas en las descripciones anteriores de los grupos de tratamiento. Todos los tratamientos se administraron mediante inyección intraperitoneal en un volumen de 0,1 ml.

En los grupos de ratones tratados con rituximab, se observó un beneficio de supervivencia significativo cuando se inició la administración en el día 1 o el día 3, pero no en el día 6. La IL-21 murina sola no proporcionó ningún beneficio de supervivencia a los ratones portadores de tumores. Los ratones tratados con una combinación de mIL21 (100 ug/día, días 1-5) y rituximab (20 ug/día, días 3, 7, 11, 15, 19) presentaron un beneficio de supervivencia altamente significativo (P < 0,0001 en comparación con el vehículo de control, P < 0,02 en comparación con el rituximab comenzando en el día 3; prueba de orden logarítmico). En el día 120 del estudio, la supervivencia acumulada en el grupo de mIL-21 + rituximab era del 70 %, frente al 20 % del grupo de rituximab solo.

Ejemplo 4

IL-21 + rituximab aumentan la supervivencia de ratones inyectados con células tumorales Raji

Se realizó un estudio para evaluar si el crecimiento tumoral se retrasaba en ratones IDCG CB-17 inyectados con células Raji tratados con rituximab, mIL-21 o una combinación de mIL-21 y rituximab. El estudio se diseñó para caracterizar la supervivencia de ratones portadores de Raji en los diversos grupos de tratamiento.

El protocolo se describe en el ejemplo 3.

Se usaron los siguientes grupos:

Grupo 1 (n=8) control de vehículo PBS administrado IP en los días 3-7.

Grupo 2 (n=8) 100 µg de mIL-21 IP a diario durante 5 días comenzando el día 1.

Grupo 3 (n=8) 100 µg de mIL-21 IP durante 5 días comenzando el día 3.

Grupo 4 (n=9) 20 µg de rituximab cada 4 días durante un total de 5 inyecciones comenzando el día 3.

Grupo 5 (n=9) 20 µg de rituximab cada 4 días durante un total de 5 inyecciones comenzando el día 5.

Grupo 6 (n=9) 100 µg de mIL-21 IP a diario durante 5 días comenzando el día 1 + 20 µg de rituximab cada 4 días durante un total de 5 inyecciones comenzando el día 3.

Grupo 7 (n=9) 100 µg de mIL-21 IP a diario durante 5 días comenzando el día 3 + 20 µg de rituximab cada 4 días durante un total de 5 inyecciones comenzando el día 5.

Se repartieron los ratones (hembras, C.B-17 IDCG, de 9 semanas de edad; Harlan, Madison, WI) en siete grupos. En el día 0, se recogieron células Raji (ATCC N.º CRL-86) del cultivo y se inyectaron a todos los ratones por vía intravenosa, a través de la vena de la cola (1.000.000 células/ratón). Después, se trató a los ratones con rituximab, mIL-21 o una combinación de los dos agentes, usando las dosis y las pautas descritas en las descripciones anteriores de los grupos de tratamiento. Todos los tratamientos se administraron mediante inyección intraperitoneal en un volumen de 0,1 ml.

En los grupos de ratones tratados con rituximab, se observó un beneficio de supervivencia significativo cuando se inició la administración en el día 3 o el día 5. La IL-21 murina sola no proporcionó ningún beneficio de supervivencia a los ratones portadores de tumores. Los ratones tratados con una combinación de mIL-21 (100 ug/día, días 3-7) y rituximab (20 ug/día, días 5, 9, 13, 17, 21) presentaron un beneficio de supervivencia altamente significativo (P < 0,0001 en comparación con el vehículo de control, P < 0,03 en comparación con el rituximab comenzando en el día 5; prueba de orden logarítmico). En el día 100 del estudio, la supervivencia acumulada en el grupo de mIL-21 + rituximab era del 55 %, frente al 10 % del grupo de rituximab solo.

Ejemplo 5

Estudios con IL-21 + rituximab en primates no humanos

Se coadministraron rituximab y rIL-21 por vía intravenosa a grupos que consistían en tres macacos cangrejeros macho durante tres periodos de administración que consistían en un periodo de una semana por dosis. Hubo una semana sin administración entre la segunda y la tercera semana de administración. Se administró rituximab en el primer día de cada periodo de administración y se administró rIL-21 durante tres días comenzando en el primer día de cada periodo de administración. Las excepciones de administración fueron el grupo de control al que se le administró como artículo de control cloruro sódico al 0,9 %, el grupo 3, al que se le administró rituximab solo, y el grupo 2, que recibió rIL-21 sola. Al grupo 5 se le administró rIL-21 en el primer día de cada periodo de

5 administración, aunque la dosis semanal total fue equivalente a la de otros grupos que recibieron rIL-21. Al grupo 7 se le administró rIL-21 por vía subcutánea en lugar de intravenosa. El grupo 4 no recibió dosis durante el tercer periodo de administración; la última dosis la recibió en el día 10. La última dosis para todos los demás grupos fue en el día 24. A los animales se les administraron las dosis usando inyección intravenosa en la vena cefálica, safena u otra vena adecuada; inyección subcutánea en la zona intraescapular o en cualquier otro sitio adecuado.

10 Tabla 3

Programa del estudio y grupos

Grupo

Tratamiento Vía Niveles de dosis (mg/kg) Concentración (mg/ml) Volumen de dosis b (ml/kg) Días de la dosis

1

Artículo de control IV 0,0 0,0 3,0 0,5 1, 8, 22 2, 3, 9, 10, 23, 24

2

rIL-21 Artículo de control IV 0,5 0,0 1,0 0,0 0,5 2,5 1-3, 8-10, 22-24 1, 8, 22

3

Artículo de control Rituxan c IV 0,0 0,05 0,0 0,1 0,5 0,5 1-3, 8-10, 22-24 1, 8, 22

4

rIL-21 Rituxan IV IV 0,5 10 1,0 4,0 0,5 2,5 1-3, 8-10 1, 8

5

rIL-21 Artículo de control Rituxan c IV IV IV 1,5 0 0,05 3,0 0,0 0,1 0,5 0,5 0,5 1, 8, 22 2, 3, 9, 10, 23, 24 1, 8, 22

6

rIL-21 Rituxan c IV IV 0,5 0,05 1,0 0,1 0,5 0,5 1-3, 8-10, 22-24 1, 8, 22

7

rIL-21 Rituxan c SC IV 0,5 0,05 3,0 0,1 0,17 0,5 1-3, 8-10, 22-24 1, 8, 22

a En grupos con coadministraciones de rIL-21 y Rituxan, se administró el Rituxan antes que la rIL-21. b El volumen de administración (ml) de cada animal se calculó basándose en el peso corporal más reciente. Los volúmenes de dosis se redondearon al alza hasta el siguiente incremento legible de la jeringuilla. c La dosis de Rituxan fue seguida de un lavado con solución salina de 3,0 ml/kg.

Se analizaron subconjuntos de células de sangre periférica usando citometría de flujo. Se colocaron aproximadamente 1,3 ml de sangre recogida en un tubo tratado con EDTA-2K, una vez durante la aclimatación del día -8, antes de la administración y seis horas después de la dosis en los días 1, 8 y 22. Se tomaron muestras de

15 antes de la dosis en los días 3, 10 y 24. Se tomaron muestras una vez en los días 7, 14, 17 y 42. Se alicuotaron aproximadamente 0,5 ml de la muestra para análisis hematológico y se mantuvo el resto de la muestra a temperatura ambiente hasta el procesamiento para el análisis de citometría de flujo.

Se recogieron aproximadamente 2,0 ml de sangre completa en tubos que contenían heparina de litio durante la aclimatación en los días -8 y -4. También se recogió antes de la administración en los días 3, 10, 22 y 24 y una vez

20 en los días 7 y 14. Se almacenaron las muestras a temperatura ambiente hasta el procesamiento para los análisis de citometría de flujo y los ensayos de actividad CCDA.

Tabla 4

Marcadores antigénicos

Tipo de célula identificado

Linfocito B CD45+/CD20-/CD21+

Linfocito B CD45+/CD20+/CD21-

Linfocito B CD45+/CD20+/CD21+

Linfocito B CD45+/CD20alto

CD45/CD20/CD21/CD40

Linfocito B CD45+/CD20alto/CD21-/CD40-Linfocito B CD45+/CD20alto/CD21-/CD40+

Linfocito B CD45+/CD20alto/CD21+/CD40+

Linfocito B CD45+/CD20bajo

Linfocito B CD45+/CD20bajo/CD20bajoCD40+

Linfocito B CD45+/CD20bajo/CD21+/CD40+

Linfocito citolítico natural CD45+/CD14-/CD16+

Monocito CD45+/CD14+/CD16-

Monocito CD45+/CD14+/CD16+

CD45/CD14/CD16/CD64

Monocito CD45+/CD14+/CD64-

Monocito CD45+/CD14+/CD64+

Granulocito CD45+/CD64-

Granulocito CD45+/CD64+

Linfocito T colaborador CD45+/CD3+/CD8-

Linfocito T citotóxico CD45+/CD3+/CD8+

Linfocito NK CD45+/CD3-/CD8+

Linfocito NK CD45+/CD14-/CD16+

CD45/CD3/CD8/CD11b + 11c

Célula todo CD45+/CD11b + 11cdim

Célula todo CD45+/CD11b + 11cbrillante

Célula CD45+/CD3-/CD11b + 11cdim

Célula CD45+/CD3-/CD11b + 11cbrillante

Célula CD45+/CD3-/CD11b + 11cneg

El tratamiento con IL-21 presentó efectos marcados sobre el fenotipo y el número de leucocitos en circulación. Poco después del tratamiento con IL-21, todas las poblaciones de linfocitos disminuyeron. Los linfocitos B se recuperaron

5 más rápidamente que los linfocitos T y los linfocitos NK. Los linfocitos T volvieron a los niveles iniciales en 4-6 días después de la administración y los linfocitos T cooperadores se elevaron ligeramente 4-6 días después del segundo ciclo de tratamiento con IL-21. Los linfocitos NK disminuyeron en todos los grupos, con una recuperación sólo parcial entre ciclos de administración. El número de monocitos en circulación aumentó después del tratamiento con IL-21 y tanto los monocitos como los granulocitos presentaron un aumento de la expresión del receptor de Fc.

