CN105532581B - 一种在体外研究昆虫共生菌经卵垂直传播的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在体外研究昆虫共生菌经卵垂直传播的方法。该方法首先将共生菌从昆虫体内取出离心纯化，得到共生菌悬液，然后解剖虫体获得卵巢，置于细胞培养基中，之后将纯化后的共生菌悬液加入到含有卵巢的细胞培养基中，进行共生菌和昆虫卵巢的共培养，最后在显微镜下观察共生菌进入卵巢的情况。本发明有助于在体外对昆虫共生菌经卵垂直传播的机制进行研究。
Description
技术领域
本发明涉及昆虫生理生化研究的技术领域，尤其涉及昆虫与其共生菌互作的研究领域。
背景技术
昆虫是自然界种类最多的动物，与人类的生产活动和身体健康密切相关。研究昆虫的生理生化特征是利用或控制昆虫的基础。在一些昆虫中，特别是以刺吸式口器吸食植物汁液的半翅目昆虫中，存在一些与其生存与发育密切相关的共生菌，这些共生菌存在于昆虫的脂肪体中，为宿主提供水稻汁液中所稀缺的一些必需氨基酸等营养物质，失去这些共生菌，昆虫将不能存活。如在褐飞虱中，就存在大量的类酵母共生菌为褐飞虱提供组氨酸、精氨酸等必需氨基酸。而稻飞虱、蚜虫、叶蝉等半翅目昆虫，多是农林重要害虫。因此，研究半翅目昆虫与其共生菌的关系有着非常重要的意义。上述这类共生菌在半翅目昆虫中通过宿主的卵巢-卵母细胞这种经卵垂直传播方式从母代传到子代，但是目前由于缺乏合适的研究模式，半翅目昆虫共生菌的经卵垂直传播机制一直不太明确。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种在体外研究昆虫共生菌经卵垂直传播的方法。
本发明目的是通过以下技术方案得以实现的。
一种在体外研究昆虫共生菌经卵垂直传播的方法，按以下操作步骤进行：
（1）昆虫准备：用75%酒精对性成熟的雌成虫表面消毒5分钟后，再用无菌1×PBS清洗3遍备用，所述1×PBS为磷酸盐缓冲液，其pH = 6.4；
（2）获取共生菌：将上述雌成虫置于无菌的1×PBS中，用消毒过的显微解剖镊小心剖开虫体腹部，在尽量不破坏虫体肠道的情况下，收集游离的共生菌；
（3）共生菌的纯化：将步骤（2）得到的共生菌液与Percoll分离液混匀得到含有70%Percoll的混合液，之后进行密度梯度离心纯化，最终获得共生菌悬液，并用血球计数板进行计数，计算共生菌悬液中共生菌的浓度；
（4）离体卵巢的获得：取步骤（1）的成虫，置于无菌的1× PBS中，用消毒过的显微解剖镊小心剖开虫体腹部，在尽量不破坏虫体肠道的情况下，获得卵巢，并用1×PBS清洗卵巢，之后将卵巢置于含有昆虫培养基的培养皿中；
（5）共生菌与卵巢共培养：将步骤（3）纯化得到的共生菌液加入到步骤（4）所述的含有卵巢的培养皿中，进行共生菌与卵巢的共培养，培养温度为27℃，同时，以50转/分钟的速度旋转培养皿；
（6）观察：共生菌与卵巢共培养1天后，在倒置显微镜下，观察共生菌进入卵巢的情况。
以上（1）至（5）步骤中解剖、加样、取样等操作均在超净工作台内无菌操作完成。
本发明的有益效果是：填补了在体外研究半翅目昆虫共生菌经卵垂直传播领域的空白，通过利用本方法，可以在共生菌-昆虫卵巢共培养体系中添加待验证的因子来判断此因子是否影响共生菌进入卵巢，从而在体外研究共生菌经卵垂直传播的机制。
具体实施方式
以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
实施例：在体外研究褐飞虱类酵母共生菌经卵垂直传播的方法
该方法按如下步骤进行：
