CN102174395A - 诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及自动化细胞扩增与培养仪器的相关技术领域，特别是一种诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，包括相互连接的自动化细胞扩增与培养系统、操作室以及控制系统，所述的自动化细胞扩增与培养系统包括培养箱以及与培养箱相连的培养箱控制室，培养箱内包括设置有至少一个用于固定培养容器的培养容器固定块的培养装置、培养容器盖自动启合系统、培养容器自动弹出与闭合系统、数字温控系统和至少一个传感器；培养箱控制室包括：气流净化与引入系统和培养箱数字动力系统；操作室内包括条码自动录入系统、自动换液系统和细胞在线观测系统。本发明可以自动将体细胞诱导为多能干细胞，可用于干细胞研究以及临床干细胞治疗。

Description

诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统
技术领域
本发明专利涉及自动化细胞扩增与培养仪器的相关技术领域，特别是一种诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统。
背景技术
随着慢性与退行性疾病的大量增加，用传统药物、手术治疗已经无法满足未来的医疗需求。基于干细胞技术的再生医学兴起，有望带来第三次医疗革命，为人类的健康需求提供新型的解决方案。干细胞与相关重编程技术的迅速发展，推动了干细胞科技的发展。新型体细胞重编程技术对干细胞的临床应用以及相关技术的未来发展具有重要意义，并且已成为干细胞再生医学研究领域热点。重编程技术的优化以及重编程细胞的定向分化技术上的突破将进一步推动干细胞与再生医学的发展。
通过特定的基因组合与转染可以将已分化的体细胞诱导重编程为多潜能干细胞( iPS), 是近年来干细胞研究领域最令人瞩目的一项新的干细胞制造技术。与胚胎干细胞(ES)不同, iPS细胞的制造不需要毁损胚胎, 因而不会涉及更多的伦理学问题。iPS的出现不仅为体细胞重编程去分化机制的研究注入了新的活力, 而且为疾病发生发展相关机制研究与特异的细胞治疗, 特别是再生医学带来新的曙光。
iPS细胞在形态学、表观遗传学、全基因表达谱以及细胞类型特异的分化潜能方面与ES细胞极其相似，并且个体特异来源的iPS细胞尚不涉及免疫排斥问题，所以iPS具备成为细胞治疗以及组织器官再生最有前景的种子细胞。研究表明, 一些遗传缺陷性疾病患者的体细胞也可通过转基因方法重编程为iPS细胞, 这将对通过体外细胞培养研究某些遗传疾病的发病机制提供了希望。
国际国内对iPS研究的广泛关注，源于iPS及其相关技术能够通过产生功能性细胞为移植提供种子细胞，从而治疗一些传统医学手段无法根治的疾病，如部分血液系统疾病，糖尿病及某些神经性疾病等。由iPS 技术和相关技术体系获得的具有治疗作用的功能性细胞将在临床应用、工业化抗体与蛋白生产中发挥作用，对于科学研究和国家新型产业发展的推动作用将具有无可替代的作用。功能性细胞的研究也将涉及到生物、医学、材料等各个科研领域，它的发展将带动以上科学研究领域发展。功能性细胞的产业化，作为国民经济发展的新兴战略产业，也是未来经济发展不可或缺的一个环节。所以，功能性细胞获得的核心技术体系的建立具有其国家利益与需求的必要性。
如何简单、高效的制造iPS将是制约iPS技术向前沿发展的一个瓶颈问题。
发明内容
本发明提供一种诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，以实现自动化、高效制造诱导多能干细胞（iPS），避免人为操作的误差和繁琐及由此引发的污染和效率低下等技术问题。
本发明采用如下技术方案实现：
一种诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，包括相互连接的自动化细胞扩增与培养系统、操作室以及与自动化细胞扩增与培养系统、操作室分别连接的控制系统，
所述的自动化细胞扩增与培养系统包括培养箱以及与培养箱相连的培养箱控制室，培养箱内包括设置有至少一个用于固定培养容器的培养容器固定块的培养装置、培养容器盖自动启合系统、培养容器自动弹出与闭合系统、数字温控系统和至少一个传感器；
培养箱控制室包括：气流净化与引入系统和培养箱数字动力系统；
操作室内包括条码自动录入系统、自动换液系统和细胞在线观测系统;
所述培养箱和操作室之间设有隔离板，隔离板上设有独立自动门控系统，所述自动化细胞扩增与培养系统通过培养容器自动弹出与闭合系统控制培养容器沿X轴方向通过自动门系统在培养装置和操作室之间往复运动。
作为一种优选方案，所述培养容器为培养皿或培养瓶。
作为一种优选方案，自动化细胞扩增与培养系统为相互连接的上下两层，上层为培养箱，下层为培养装置控制室。
作为一种优选方案，所述培养装置为环形旋转式培养装置。
作为进一步的优选方案，所述培养装置包括至少一层的培养板，每层培养板上设有至少一个固定有一个或多个培养容器的培养容器固定块，每层培养板对应一个自动门系统，所述自动化细胞扩增与培养系统通过培养容器自动弹出与闭合系统控制培养板沿X轴方向通过自动门系统在培养箱与操作室之间往复运动。
作为再进一步的优选方案，所述培养装置包括8～20层的培养板。