10 A. Efectos en los linfocitos

Las dosis subclínicas de rituximab redujeron el número de linfocitos B en circulación hasta una concentración mínima un 70 % por debajo del nivel inicial en un plazo de 6 h desde la administración. El tratamiento con rIL-21 sola redujo inicialmente los linfocitos B, los linfocitos T y los linfocitos NK en circulación, seguido de un aumento sostenido y la resolución antes del siguiente ciclo de administración. Basándose en la rápida inversión de la 15 linfopenia y las observaciones anteriores de depleción de folículos linfoides con rIL-21, se interpretó este efecto como una marginación transitoria de linfocitos activados combinada con un aumento de la recirculación desde los tejidos linfoides a la sangre. El aumento de los linfocitos B periféricos se mitigó ampliamente en animales tratados con rIL-21 y rituximab y, de forma coherente, se observó una concentración mínima de linfocitos B, en relación con los grupos tratados con rituximab o rIL-21 solos. El tratamiento con rituximab no modificó los cambios en otros

20 subconjuntos de linfocitos inducidos por la rIL-21.

Tabla 5 (continuación)Tabla 6 (continuación)Tabla 7 (continuación)Tabla 8 (continuación)

Linfocitos B CD20bajo en sangre periférica (recuentos por ul)

Tratamiento

Día-8 Día1 Día1,25 Día3 Día7 Día8 Día8,25 Día10 Día14 Día17 Día22 Día22,25 Día24 Día29 Día32 Día37 Día42

Control

918 605 1183 855 620 791 1285 965 805 863 1145 1240 838 777 815 882 739

Control

1545 980 1464 1416 1035 934 1999 1233 1050 1099 1027 1507 1235 1151 1202 947 909

Control

1044 876 1648 1182 1179 807 1827 1145 1275 1046 888 1732 1161 897 1053 1205 944

IL-21 0,5 mg/kg

677 650 461 598 1043 731 292 1241 871 835 507 231 307 717 553 380 426

IL-21 0,5 mg/kg

3159 2254 1684 3418 9268 4208 2136 9414 8355 5929 3887 1235 4702 7469 3657 3214 4338

IL-21 0,5 mg/kg

1310 1107 858 1486 4748 2378 1176 5343 6210 4139 1970 769 1562 4227 3122 2298 2292

Ritux 0,05 mg/kg

549 599 369 449 441 325 227 305 331 397 390 669 394 634 381 534 419

Ritux 0,05 mg/kg

2150 1892 657 1459 1993 1872 648 1580 1830 1810 1965 1572 1757 2133 1949 1820 1446

Ritux 0,05 mg/kg

1430 1103 879 936 920 893 407 617 648 861 1015 1127 834 1160 1103 818 657

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg

687 407 36 9 4 3 2 0 2 2 2 2 1 7 15 2 5

mg/kg IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg

1214 1116 69 5 1 1 1 2 1 6 12 3 3 9 59 102 182

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg

2072 1846 157 17 2 4 3 0 0 3 12 12 12 110 192 564 707

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

597 603 283 356 1578 1386 14 511 646 488 512 169 222 699 564 546 540

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux mg/kg

897 782 331 1375 1622 1247 49 1393 944 661 540 148 726 468 354 798 706

Linfocitos B CD20bajo en sangre periférica (recuentos por ul)

Tratamiento

Día-8 Día1 Día1,25 Día3 Día7 Día8 Día8,25 Día10 Día14 Día17 Día22 Día22,25 Día24 Día29 Día32 Día37 Día42

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux0,05 mg/kg

729 134 565 1560 1779 9 533 780 745 669 148 812 1119 845 902 928

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux0,05 mg/kg

597 603 283 356 1578 1386 14 511 646 488 512 169 222 699 564 546 540

IL-21 0,5 mg/kg + Rituxmg/kg

897 782 331 1375 1622 1247 49 1393 944 661 540 148 726 468 354 798 706

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux0,05 mg/kg

729 134 565 1560 1779 9 533 780 745 669 148 812 1119 845 902 928

Linfocitos B CD20alto en sangre periférica (recuentos por ul)

Tratamiento

Día-8 Día1 Día1,25 Día3 Día7 Día8 Día8,25 Día10 Día14 Día17 Día22 Día22,25 Día24 Día29 Día32 Día37 Día42

Control

509 408 493 447 491 607 440 425 386 393 594 423 430 387 4961 523 392

Control

2243 1808 1705 1764 1938 2594 1624 1482 1510 1529 1662 1578 1461 1542 1645 1626 1522

Control

1414 1245 1384 1190 1438 1248 1225 1173 1277 1183 1134 1418 1238 1080 1334 1147 952

IL-21 0,5 mg/kg

949 701 576 452 581 584 242 396 391 518 412 209 226 470 592 354 442

IL-21 0,5 mg/kg

1945 1784 932 488 1790 1014 773 1582 2542 2886 2241 819 1468 1897 1956 996 2104

IL-21 0,5 mg/kg

448 418 262 164 681 399 592 779 1370 909 562 181 499 701 750 338 386

Ritux 0,05 mg/kg

541 500 0 4 57 57 0 3 67 78 160 224 147 97 304 299 152

Ritux 0,05 mg/kg

810 721 2 11 89 101 8 24 95 44 49 25 145 9 96 31 49

Ritux 0,05 mg/kg

2144 1579 0 18 170 141 1 16 79 68 88 380 265 32 167 227 240

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux10 mg/kg

618 518 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux10 mg/kg

954 882 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 4 6

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux10 mg/kg

1538 1333 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 16 64

Linfocitos B CD20alto en sangre periférica (recuentos por ul)

Tratamiento

Día-8 Día1 Día1,25 Día3 Día7 Día8 Día8,25 Día10 Día14 Día17 Día22 Día22,25 Día24 Día29 Día32 Día37 Día42

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

1295 1240 0 10 111 339 0 7 189 6 426 132 64 6 86 148 475

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

778 764 9 39 55 71 0 6 100 62 161 23 97 1 20 34 70

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

163 0 7 24 99 0 5 63 102 161 46 18 1 5 7 18

Linfocitos T citotóxicos (LCT) en sangre periférica (recuentos por ul)

Tratamiento

Día-8 Día1 Día1,25 Día3 Día7 Día8 Día8,25 Día10 Día14 Día17 Día22 Día22,25 Día24 Día29 Día32 Día37 Día42

Control

2760 2206 2498 2867 2629 2502 2433 2688 2301 2926 3523 2705 2388 2064 2126 2662 2005

Control

3335 1891 1522 2212 2222 2051 2001 2099 2023 2438 1930 1983 2059 2141 2299 1977 2189

Control

2462 2002 1933 2496 2359 1531 1976 2133 2352 2302 1627 2411 2001 1623 2054 2087 1681

IL-21 0,5 mg/kg

1591 1171 650 996 1498 1377 668 568 1815 2928 978 527 591 2159 1914 1137 1156

IL-21 0,5 mg/kg

3916 3211 1307 830 3642 1782 1177 1331 5046 6180 2705 1629 1020 4204 2785 2648 1674

IL-21 0,5 mg/kg

3508 2978 1135 1331 2481 1516 743 1260 2728 3846 2702 1016 776 3604 3575 2658 2755

Ritux 0,05 mg/kg

1201 1353 1093 975 1079 580 963 713 795 1206 788 1037 512 683 503 996 644

Ritux 0,05 mg/kg

4245 3338 1069 3741 3394 2492 1084 2975 3166 3053 2830 1405 2294 2120 1804 2335 2078

Ritux 0,05 mg/kg

4417 2961 3737 3709 3412 3115 2790 3668 2572 3184 2778 3721 2582 2140 2316 2474 2335

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux10 mg/kg

2990 2613 840 381 1502 1005 548 1093 2478 4025 4224 4392 2690 4328 2943 3346 2627

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux10 mg/kg

3689 2888 1069 855 2323 1316 499 1480 3742 4043 3372 3123 1705 3156 2541 4294 2321

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux10 mg/kg

2636 3410 654 790 3573 2615 863 1671 3470 3947 3325 2812 1737 3297 2092 2588 1813

Linfocitos T citotóxicos (LCT) en sangre periférica (recuentos por ul)

Tratamiento

Día-8 Día1 Día1,25 Día3 Día7 Día8 Día8,25 Día10 Día14 Día17 Día22 Día22,25 Día24 Día29 Día32 Día37 Día42

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

1035 1233 453 435 970 1531 211 763 1591 1576 1457 297 230 1087 1047 909 528

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

1555 1413 653 880 1150 1357 323 640 1273 716 892 304 183 571 452 800 570

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

2244 781 672 1317 2156 362 679 1644 1883 2122 636 455 2021 1660 1652 1142

Linfocitos T colaboradores en sangre periférica (recuentos por ul)

Tratamiento

Día-8 Día1 Día1,25 Día3 Día7 Día8 Día8,25 Día10 Día14 Día17 Día22 Día22,25 Día24 Día29 Día32 Día37 Día42

Control

2163 2052 2156 2044 2178 2543 2676 2499 2404 2504 3328 2392 2485 2254 2342 2692 1949

Control

4533 3187 2327 3400 3515 3659 3062 3303 3409 3845 3183 2768 3460 3493 3772 3244 3483

Control

5205 4603 4403 4871 4798 4195 4516 5174 4861 5336 4055 4887 4979 4189 5164 4672 3833

IL-21 0,5 mg/kg

2476 2489 1033 1734 2672 2400 904 1069 2806 3834 2153 624 1455 3475 3179 2429 2336

IL-21 0,5 mg/kg

5519 4727 2445 1475 5465 3086 1791 3498 7522 8228 4390 2247 2904 5849 4633 4771 5752

IL-21 0,5 mg/kg

4181 3811 1505 2134 3428 2102 1173 2152 3814 4795 4109 1561 1942 4579 4988 3906 3619

Ritux 0,05 mg/kg

1381 1439 1391 1228 1394 905 1439 1145 1219 1665 1345 1525 1048 1721 1471 1814 1121

Ritux 0,05 mg/kg

5265 4916 2477 4685 4994 5234 2956 5037 4991 5209 5112 2475 4826 5337 4818 5152 4455

Ritux 0,05 mg/kg

5378 4438 4687 5168 5362 5097 4099 5604 4144 4601 4638 4835 4405 5098 5032 4772 4062

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux10 mg/kg

3160 2905 961 768 2057 1416 750 1790 3418 4019 4376 3457 3257 4825 3661 3669 2601

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux10 mg/kg

3837 3166 1324 1288 2817 1725 626 1886 4039 3590 3038 2784 2185 3282 2665 3629 2742

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux10 mg/kg

4053 4970 1414 1689 4844 3214 1012 2709 5052 5337 4600 3659 2848 4858 3513 4056 3090

Linfocitos T colaboradores en sangre periférica (recuentos por ul)

Tratamiento

Día-8 Día1 Día1,25 Día3 Día7 Día8 Día8,25 Día10 Día14 Día17 Día22 Día22,25 Día24 Día29 Día32 Día37 Día42

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

1842 2234 841 1159 2017 2764 536 1815 2945 2932 3005 698 898 2577 2482 2330 1650

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

1953 1946 770 1171 1702 2360 430 894 2003 1904 2261 428 376 2806 2714 2298 1871

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

1647 329 779 1390 2683 550 780 1536 1799 2485 605 783 2127 1944 1720 1504

B. Efectos de CCDA

Se realizaron preparaciones de CMN con gradientes de densidad de Ficoll. Durante el curso de este estudio se caracterizaron preparaciones de CMN de todos los animales tratados en función de su inmunofenotipo y su actividad CCDA ex vivo. Las células objetivo se cargaron con calceína-AM antes del ensayo, con una liberación específica de

5 la tinción intracelular durante una incubación de 3 h como el criterio de valoración del ensayo.

