CN102181476A

CN102181476A - 一种删除转基因杨树选择标记基因的方法

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Publication number: CN102181476A
Application number: CN 201110063438
Authority: CN
Inventors: 诸葛强; 陶玉峰; 周洁; 王立科; 潘惠新; 黄敏仁; 陈英; 王光萍
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2031-03-16
Also published as: CN102181476B

Abstract

本发明公开了一种删除转基因杨树选择标记基因的方法，该方法首先将转基因杨树试管苗置于培养基M上以根部萌蘖芽方式继代繁殖，剪取叶盘培养，然后浸入带有pX6-GFP质粒的农杆菌EHA105菌液浸泡10~15min，去除菌液后培养至完整植株，剪取完整植株茎段，在含有β-雌二醇的培养基中培养至植株再生。本发明的方法利用培养基中添加的β-雌二醇，通过诱导转基因植株茎段形成愈伤至植株再生过程删除选择标记基因，利用Cre/lox系统具有的重组删除功能，建立无选择标记基因的杨树转基因体系，为培育具生物安全的转基因杨树新品种提供一个新途径，为安全、高效的林木转基因育种提供基础。

Description

一种删除转基因杨树选择标记基因的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种删除转基因杨树选择标记基因的方法。

背景技术

杨树是世界上重要的造林树种之一，在我国人工林中杨树也有较大比重。在林木植物中杨树是较早开展转基因研究的树种之一，据报道通过基因工程技术已成功转入了抗病虫、耐盐碱、抗大气污染、降低木质素含量、增加生长量等基因，为培育具有优良性状的转基因杨树新品种提供了基础。但由于转基因植物的安全性等问题限制了转基因杨树的环境释放和推广应用。

近年来，转基因植物的安全性受到广泛关注，而转基因技术中标记基因的安全性问题已成为当今基因工程研究的热点。筛选标记基因作为标记基因的一种，是指在遗传转化中能够使转化细胞（或个体）从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因；目前常用的筛选标记基因主要有两大类，即抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因；这两类标记基因在完成筛选后并不参与植物的性状改良，它在植物中的存在便是多余的，且可能对环境或非靶标生物存在潜在风险，如转基因植物的抗生素抗性标记基因可能会转移进入人或动物的病原菌中，从而引起这些病原菌对抗生素的抗性，使抗生素失去效力；标记基因也可能会转移到杂草产生所谓“超级杂草”，破坏生态安全。如何消除选择标记，培育无选择标记的转基因植物已成为基因工程研究的热点。

王永刚（2007）在“无选择标记遗传转化体系研究”（南京林业大学硕士学位论文）一文中虽利用Cre/lox系统进行杨树无选择标记遗传转化体系研究，但未获得删除选择标记基因的转基因杨树；府健（2007）在《南林895杨无选择标记遗传转化的研究》（南京林业大学硕士学位论文）也利用该系统进行无选择标记转基因杨树的研究，但在21株转基因杨树中仅检测出一株删除了选择标记基因，仅约为5%，删除效率较低。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种删除转基因杨树选择标记基因的方法，利用Cre/lox系统具有的重组删除功能，建立无选择标记基因的杨树转基因体系，为培育具生物安全的转基因杨树新品种提供一个新途径，为安全、高效的林木转基因育种提供基础。

发明内容：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种删除转基因杨树选择标记基因的方法，包括以下步骤：

（1）采用感受态热激法将pX6-GFP质粒转入农杆菌EHA105，菌液涂抹在含有抗生素的YEB平板上，28℃培养24~36h，得转化后的单菌落，备用；

（2）将经分析鉴定的转基因杨树试管苗置于培养基M上，以根部萌蘖芽方式继代繁殖1个月，备用；培养基M的配方为在基本培养基MS中添加蔗糖25~30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

（3）在步骤（2）培养的试管苗上选取幼嫩、平展的叶，剪去叶边缘，得叶盘为外植体，接种于叶盘分化培养基T上，控温25±2℃，光照3000~4000lux，光照时间16~18h/d，培养2~3d；

（4）在农杆菌液体培养基中扩大培养步骤（1）的单菌落，得指数生长期的菌体，在基本培养基MS液体培养基悬浮菌体，得OD₆₀₀值为0.3~0.4的侵染菌液；

（5）将步骤（3）的培养后的外植体浸入步骤（4）的侵染菌液，振荡，浸泡10~15min，除去多余菌液，转至含有50~100μmol/L乙酰丁香酮的叶盘分化培养基T上暗培养2~3d，期间多次洗除菌液；