作为再进一步的优选方案，所述培养装置设有转轴，培养板与转轴连接，在转轴的带动下整体旋转或者单层旋转。
作为再进一步的优选方案，所述培养箱数字动力系统包括由控制系统控制为培养装置提供动力的电机，通过驱动装置与培养装置的转轴连接，驱动培养装置旋转。
作为再进一步的优选方案，所述的驱动装置包括与电机连接的带有螺纹的驱动杆、与驱动杆螺纹咬合的齿轮，所述齿轮的轴心与培养装置的转轴连接，驱动培养装置旋转；或者
所述的驱动装置包括与电机连接的齿轮组，齿轮组的主齿轮的轴心与电机连接，齿轮组的另一齿轮的轴心与培养装置的转轴连接，驱动培养装置旋转；或者
所述的驱动装置为培养装置的转轴，所述转轴一端直接与电机连接，驱动培养装置旋转。
作为一种优选方案，所述数字温控系统包括可控制温度的均匀加热装置和温控传感器，温控传感器及均匀加热装置设置在培养箱内，控制系统分别与温控传感器及均匀加热装置连接，根据温控传感器的的数据来控制均匀加热装置所提供的温度。
作为一种优选方案，所述自动化细胞扩增与培养系统为二氧化碳培养系统，通过气流净化与引入系统向培养箱通入混合了空气的二氧化碳。
作为一种优选方案，所述的气流净化与引入系统包括：空气净化装置、二氧化碳气瓶、气体加温加湿与混合装置、气体均匀输送装置和气体加压装置，空气净化装置与二氧化碳气瓶与气体加温加湿与混合装置连接，气体加温加湿与混合装置还与气体均匀输送装置和气体加压装置连接，气体均匀输送装置与培养箱连接，在空气净化装置中经过净化的空气与由二氧化碳气瓶提供的二氧化碳在气体加温加湿与混合装置中加温加湿及混合得到混合气体，混合气体通过气体加压装置经气体均匀输送装置输送到培养箱。
作为进一步的优选方案，所述的培养箱后壁和/或侧壁分布有至少一个小孔，所述气体均匀输送装置与至少一个小孔连接，气体均匀输送装置将混合气体从小孔输入培养箱。
作为一种优选方案，所述自动化细胞扩增与培养系统和/或操作室还包括灭菌系统，包括光灭菌装置和/或气体灭菌装置，所述光灭菌装置包括与自动化细胞扩增与培养系统和/或操作室连接的灭菌光源发生器，所述气体灭菌装置包括与自动化细胞扩增与培养系统和/或操作室连接的灭菌气体输送管。
作为进一步的优选方案，所述的灭菌光源发生器为紫外光发生器，所述的灭菌气体为环氧乙烷或臭氧。
作为一种优选方案，所述的培养容器盖自动启合系统包括由控制系统控制的电机、与电机连接可沿Z轴方向往复运动的至少一个Z轴运动机械臂杆以及用于吸附培养容器盖的吸引装置，所述Z轴运动机械臂杆以及吸引装置设置在培养容器的上方。
作为进一步的优选方案，所述吸引装置包括通过电磁引力吸引经过磁化处理的培养容器盖的电磁引力吸引装置；或者
所述吸引装置包括通过负压吸引住培养容器盖的负压吸引装置。
作为一种优选方案：所述的培养容器自动弹出与闭合系统包括由控制系统控制的电机以及由电机驱动并控制培养板沿X轴方向在自动化细胞扩增与培养系统和操作室之间往复运动的培养板驱动装置。
作为一种优选方案：所述的条码录入系统，包括有控制系统控制的沿Z轴及X轴往复运动的条码录入运动机械臂、与条码录入运动机械臂连接的条码扫描头，所述条码扫描头在条码录入运动机械臂的控制下沿X轴方向运动，可到达培养板伸入操作室后在X轴的位移范围。
作为一种优选方案：所述的换液系统包括设有废液吸液模块的废液自动清除系统和设有培养基加液模块的培养基自动添加系统，以及由控制系统控制可沿Z轴及Y轴往复运动的换液运动机械臂，废液吸液模块与培养液加液模块分别设置在换液运动机械臂的下方，可上吸和下推一定体积的液体，废液吸液模块与培养液加液模块在X轴上的位置，在培养板伸入操作室后在X轴的位移范围内。
作为进一步的优选方案：所述的培养基自动添加系统还包括培养基存储单元、培养因子存储单元、培养基供应管路、培养因子供应管路以及混合器，培养基存储单元通过设有液体驱动装置的培养基供应管路与混合器输入端连接，培养因子存储单元通过设有液体驱动装置的培养因子供应管路与混合器输入端连接，混合器输出端通过定量液体驱动装置与培养液加液模块连接；
所述的废液自动清除系统还包括通过设有液体驱动装置的代谢废物排放管与废液吸液模块连接的废液池；
所述液体驱动装置由控制系统控制。
作为再进一步的优选方案：所述培养液加液模块与废液吸液模块可拆卸更换。
作为再进一步的优选方案：培养液加液模块与废液吸液模块还设有液面传感器以及根据液面传感器的传感信息上吸和下推液体的独立的微量泵。
作为再进一步的优选方案，所述混合器为具有三条通路的三通装置，上面两通分别连接培养基管路和培养因子管路，混合器内置有可控制搅拌速度的搅拌器，所述搅拌器为由电磁发生器提供动能的磁力搅拌器，或者是由电机控制的机械搅拌器，混合的液体向混合器的下面通路由定量液体驱动装置将液体定量输送到培养液加液模块，定量液体驱动装置由控制系统控制。
作为一种优选方案：所述诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统还包括与自动换液系统连接的清洗系统，所述清洗系统包括清洗槽、加液管、清洗喷头、排污管道和动力装置。
作为进一步的优选方案：所述的清洗槽为置于换液运动机械臂下方的容器，清洗槽包括吸液头清洗槽和添加头清洗槽，废液吸液模块做向下的Z轴运动，可与吸液头清洗槽完全成盖合结构，培养基加液模块做向下的Z轴运动，可与添加头清洗槽完全成盖合结构，吸液头清洗槽内还设有沿X轴或Y轴的可伸缩第一喷头和储水装置，添加头清洗槽内设有沿X轴或Y的可伸缩第二喷头，第一喷头、第二喷头以及储水装置通过设有液体驱动装置的管道与清洗液存储装置连接 ，吸液头清洗槽与添加头清洗槽的底部均设有排液口，所述排液口通过管道与废液池连接，所述液体驱动装置由控制系统控制。