El tratamiento de macacos cangrejeros con rIL-21 dio como resultado cambios en los recuentos de linfocitos NK en sangre periférica y en el porcentaje de linfocitos NK en preparaciones de CMN. Inicialmente, los linfocitos NK disminuyeron después del tratamiento, con una tendencia hacia los valores iniciales entre ciclos de administración.

Las CMN de macacos cangrejeros tratados con rIL-21 o rituximab en combinación con rIL-21, mostraron un aumento

10 de la actividad CCDA ex vivo, en comparación con CMN de animales tratados con control de vehículo y con rituximab solo. La actividad lítica fue baja en el día 3, correlacionada con muy pocos linfocitos NK en la preparación de CMN. En los días 7 y 10, aumentó la CCDA con respecto al valor inicial en animales tratados con rIL-21 y se observaron tendencias similares en animales tratados con rIL-21 más rituximab. En el día 14 se mantuvo la actividad lítica por linfocito NK, a pesar del bajo número de linfocitos NK en las preparaciones de CMN.

Tabla 9

Número de linfocitos NK en sangre periférica (recuentos/ul)

Tratamiento

Día-8 Día1 Día3 Día7 Día8 Día8,25 Día10 Día14 Día17 Día22 Día22,25 Día24 Día29 Día32 Día37 Día42

Control

210 211 224 224 326 223 202 147 204 368 196 181 126 190 149 180

Control

209 160 232 177 221 285 147 187 135 121 181 127 60 95 128 200

Control

339 470 565 525 388 443 462 533 560 335 381 496 263 476 531 290

IL-21 0,5 mg/kg

394 367 305 859 573 145 287 650 1077 355 84 182 365 332 249 210

IL-21 0,5 mg/kg

452 546 196 594 546 141 502 845 805 284 143 176 221 277 275 563

IL-21 0,5 mg/kg

2135 183 9 122 0 927 198 550 1057 1249 1036 209 239 1104 852 1109 956

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

268 211 89 179 271 26 242 335 156 173 62 53 143 105 141 81

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

231 164 211 133 211 23 241 88 55 61 18 146 72 60 88 152

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg

286 149 528 506 38 277 281 221 276 80 225 268 256 255 174

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg

579 399 153 365 218 81 408 464 469 224 161 139 330 251 405 119

(continuación)

Número de linfocitos NK en sangre periférica (recuentos/ul)

Tratamiento

Día-8 Día1 Día3 Día7 Día8 Día8,25 Día10 Día14 Día17 Día22 Día22,25 Día24 Día29 Día32 Día37 Día42

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg

726 476 236 555 240 56 355 448 673 386 177 178 256 178 390 212

IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg

337 442 310 310 154 67 525 482 1570 220 170 53 221 118 166 167

Ritux 0,05 mg/kg

235 240 191 179 183 67 137 176 235 167 129 129 108 97 191 109

Ritux 0,05 mg/kg

1265 794 948 824 712 125 795 836 638 745 398 623 681 542 741 615

Ritux 0,05 mg/kg

860 300 395 382 366 102 361 283 2944 290 225 268 223 175 210 276

Tabla 10

Linfocitos NK como porcentaje del total de la preparación de CMN

Día_Núm

Día 8 Día 3 Día 7 Día 10 Día 14 Día 22 Día 24

Control

3,6 3,2 3,5 2,9 3,05 4,5 6,6

Control

3,73 4,05 4,8 4,9 4,9 4,65 6,05

Control

7,87 7,45 8,5 7,25 7,15 7,65 11,45

IL-21 0,5 mg/kg 3d

8,03 1,9 4,6 1,1 4,95 8,55 2,1

IL-21 0,5 mg/kg 3d

8,4 0,35 3,65 0,55 4,65 8,15 0,65

IL-21 0,5 mg/kg 3d

17,97 2,95 5,4 1,45 4,3 11,5 2,9

Rituxan 0,05 mg/kg

7,77 6,05 7 5 8,75 8,1 8,2

Rituxan 0,05 mg/kg

7,63 6,75 8,45 6,35 9,3 8,35 9,55

Rituxan 0,05 mg/kg

6,17 3,95 4,4 2,45 3,7 4,25 6,25

Rituxan 10 mg/kg + IL-21 0,5 mg/kg

10,03 0,95 2,05 0,7 1,8 3,05 5,2

Rituxan 10 mg/kg + IL-21 0,5 mg/kg

9,6 0,35 2,85 0,55 1,75 5 6,3

Rituxan 10 mg/kg + IL-21 0,5 mg/kg

2,7 0,3 1,05 0,55 1 2,25 0,9

Rituxan 0,05 mg/kg + IL21 0,5 mg/kg

8,63 0,45 1,5 1,15 4,15 4,8 0,45

Rituxan 0,05 mg/kg + IL21 0,5 mg/kg

6,17 0,5 0,95 0,3 1,8 2,75 0,65

Rituxan 0,05 mg/kg + IL21 0,5 mg/kg

5,7 0,65 1,75 0,55 2,25 3,85 1

Tabla 11

CCDA en macacos cangrejeros tratados con rIL-21. A partir del porcentaje de lisis de prep. de CMN completas a una proporción de E:O de 25.

Tratamiento

ID del macaco Objetivo Efector Día -4 Día 3 Día 7 Día 10 Día 14 Día 22 Día 24

Control

Macaco 1 BT474-2 CMN 8,53 3,87 12,24 10,49 12,16 13,74 15,7

Control

Macaco 2 BT474-2 CMN 17,07 12,93 18,02 16,42 11,17 19,27 13,41

Control

Macaco 3 BT474-2 CMN 18,57 6,85 9,38 6,71 13,67 16,36 19,63

rIL-21 0,5 mg/kg

Macaco 4 BT474-2 CMN 23,13 9,45 46,34 25,28 29,78 24,14 9,72

rIL-21 0,5 mg/kg

Macaco 5 BT474-2 CMN 30,73 2,2 48,52 13,76 26,92 29,34

rIL-21 0,5 mg/kg

Macaco 6 BT474-2 CMN 28,72 21,56 36,07 21,82 32,01 34,4 20,91

rIL-21 0,5 mg/kg+ Rituxan 0,05 mg/kg

Macaco 16 BT474-2 CMN 28 8,52 28,87 45,03 24,43 28,44 8,5

rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 0,05 mg/kg

Macaco 17 BT474-2 CMN 26,9 1,57 17,7 13,61 10,23 14,8 2,21

(continuación)

CCDA en macacos cangrejeros tratados con rIL-21. A partir del porcentaje de lisis de prep. de CMN completas a una proporción de E:O de 25.

rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 0,05 mg/kg

Macaco 22 BT474-2 CMN 33,07 7,55 17,63 20,92 19,81 14,48 8,95

rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 10 mg/kg

Macaco 10 BT474-2 CMN 34,37 7,19 34 27,55 20,57 23,22 18,01

rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 10 mg/kg

Macaco 11 BT474-2 CMN 33,82 5,87 29 20,84 15,24 30,09 22,44

rIL-21 0,5 mg/kg+ Rituxan 10 mg/kg

Macaco 12 BT474-2 CMN 13,43 9,42 19,69 15,35 8,03 9,31 7

Rituxan 0,05 mg/kg

Macaco 7 BT474-2 CMN 27,91 15,51 30,78 25,22 33,84 25,26 25,86

Rituxan 0,05 mg/kg

Macaco 8 BT474-2 CMN 27,98 17,37 23,59 19,79 16,26 29,7 19,69

Rituxan 0,05 mg/kg

Macaco 9 BT474-2 CMN 33,81 6,78 20,15 16,21 14,52 17,47 26,16

Tabla 12

Porcentaje de lisis específica medido usando CCDA en macacos cangrejeros tratados con rIL-21. CCDA ajustada de NK para una proporción de E:O de 2.

Tratamiento

ID del macaco Objetivo Efector Día -4 Día 3 Día 7 Día 10 Día 14 Día 22 Día 24

Control

Macaco 1 BT474-2 L_NK 9,43 4,71 16,24 18,46 14,41 14,35 15,83

Control

Macaco 2 BT474-2 L_NK 19,07 15,09 21,23 20,38 11,17 21,93 14,04

Control

Macaco 3 BT474-2 L_NK 18,45 7,12 8,98 7,51 13,77 16,47 18,88

rIL-21 0,5 mg/kg

Macaco 4 BT474-2 L_NK 23,1 15,98 52,37 63,06 31,84 23,77 10,28

rIL-21 0,5 mg/kg

Macaco 5 BT474-2 L_NK 30,52 2,99 57,41 49,07 29,02 29,32

rIL-21 0,5 mg/kg

Macaco 6 BT474-2 L_NK 27,36 28,1 39,81 24,36 37,28 31,91 32,19

r1L-21 0,5 mg/kg + Rituxan 0,05 mg/kg

Macaco 16 BT474-2 L_NK 27,95 10,39 35,81 57,8 25,19 29,25 8,51

rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 0,05 mg/kg macaco

Macaco 17 BT474-2 L_NK 27,14 1,57 19,63 20,07 10,23 17,33

(continuación)

Porcentaje de lisis específica medido usando CCDA en macacos cangrejeros tratados con rIL-21. CCDA ajustada de NK para una proporción de E:O de 2.

rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 0,05 mg/kg

Macaco 22 BT474-2 L_NK 31,2 7,57 23,16 21,63 21,63 14,48 8,95

rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 10 mg/kg

Macaco 10 BT474-2 L_NK 33,53 9,87 46,66 30,62 26,89 25,51 19,54

rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 10 mg/kg

Macaco 11 BT474-2 L_NK 33,5 6,71 37,37 27,43 15,89 31,52 22,95

rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 10 mg/kg

Macaco 12 BT474-2 L_NK 13,43 15,24 37,3 15,56 9,89 9,31 7

Rituxan 0,05 mg/kg

Macaco 7 BT474-2 L_NK 27,7 16,68 32,32 27,36 33,62 25,26 25,82

Rituxan 0,05 mg/kg

Macaco 8 BT474-2 L_NK 26,03 18,13 23,11 21,31 16,24 29,56 19,67

Rituxan 0,05 mg/kg

Macaco 9 BT474-2 L_NK 34,07 7,69 7,69 25,72 22,44 15,06 21,03 26,84

C. Criterios de valoración adicionales

La IL-2Ra soluble (sCD25), un marcador de activación inmunitaria, aumentó rápidamente tras la administración de rIL-21, y la perforina intracelular, una enzima granular lítica aumentó más lentamente, con su expresión más alta 5 después del segundo intervalo de administración. El FcyRI (CD64) y el FcyRIII (CD16) estaban regulados por incremento tanto en monocitos como en granulocitos.

