CN102173997A

CN102173997A - 抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物及其制备方法

Info

Publication number: CN102173997A
Application number: CN201110045000XA
Authority: CN
Inventors: 邵敬伟; 王文峰
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2011-02-24
Filing date: 2011-02-24
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明涉及一种抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物及其制备方法，其在制备抗癌药物中的应用。通过体外癌细胞抑制实验表明，本发明的大黄素二正辛基季铵盐可以有效杀死肝癌HepG2、胃癌BGC、胃癌AGS、子宫颈癌Hela等癌细胞；体内动物实验表明，其对小鼠恶性肿瘤H22的生长具有显著的抑制作用。

Description

抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一类具有抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物及其制备方法。

技术背景

大黄素（1,3,8-三羟基-6-甲基-9,10-蒽醌）是蓼科植物中含量较高的蒽醌化合物，广泛存在于大黄、虎杖、决明子和何首乌等中药中，具有多种生物活性．如抗感染、抗病毒、免疫抑制、保肝、抗肿瘤、抑制细胞增生、诱导细胞凋亡、阻止肿瘤的转移等，尤其具有较强的抗菌和抗肿瘤作用。但大黄素本身具有毒性高，生物活性不够好及生物活性机理不是很明确等缺点，大黄素目前还没有用于临床方面的报道。随着对其药理作用的深入研究，大黄索良好的临床应用前景。因为大黄素具有良好的抗肿瘤作用，经修饰的某些大黄素衍生物表现出更好的抗癌活性。因此以大黄素为母体，对其进行修饰改造是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物及其制备方法和应用。

本发明的大黄素衍生物为大黄素二正辛基季铵盐，结构式如式I所示，其中

Figure 201110045000X100002DEST_PATH_IMAGE001

代表阴离子，

I。

合成路线如下所示（以表示Br^-为例，）：

Figure 201110045000X100002DEST_PATH_IMAGE003

上述的化合物1-5分别代表大黄素、1,3,8-三甲氧基-6-甲基-9,10-蒽醌、1,3,8-三甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌、1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌、甲基二正辛基-[2-(4,5-二羟基-7-甲氧基-9,10-蒽醌基)甲基]溴化铵。

所述的大黄素二正辛基季铵盐的制备方法（以

表示Br^-为例），包括以下步骤：

（1）大黄素与硫酸二甲酯在K₂CO₃存在下反应，生成1,3,8-三甲氧基-6-甲基-9,10-蒽醌；

（2） 1,3,8-三甲氧基-6-甲基-9,10-蒽醌与N-溴代丁二酰亚胺反应，生成1,3,8-三甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌；

（3） 1,3,8-三甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌与氢溴酸反应，生成1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌；

（4） 1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌与N-甲基二正辛胺反应，合成大黄素二正辛基季铵盐，其结构式如上述所示的化合物5。

具体步骤如下：

（1）1,3,8-三甲氧基-6-甲基-9,10-蒽醌的合成：取1.6g大黄素溶解于100～200ml丙酮中，加入8～12g无水碳酸钾，加热至回流，在回流的状态下慢慢滴加4～8ml (CH₃O)₂SO₂，回流16～24h，冷却至室温，浓缩，加入40～100ml水搅拌30min，抽滤，用丙酮洗涤，得到黄色粉末粗产品，硅胶柱层析分离得到1,3,8-三甲氧基-6-甲基-9,10-蒽醌；

（2）1,3,8-三甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌的合成：取0.8g 1,3,8-三甲氧基-6-甲基-9,10-蒽醌，1.2～1.6g N-溴代丁二酰亚胺(NBS)，0.20～0.3g 过氧化苯甲酰和60～160ml的CCl₄加入三口烧瓶中，加热回流15～25h，冷却至室温，过滤，滤渣分别用CCl₄，H₂O和丙酮洗涤，再用硅胶柱层析分离得到1,3,8-三甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌；

（3）1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌的合成：100mL三口烧瓶中加入280～800mg 1,3,8-三甲氧基-6溴甲基-蒽醌、30～50mL冰乙酸，加热至回流；在氮气保护下滴加5～9mL 47%（重量比）氢溴酸水溶液，继续回流反应4～6 h；反应物倒入200～300mL 冰水中，搅拌后抽滤，滤渣烘干，用硅胶柱层析分离得到1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌；

（4）甲基二正辛基-[2-(4,5-二羟基-7-甲氧基-9,10-蒽醌基)甲基]溴化铵的合成：100mL三口瓶中加入125～500mg1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌、50～150mL氯仿和127.9～468 mg N-甲基二正辛胺；在氮气保护下回流反应，用TLC跟踪反应进程，15～24 h后反应结束；旋转蒸发除去溶剂，浓缩物在硅胶层析柱上先用氯仿再用体积比为1：1的氯仿-乙醇逐渐梯度洗脱，从最后的洗脱液中分离得到甲基二正辛基-[2-(4,5-二羟基-7-甲氧基-9,10-蒽醌基)甲基]溴化铵。