作为一种优选方案：所述细胞在线观测系统包括沿Z轴和Y轴往复运动的观测运动机械臂、物镜与自动调焦系统、照明系统、荧光激发光系统、成像系统、滤光转轮和图像采集系统，观测运动机械臂由控制系统控制，实时在线对培养容器中细胞进行观测。
作为进一步的优选方案：观测运动机械臂上固定有“ㄈ”型臂， “ㄈ”型臂上端是普光照明系统，下端安装有物镜与自动调焦系统、荧光激发光系统、成像系统、滤光转轮和图像采集系统。
作为再进一步的优选方案：所述“ㄈ”型臂下方还设置有滑槽，所述滑槽具有一个垂直的主槽以及与主槽相连的水平设置的多个副槽，主槽上端与“ㄈ”型臂连接，副槽一端与主槽连接，另外一端紧靠隔离板。
作为进一步的优选方案：所述成像系统为CCD成像系统或CMOS成像系统，或者是PMT成像系统。
作为一种优选方案：所述的培养基存储单元、培养因子存储单元存放在0～8℃保存。
作为进一步的优选方案：所述的培养基存储单元、培养因子存储单元存放在4℃保存。
作为进一步的优选方案：所述的操作室还包括与控制系统连接用于提供0～8℃存储环境的制冷设备。
作为一种优选方案：所述的控制系统，包括人机对话操作面板、控制面板、传感器系统、电路系统、控制电路系统和计算机。
作为进一步的优选方案：所述的人机对话操作面板，可以进行自检、报警、信息录入、运行程序设置、预览和数据导出。
作为进一步的优选方案：所述的传感器系统与设置在自动化细胞扩增与培养系统内的传感器连接，所述传感器包括二氧化碳传感器、氧气传感器、温度传感器、湿度传感器、压力传感器、粉尘传感器、pH传感器、细菌检测传感器、培养容器占位传感器和/或故障传感器。
本发明专利能高效、全自动化、无人值守的将体细胞转化为iPS，本发明集自动化细胞扩增与培养、代谢产物自动清理、新培养基自动添加、在线实时监测、图像分析、坏皿标注、数据归类整理等功能于一体，实现自动化、高效制造诱导多能干细胞（iPS），避免人为操作的误差和繁琐及由此引发的污染和效率低下等问题，而发明的诱导多能干细胞（iPS）制造系统。
附图说明：
图1：仪器的正面结构示意图；
图2：仪器的冠状面结构示意图；
图3：培养箱底面结构示意图；
图4：换液系统示意图；
图5：CCD型细胞在线观测系统示意图；
图6：液体传输系统示意图；
图7 人机操作系统运行程序。
附图标注说明：
标号 名称 标号 名称 标号 名称
1 培养箱 4.6 注射管 6.5 扫描头
1.1 培养箱密封玻璃门 4.7 Z向电机 6.6 Z向电机
1.2 单层独立自动门 4.8 Y向机械臂 7 清洗槽
1.3 培养箱底盘 4.9 Y向电机 7.1 废液排放管
1.4 齿轮 4.10 混合器 7.2 代谢废物排放管
1.5 旋转轴 4.11 磁力搅拌器 7.3 加液模块清洗槽
1.6 固定螺丝 4.12 电磁发生器 7.4 废液吸除模块清洗槽
1.7 驱动轴 4.13 微量推进泵 7.5 向上冲洗头推进器
1.8 培养装置电机 4.14 转录因子存储瓶 7.6 清洗槽喷洗臂杆
2 培养装置 5 细胞在线观测系统 7.7 加液清洗槽喷洗进液管
2.1 培养皿盖启合系统 5.1 Z向驱动轴 7.8 吸液清洗槽喷洗进液管
2.2 培养皿固定块 5.2 照明系统 7.9 吸液清洗槽进水管
2.3 矩形培养板 5.3 U型臂 7.10 三通阀门
2.4 培养皿 5.4 物镜 7.11 热空气通入烘干系统
2.5 驱动轴 5.5 CCD成像系统 8 涡轮泵系统
2.6 驱动电机 5.6 Z向电机 9 废液池
2.7 固定件和设备 5.7 Y向驱动轴 10 清洗液存储瓶
3 操作室 5.8 Y向机械臂 11 纯水存储瓶
3.1 操作室玻璃密封门 5.9 Y向电机 12 培养基存储瓶
3.2 操作室弧形玻璃橱窗 5.10 U型臂重力支撑杆 13 制冷系统
4 换液系统 5.11 荧光激发光源 14 操作室控制系统
4.1 Z向驱动轴 5.12 滤光片转轮 15 计算机系统
4.2 Z向基点 5.13 滑槽 16 培养箱控制系统
4.3 Y向驱动轴 6 条码录入系统 17 控制面板
4.4 换液系统管道 6.1 Z向驱动轴 18 培养箱旋转动力系统
4.5 换液头 6.2 X向驱动轴 19 人机对话面板
4.5.1 废液吸液模块 6.3 X向电机 20 空气净化系统
4.5.2 培养基加液模块 6.4 X向机械臂
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
如图1所示标识了X轴、Y轴及Z轴的方向。图一的左右方向即水平为X轴方向、上下方向即垂直方向为Z轴方向，前后方向为Y轴方向。
实施例一：本发明所属的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统的制备
本发明所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，是由自动化细胞扩增与培养系统、操作室、液体传输系统和控制系统组成。