Se midió la perforina por citometría de flujo en las preparaciones de CMN. Para la medida de sCD25, se recogió sangre una vez durante la aclimatación del día -8 y una vez en los días 17, 29, 37 y 42. También se recogió en los días 1, 8 y 22 antes de la administración de la dosis y cinco minutos, 30 minutos, dos horas y seis horas después de

10 la dosis. En los días 3, 10 y 24, se recogió sangre 30 minutos después de la dosis.

Se transfirieron aproximadamente 0,75 ml de sangre a un tubo de coagulación SST. Se dejó que las muestras coagularan a temperatura ambiente durante aproximadamente 40-60 minutos. Se obtuvo suero por centrifugación (2000 x g durante aproximadamente 15 minutos, a 2-8 °C) y se almacenó en un congelador a -70 °C. Se cap turó el CD25 soluble presente en el suero usando un anticuerpo monoclonal murino anti-sCD25 y se detectó con anticuerpo

15 policlonal de cabra biotinilado anti-sCD25. La estreptavidina-HRP y el sustrato TMB permitieron la cuantificación colorimétrica del sCD25 presente en las muestras y los estándares.

Tabla 13

Contenido de sCD25 en suero (ng/ml)

Día_núm

Día -8 Día 1 Día 3 Día 8 Día 10 Día 17 Día 22 Día 24 Día 29

Control

0 0 0 0,79 0,69 0,73 0 0 0,67

Control

1,01 1,14 0,91 1,08 1,12 1,2 1,14 1,08 1,04

Control

0,75 0,73 0,85 0,85 0,97 0,98 0,97 0,86 1,31

IL-21 0,5 mg/kg

0 0 2,58 1,41 10,2 1,43 0 6,54 0,97

IL-21 0,5 mg/kg

0 0,81 4,58 1,64 8,37 1,21 0,81 5,16 1,29

(continuación)

Contenido de sCD25 en suero (ng/ml)

IL-210,5 mg/kg

0 0 2,49 1,73 9,29 1,4 0,8 5,65 1,43

Rituxan 0,05 mg/kg

0 0 0 0 0 0 0 0 0

Rituxan 0,05 mg/kg

0 0 0 0 0 0 0 0 0

Rituxan 0,05 mg/kg

0,75 0,7 0,67 0,67 0 0 0 0 0

Rituxan 10 mg/ml + IL-21 0,5 mg/kg

0 0 3,12 1,29 9,82 1,11 0 0 0

Rituxan 10 mg/ml + IL-21 0,5 mg/kg

0 0 3,18 1,36 13,5 0,7 0 0 0

Rituxan 10 mg/ml + IL-21 0,5 mg/kg

0 0 3,51 0,83 8,31 0 0 0 0

Rituxan 0,05 mg/kg + IL21 0,5 mg/kg

0 0 1,74 1,3 9,51 0 0 2,76 0

Rituxan 0,05 mg/kg + IL21 0,5 mg/kg

0 0 4,75 1,83 13 0,95 0 7,98 0

Rituxan 0,05 mg/kg + IL21 0,5 mg/kg

0 0 3,39 1,29 6,75 1,48 0 5,7 0

Tabla 14

Porcentaje de LTC positivos para la expresión de perforina

Día_Núm

Día -8 Día 3 Día 7 Día 10 Día 14 Día 22 Día 24 Día 29

Control

0,9 1,6 0,2 0 0,4 0 0 0,4

Control

2,3 1 1,2 1,1 5,9 0,1 0,2 5,9

Control

3,8 1,7 2 2 4,2 0,1 0,7 3,5

IL-21 0,5 mg/kg

4,7 10,4 16,7 34,7 28,3 0 0,2 20,1

IL-21 0,5 mg/kg

1,3 17,5 9,8 33,4 31,8 0 4,2 35,6,

IL-21 0,5 mg/kg

4,2 7,6 19,6 39,4 24,6 0,2 12,3 21,4

Rituxan bajo

1,7 0,1 0,1 1 0,4 0,1 0 1,7

Rituxan bajo

1,3 0,3 0,1 2,4 1 0 0,1 3,9

Rituxan bajo

2,6 1,3 0,6 0,4 7,2 0 0,1 5,9

Rituxan alto + IL-21 0,5 mg/kg

0,3 0,2 1,2 16,8 26,8 0 0,1 0,9

Rituxan alto + IL-21 0,5 mg/kg

2,1 1,8 5,1 13,8 25,2 0,1 0,2

Rituxan alto + IL-21 0,5 mg/kg

1,1 14,8 4,6 18,7 9,8 0 0 9,8

Rituxan bajo + IL-21 0,5 mg/kg

3,1 16,5 16,2 34,6 51,6 0,2 19 58

Rituxan bajo + IL-21 0,5 mg/kg

0,7 3,7 1,9 5,8 9 0,1 5,8 12,9

Rituxan bajo + IL-21 0,5 mg/kg

3 6,5 7 12,4 20,8 0,1 3,7 15

Tabla 15

Porcentaje de linfocitos NK positivos para la expresión de perforina

Día_Núm

Día -8 Día 3 Día 7 Día 10 Día 14 Día 22 Día 24 Día 29

Control

0,6 23,2 0,9 1,8 2,4 1,7 0,5 2,3

Control

3,5 4,5 3,1 3,3 22,2 3,1 0,6 13

Control

17 5,8 3,5 6,3 19,1 1 4,6 29,8

IL-21 0,5 mg/kg 3d

1,6 6,4 17,3 19,2 56,4 1,2 1,4 23,6

IL-21 0,5 mg/kg 3d

0,9 14,5 4,3 11,1 43,6 0,8 2,5 58,9

IL-21 0,5 mg/kg 3d

6,5 5,4 23,9 49,4 43,4 0,8 10,5 45,5

Rituxan bajo

2,1 0,3 0,9 1,9 1,4 1,3 0,4 5,8

Rituxan bajo

1,8 0,9 0,4 7 2,4 1,5 0,2 10,3

Rituxan bajo

2,6 1,4 1,6 3,2 13,2 4,7 0,3 5,7

Rituxan alto + IL-21 0,5 mg/kg

0,5 6,8 4,5 16,1 49,6 2,1 0,6 2,5

Rituxan alto + IL-21 0,5 mg/kg

3,3 18,1 4,1 4,4 51,1 1,7 1,5

Rituxan alto + IL-21 0,5 mg/kg

0,8 25,9 3,2 3 22,3 7,7 6,7 32,6

Rituxan bajo + IL21 0,5 mg/kg

2,1 15 7,1 14,5 73,7 2,9 9,6 66

Rituxan bajo + IL21 0,5 mg/kg

1,1 19,8 2,7 8,9 8,2 4,7 9,6 10,9

Rituxan bajo + IL21 0,5 mg/kg

6,2 20,3 7,3 13,5 49 8,7 9,9 22,7

Tabla 16 Tabla 17

con respecto al valor inicial de CD64 MFI

Día

Día 3 Día 7 Día 8 Día 8,25 Día 10 Día 14 Día 17 Día 22 Día 22,25 Día 24 Día 29 Día 32 Día 37 Día 42

Control

-14,0 -3,5 -12,9 -11,8 -24,2 -2,3 -8,6 5,3 -1,0 -8,5 -2,9 0,3 -19,6 -25,8

Control

-1,2 5,6 -4,3 -9,0 -2,1 6,4 3,2 18,2 11,7 3,3 17,8 6,6 4,6 -1,2

Control

-17,0 22,2 -12,3 -10,8 -5,6 -2,4 11,9 41,0 20,9 24,0 27,0 -15,9 10,2 -18,3

Control IL-210,5 mg/kg

-16,3 -2,4 -0,7 -11,0 0,0 25,9 19,6 9,3 9,5 -13,3 2,2 0,4 -14,2 -35,6

IL-21 0,5 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg

65,0 143,1 81,4 110,2 151,8 160,2 123,7 97,7 88,0 77,6 88,9 1,9 16,1 -10,9

IL-21 0,5 mg/kg

68,3 34,2 39,8 76,2 74,8 71,1 74,1 83,1 64,2 41,7 -9,4 12,9 -15,2

Rituxan 0,05 mg/ml

-0,3 0,7 10,3 9,8 7,9 2,2 13,5 10,7 15,5 0,1 21,1 8,8 4,7 -2,0

Rituxan 0,05 mg/ml

-11,8 15,6 -10,0 -18,0 -15,3 -4,2 6,1 18,3 17,7 0,0 22,0 -10,7 -1,9 -31,5

Rituxan 0,05 mg/ml

0,0 1,8 -8,7 0,4 -9,5 -6,4 20,8 21,3 22,1 21,8 31,9 4,1 0,2 7,7

Rituxan 10mg/ml + IL -21 0,5 mg/kg

2,9 41,1 21,5 9,5 35,3 83,1 28,0 15,9 21,9 26,2 -2,4 -29,8 -14,6 -10,0

Rituxan 10mg/ml + IL-210,5 mg/kg

5,7 48,3 16,2 10,9 41,7 73,2 60,6 45,5 42,2 24,8 22,1 -1,3 2,0 -5,7

Rituxan 10mg/ml +

-16,5 76,5 69,0 77,9 113,1 313,4 144,8 99,1 137,1 85,8 15,3 -12,9 -27,4 -11,6

Rituxan 0,05 mg/ml + IL210,5 mg/kg

-1,5 138,8 130,6 101,1 122,2 256,0 176,2 47,8 35,7 42,2 162,5 94,7 16,3 4,0

Rituxan 0,05 mg/ml + IL210,5 mg/kg

26,1 36,2 26,0 21,5 63,6 92,9 68,9 41,9 57,9 46,3 12,0 -3,0 -2,4 -11,6

Rituxan 0,05 mg/ml + IL210,5 mg/kg

40,7 30,3 56,3 97,1 154,5 251,6 129,8 35,7 79,1 43,9 92,0 62,2 57,9 19,2

Monocitos - Cambio porcentual con respecto al valor inicial de CD64 MFI

Día

Día 3 Día 7 Día 8 Día 8,25 Día 10 Día 14 Día 17 Día 22 Día 22,25 Día 24 Día 29 Día 32 Día 37 Día 42