其中步骤（1）、（2）所述硅胶柱层析的洗脱液为二氯甲烷；步骤（3）所述硅胶柱层析的洗脱液为氯仿。

所述大黄素二正辛基季铵盐在制备治疗癌症药物中的应用。所述癌症包括肝癌、胃癌、子宫颈癌和恶性肿瘤。

通过体外癌细胞抑制实验表明，本发明的大黄素二正辛基季铵盐可以有效杀死肝癌HepG2、胃癌BGC、胃癌AGS、子宫颈癌Hela等癌细胞；体内动物实验表明，其对小鼠恶性肿瘤H22的生长具有显著的抑制作用。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1：中间产物2 (1,3,8-三甲氧基-6-甲基-9,10-蒽醌)的合成a

取1.6g (5.8mmol)大黄素1溶解于120ml丙酮中，加入12g (87mmol)无水碳酸钾，在回流的状态下慢慢滴加8ml (87mmol)的(CH₃O)₂SO₂，回流24h，冷却室温，浓缩溶液，加入100ml水搅拌30min，抽滤，用少量冷的丙酮洗涤，得到黄色粉末粗产品，硅胶柱层析分离得到亮黄色固体1.52g，产率82.6%。产物结构经¹H NMR、IR、熔点确定。中间产物2的表征数据如下：

m.p. 226~228℃; IR(KBr)ν _max/cm-1: 2941,2843,1662,1601,1322,1241,1022,759. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃), δ: 7.65(s, 1H, Ar-H), 7.34(d, 1H, J=2.4Hz, Ar-H), 7.11(s, 1H, Ar-H), 6.78(d, 1H, J=2.0Hz, Ar-H), 4.00(s, 3H, OCH₃), 3.97(s, 3H, OCH₃), 3.96(s, 3H, OCH₃), 2.48(s, 3H, CH₃).

实施例2：中间产物2 (1,3,8-三甲氧基-6-甲基-9,10-蒽醌)的合成b

取1.6g (5.9mmol)大黄素1溶解于200ml丙酮中，加入10g(73mmol)无水碳酸钾，在回流的状态下慢慢滴加4ml (43mmol)的(CH₃O)₂SO₂，回流24h，冷却室温，浓缩溶液，加入80ml水搅拌30min，抽滤，用少量冷的丙酮洗涤，得到黄色粉末粗产品，硅胶柱层析分离得到亮黄色固体1.34g，产率72.8%。

实施例3：中间产物2 (1,3,8-三甲氧基-6-甲基-9,10-蒽醌)的合成c

取1.6g (5.9mmol)大黄素1溶解于180ml丙酮中，加入10g(73mmol)无水碳酸钾，在回流的状态下慢慢滴加4ml (43mmol)的(CH₃O)₂SO₂，回流20h，冷却室温，浓缩溶液，加入60ml水搅拌30min，抽滤，用少量冷的丙酮洗涤，得到黄色粉末粗产品，硅胶柱层析分离得到亮黄色固体1.30g，产率70.6%。

实施例4：中间产物3 (1,3,8-三甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌)的合成a

取0.8g实施例1制备的化合物2(2.56mmol)，1.6g N-溴代丁二酰亚胺(NBS) (9.0mmol)，0.20g 过氧化苯甲酰(BPO)和60ml的CCl₄加入三口烧瓶中，加热回流25h，冷却室温，过滤得到黄色固体，分别用少量的CCl₄，H₂O和丙酮洗涤，得到黄色固体，用硅胶柱层析分离得到黄色固体0.83g，产率83%。产物结构经¹H NMR、IR、熔点确定。中间产物3的表征数据：

m.p.217.0~219.0℃; IR(KBr)ν _max/cm-1:3436,1662,1597,1314,1253,1021,943. ¹HNMR (400MHz, CDCl₃), δ:7.83(d, 1H, J=1.2Hz, Ar-H), 7.33(d, 1H, J=2.4Hz, Ar-H), 7.11(d, 1H, J=1.2Hz, Ar-H), 6.78(d, 1H, J=2.4Hz, Ar-H), 4.52(s, 2H,-CH₂), 4.02(s, 3H, OCH₃), 3.97 (s, 3H, OCH₃), 3.96 (s, 3H, OCH₃).