1、自动细胞扩增系统：包括气流净化与引入系统、环形旋转式培养箱、培养箱数字动力系统、数字温控系统、灭菌系统、培养皿盖自动启合系统、培养皿自动弹出与闭合系统、自动门控系统和传感器等组成。
自动细胞扩增系统在结构上分两层，上层是培养装置，下层为动力系统和控制系统等装置，如图1和图2所示，其内面分布的是环形的培养装置2，即环形旋转式培养箱见图2，培养装置由不锈钢材质制作成，成环形分部的矩形培养板2.3（即培养板），环形分布的数量根据具体情况制作，可为8块或更多，制作中使用的是8块见图2，叠放有10层，每层的层高根据内面的设施来设计，制作中使用的为每层层高10cm，培养箱体的高度约为100cm，下层的动力系统和控制系统约有50cm高。如图2所示培养箱的正面有一扇密封性能良好的不锈钢外框内镶耐压钢化玻璃的门1.1，该门打开可以将培养皿取出或放入培养装置。环形培养装置整体性能稳固，培养板架之间由钢结构连接固定2.7，其内部空间安装有各种传感器系统，传感器主要有O2传感器、CO2传感器、湿度传感器、精度在0.1度的温度传感器、气体压力传感器等；培养箱数字动力系统18为培养箱提供旋转动力见图3，计算机根据指令将培养装置的其中一扇旋转到操作室自动门侧1.2，按照设定程序，操作室与培养装置的自动门打开，自动门1.2是由计算机程序控制，对应每层矩形培养装置具有一个独立的自动门，当指令给出后门被自动打开，或者在矩形培养板的前端安装一个近距离感应器，当板推至门前一定距离，门控指令被激活，门打开；培养装置矩形培养板弹出到操作室3，开始操作。培养皿自动弹出与闭合系统包括2.5和2.6是由数控电机提供动力，由计算机控制，可以作X轴往复运动，以代替操作室中机械臂的X轴运动。培养皿放入在培养皿固定块中，培养皿固定块2.2是一个可以将培养皿安全固定在其中，底部为空的，内框大小正好可以将培养皿嵌合进去，并且有弹簧片可以将培养皿锁定；培养皿固定块配置数量可根据具体情况设置，在制作中使用的是3块，以便控制培养箱的体积在一定范围内。培养皿在弹出前由培养皿盖自动启合系统2.1将培养皿的盖启开，矩形培养板架2.3再弹出到操作室，培养皿盖自动启合系统2.1是由一个数控电机驱动两个能做垂直运动的驱动杆组成，驱动杆下端连接有电磁装置，培养皿盖为特制，事先做了磁化处理，当矩形培养板2.3需要弹出前，计算机给培养皿盖启合系统下达命令，激活电机驱动垂直运动驱动杆到培养皿盖的中心区域，此时电磁系统激活，将培养皿盖吸引，同时做上升运动，培养皿盖启开，培养皿自动弹出与闭合系统启动，培养皿2.4被弹出到操作室；操作完毕，矩形培养板复位到培养装置，培养皿盖自动启合系统做垂直向下的运动，将培养皿盖盖好，同时断开电磁后复位，整个启合操作完毕。
培养箱下层为动力系统和控制系统。气流净化与引入系统20是可将空气净化为100级的装置，与二氧化碳送气管连接，通过一个加压装置，将气体沿培养箱后壁和侧壁分布的若干小孔运送到培养装置内，并达到一定的压力；灭菌系统是对整个培养箱和操作室环境进行灭菌处理的设施，采用紫外光和环氧乙烷双重灭菌方式，先使用紫外光进行照射灭菌，后通入环氧乙烷气体对整个环境进行灭菌，然后将气体排出，二氧化碳气体和环氧乙烷气体的连接口在培养箱侧面。在培养箱底层为计算机系统15，控制着本专利项目的仪器操作过程；培养箱的控制系统16是培养箱的控制中枢，与计算机相连，接受计算机提供的指令，监控培养箱的整个培养过程与环境，并能按程序将培养皿弹出到操作室进行换液和显微观测、识别。控制面板17和人机对话面板19与控制系统和计算机相连，控制面板17显示仪器当前的运行状况和程序设定状况，人机对话面板19是将程序录入到系统中的输入设备。
2、自动换液与显微观测系统：是操作室3部分见图1、图2，包括换液系统4、细胞在线观测系统5和条码录入系统6组成。
条码录入系统，包含操作室3内的条码自动录入6和放置培养皿进入培养箱时，由人工使用USB接口的扫描头对置入培养箱的培养皿的条码信息进行录入，系统以便确认地址信息。操作室3内条码自动录入系统6是由Z和X向运动的二维机械臂控制，能做Z向和X向运动，Z向运动是由Z向电机6.6驱动Z向驱动轴6.1完成；X向运动是由X向电机6.3和X向驱动轴6.2，驱动X向机械臂6.4完成，扫描头6.5对培养皿2.4上的信息进行录入，以记录培养皿的换液和显微观测信息，不致重复或漏掉，并且可在计算机系统内详细记录换液、显微观测的具体时间和次数。具体工作方式：当换液程序启动，矩形培养板2.3由驱动电机2.6驱动驱动轴2.5推入操作室，条码录入系统6由Z向电机6.6驱动Z向驱动轴6.1将条码扫描机械臂运行至指定位置，X向电机6.3驱动X向驱动轴6.2做X向运动，将扫描头运行至培养皿2.4指定位置进行培养皿2.4的条形码信息录入。一般操作程序为条码扫描→细胞在线观测→换液，一次进行。细胞在线观测不是每次换液时都需要操作，这个可以根据需要进行自定义具体的操作流程。
细胞在线观测系统5见图5是固定在Z、Y向二维机械臂的CCD型倒置荧光显微镜，由Z向电机5.6驱动Z向驱动轴5.1进行上下运动，由Y向电机5.9驱动Y向驱动轴5.7做前后运动。显微镜系统安装在一个“ㄈ”型臂5.3上，臂的上面安装有照明设施5.2，下面安装有物镜5.4、CCD5.5、荧光激发光源5.11、滤光转轮5.12等；“ㄈ”型臂5.3固定在机械臂5.8上，“ㄈ”型臂5.3在靠近培养箱1与操作室3的隔离钢板上，开有较多E型的滑槽5.13，滑槽5.13与“ㄈ”型臂5.3上的支撑点5.10吻合，以减轻机械臂的支撑重量和稳定性。当工作时，细胞在线观测系统5由Z向电机5.6驱动Z向驱动轴5.1沿Z轴滑道运行，到达指定地点，由Y向电机5.9驱动Y向驱动轴5.7沿Y轴滑道运行到达培养皿板2.3出进行工作，X轴的运动由培养皿板的推进电机2.6驱动驱动轴2.5做X轴运动，以便对每个培养皿孔进行观测，依次进行。