（6）先将步骤（5）暗培养后的叶盘转移到叶盘分化筛选培养基W上培养，直至分化出不定芽；再将不定芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基Y继代培养；待不定芽伸长至1.5~2cm长，将每个不定芽分离独立移入生根筛选培养基G，直至形成完整植株，对转基因植株进行分析鉴定；

（7）剪取步骤（6）中已经分析鉴定的转基因抗性植株茎段，依次在删除选择标记分化培养基W’、删除选择标记不定芽伸长培养基Y’、删除选择标记生根培养基G’中培养诱导愈伤组织至植株再生；利用培养基中添加的β-雌二醇，通过诱导步骤（2）获得的转基因植株茎段形成愈伤至植株再生过程删除选择标记基因；其中，删除选择标记分化培养基W’为：在基本培养基MS中添加TDZ0.002~0.003mg/L、BA0.5~0.6mg/L、β-雌二醇5??M、蔗糖30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8；删除选择标记不定芽伸长培养基Y’为：在基本培养基MS中添加TDZ0.001~0.002mg/L、BA0.2~0.3mg/L、β-雌二醇5??M、蔗糖30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8；删除选择标记生根培养基G’为：在1/2基本培养基MS中添加IAA0.1~0.2mg/L、β-雌二醇5??M、蔗糖20g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6-5.8。

（8）对步骤（7）获得的转基因植株进行PCR分子检测和敏感性试验检测。

PCR分子检测方法为：根据pX6-GFP载体序列设计引物，设计的引物序列如下：①:在第一个loxP位点两侧设计的引物为：P1：5'-CCATCTCCACTGACGTAAGGGAT-3'，P2：5'-CTCGTCAATTCCAAGGGCATCGGT-3'，PCR扩增反应产物长度为653bp；②:在第二个loxP位点两侧设计的引物为：P3：5'-CTGGACACAGTGCCCGTGTCGGA-3'，P4：5'-TTGTATAGTTCATCCATGCCATG-3'，PCR扩增反应产物长度为1376bp。PCR反应条件：94℃反应5min，然后按94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒进行35个循环，72℃延伸10min。

敏感性试验为卡那霉素敏感性试验，方法为：选取经分子检测验证已删除选择标记基因且生长健壮的转基因杨树植株，取顶端第3~5叶片，去叶边缘和主叶脉，剪成0.5cm²的叶盘，以近轴面接触培养基的方式置于不含卡那霉素抗生素的芽诱导培养基预培养，4d后转置于含有头孢霉素（cef）500??M和不同浓度卡那霉素的芽诱导培养基，卡那霉素的浓度梯度设置为0、5、10、15、20、25mg/L，并以未转基因南林895杨植株和未经β-雌二醇处理的转基因植株为对照，每隔14d更换1次分化培养基，定期观察叶盘不定芽诱导情况，分析转基因植株选择标记基因的删除效果。

有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点是：本发明的利用培养基中添加的β-雌二醇，通过诱导转基因植株茎段形成愈伤至植株再生过程删除选择标记基因，与采用转化细胞培养诱导形态发生形成器官甚至完整植株后再删除选择标记的方法比较，本发明在转基因植株茎段形成愈伤后就删除选择标记基因，其后再从去除选择标记的细胞诱导形态发生至植株再生，经检测分析，部分删除选择标记的效率达83%，完全删除选择标记的效率为17%，大大提高了选择标记基因的删除效率。因此，本发明可消除由于使用选择标记基因可能对生态、环境等带来危害的风险。并且，利用该无选择标记转基因技术可进行林木多个目的基因的转基因新品种培育，为培育具生物安全的转基因杨树新品种提供一个新途径，为安全、高效的林木转基因育种提供基础。

附图说明

图1是部分GFP表达植株的PCR检测的0.8%琼脂糖凝胶电泳图。图中，泳道N为负对照，泳道C1~C4为β-雌二醇处理的转基因植株，泳道X未引物对P1和P2，泳道Y为引物对P3和P4，泳道Z为引物对P1和P4，泳道M为Marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。

以下实施例所使用的材料和方法详情如下：

培养基M：在基本培养基MS中添加：蔗糖25~30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

叶盘分化培养基T：在基本培养基MS中添加TDZ 0.002~0.003mg/L、BA 0.5~0.6mg/L、蔗糖25~30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

叶盘分化筛选培养基W：在基本培养基MS中添加TDZ0.002~0.003mg/L、BA0.5~0.6mg/L、卡那霉素20mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