Control

-6,0 -25,1 -23,8 -17,8 -0,2 -2,1 3,4 2,0 -1,2 -1,5 10,1 -15,5 -6,7 -9,8

Control

-12,5 -18,0 -30,5 -6,5 -10,6 0,9 12,8 6,1 15,3 12,4 13,3 -35,7 1,2 8,5

Control

-13,7 -13,6 -23,0 -10,9 11,0 4,6 10,0 10,4 12,1 4,1 6,3 -31,1 -17,7 11,6

IL-21

74,2 32,7 12,1 36,1 127,6 35,4 10,2 0,3 23,9 105,2 2,7 -22,1 -1,1 -25,9

IL-21 0,5 mg/kg

346,4 119,0 39,3 122,3 322,5 112,0 37,9 19,2 54,5 301,2 66,2 -10,6 30,7 7,8

IL-21 0,5 mg/kg

65,4 23,4 125,1 230,4 67,0 38,1 18,4 82,4 185,2 39,5 -18,6 -13,6 13,9

Rituxan 0,05 mg/ml

-14,8 -11,5 -17,3 -1,3 -3,8 -8,6 -10,6 -6,3 7,3 -16,0 -11,8 -12,3 -8,1 -2,7

Rituxan 0,05 mg/ml

-21,0 -3,9 -16,8 16,6 -11,1 7,3 5,6 3,5 22,6 13,7 9,9 -12,6 15,9 14,2

Rituxan 0,05 mg/ml

-6,9 4,4 -21,1 2,5 8,2 16,1 17,3 13,8 10,8 15,6 24,2 -24,1 25,4 50,6

Rituxan 10mg/ml + IL21 0,5 mg/kg

236,5 123,6 77,5 182,4 320,9 114,1 57,9 23,8 32,8 11,8 21,2 8,0 31,0 60,5

Rituxan 10mg/ml + IL21

249,5 123,3 68,1 173,8 281,8 62,3 75,7 19,1 22,6 16,4 26,0 -2,5 35,2 5,9

Rituxan 10mg/ml + IL21 0,5 mg/kg

334,9 105,2 52,6 115,1 393,7 135,5 107,4 2,7 8,3 5,2 29,1 -3,0 21,6 -3,5

Rituxan 0,05 mg/ml + IL210,5 mg/kg

225,5 114,3 76,2 159,7 304,1 89,9 46,2 33,1 58,1 281,6 58,2 7,6 21,3 13,3

Rituxan 0,05 mg/ml + IL210,5 mg/kg

208,9 1148,7 83,3 194,4 368,5 89,4 43,0 28,3 82,5 245,1 39,0 -4,6 9,5 10,9

Rituxan 0,05 mg/ml + IL210,5 mg/kg

196,9 183,6 128,5 303,1 356,7 108,2 26,5 15,3 55,9 193,6 11,9 -10,4 48,8 20,8

Ejemplo 6

Destrucción de líneas celulares de cáncer de mama que expresan Her-2/neu mediada por IL-21 y trastuzumab

A.

Se obtuvieron doscientos ml de sangre humana de un programa de donantes. Se recogieron 180 ml de sangre en tubos de ácido cítrico y dextrosa y se recogieron 20 ml del mismo donante en tubos de coagulación (BD Biosciences). Se centrifugó la sangre de los tubos de coagulación a 2800 rpm durante 30 minutos. Se recogió el suero de la parte superior y se usó en los medios de cultivo (véase más adelante). Los 180 ml de sangre de los tubos de ACD se agruparon y se diluyeron 1:2 en solución salina de tampón de fosfato (PBS), suero bovino fetal (FBS) al 2 %. Se pusieron alícuotas de sangre de 30 ml en tubos de 50 ml. Se depositaron 12 ml de Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences) formando una capa sobre sobre el fondo de cada uno de los tubos de 50 ml de sangre. Se centrifugaron los tubos de sangre a 1800 rpm durante 30 minutos. Se recogió la interfaz de capa leucocítica de cada tubo de 50 ml y se agruparon. Se lavaron los grupos 2-3 veces con un total de 100x el volumen celular de PBS, FBS al 2 %. El sedimento final lavado se volvió a suspender en 2 ml de PBS, FBS al 2 %. Se contaron las células en un hemocitómetro.

Se cultivaron células CMN purificadas como se describe anteriormente a 5x106 células/ml, en SF completo (aMEM con nucleósidos, B-mercaptoetanol 50 µM, insulina 1:100, transferrina, reserva de selenio (Invitrogen), 150 µg/ml de transferrina adicionales, 5 mg/ml de seroalbúmina bovina) con suero autólogo al 4 %, con o sin la adición de 20 ng/ml de IL-21 humana durante 4 días a 37 °C. En el día 4 se recogieron las células, se contaron en el hemocitómetro y se lavaron en solución salina tamponada de Hank (HBSS sin Ca o Mg) con suero bovino fetal (FBS) al 5 %, ahora denominado HBSSF. Se resuspendieron los sedimentos celulares en HBSSF a 5x106 células/ml.

Se marcaron líneas celulares de cáncer de mama objetivo, incluidas BT-474 (ATCC N.º HTB-20), SK-BR-3 (ATCC N.º HTB-30) o MCF-7 (ATCC N.º HTB-22), con calceína 10 µM en HBSSF durante 1 hora a 37 °C. Después, se lavaron los objetivos en 10 volúmenes de HBSSF a 1100 rpm durante 8 minutos. Se resuspendieron los sedimentos celulares en HBSSF a 50.000 células/ml. Se centrifugaron células efectoras CMN pretratadas con o sin IL-21 humana durante 4 días como se describe anteriormente a 1100 rpm durante 8 minutos y se resuspendieron los sedimentos celulares en HBSSF a aproximadamente 5x106 células/ml. Se prepararon diluciones seriadas 1:3 de los efectores en placas de fondo redondo de 96 pocillos por duplicado. Se añadieron 100 µl de objetivos a cada pocillo en presencia de 2 µg/ml de IgG humana o de 2,5 µg/ml de trastuzumab. Se centrifugaron las placas de 96 pocillos a 500 rpm durante 3 minutos. Se incubaron las placas a 37 °C durante 3 horas y después se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. Se transfirieron 100 µl de sobrenadante de cada pocillo a placas de 96 pocillos de fondo plano y se leyeron en el fluorímetro Wallac (Wallac) a 485/535 con intervalos de 1 segundo.

La línea celular de cáncer de mama MCF-7 expresa antígeno Her-2/neu a niveles bajos en comparación con la línea celular BT-474, que expresa este antígeno a niveles altos. En el ensayo de CCDA descrito anteriormente, cuando se usan objetivos MCF-7 a una proporción de efector:objetivo (E:O) de 3, los efectores no tratados en presencia de trastuzumab no tienen más actividad citolítica que los efectores no tratados con IgG en el ensayo. En presencia de trastuzumab, a una E:O de 10, los efectores pretratados con IL-21 tienen 4 veces más actividad citolítica que los efectores no tratados. A una E:O de 10, en presencia de IgG, los efectores pretratados con IL-21 presentaban un aumento de 0,5 veces de la actividad citolítica con respecto a los efectores no tratados. Cuando los objetivos son células BT-474, en presencia de trastuzumab, a una E:O de 10 se produce un aumento de 7 veces de la actividad citolítica de los efectores no tratados con respecto a aquellos no tratados y con IgG presente en el ensayo. A una

E:O de 10, el pretratamiento con IL-21 aumenta esta actividad citolítica 2 veces. Estos resultados respaldan el hecho de que la línea celular MCF-7 es una línea celular que expresa poco antígeno, ya que el trastuzumab solo no es eficaz para potenciar la actividad citolítica efectora sobre esta línea celular. El trastuzumab solo es eficaz para potenciar la actividad citolítica de efectores sobre los objetivos BT-474. El pretratamiento con IL-21 aumenta adicionalmente la actividad citolítica de los efectores sobre estas dos líneas celulares.

Tabla 18

Actividad CCDA de linfocitos NK humanos contra objetivos de cáncer de mama. El criterio de valoración es el porcentaje lisado a una proporción de E:O de 3.

Donante

Objetivo Control Pretratamiento con rIL-21

A74

MCF-7 11,2943 22,71177

A74

SKBr3 12,12149 39,34667

A74

MCF-7 0 25,9

(continuación)

Actividad CCDA de linfocitos NK humanos contra objetivos de cáncer de mama. El criterio de valoración es el porcentaje lisado a una proporción de E:O de 3.

B202

HCC142 8 27,76922 54,18124

B202

HCC38 27,4133 43,12007

B202

HCC38 9,00991 40,34685

B202

MCF7 13,73884 45,35621

B202

MCF7 8,487321 39,9608

B202

MCF7 8,739211 41,61529

B202

SKBR3 28,50026 53,7579

B202

SKBR3 14,84613 26,45897

C025

HCC142 8 18,60837 50,02053

C025

HCC142 8 14,20742 27,40921

C025

HCC38 16,89381 32,41753

C025

HCC38 7,033291 28,39438

C025

MCF7 14,40028 45,16213

C025

MCF7 6,009641 27,19668

C025

MCF7 8,491816 23,90491

C025

MCF7 11,2943 22,71177

C025

SKBR3 26,61171 48,15062

C025

SKBR3 18,33489 34,07056

C025

SKBR3 12,12149 39,34667

B.

Se obtuvieron doscientos ml de sangre humana de un programa de donantes. Se recogieron 180 ml de sangre en tubos de ácido cítrico y dextrosa y se recogieron 20 ml del mismo donante en tubos de coagulación (BD 5 Biosciences). Se centrifugó la sangre de los tubos de coagulación a 2800 rpm durante 30 minutos. Se recogió el suero de la parte superior y se usó en los medios de cultivo (véase más adelante). Los 180 ml de sangre de los tubos de ACD se agruparon y se diluyeron 1:2 en solución salina de tampón de fosfato (PBS), suero bovino fetal (FBS) al 2 %. Se pusieron alícuotas de sangre de 30 ml en tubos de 50 ml. Se depositaron 12 ml de Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences) formando una capa sobre sobre el fondo de cada uno de los tubos de 50 ml de

10 sangre. Se centrifugaron los tubos de sangre a 1800 rpm durante 30 minutos. Se recogió la interfaz de capa leucocítica de cada tubo de 50 ml y se agruparon. Se lavaron los grupos 2-3 veces con un total de 100x el volumen celular de PBS, FBS al 2 %. El sedimento final lavado se volvió a suspender en 2 ml de PBS, FBS al 2 %. Se contaron las células en un hemocitómetro.