换液系统4见图4是固定在Z、Y向机械臂上的换液装置，由换液头4.5包含废液吸除模块4.5.1和培养基加液模块4.5.2，模块上分别矩阵排列着12～24个输注管4.6，与培养皿2.4能吻合，该模块可根据需要更换为6道、12道、24道或其他型号的；Z向运动是由Z向驱动轴4.1和Z向电机4.7进行上下运动；Y向运动是由Y向驱动轴4.3和Y向电机4.9进行前进和后退运动，运动精度由计算机向电机发送控制指令完成；当培养板2.3弹出到操作室3，换液头由Z向驱动轴运行到指定位置，Y向电机4.9驱动Y向驱动轴4.3将换液头推进到培养皿上端位置，Z向电机4.7再做微调，与培养皿2.4吻合，废液吸除模块4.5.1将培养皿2.4内的废液吸除，培养皿弹出系统的驱动轴2.5将矩形培养板2.3再次向前推进一个培养皿2.2的位置，重复废液吸除操作，直至第三块板；Y向驱动电机将换液头4.5继续前推，将培养基加液模块4.5.2推至与培养皿2.3吻合的位置，进行培养基添加操作，操作完毕，培养皿弹出系统的驱动轴2.5将矩形培养板2.3向复位方向运动一个培养皿2.2的位置，重复上一轮操作，直至最后一块培养皿2.4，全部操作完毕矩形培养板2.3复位，进行下一块2.3操作。
3、液体传输系统：包括吸除废液、添加培养基和清洗三个方面见图6。吸除废液由废液吸除模块4.5.1连接有代谢废物排放管7.2，直接通入废液池9，由涡轮泵提供动能8；培养基添加模块4.5.2连接加样管，由涡轮泵8提供动力，培养基包含两部分，一部分是普通培养基，存储在培养基存储瓶12，另一个是培养因子，存储在培养因子存储瓶4.14中，培养基和培养因子分别由涡轮泵8和微量推进泵4.14提供动力，将培养基和培养因子运送到混合器4.10内，混合器4.10置于电磁搅拌发生器4.12上，混合器4.10内有磁力搅拌器4.11对两路液体进行混合，然后由涡轮泵8将培养基运送到添加头4.5.2；培养基管路的清洗路由一个三通阀门7.10分开，分别连接一个涡轮泵8，清洗路连接到纯水存储瓶11。清洗槽7是对换液头4.5及管路进行清洗，分加液模块清洗槽7.3和废液吸除模块清洗槽7.4，两槽分别安装有一个可以伸缩的向上清洗喷头7.6，用来清洗换液头外缘，由推进电机7.5控制，两者的管路7.7和7.8分别连接到纯水存储瓶11和清洗液存储瓶10，顺序为先用清洗液清洗，然后用纯水再清洗，两液路均由三通阀门7.10控制；废液吸除模块清洗槽7.4，另外有一个储水装置7.9，以便废液吸除模块4.5.1从中7.4吸取清洗液对管路进行清洗。最后清洗干净的换液头4.5由安装在清洗槽7上的烘干系统7.11对换液头4.5进行烘干。液体存储瓶10、11、12和4.14存放在4℃环境中，由制冷系统13提供冷气。
4、控制系统是仪器的中枢系统，主要由操作室控制系统14、培养箱控制系统16、计算机系统15、控制面板17和人机对话面板19组成。控制面板17显示仪器当前的状况，包括氧气含量、二氧化碳含量、压力、温度、湿度等参数；人机对话面板19主要是提供程序设置的输入和更改，以及对已经设定的程序进行预览。基本流程为：A、人工检查各种设置是否安装和连接，如二氧化碳气管、环氧乙烷气管、废液池等各种存储瓶的管路是否连接好，瓶内液体是否充足，废液池是否过满等，液体不足和过满均有报警装置；然后仪器自检正常，即可开始工作；B、将信息通过操作面板19录入到系统中，包括输入培养细胞的名称和类型、录入培养皿的条码信息以便仪器确定地址信息等；C、运行程序设置，包括选择培养皿的弹出顺序、设置观测时间流程、设置换液时间表、设置清洗流程、给定培养基配量表等；D、仪器对设置进行预览和自检，如没有冲突则可保持设置，开始运行；如设置有问题或冲突，仪器提示重新设置。另外仪器可与电脑显示屏连接，查看操作信息和细胞生长状况的图像。
实施例二：应用本发明对293T进行自动化扩增培养
培养板的放置和信息录入：使用USB接口的外界条码扫描头对12孔培养皿上的条码信息录入，然后将其放置到培养板架2的相应的固定块2.3中，系统自动确定培养皿的放置地址信息。在培养箱人对话操作面板19上设置温度为37℃、湿度100%和CO2浓度5%。