不定芽伸长筛选培养基Y配方为：在基本培养基MS中添加TDZ0.001~0.002mg/L、BA0.2~0.3mg/L、卡那霉素20mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

生根筛选培养基G配方为：在基本培养基MS中添加IAA0.1~0.2mg/L、卡那霉素10mg/L、蔗糖20g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

删除选择标记分化培养基W’：在基本培养基MS中添加TDZ0.002~0.003mg/L、BA0.5~0.6mg/L、β-雌二醇5??M、蔗糖 30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

删除选择标记不定芽伸长培养基Y’：在基本培养基MS中添加TDZ0.001~0.002mg/L、BA0.2~0.3mg/L、β-雌二醇5??M、蔗糖30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

删除选择标记生根培养基G’：在1/2基本培养基MS中添加IAA0.1~0.2mg/L、β-雌二醇5??M、蔗糖20g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6-5.8。

农杆菌EHA105：购自TaKaRa公司。

pX6-GFP：由洛克菲勒公司提供。

β-雌二醇：购自Sigma公司。

实施例1 农杆菌的制备

挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于5mlLB培养基中，28℃，220rpm培养24h。20ml的LB培养基中加入400??l菌液，28℃，220rpm培养3h，至OD₆₀₀0.3左右。将菌液分装于10ml的无菌离心管中，置于冰中冰浴10min。将离心管放入离心机，4℃，4000rpm离心10min。弃去上清液，加入5ml预冷的0.15mol/L的NaCl，轻轻重悬。冰浴30min，4℃，4000rpm离心10min。弃去上清液，加入600??l预冷的0.02mol/L的CaCl₂，轻轻重悬。将1??lpX6-GFP质粒加入200??l的农杆菌感受态细胞中，轻轻混合，冰浴30min。液氮中冷冻1min。37℃水浴3～5min，迅速放置冰上，冰浴1min。加入800??lYEB（str⁵⁰）培养基，28℃，100rpm培养3h。4000rpm离心3min，弃去800??l上清液，剩余的菌液重悬。菌液涂抹在含有四环素的YEB平板上，28℃培养24-36h。挑取转化后的单菌落，置于10ml含有四环素的培养基中，28℃，220rpm摇培。

实施例2 南林895杨的遗传转化

将南林895杨转基因植株试管苗置于培养基M上以根部萌蘖芽方式继代繁殖，在继代约1个月的试管苗上选取幼嫩、平展的第3~5片叶，叶的大小、形状和色泽基本一致。剪去叶边缘，剪成0.7~0.8cm²的叶盘为外植体，以远轴面和培养基接触的方式接种。培养温度为25±2℃，光照3000~4000lux，光照时间16~18h/d。置于T培养基预培养2~3d，叶盘远轴面与培养基接触。挑取携带有GFP基因的农杆菌EHA105（pX6-GFP质粒）单菌落接种到YEB液体培养基中，27±1℃，220~230rpm振荡培养过夜；次日取0.8~1mL转接25~30mL的YEB液体培养基。培养至进入指数生长期；5000rpm离心5~8min收集菌体，取适当MS液体培养基悬浮菌体至OD₆₀₀值为0.3~0.4左右备用。将预培养后叶盘浸入侵染菌液，轻微振荡，充分浸泡10~15min左右，在无菌滤纸上吸去多余菌液，放回T培养基进行暗培养。暗培养2~3d后，叶盘洗涤3~4次以除去农杆菌，叶盘转移到叶盘分化培养基W培养，直至分化出不定芽。将不定芽连同原外植体一同移入不定芽伸长培养基Y，2~3周继代1次。待不定芽伸长至1.5~2cm左右，将每个不定芽分离独立接入生根培养基G，直至形成完整植体。

实施例3 南林895杨转基因植株选择标记的删除

经筛选获得的南林895杨转基因植株继代繁殖后，剪取已分析鉴定的转基因抗性植株茎段，置于删除选择标记叶盘分化培养基W’培养，直至分化出不定芽。将不定芽连同原外植体一同移入删除选择标记不定芽伸长培养基Y’，2~3周继代1次。待不定芽伸长至1.5cm左右，将每个不定芽分离独立接入删除选择标记生根培养基G’，直至形成完整植体。