Se diluyeron CMN a 5 - 10 x 107 células/ml en PBS, FBS al 2 %. Se purificaron los linfocitos NK usando el kit de 15 enriquecimiento de linfocitos NK humanos de StemCell Technologies. Se centrifugaron los linfocitos NK a 1100 rpm durante 8 minutos y se resuspendieron en 0,5 ml de PBS, FBS al 2 % y se contaron en un hemocitómetro.

Se plaquearon células BT-474 (ATCC N.º HTB-20) a 125 x106 células/ml en una placa de 12 pocillos en DMEM (Gibco), FBS al 10 % y se dejó que se adhirieran durante 3 horas. Se diluyeron linfocitos NK purificados como anteriormente a 1 - 2 x 106 células/ml en SF completo (aMEM con nucleósidos, -mercaptoetanol 50 µM, insulina 20 1:100, transferrina, reserva de selenio (Invitrogen), 150 µg/ml de transferrina adicionales, 5 mg/ml de seroalbúmina bovina) más suero AB humano inactivado por calor al 4 %. Los medios se retiraron por aspiración de las células BT474 y se añadieron 2 ml de linfocitos NK diluidos a las células BT-474, estableciendo el cocultivo. Al cocultivo se le añadió nada, 2 µg/ml de trastuzumab, 20 ng/ml de IL-21 humana o 2 µg/ml + 20 ng/ml de IL-21 humana. Se incubaron los cocultivos durante la noche a 37 °. D espués del cocultivo durante la noche se recogieron las células y

25 se contaron en un hemocitómetro. Se lavaron las células en HBSSF (véase más adelante) y se resuspendieron los sedimentos celulares en 1 ml de HBSSF.

Se añadieron 20 µg/ml de gamma globulina de ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) y anticuerpo conjugado 1:100 a 100.000 - 200.000 linfocitos NK en 100 µl de HBSSF. La combinación de

anticuerpos incluía CD25FITC, CD56PE, CD16Cychrome y CD8APC (BD Pharmingen). Los controles de isotipo incluían 100.000 - 200.000 linfocitos agrupados de cocultivos de NK con cada anticuerpo solo. Se incubaron las células a 4 °C durante 30 minutos en oscuridad. Se l avaron las células 1 vez en PBS, FBS al 2 % y se dejaron en 200 µl de PBS, FBS al 2 %. Se añadió paraformaldehído al 0,2 % para fijar las células y las células se mantuvieron a 4 °C hasta que estuvieron listas para realizar el a nálisis FACS. Se realizó un análisis FACS en un FACS Calibur de Becton Dickinson a los 3-4 días de la fijación. Se usó el programa informático Cellquest para analizar los datos de flujo. Se calculó el número total de células multiplicando el número de células por ml por el volumen del cultivo.

En la totalidad de los los 4 donantes sometidos a prueba se observó un aumento de la población de células CD56+/CD25+ cuando el trastuzumab y la IL-21 estaban presentes en el cocultivo de linfocitos NK y la línea celular de cáncer de mama BT-474. Específicamente, en comparación con los cocultivos con medio solo (descritos anteriormente), el trastuzumab solo dio como resultado un aumento de 2 - 20 veces, la IL-21 sola dio como resultado un aumento de 2 - 4 veces y, cuando estaban presente la IL-21 y el trastuzumab se observó un aumento de 4 - 50 veces de la población CD56+/CD25+. En todos los donantes se observó un aumento de la población CD56+/CD25+en presencia de IL-21 y trastuzumab con respecto a todas las demás condiciones de cocultivo.

C.

Se obtuvieron 200 ml de sangre humana del programa de donantes del propio centro. Se recogieron 180 ml de sangre en tubos ACD y se recogieron 20 ml del mismo donante en tubos de coagulación. Se centrifugó la sangre de los tubos de coagulación a 2800 rpm durante 30 minutos. Se recogió el suero de la parte superior y se usó en los medios de cultivo (véase más adelante). Los 180 ml de sangre de los tubos de ACD se agruparon y se diluyeron 1:2 en solución salina de tampón de fosfato (PBS), suero bovino fetal (FBS) al 2 %. Se pusieron alícuotas de sangre de 30 ml en tubos de 50 ml. Se depositaron 12 ml de Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, N.º de cat. 17-144003) formando una capa sobre el fondo de cada uno de los tubos de 50 ml de sangre. Se centrifugaron los tubos de sangre a 1800 rpm durante 30 minutos. Se recogió la interfaz de capa leucocítica de cada tubo de 50 ml y se agruparon. Se lavaron los grupos 2-3 veces con un total de 100x el volumen celular de PBS, FBS al 2 %. El sedimento final lavado se volvió a suspender en 2 ml de PBS, FBS al 2 %. Se contaron las células en un hemocitómetro.

Se cultivaron células CMN purificadas como se describe anteriormente a 0,5x106 células/ml en SF completo (aMEM con nucleósidos, -mercaptoetanol 50 µM, insulina 1:100, transferrina, reserva de selenio (Invitrogen), 150 µg/ml de transferrina adicionales, 5 mg/ml de seroalbúmina bovina) con suero autólogo al 4 %, con o sin la adición de 20 ng/ml de IL-21 humana durante 4 días a 37 °C. En el día 4 se recogieron las células, se contaron en el hemocitómetro y se lavaron en solución salina tamponada de Hank (HBSS sin Ca o Mg) con suero bovino fetal (FBS) al 5 %, ahora denominado HBSSF. Se resuspendieron los sedimentos celulares en HBSSF a 0,5x106 células/ml.

Se marcaron líneas celulares de cáncer de mama objetivo, incluidas BT-474 o MCF-7, con calceína 10 µM en HBSSF durante 1 hora a 37 °C. Después, se lavaron os o bjetivos con 10 volúmenes de HBSSF a 1100 rpm durante 8 minutos. Se resuspendieron los sedimentos celulares en HBSSF a 50.000 células/ml. Se centrifugaron células efectoras CMN pretratadas con o sin IL-21 humana durante 4 días como se describe anteriormente a 1100 rpm durante 8 minutos y se resuspendieron los sedimentos celulares en HBSSF a aproximadamente 0,5x106 células/ml. Se prepararon diluciones seriadas 1:3 de los objetivos en placas de fondo redondo de 96 pocillos por duplicado. Se añadieron 100 µl de objetivos a cada pocillo en presencia de 2 µg/ml de IgG humana o de 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 o 0,31 µg/ml de herceptin. Se centrifugaron las placas de 96 pocillos a 500 rpm durante 3 minutos. Se incubaron las placas a 37 °C durante 3 horas y después se centrif ugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. Se transfirieron 100 µl de sobrenadante de cada pocillo a placas de 96 pocillos de fondo plano y se leyeron en el fluorímetro de Wallac a 485/535 con intervalos de 1 segundo.

Usando las líneas celulares BT-474 o MCF-7 como objetivos en un ensayo de CCDA, las CMN pretratadas con IL-21 presentan más actividad a todas las concentraciones de trastuzumab probadas que las CMN no tratadas o cuando hay IgG presente en el ensayo. A una proporción de efector:objetivo (E:O) de 3, la actividad citolítica es máxima a 5 µg/ml de trastuzumab cuando se usan BT-474. A una E:O de 3, la actividad citolítica es máxima a 1,25 µg/ml cuando se usan MCF-7.

D.

Se recogió sangre periférica de macacos cangrejeros en tubos de 5 ml con heparina de litio y se almacenó a temperatura ambiente hasta el procesamiento de las muestras. Se diluyeron las muestras con PBS que contenía EDTA 1 mM y se recogió la fracción de células mononucleares (CMN) por centrifugación sobre Ficoll al 95 %. Después de lavarlas, se cultivaron las células durante 3 días en medios de crecimiento que contenían 20 ng/ml de rIL-21 o en medios de control. Después de la incubación, se lavaron y se contaron las células, y se tiñeron alícuotas para realizar el inmunofenotipado por citometría de flujo. Se usó una alícuota de células para realizar ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos como sigue. Se cargaron células objetivo de cáncer de mama BT474 con tinción de calceína-AM durante 60 minutos a 37 °C, se lavaron y se colocaron 1000 células obje tivo en pocillos que contenían 2 µg/ml de Herceptin y 50.000, 25.000, 12.500, 6250, 3125, 1563 o 781 CMN. Se incubaron

los ensayos durante 3 h en oscuridad a 37 °C. Despu és de esta incubación, se midió la liberación de calceína-AM a los sobrenadantes y se calculó la lisis específica basándose en la liberación por lisis total (detergente) y la liberación no específica en ausencia de cualquier célula efectora CMN. Se repitió el experimento dos veces para cada uno de los 8 macacos cangrejeros donantes. Se presentaron los datos como porcentaje de lisis específica por CMN a una 5 proporción de E:O de 25, o se normalizaron los datos para reflejar el número real de linfocitos NK en la preparación de CMN, basándose en el análisis de citometría de flujo. Para los datos ajustados de NK, se ajustó la proporción de

E:O frente al porcentaje lisado usando una curva sigmoidal de 4 parámetros y se usó la ecuación de Hill para determinar el porcentaje lisado a una proporción de E:O de 3 NK por objetivo BT-474.

El tratamiento in vitro de CMN de macaco cangrejero con rIL-21 aumentó la actividad en ensayos de CCDA mediada

10 por Herceptin usando objetivos de cáncer de mama BT-474. Algunos animales presentaron una respuesta mayor frente a rIL-21 que otros, y esta respuesta variable fue coherente en cada animal en experimentos repetidos. Se ajustó un modelo de efectos mixtos usando Proc MIXED en SAS@ (Littell et al. SAS System for Mixed Models; SAS Institute, 1996) con el tratamiento como un efecto fijo y efectos aleatorios para el donante y el tratamiento por interacción de donante. Se usó la opción Kenward Roger en SAS® para determinar los grados de libertad del

15 denominador para el cálculo del valor de P para el tratamiento. El término del tratamiento fue muy significativo.

Tabla 19

Actividad CCDA de preparaciones de CMN de macaco cangrejero frente a objetivos de cáncer de mama BT-474. El criterio de valoración es el porcentaje lisado a una proporción de E:O de 25.

Controles-sin tratamiento

Pretratamiento con rIL-21

Animal

Cont-ciclo1 Cont-ciclo2 rIL21-ciclo1 rIL21-ciclo2

A

15,10089 34,57907

B

4,576255 6,457869 17,69686 15,00928

C

12,60543 4,191629 29,77582 20,20712

D

25,48322 16,04117 32,51966 32,08234

E

20,77167 6,569754 32,82285 26,04751

F

15,85598 4,479947 22,39635 12,16969

G

31,07411 18,44403 54,5077 37,00462

H

26,21558 7,980985 29,85094 20,00046

Tabla 20

Actividad CCDA de preparaciones de CMN de macaco cangrejero frente a objetivos de cáncer de mama BT-474. El criterio de valoración es el porcentaje lisado a una proporción de E:O ajustada de NK de 3.