实施例5：中间产物3 (1,3,8-三甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌)的合成b

取0.8g实施例2制备的化合物2(2.56mmol)，1.2g N-溴代丁二酰亚胺(NBS) (6.74mmol)，0.24g BPO和100ml的CCl₄加入三口烧瓶中，加热回流18h，冷却室温，过滤得到黄色固体，分别用少量的CCl₄，H₂O和乙醇洗涤，得到黄色固体，用硅胶柱层析分离得到黄色固体0.84g，产率84%。

实施例6：中间产物3 (1,3,8-三甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌)的合成c

取0.8g实施例3制备的化合物2(2.56mmol)，1.60g N-溴代丁二酰亚胺(NBS) (9.0mmol)，0.30g BPO和160ml的CCl₄加入三口烧瓶中，加热回流15h，冷却室温，过滤得到黄色固体，分别用少量的CHCl₃，H₂O和乙醇洗涤，得到黄色固体，用硅胶柱层析分离得到黄色固体0.80g，产率80%。

实施例7：化合物4 (1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌) 合成a

100mL三口烧瓶中加入280.7mg ( 0.72mmol) 实施例4制备的1,3,8-三甲氧基-6溴甲基-蒽醌，30mL冰乙酸，加热至回流。在氮气保护下滴加5mL 氢溴酸( 47%水溶液 )。加完之后，继续回流反应6 h，析出大量橙色固体，结束反应。混合物倒入200mL 冰水中，搅拌后抽滤，固体烘干，用硅胶柱层析得到224.3mg纯品，产率85.8%。

化合物4的表征数据如下：

m.p.246~247℃; IR(KBr), ν _max/cm-1: 3435, 3080, 1667, 1633, 1486, 1328, 1262, 763. ¹H NMR(400MHz, CDCl₃), δ: 12.23(s, H, OH), 12.17(s, H, OH), 7.82(d, 1H, J=1.6Hz, Ar-H), 7.40(d, 1H, J=1.6Hz, Ar-H), 7.30(d, 1H, J=1.6Hz, Ar-H), 6.71(d, 1H, J=2.8Hz, Ar-H), 4.47(s, 2H, CH₂-N), 3.95(s, 3H, OCH₃).

实施例8：化合物4 (1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌) 合成b

100mL三口烧瓶中加入800mg ( 2.05mmol) 实施例5制备的1,3,8-三甲氧基-6溴甲基-蒽醌，50mL冰乙酸，加热至回流。在氮气保护下滴加9mL 氢溴酸( 47%水溶液 )。加完之后，继续回流反应5 h，析出大量橙色固体，结束反应。混合物倒入300mL 冰水中，搅拌后抽滤，固体烘干，用硅胶柱层析得到641.2mg纯品，产率86.2%。

实施例9：化合物5 (甲基二正癸基-[2-(4,5-二羟基-7-甲氧基-9,10-蒽醌基)甲基]溴化铵即本发明的大黄素衍生物) 合成a

100mL三口瓶中加入125.0mg(0.34mmol)实施例7制备的化合物4 (1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌)，50mL氯仿和122.8 mg (0.48mmol) N-甲基二正辛胺。在氮气保护下回流反应，用TLC跟踪反应进程，24 h后反应结束。旋转蒸发除去溶剂，剩余物在硅胶层析柱上先用氯仿再用氯仿-乙醇逐渐梯度洗脱，分离得到产品144.1mg，得率48.6%

化合物5的表征数据如下：

m.p.102.2-103.6℃; IR(KBr), ν _max/cm-1: 3433, 2925, 2854, 1678, 1629, 1611, 1482, 1224, 1164, 759. ¹H NMR(400MHz, CD₃COCD₃), δ: 12.10(s, 1H, OH), 12.07(s, 1H, OH), 7.87(s, 1H, Ar-H), 7.75(s, 1H, Ar-H), 7.33(d, 1H, J=2.4Hz, Ar-H), 6.69(d, 1H, J=2.4Hz, Ar-H), 5.22(s, 2H, CH₂-N), 3.96(s, 3H, OCH₃), 3.50(s, 4H, CH ₂-N-CH ₂), 3.35(s, 3H, N-CH₃), 1.26~1.58(m, 24H, 2×(CH₂)₆), 0.89(t, 6H, J=7.2Hz, 2×CH₃). 元素分析，C₃₃H₄₈BrNO₅. H₂O%，实测值（计算值），% : C 62.30 (62.26)；H 7.70(7.92) ；N 2.13 (2.20)。