（1）昆虫准备：取褐飞虱成熟雌成虫，用75%酒精进行表面消毒5分钟后，再用无菌1×PBS清洗3遍备用，所述1×PBS为磷酸盐缓冲液，其pH = 6.4；
（2）获取共生菌：将上述褐飞虱雌成虫30头置于无菌的1×PBS中，用消毒过的显微解剖镊小心剖开虫体腹部，在尽量不破坏虫体肠道的情况下，用枪头收集游离的类酵母共生菌；
（3）共生菌的纯化：将步骤（2）得到的类酵母共生菌液与Percoll分离液混匀得到含有70% Percoll的混合液，之后进行密度梯度离心，离心后，小心吸取含有类酵母共生菌的上层液，在上述上层液中加入5倍体积以上的1×PBS，混匀后高速离心，获得类酵母共生菌沉淀，用1×PBS重悬类酵母共生菌，再次高速离心，获得类酵母共生菌沉淀，如此重复操作3次，尽量去除残留的Percoll液，用1×PBS重悬类酵母共生菌沉淀，获得类酵母共生菌悬液，在显微镜下用血球计数板对类酵母共生菌进行计数，计算类酵母共生菌浓度；
（4）离体卵巢的获得：取步骤（1）中褐飞虱成熟雌成虫10头，置于无菌的1× PBS中，用消毒过的显微解剖镊小心剖开虫体腹部，在尽量不破坏虫体肠道的情况下，获得褐飞虱卵巢，并用1×PBS清洗褐飞虱卵巢，之后将10个褐飞虱卵巢置于含有1.5 mL IPL-41(Giboco, 11405-081)昆虫培养基、直径为35mm的小培养皿中；
（5）共生菌与卵巢共培养：将步骤（3）纯化得到的类酵母共生菌液加入到步骤（4）所述的含有褐飞虱卵巢的小培养皿中，类酵母共生菌液终浓度为100000个/mL，将小培养皿放在50转/分钟的小摇床上，置于27℃培养箱中，进行类酵母共生菌与褐飞虱卵巢的共培养；
（6）观察：类酵母共生菌液与褐飞虱卵巢共培养1天后，在倒置显微镜下，观察类酵母共生菌进入褐飞虱卵巢的情况。结果显示，10个褐飞虱卵巢中均发现有类酵母共生菌正在进入或已经进入。
上述步骤（1）至（5）的解剖、加样、取样等操作均在超净工作台内无菌操作完成。
Claims (2)
1.一种在体外研究昆虫共生菌经卵垂直传播的方法，其特征在于所述昆虫为半翅目类昆虫，且该方法包括以下操作步骤：
（1）昆虫准备：用75%酒精对性成熟的雌成虫表面消毒5分钟后，再用无菌1×PBS清洗3遍备用，所述1×PBS为磷酸盐缓冲液，其pH = 6.4；
（2）获取共生菌：将上述雌成虫置于无菌的1×PBS中，用消毒过的显微解剖镊小心剖开虫体腹部，在尽量不破坏虫体肠道的情况下，收集游离的共生菌；
（3）共生菌的纯化：将步骤（2）得到的共生菌与Percoll分离液混匀得到含有70%Percoll的混合液，之后进行密度梯度离心纯化，最终获得共生菌悬液，并用血球计数板进行计数，计算共生菌悬液中共生菌的浓度；
（4）离体卵巢的获得：取步骤（1）的成虫，置于无菌的1× PBS，用消毒过的显微解剖镊小心剖开虫体腹部，在尽量不破坏虫体肠道的情况下，获得卵巢，并用1×PBS清洗卵巢，之后将卵巢置于含有昆虫培养基的培养皿中；
（5）共生菌与卵巢共培养：将步骤（3）纯化得到的共生菌悬液加入到步骤（4）所述的含有卵巢的培养皿中，进行共生菌与卵巢的共培养，培养温度为27℃，同时，以50转/分钟的速度旋转培养皿；
（6）观察：共生菌与卵巢共培养1天后，在倒置显微镜下，观察共生菌进入卵巢的情况。
2.根据权利要求1所述的一种在体外研究昆虫共生菌经卵垂直传播的方法，其特征还在于，以上（1）至（5）步骤中解剖、加样、取样操作均在超净工作台内无菌操作完成。
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