Controles-sin tratamiento

Pretratamiento con rIL-21

Cont animal

Cont Cont IL-21 IL-21

A

17,56976 36,4764

B

5,349258 7,43626 22,17732 17,10627

C

13,51977 3,109 31,55683 26,31246

D

24,98626 15,87297 31,02951 31,07489

E

19,4483 6,177042 38,98066 24,94877

F

16,14824 4,779288 24,31473 15,74664

G

31,54203 17,95528 53,47342 35,68798

H

23,98745 8,451089 32,60043 16,41115

Ejemplo 7

Modelo de ratón de depleción de CD4/CD8

Durante muchos años se ha usado la depleción de células usando anticuerpos frente a receptores de superficie celular para comprenden las funciones específicas de estas células en los mecanismos inmunitarios. Cuando se inyectan en ratones, los anticuerpos frente a los antígenos CD4 y CD8 de los linfocitos T provocan la depleción de subconjuntos de linfocitos T específicos mediante un mecanismo que implica la CCDA y el complemento. Se inyectan dosis bajas de anticuerpos en ratones para provocar una depleción de entre el 20-50 % de linfocitos T CD4

o CD8. Se administra IL-21 a grupos de ratones y se estudia su capacidad para potenciar la depleción realizando un seguimiento de los linfocitos T mediante citometría de flujo. El aumento de la depleción de los linfocitos T con la IL21 indica la capacidad de la IL-21 para potenciar la depleción de células mediada por anticuerpos in vivo.

Para los estudios de depleción se usan CD4 de rata anti-ratón (clon GK1.5, ATCC) o CD8 de rata anti-ratón (clon 536.72, ATCC). A grupos de ratones C57BL/16 de 8-12 semanas de edad (Charles River Laboratories) se les inyecta

i.p. anticuerpo de control, 5-50 µg de AcM anti-CD4 o anti-CD8 el día 0. Los grupos de ratones reciben i.p. PBS o 25 µg de mIL-21 comenzando dos días antes de los sangrados hasta el día uno. Se sangra a los ratones en los días 1, 4 y 7. Se somete a ensayo el número de linfocitos T CD4 y CD8 en la sangre mediante citometría de flujo.

El aumento de la depleción de linfocitos T con la IL-21 indica la capacidad de la IL-21 para potenciar la depleción de células mediada por anticuerpos in vivo, lo que sugiere que la IL-21 puede potenciar los efectos mediados por anticuerpos.

Ejemplo 8

Ensayo de eliminación pulmonar

Se han usado ensayos de eliminación pulmonar para estudiar la función de los linfocitos NK in vivo. Se inyectan i.v. en ratones células RAJI marcadas con cromo-51 (51Cr). Los grupos de ratones reciben PBS, mIL-21, rituximab solo o rituximab + IL-21. Se sacrifica a los ratones 5-8 horas después de la inyección i.v. y se somete a ensayo a los pulmones para determinar la cantidad de radioactividad usando un contador gamma. La disminución de la radioactividad en el pulmón es un indicador del aumento de la eliminación (destrucción) de células tumorales por linfocitos NK. La capacidad de la IL-21 para potenciar la eliminación de células tumorales en presencia de rituximab es indicativa de la capacidad de la IL-21 de potenciar la actividad lítica mediada por anticuerpos in vivo.

Se marcan células RAJI con 100 µCi de 51Cr durante 2 horas a 37 °C. Se lavan las células dos veces con PBS y se resuspenden en PBS estéril, a pH 7,2. A los ratones se les inyectan i.v. 10 millones de células RAJI marcadas en el tiempo 0 (t = 0). Grupos de ratones reciben 20 µg de anticuerpo de control o rituximab i.p. a t = 10 min. Grupos de ratones reciben PBS o 25 µg de mIL-21 a t = -24 h, t = 0 h y t = 4 h. Se sacrifica a los ratones entre 5-8 horas después de la inyección de tumores, se aíslan los pulmones y se cuenta en un contador gamma. La radioactividad se representa gráficamente como el porcentaje de inyecciones de control (células marcadas solas).

La disminución de la radioactividad en el pulmón es un indicador del aumento de la eliminación (destrucción) de células tumorales por linfocitos NK. La capacidad de la IL-21 para potenciar la eliminación de células tumorales en presencia de rituximab es indicativa de su capacidad de potenciar la actividad lítica mediada por anticuerpos in vivo.

Ejemplo 9

Estudio de depleción de Raji/macrófagos IDCG

La combinación de IL-21+rituximab (rituximab) tiene una actividad antitumoral sinérgica en un modelo tumoral de Raji/IDCG. Se cree que la CCDA desempeña un papel importante en la actividad antitumoral del rituximab in vivo,y los macrófagos son células efectoras importantes en este proceso. La IL-21 puede influir en la actividad CCDA de los macrófagos en ratones, dando lugar a la sinergia con el rituximab. Con el fin de probar la importancia de los macrófagos en el efecto antitumoral de IL21 + rituximab, se provocará la depleción de macrófagos en ratones, usando liposomas de clodronato (Sigma, St. Louis, MO). El experimento demuestra que los macrófagos son decisivos para la actividad antitumoral sinérgica de IL-21 + rituximab mediante la demostración de que los ratones con depleción de esta población celular presentan una supervivencia acortada con relación a los ratones sin depleción.

Para estudiar la importancia de los macrófagos en la actividad antitumoral de IL21 + rituximab contra células Raji en ratones IDCG, se realizó el experimento siguiente. Se retrasó el tratamiento con rituximab para reducir su eficacia (Funakoshi, Longo et al. Blood, 83(10):2787-94, 1994) y se inyectó mIL-21 durante 5 días consecutivos que encuadran la primera inyección de rituximab. Se usaron células HS-Sultan y Raji porque no generan señales a través de STAT1 o STAT3 y su crecimiento no se inhibe por la IL-21 in vitro o in vivo).

Grupo Cepa #Ratones Tratamiento Liposomas de clodronato+IL

1.) IDCG 10 (1481-90)

21+rituximab 2.) IDCG 10 (1491-1500) Liposomas de PBS+IL-21+rituximab 3.) IDCG 9 (1501-09) Liposomas de clodronato+rituximab 4.) IDCG 9 (1510-18) Liposomas de PBS+rituximab 5.) IDCG 9 (1519-28) Liposomas de clodronato+PBS

1 x 106 células Raji inyectadas IV en el día 0 del estudio 100 µg de IL-21 administrados por vía IP en los días 3-7 20 µg de rituximab administrados por vía IP en el día 5, el día 9, el día 13, el día 17 y el día 21. Liposomas administrados IV: día 3 - 0,2 ml de liposomas al 100 % día 9 - 0,2 ml de liposomas al 50 % día 15 - 0,2 ml de liposomas al 50 % día 21 - 0,2 ml de liposomas al 50 % La figura 1 muestra que la depleción de macrófagos con liposomas de clodronato (p. ej., Clod.IL21+R) redujo

espectacularmente el beneficio de supervivencia para ratones IDCG portadores de células de linfoma Raji en comparación con ratones inyectados con liposomas de PBS. Los ratones depleción de macrófagos tratados con IL21+rituximab (Clod.IL21+R) o rituximab (Clod.R) presentaron una supervivencia (tiempo medio hasta la muerte) significativamente más corta en comparación con los ratones sin depleción (PBS.IL21+R y PBS.R respectivamente).

Ejemplo 10 Eliminación tumoral después de IL-21 + rituximab en ratones IDCG con depleción de granulocitos

La IL-21 junto con rituximab es capaz de eliminar eficazmente células tumorales RAJI in vivo mejor que el rituximab solo. Se inyectarán células RAJI en ratones IDCG CB17 que tienen depleción de granulocitos. Se estudió el efecto del rituximab solo o en combinación con IL-21.

A ratones CB17-idcg se les inyectaron IV 1 x 106 células Raji. Además, a algunos de los ratones se les inyectó anticuerpo monoclonal Gr-1 (BD Biosciences, Palo Alto, CA). Se tratará a los ratones con 20 µg de Rituxan, 100 µg de mIL-21 o una combinación de Rituxan y mIL-21 mediante inyecciones IP.

Se monitorizó a los ratones para detectar 1) pérdida de peso corporal coherente o rápida del 20 %, 2) parálisis o incapacidad de mantener una posición erguida o moverse, 3) respiración trabajosa - especialmente si va acompañada de descarga nasal o cianosis, 4) letargo o ausencia de respuesta a estímulos suaves. Se sacrificó a los ratones que cumplían los criterios anteriores.

Se administraron tratamientos de Ac para los grupos 1-6 en los días 5, 9, 13, 17 y 21. A los grupos 7-10 se les trató en los días 12, 19, 26, 33 y 40. La proteína se administró en los días 3-7 para los grupos 1-6 y en los días 10-14 para los grupos 7-10.

Tratamiento con

Ratones # Depleción Proteína

Ac

1) C.b-17 IDCG 2) C.B-17 IDCG 3) C.B-17 IDCG 4) C.B-17 IDCG 5) C.B-17 IDCG 6) C.B-17 IDCG

8 8 8 8 8 8 ninguna ninguna ninguna Gr-1 Gr-1 Gr-1 PBS 20 µg de rituximab 20 µg de rituximab PBS 20 µg de rituximab 20 µg de rituximab PBS PBS 100 ug de IL21 PBS PBS 100 ug de IL21

44

La figura 2 muestra que la actividad antitumoral sinérgica de IL-21+rituximab está comprometida por la depleción de granulocitos con AcM anti-Gr-1. La supervivencia de ratones IDCG portadores de Raji (fracción superviviente a los 100 días) se reduce significativamente en ratones IDCG con depleción de granulocitos (líneas de puntos) en comparación con los ratones sin depleción (líneas continuas).

Ejemplo 11

IL-21 en combinación con anticuerpos anti-CTLA4

A. Modelo tumoral de células RENCA

Para probar si la IL-21 en combinación con AcM anti-CTLA4 tiene efectos sobre el crecimiento de tumores en ratones, se usó un modelo tumoral de células RENCA. Se ha demostrado que los modelos de ratón de carcinoma de células renales que usan células Renca establecen tumores metastásicos que son sensibles al tratamiento agentes inmunoterápicos tales como la IL-12 y la IL-2 (Wigginton et al., J. of Natl. Cancer Inst. 88:38-43, 1996). A grupos de ratones se les inyectó s.c tumor RENCA en el día 0. Después, se inyectó a los ratones vehículo solo, 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA4 (clon 9H10, eBiosciences, San Diego, CA), 25 ug de mIL-21 sola o 50 ug o 100 ug de anti-CTLA4 en combinación con 25 ug de mIL-21. Se usó una dosis baja de 25 ug de mIL-21 que normalmente no tiene un efecto antitumoral potente en este modelo.