实施例4 删除选择标记转基因植株的GFP和PCR分析。

在pX6-GFP载体系统中噬菌体P1 Cre重组酶可特异性的识别loxP位点，此重组酶的合成又受XVE系统控制。Cre重组酶由OLexA-46启动子驱动，卡那霉素选择标记基因（nptⅡ）置于XVE编码序列和Cre重组酶转录单位之间，这三个转录单位一起被置于两个loxP位点间。XVE编码蛋白在β-雌二醇的诱导下可以激活OLexA-46启动子，从而表达出Cre/loxP DNA重组酶，此重组酶特异性识别loxP位点，切除位于两个loxP位点间的DNA序列，从而删除XVE编码序列、Cre重组酶序列和nptⅡ基因三个组件，使下游的GFP基因与G10-90启动子相连，从而激活GFP蛋白的表达，在紫外激发下发出绿色荧光。

利用已获得的抗性植株诱导愈伤至植株再生删除标记过程（实施例2），显微观察发现，如表1所示，经1??M浓度的β-雌二醇处理获得的植株中绿色荧光亮度较弱；当β-雌二醇浓度为2??M时，获得的转基因植株绿色荧光亮度相对较强；当β-雌二醇浓度达到5??M时，转基因植株的绿色荧光亮度更强；当β-雌二醇浓度为10??M和15??M时，转基因植株的绿色荧光亮度相对于β-雌二醇浓度为5??M时没有明显变化，GFP表达最高达到40%，明显高于利用农杆菌侵染叶盘分化不定芽至完整植株过程中删除标记基因的效率。

表1 利用已获得的抗性植株诱导愈伤至植株再生过程删除标记的GFP表达分析

β-雌二醇浓度（??M）	获得的转基因植株数目（个）	GFP表达植株数目（个）
			0	19	0
1	18	4
			2	20	6
5	21	8
			10	25	9
15	20	8

PCR分子检测方法为：根据pX6-GFP载体序列设计引物，设计的引物序列如下：①:在第一个loxP位点两侧设计的引物为：P1：5'-CCATCTCCACTGACGTAAGGGAT-3'，P2：5'-CTCGTCAATTCCAAGGGCATCGGT-3'，PCR扩增反应产物长度为653bp；②:在第二个loxP位点两侧设计的引物为：P3：5'-CTGGACACAGTGCCCGTGTCGGA-3'，P4：5'-TTGTATAGTTCATCCATGCCATG-3'。③：P1和P4引物序列之间的长度达6000bp，通过一般的PCR反应不能扩增出产物。如果Cre/loxP DNA重组酶切除了两个loxP位点之间的序列，使G10-90启动子和GFP基因相连，那么P1和P4引物间的序列长度改变为881bp，一般的PCR可以扩增出产物。PCR反应条件：94℃反应5min，然后按94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒进行35个循环，72℃延伸10min。PCR扩增反应产物长度为1376bp。

PCR检测可以进一步分析Cre/loxP DNA重组酶切除两个loxP位点之间序列的情况。因在pX6-GFP载体中P1和P4引物序列之间的长度达6000bp，通过一般的PCR反应不能扩增出产物。如果Cre/loxP DNA重组酶切除了两个loxP位点之间的序列，使G10-90启动子和GFP基因相连，那么P1和P4引物间的序列长度改变为881bp，一般的PCR可以扩增出产物，如图1所示。在经愈伤组织再生植株途径获得GFP表达的35株植株中，经PCR检测发现，其中有29株经3对引物都可以扩增出产物，即这些植株也为选择标记部分删除的植株，另外有6株植株仅P1和P4引物可以扩增出产物，是选择标记基因完全删除的植株。

实施例5：删除选择标记基因植株对抗生素的敏感性试验。

为验证经PCR检测为已删除选择标记植株中标记基因的删除是否完全，以其叶盘对卡那霉素的敏感性测试为依据，该方法为：选取经分子检测已删除选择标记基因且生长健壮的转基因杨树植株，取顶端第3~5叶片，去叶边缘和主叶脉，剪成0.5cm²的叶盘，以近轴面接触培养基的方式置于不含抗生素的芽诱导培养基预培养，4d后转置于含有cef 500??M和不同浓度卡那霉素的芽诱导培养基，卡那霉素的浓度梯度设置为0、5、10、15、20、25mg/L，并以未转基因南林895杨植株和未经β-雌二醇处理的转基因植株为对照，每隔14d更换1次分化培养基，定期观察叶盘不定芽诱导情况，分析转基因植株选择标记基因的删除效果。

试验结果如表2所示，在卡那霉素浓度大于20mg/L时，已删除选择标记的转基因植株和对照南林895杨的叶盘均不能分化不定芽，而未删除选择标记的转基因植株仍可以分化不定芽。由此可见，已删除选择标记的转基因杨树和对照南林895杨对卡那霉素的敏感性是一致的。这也表明可利用此系统进行杨树多个目的基因的转基因研究。