干细胞的自动化诱导：1.首先将293T包装细胞人工操作进行分盘培养。293T包装细胞复苏并传代3次以上后，洗净培养皿中的培养基，用3-5ml PBS洗一遍，0.25%胰酶600??l消化30s。然后加入293T培养基终止消化，用枪轻轻吹散粘附的细胞，将其转入15ml离心管，500rpm离心5min，重悬细胞并计数，把细胞稀释为3×106细胞/ml。该细胞悬浮液通过微量推进泵4.14和涡轮泵8以1:100的比例（这个比例根据重悬细胞浓度变化可调节将培养基和细胞悬液运送到添加头4.5.2），接种于12孔板，每孔1 ml 293T培养基，依次执行，培养时间设定为24h。2. 病毒包装：设定换液时间为每天12:00对293T包装细胞进行更换培养基，操作顺序为先对条码信息进行自动录入，然后细胞在线观测系统对293T的培养状况进行观察和拍照，执行完毕后，启动换液系统对代谢废物清除和添加培养基操作，如检测到细胞密度为70-80%时候将含有Sox,Klf4,Oct3/4,c-Myc基因的病毒按照试剂盒的用量通过微量推进泵4.14加入培养板，同时通过计算机系统15自动记录时间和板编号，最后复位继续培养。3. Fibroblast细胞分盘：体外获取的Fibroblast细胞经过消化计数后稀释为3×106细胞/ml，该细胞悬浮液通过微量推进泵4.14和涡轮泵8以1:100的比例（这个比例根据重悬细胞浓度变化可调节将培养基和细胞悬液运送到添加头4.5.2），接种于12孔板，每孔1 ml  Fibroblast培养基，依次执行。通过计算机系统15自动记录时间和板编号，最后复位继续培养。4. 病毒收集和感染：Fibroblast细胞培养24 h后进行病毒感染。先通过废液吸除模块4.5.1将Fibroblast细胞培养板培养上清吸干净，再由废液吸除模块4.5.1从293T包装细胞培养上清中吸取50 ??l培养上清入到上述Fibroblast细胞培养板中。接着由培养基添加模块4.5.2添加900 ??l Fibroblast细胞培养基补足1 ml。同时另一孔只加入1 ml 含pMX-GFP病毒的培养基作为感染对照。由计算机系统15自动记录时间和板编号，最后复位继续培养。5. 病毒二次感染：操作同步骤4，设定换液系统4程序为第二天通过涡轮泵8的改变将培养基更换为DFBS培养基，其后每天12时换液。6. 饲养层细胞接种：在体外将传代3待以上的MEF细胞用0.25%胰酶600??l消化30s。然后加入MEF培养基终止消化，用枪轻轻吹散粘附的细胞，将其转入15ml离心管，500rpm离心5min，重悬细胞并计数，把细胞稀释为3×106细胞/ml。该细胞悬浮液通过微量推进泵4.14和涡轮泵8以1:100的比例（这个比例根据重悬细胞浓度变化可调节将培养基和细胞悬液运送到添加头4.5.2），接种于12孔板，由扫描头6.5对培养皿2.4上的信息进行录入，用于后续的培养。依次执行。7. 感染后接种饲养层细胞：计算机系统15程序设定为Fibroblast细胞感染病毒后第6天提示接种。手动取出感染的Fibroblast细胞用0.05%胰酶消化，计数后重悬为3×105细胞/ml的密度，再通过微量推进泵4.14和涡轮泵8通过1:100的比例这个比例根据重悬细胞浓度变化可调节将Fibroblast培养基和细胞悬液运送到混合器4.10内混合后由添加头4.5.2接种于12孔板，同时培养基更换为DFBS+Vc+VPA(Vc浓度为50??g/ml, VPA浓度为1mM/ml)，设定换液系统4每天12时更换培养基，VPA于处理8-10天后撤去，感染后第18天左右将培养基换为KSR培养基。8. 克隆的鉴定：病毒感染第20天后，细胞在线观测系统5程序设定每天换液时自动检测荧光表达和克隆大小，在荧光值达到设定值或克隆大小达到0.5 mm时拍照定位并主动报警提示后续挑克隆。

Claims (36)

1. 一种诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，包括相互连接的自动化细胞扩增与培养系统、操作室以及与自动化细胞扩增与培养系统、操作室分别连接的控制系统，其特征在于：
    所述的自动化细胞扩增与培养系统包括培养箱以及与培养箱相连的培养箱控制室，培养箱内包括设置有至少一个用于固定培养容器的培养容器固定块的培养装置、培养容器盖自动启合系统、培养容器自动弹出与闭合系统、数字温控系统和至少一个传感器；
培养箱控制室包括：气流净化与引入系统和培养箱数字动力系统；
 操作室内包括条码自动录入系统、自动换液系统和细胞在线观测系统；
所述培养箱和操作室之间设有隔离板，隔离板上设有独立自动门控系统，所述自动化细胞扩增与培养系统通过培养容器自动弹出与闭合系统控制培养容器沿X轴方向通过自动门系统在培养箱和操作室之间往复运动。
2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述培养容器为培养皿或培养瓶。
3.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，自动化细胞扩增与培养系统为相互连接的上下两层，上层为培养箱，下层为培养装置控制室。
4.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述培养装置为环形旋转式培养装置。
5.根据权利要求4所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述培养装置包括至少一层的培养板，每层培养板上设有至少一个固定培养容器的培养容器固定块，每层培养板对应一个自动门系统，所述自动化细胞扩增与培养系统通过培养容器自动弹出与闭合系统控制培养板沿X轴方向通过自动门系统在培养箱与操作室之间往复运动。
6.根据权利要求5所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述培养装置包括8～20层的培养板。
7.根据权利要求5所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述培养装置设有转轴，培养板与转轴连接，在转轴的带动下整体旋转或者单层旋转。