A ratones BALB/c hembra de diez semanas de edad (Charles River Laboratories) se les inyectaron SC en el flanco derecho 0,1 x 106 células RENCA en el día 0. Grupos de ratones recibieron vehículo solo (PBS, pH 7,2) o 25 ug de mIL-21 en los días 5-9, 19-23. Grupos distintos recibieron 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA-4 solo en los días 0, 4 y 8 o recibieron AcM anti-CTLA4 (50 ug o 100 ug) en los días 0, 4 y 8 en combinación con 25 ug de mIL-21 en los días 5-9, 19-23. Todas las inyecciones se administraron por vía intraperitoneal. Se monitorizó el crecimiento tumoral 3X/semana durante 5 semanas usando medidas de calibre. Se calculó el volumen del tumor usando la fórmula1/2*(B)2*L (mm3).

La inyección de mIL-21 sola o las dos concentraciones de AcM anti-CTLA4 solo no tuvieron ningún efecto sustancial sobre el crecimiento tumoral. En contraste, la combinación de mIL21 con AcM anti-CTLA4 a cualquier concentración mostró una disminución significativa del volumen del tumor en comparación con los controles (figura 1). Estos datos indican que la combinación de IL21 con AcM anti-CTLA4 tiene actividad antitumoral sinérgica y es un posible tratamiento combinado para el cáncer.

B. La administración terapéutica de IL-21 de ratón en combinación con anti-CTLA4 de ratón inhibe el crecimiento tumoral en el modelo RENCA.

Para probar si la combinación de IL-21 con AcM anti-CTLA4 tiene efectos sobre el crecimiento tumoral en ratones cuando se administra usando un régimen terapéutico, a grupos de ratones se les inyectó s.c. tumor RENCA en el día

0. Después, a los ratones se les inyectó vehículo solo, 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA4 (clon 9H10, eBiosciences), 25 ug de mIL-21 sola o 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA4 en combinación con 25 ug de mIL-21 comenzando a un volumen de tumor de 60-80 mm3. Se usa una dosis baja de 25 ug de mIL-21 que normalmente no tiene un efecto antitumoral potente en este modelo. El AcM anti-CTLA4 se administran en los días 1, 5, 9 y 13, después de haberse alcanzado un volumen tumoral de 60-80 mm3. La mIL-21 se inyecta en los días 5-9, 19-23 o desde los días 1-10 después de haberse alcanzado un volumen tumoral de 60-80 mm3. Los efectos antitumorales observados en los grupos que combinaban mIL-21 y AcM anti-CTLA4 indican un efecto antitumoral sinérgico en este modelo cuando se administra en un régimen terapéutico.

A ratones BALB/c hembra de diez semanas de edad (Charles River Laboratories) se les inyectan SC en el flanco derecho 0,1 x 106 células RENCA en el día 0. Grupos de ratones recibieron vehículo solo (PBS, pH 7,2) o 25 ug de mIL-21 en los días 5-9, 19-23 o en los días 1-10 después de haberse alcanzado un volumen tumoral de 60-80 mm3. Grupos distintos reciben 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA solo en los días 1, 5, 9 y 13 o reciben AcM anti-CTLA4 (50 ug o 100 ug) en los días 1, 5, 9 y 13 en combinación con 25 ug de mIL-21 en los días 5-9, 19-23 o en los días 110 después de haberse alcanzado un volumen tumoral de 60-80 mm3. Todas las inyecciones se administran por vía intraperitoneal. Se monitoriza el crecimiento tumoral 3X/semana durante 5 semanas usando medidas de calibre. Se calcula el volumen del tumor usando la fórmula 1/2*(B)2*L (mm3).

Los efectos antitumorales observados en los grupos que combinaban mIL-21 y AcM anti-CTLA4 indican un efecto antitumoral sinérgico en este modelo cuando se administra en un régimen terapéutico. Estos datos indican que la combinación de IL21 con AcM anti-CTLA4 tiene actividad antitumoral sinérgica y es un posible tratamiento combinado para el cáncer.

C. El tratamiento combinado con mIL-21 y anti-CTLA4 de ratón inhibe el crecimiento tumoral en el modelo de timoma E.G7.

Para probar si la combinación de mIL-21 y AcM anti-CTLA4 induce la actividad antitumoral, a grupos de ratones se les inyecta s.c el tumor E.G7 en el día 0 (Shrikant, P y Mescher, M., J. Immunology 162:2858-2866, 1999). A los ratones se les inyecta vehículo solo, 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA4 (clon 9H10, eBiosciences), 25 ug de mIL21

sola o 50 ug o 100 ug de anti-CTLA4 en combinación con 25 ug de mIL21. Se usa una dosis baja de 25 ug de mIL21 que normalmente no tiene un efecto antitumoral potente en este modelo. El AcM anti-CTLA4 se administra en los días 0, 4 y 8. La mIL21 se inyecta en los días 5-9, 19-23 o en los días 2-20 en días alternos (EOD, por sus siglas en inglés). Los efectos antitumorales observados en los grupos que combinan mIL21 y CTLA4 indican un efecto antitumoral sinérgico en este modelo.

A ratones C57BL/6 hembra de diez semanas de edad (Charles River Laboratories) se les inyectan SC en el flanco derecho 0,4 x 106 células E.G7 (ATCC N.º CRL-2113) en el día 0. Después, a los ratones se les inyecta vehículo solo, 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA4 (clon 9H10, eBiosciences), 25 ug de mIL-21 sola o 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA4 en combinación con 25 ug de mIL-21. Se usa una dosis baja de 25 ug de mIL-21 que normalmente no tiene un efecto antitumoral potente en este modelo. El AcM anti-CTLA4 se administra en los días 0, 4 y 8. La mIL-21 se inyecta en los días 5-9, 19-23 o en los días 2-20 en días alternos (EOD). Las inyecciones intraperitoneales se administraron en un volumen total de 200 ul. Todos los reactivos se administran mediante inyecciones intraperitoneales. Se monitoriza el crecimiento tumoral 3X/semana durante 4 semanas usando medidas de calibre. Se calculó el volumen del tumor usando la fórmula ½*(B)2*L (mm3).

Los efectos antitumorales observados en los grupos que combinan mIL21 y AcM anti-CTLA4 indican un efecto antitumoral sinérgico en este modelo. Estos datos indican que la combinación de IL-21 con AcM anti-CTLA4 tiene actividad antitumoral sinérgica y es un posible tratamiento combinado para el cáncer.

D. El tratamiento combinado con mIL-21 y AcM anti-CTLA4 de ratón inhibe el crecimiento tumoral en el modelo de melanoma B 16.

PAra probar si la combinación de mIL-21 y AcM anti-CTLA4 induce la actividad antitumoral en otros tumores, a grupos de ratones se les inyectan s.c. células de melanoma B16-F10 (ATCC N.º CRL-6475) en el día 0. Después, a los ratones se les inyecta vehículo solo, 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA4 (clon 9H10, eBiosciences), 25 ug de mIL-21 sola o 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA4 en combinación con 25 ug de mIL-21. El AcM anti-CTLA4 se administra en los días 0, 4 y 8. La mIL-21 se inyecta en los días 5-9, 19-23 o en los días 2 y 20 en días alternos (EOD). Los efectos antitumorales observados en los grupos que combinan mIL-21 y AcM anti-CTLA4 indican un efecto antitumoral sinérgico en este modelo.

A ratones C57BL/6 hembra de diez semanas de edad (Charles River Laboratories) se les inyectan SC en el flanco derecho 0,5 x 106 células de melanoma B16 en el día 0. Después, a los ratones se les inyecta vehículo solo, 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA4 (clon 9H10, eBiosciences), 25 ug de mIL-21 sola o 50 ug o 100 ug de AcM anti-CTLA4 en combinación con 25 ug de mIL-21. El AcM anti-CTLA4 se administra en los días 0, 4 y 8. La mIL21 se inyecta en los días 5-9, 19-23 o en los días 2-20 en días alternos (EOD). Las inyecciones intraperitoneales se administraron en un volumen total de 200 ul. Todos los reactivos se administran mediante inyecciones intraperitoneales. Se monitoriza el crecimiento tumoral 3X/semana durante 4 semanas usando medidas de calibre. Se calculó el volumen del tumor usando la fórmula ½*(B)2*L (mm3).

Los efectos antitumorales observados en los grupos que combinan mIL21 y AcM anti-CTLA4 indican un efecto antitumoral sinérgico en este modelo. Estos datos indican que la combinación de IL-21 con AcM anti-CTLA4 tiene actividad antitumoral sinérgica y es un posible tratamiento combinado para el cáncer.

Listado de secuencias

5 10

<110> ZymoGenetics, Inc. Kindsvogel, Wayne R. Hughes, Steven D. Holly, Richard D. Clegg, Christopher H. Foster, Donald C. Johnson, Rebecca A. Heipel, Mark D. ……Sivakumar, Pallavur V.

<120> PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO ANTICUERPOS MONOCLONALES

DEL CÁNCER USANDO TRATAMIENTO CON IL-21 Y

15

<130> 04-03PC

<160> 2

20 25

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0 <210> 1 <211> 642 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (47)...(532)

30

<400> 1

<210> 2

<211> 162

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Rituximab y un polipéptido de IL-21 o un fragmento de un polipéptido de IL-21 como se muestra en la SEQ ID N.º: 2 desde el residuo de aminoácido 30 hasta el residuo 162, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto, en el que el rituximab y el polipéptido de IL-21 son para su administración una vez por semana durante hasta ocho

   5 semanas consecutivas.

2. 2.

   Rituximab y un polipéptido o fragmento de IL-21 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cáncer es linfoma no hodgkiniano.

3. 3.

   Rituximab y un polipéptido o fragmento de IL-21 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el sujeto es un paciente humano.

   10 4. Rituximab y un polipéptido o fragmento de IL-21 para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el paciente no ha mostrado anteriormente remisión o regresión tumoral apreciable en respuesta al rituximab.
4. 5. Rituximab y un polipéptido o fragmento de IL-21 para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el paciente ha recaído después de recibir tratamiento con rituximab.
5. 6. Rituximab y un polipéptido o fragmento de IL-21 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la 15 administración de IL-21 da como resultado una respuesta inmunológica óptima.
6. 7. Uso de rituximab y un polipéptido de IL-21 o un fragmento de un polipéptido de IL-21 como se muestra en la SEQ ID N.º: 2 desde el residuo de aminoácido 30 hasta el residuo 162, para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer en un sujeto, en el que el rituximab y el polipéptido de IL-21 son para su administración una vez por semana durante hasta ocho semanas consecutivas.

   Figura 1 Figura 2 Figura 3