表2卡那霉素对叶片分化的影响

卡那霉素浓度（mg/L）	未删除标记转基因植株分化叶盘数/供试叶盘数（分化率）	对照南林895杨分化叶盘数/供试叶盘数（分化率）	已完全删除标记植株分化叶盘数/供试叶盘数（分化率）
				0	30/30 （100.0%）	30/30 （100 %）	15/15 （100.0%）
5	28/30 （93.3%）	27/30 （90.0%）	14/15 （93.3%）
				10	25/30 （80.0%）	20/30 （66.7%）	9/15 （60.0%）
15	21/30 （70.0%）	12/30 （40.0%）	5/15 （33.3%）
				20	17/30 （56.7%）	0/30 （0）	0/15 （0）
25	8/30 （26.7%）	0/30 （0）	0/15 （0）

Claims

1.一种删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（2）将转基因杨树试管苗置于培养基M上以根部萌蘖芽方式继代繁殖1个月，备用；其中，培养基M的配方为在基本培养基MS中添加：蔗糖25~30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8；

（6）先将步骤（5）暗培养后的叶盘转移到叶盘分化筛选培养基W上培养，直至分化出不定芽；再将不定芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基Y继代培养；待不定芽伸长至1.5~2cm长，将每个不定芽分离独立移入生根筛选培养基G，直至形成完整植体；

（7）剪取步骤（6）中完整植株的茎段，依次在删除选择标记分化培养基W’、删除选择标记不定芽伸长培养基Y’、删除选择标记生根培养基G’中培养诱导愈伤组织至植株再生；利用培养基中添加的β-雌二醇，通过诱导步骤（8）获得的转基因植株茎段形成愈伤至植株再生过程删除选择标记基因；

（8）对步骤（7）的转基因植株进行PCR分子检测和卡那霉素敏感性试验检测。

2.根据权利要求1所述的根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述叶盘分化培养基T配方为在基本培养基MS中附加：蔗糖25~30g/L，琼脂6~7g/L，TDZ0.002~0.003mg/L，BA0.5~0.6mg/L，琼脂6~7g/L。

3.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述的叶盘分化筛选培养基W配方为：MS，TDZ0.002~0.003mg/L，BA0.5~0.6mg/L，卡那霉素20mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

4.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述的不定芽伸长筛选培养基Y配方为：MS，TDZ0.001~0.002mg/L，BA0.2~0.3mg/L，卡那霉素20mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

5.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述的生根筛选培养基G配方为：MS，IAA0.1~0.2mg/L，卡那霉素10mg/L，蔗糖20g/L，琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

6.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（7）中，所述删除选择标记分化培养基W’配方为：在基本培养基MS中添加：TDZ 0.002~0.003mg/L、BA 0.5~0.6mg/L、5μM β-雌二醇、蔗糖 30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

7.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（7）中，所述删除选择标记不定芽伸长培养基Y’配方为：在基本培养基MS中添加：TDZ 0.001~0.002mg/L、BA 0.2~0.3mg/L、5μM β-雌二醇、蔗糖30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

8.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（7）中，所述删除选择标记生根培养基G’的配方为：在1/2基本培养基MS中添加：IAA 0.1~0.2mg/L、5μM β-雌二醇、蔗糖20g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6-5.8。

9.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（8）中，所述的PCR分子检测，使用的引物序列包括P1：5'-CCATCTCCACTGACGTAAGGGAT-3'、P2：5'-CTCGTCAATTCCAAGGGCATCGGT-3'、P3：5'-CTGGACACAGTGCCCGTGTCGGA-3'和P4：5'-TTGTATAGTTCATCCATGCCATG-3'；反应条件为：94℃反应5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸10min。

10.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（8）中，所述的卡那霉素敏感性试验检测方法为：选取经分子检测已删除选择标记基因且生长健壮的转基因杨树植株，取顶端第3~5叶片，去叶边缘和主叶脉，剪成0.5cm²的叶盘，以近轴面接触培养基的方式置于不含抗生素的芽诱导培养基预培养，4d后转置于含有头孢霉素（cef） 500μM和不同浓度卡那霉素的芽诱导培养基，卡那霉素的浓度梯度设置为0、5、10、15、20、25mg/L，并以未转基因南林895杨植株和未经β-雌二醇处理的转基因植株为对照，每隔14d更换1次分化培养基，定期观察叶盘不定芽诱导情况，分析转基因植株选择标记基因的删除效果。