8.根据权利要求7所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述培养箱数字动力系统包括由控制系统控制为培养装置提供动力的电机，通过驱动装置与培养装置的转轴连接，驱动培养装置旋转。
9.根据权利要求8所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述的驱动装置包括与电机连接的带有螺纹的驱动杆、与驱动杆螺纹咬合的齿轮，所述齿轮的轴心与培养装置的转轴连接，驱动培养装置旋转；或者
所述的驱动装置包括与电机连接的齿轮组，齿轮组的主齿轮的轴心与电机连接，齿轮组的另一齿轮的轴心与培养装置的转轴连接，驱动培养装置旋转；或者
所述的驱动装置为培养装置的转轴，所述转轴一端直接与电机连接，驱动培养装置旋转。
10.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述数字温控系统包括可控制温度的均匀加热装置和温控传感器，温控传感器及均匀加热装置设置在培养箱内，控制系统分别与温控传感器及均匀加热装置连接，根据温控传感器的数据来控制均匀加热装置所提供的温度。
11.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述自动化细胞扩增与培养系统为二氧化碳培养系统，通过气流净化与引入系统向培养箱通入混合了空气的二氧化碳。
12.根据权利要求11所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述的气流净化与引入系统包括：空气净化装置、二氧化碳气瓶、气体加温加湿与混合装置、气体均匀输送装置和气体加压装置，空气净化装置与二氧化碳气瓶与气体加温加湿与混合装置连接，气体加温加湿与混合装置还与气体均匀输送装置和气体加压装置连接，气体均匀输送装置与培养箱连接，在空气净化装置中经过净化的空气与由二氧化碳气瓶提供的二氧化碳在气体加温加湿与混合装置中加温加湿及混合得到混合气体，混合气体通过气体加压装置经气体均匀输送装置输送到培养箱。
13.根据权利要求12所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述的培养箱后壁和/或侧壁分布有至少一个小孔，所述气体均匀输送装置与至少一个小孔连接，气体均匀输送装置将混合气体从小孔输入培养箱。
14.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述自动化细胞扩增与培养系统和/或操作室还包括灭菌系统，包括光灭菌装置和/或气体灭菌装置，所述光灭菌装置包括与自动化细胞扩增与培养系统和/或操作室连接的灭菌光源发生器，所述气体灭菌装置包括与自动化细胞扩增与培养系统和/或操作室连接的灭菌气体输送管。
15.根据权利要求14所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述的灭菌光源发生器为紫外光发生器，所述的灭菌气体为环氧乙烷或臭氧。
16.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述的培养容器盖自动启合系统包括由控制系统控制的电机、与电机连接可沿Z轴方向往复运动的至少一个Z轴运动机械臂杆以及用于吸附培养容器盖的吸引装置，所述Z轴运动机械臂杆以及吸引装置设置在培养容器的上方。
17.根据权利要求16所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述吸引装置包括通过电磁引力吸引经过磁化处理的培养容器盖的电磁引力吸引装置；或者
所述吸引装置包括通过负压吸引住培养容器盖的负压吸引装置。
18.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述的培养容器自动弹出与闭合系统包括由控制系统控制的电机以及由电机驱动并控制培养板沿X轴方向在自动化细胞扩增与培养系统和操作室之间往复运动的培养板驱动装置。
19.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述的条码录入系统，包括有控制系统控制的沿Z轴及X轴往复运动的条码录入运动机械臂、与条码录入运动机械臂连接的条码扫描头，所述条码扫描头在条码录入运动机械臂的控制下沿X轴方向运动，可到达培养板伸入操作室后在X轴的位移范围。
20.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述的换液系统包括设有废液吸液模块的废液自动清除系统和设有培养基加液模块的培养基自动添加系统，以及由控制系统控制可沿Z轴及Y轴往复运动的换液运动机械臂，废液吸液模块与培养液加液模块分别设置在换液运动机械臂的下方，可上吸和下推一定体积的液体，废液吸液模块与培养液加液模块在X轴上的位置，在培养板伸入操作室后在X轴的位移范围内。