实施例10：化合物5(甲基二正辛基-[2-(4,5-二羟基-7-甲氧基-9,10-蒽醌基)甲基]溴化铵即本发明的大黄素衍生物) 合成b

250mL三口瓶中加入500.0mg(1.38mmol) 实施例8制备的化合物4 (1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌)，150mL氯仿和450.2 mg (1.76mmol) N-甲基二正辛胺在氮气保护下回流反应，用TLC跟踪反应进程，20 h后反应结束。旋转蒸发除去溶剂，剩余物在硅胶层析柱上先用氯仿再用氯仿-乙醇逐渐梯度洗脱，分离得到产品484.2mg，得率44.5%

实施例11：化合物5体外对肿瘤细胞增殖抑制作用实验

将肝癌HepG2、胃癌BGC、胃癌AGS、子宫颈癌Hela等4种癌细胞和正常人胚肺成纤维细胞HELF细胞的密度分别调整为1.5×10⁵/ml，接种于96孔培养板，每孔100??l，置37℃, 5% CO₂培养箱中培养24h；移去旧培养基，加入受试衍生物（化合物5）（用培养基将受试衍生物存储液稀释，设定不同作用浓度），每孔100??L，另设空白对照组和大黄素组，每组设4个复孔。药物作用24 h后，吸弃含药培养基，于每孔中加入无血清、无酚红1640培养基100 ??L，再加入MTT溶液10 ??L，继续孵育4 h，终止培养；小心吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入150 ??L DMSO，振荡10 min，于490 nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(OD值)，计算半数抑制浓度IC50值。结果如表1所示。

表1化合物5和大黄素对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用

mean（±SD fold, n≥4）,compared with 大黄素 ,*P<0.05;**P<0.01.

应用SPSS16.0软件进行数据处理并计算癌细胞增殖的半数抑制浓度（IC50），结果见表1。如表1结果所示，所合成的化合物5对不同的肿瘤细胞均具有不同程度的增殖抑制作用；对于同一种细胞，大黄素和化合物5对细胞作用的IC50差异很大。如化合物5对肝癌HepG2的IC50为5.44??mol/L，而大黄素对肝癌HepG2的IC50>100,是化合物5的20多倍。其中，化合物5对胃癌AGS细胞的IC50最小，达2.06??mol/L，对其他癌细胞的IC50也均小于6??mol/L；而其对正常人胚肺成纤维细胞HELF的IC50相对较大，达12.08??mol/L，证明其对癌细胞具有一定的特异选择性。

实施例12：化合物5对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制实验

按常规方法接种H22肿瘤细胞：取腹腔传代6～8 d生长良好的乳白色腹水，用生理盐水稀释至1×10⁷个/mL，以0.2 mL接种于小鼠右腋皮下，接种后动物随机分组。实验分为8组,每组12只，阴性对照组给予生理盐水、阳性对照组为环磷酰胺（CTX）组,30mg/kg，每三天给一次,化合物5分为低中高三个剂量组，剂量分别为15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg ,于接种24 h后灌胃给药，每天一次，连续8d。于第8d称体重，颈椎脱臼处死动物。剥离肿瘤组织，用滤纸吸干后称重。计算肿瘤抑制率。抑瘤率＝（1-实验组瘤重/阴性对照组瘤重）×100％。结果如表2所示。

表2 小鼠移植性实体瘤抑瘤实验

Figure 201110045000X100002DEST_PATH_IMAGE005

从表2可看出，化合物5中剂量的抑瘤率达52.1%，其剂量为30 mg/kg，跟阳性对照CTX的剂量相同；而高剂量抑瘤率下降，说明从中剂量起,随着浓度提高，抑瘤率达平台期。该结果表明化合物5对此肿瘤模型有很好的抑瘤作用。

Claims

1.一种抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物，其特征在于：所述大黄素衍生物为大黄素二正辛基季铵盐，其结构式如式I所示，其中代表阴离子，

I。

2.根据权利要求1所述的抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物，其特征在于：

表示Br^-。

3.一种如权利要求2所述的抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（2）1,3,8-三甲氧基-6-甲基-9,10-蒽醌与N-溴代丁二酰亚胺反应，生成1,3,8-三甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌；

（3）1,3,8-三甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌与氢溴酸反应，生成1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌；

（4）1,8-二羟基-3-甲氧基-6-溴甲基-9,10-蒽醌与N-甲基二正辛胺反应，合成大黄素二正辛基季铵盐。

4.根据权利要求3所述的抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

5.根据权利要求4所述的抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（1）、（2）所述硅胶柱层析的洗脱液为二氯甲烷；步骤（3）所述硅胶柱层析的洗脱液为氯仿。

6.一种如权利要求1或2所述的抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物在制备治疗癌症药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的抗肝癌、胃癌和子宫颈癌的大黄素衍生物的应用，其特征在于：所述癌症包括肝癌、胃癌、子宫颈癌和恶性肿瘤。