21.根据权利要求20所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述的培养基自动添加系统还包括培养基存储单元、培养因子存储单元、培养基供应管路、培养因子供应管路以及混合器，培养基存储单元通过设有液体驱动装置的培养基供应管路与混合器输入端连接，培养因子存储单元通过设有液体驱动装置的培养因子供应管路与混合器输入端连接，混合器输出端通过定量液体驱动装置与培养液加液模块连接；
所述的废液自动清除系统还包括通过设有液体驱动装置的代谢废物排放管与废液吸液模块连接的废液池；
所述液体驱动装置由控制系统控制。
22.根据权利要求21所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述培养液加液模块与废液吸液模块可拆卸更换。
23.根据权利要求21所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：培养液加液模块与废液吸液模块还设有液面传感器以及根据液面传感器的传感信息上吸和下推液体的独立的微量泵。
24.根据权利要求21所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于，所述混合器为具有三条通路的三通装置，上面两通分别连接培养基管路和培养因子管路，混合器内置有可控制搅拌速度的搅拌器，所述搅拌器为由电磁发生器提供动能的磁力搅拌器，或者是由电机控制的机械搅拌器，混合的液体向混合器的下面通路由定量液体驱动装置将液体定量输送到培养液加液模块，定量液体驱动装置由控制系统控制。
25.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统还包括与自动换液系统连接的清洗系统，所述清洗系统包括清洗槽、加液管、清洗喷头、排污管道和动力装置。
26.根据权利要求25所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述的清洗槽为置于换液运动机械臂下方的容器，清洗槽包括吸液头清洗槽和添加头清洗槽，废液吸液模块做向下的Z轴运动，可与吸液头清洗槽完全成盖合结构，培养基加液模块做向下的Z轴运动，可与添加头清洗槽完全成盖合结构，吸液头清洗槽内还设有沿X轴或Y轴的可伸缩第一喷头和储水装置，添加头清洗槽内设有沿X轴或Y的可伸缩第二喷头，第一喷头、第二喷头以及储水装置通过设有液体驱动装置的管道与清洗液存储装置连接 ，吸液头清洗槽与添加头清洗槽的底部均设有排液口，所述排液口通过管道与废液池连接，所述液体驱动装置由控制系统控制。
27.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述细胞在线观测系统包括沿Z轴和Y轴往复运动的观测运动机械臂、物镜与自动调焦系统、照明系统、荧光激发光系统、成像系统、滤光转轮和图像采集系统，观测运动机械臂由控制系统控制，实时在线对培养容器中细胞进行观测。
28.根据权利要求27所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：观测运动机械臂上固定有“ㄈ”型臂， “ㄈ”型臂上端是普光照明系统，下端安装有物镜与自动调焦系统、荧光激发光系统、成像系统、滤光转轮和图像采集系统。
29.根据权利要求28所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述“ㄈ”型臂下方还设置有滑槽，所述滑槽具有一个垂直的主槽以及与主槽相连的水平设置的多个副槽，主槽上端与“ㄈ”型臂连接，副槽一端与主槽连接，另外一端紧靠隔离板。
30.根据权利要求27所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述成像系统为CCD成像系统或CMOS成像系统，或者是PMT成像系统。
31.    根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述的培养基存储单元、培养因子存储单元存放在0～8℃保存。
32.根据权利要求31所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述的培养基存储单元、培养因子存储单元存放在4℃保存。
33.根据权利要求31所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述的操作室还包括与控制系统连接用于提供0～8℃存储环境的制冷设备。
34.    根据权利要求1所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述的控制系统，包括人机对话操作面板、控制面板、传感器系统、电路系统、控制电路系统和计算机。
35.根据权利要求34所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述的人机对话操作面板，可以进行自检、报警、信息录入、运行程序设置、预览和数据导出。
36.根据权利要求33所述的诱导多能干细胞自动化扩增与培养系统，其特征在于：所述的传感器系统与设置在自动化细胞扩增与培养系统内的传感器连接，所述传感器包括二氧化碳传感器、氧气传感器、温度传感器、湿度传感器、压力传感器、粉尘传感器、pH传感器、细菌检测传感器、培养容器占位传感器和/或故障传感器。
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