CN102168121A - 利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖的方法，实施步骤如下：（1）孢子菌悬液的制备：将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30℃恒温培养2-4天，加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为105-106个，待用；（2）将上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，得到液体种子；（3）将上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵温度30-40℃，溶氧控制在30-40%，发酵时间14-30h；（4）发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量6000-8000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖产量为40-240g/L。本发明工艺简单，效率高、成本低，利于果聚糖的开发应用的推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵生产果聚糖的方法，特别涉及一种利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖（levan）的方法。
背景技术
levan（莱万）是一种具有广泛用途的胞外多糖，是果聚糖的一种，是由果糖残基包在球状结构里组成，以β-2,6糖苷键相连的D-果糖构成的多糖，分子式为（C18H32O16）n。许多微生物在自然环境中都能产生胞外多聚物(EPS)，果聚糖(levan)只不过是被发现的其中一种，这些胞外多聚物多数存在于湍急的小溪中。它们可以保护微生物避免干燥和毒性的侵蚀损害，并且可以储存碳源。果聚糖(levan)也可以从商品生产中的细胞碎片中被分离出来。在医药上，果聚糖(levan)可用作皮下注射用胆固醇，抗肿瘤、免疫调节剂、抗炎类药物和血浆的替代品。在食品上被用作双呋喃果糖、果糖、低聚果糖，还可用作乳化剂、包封剂、色素和香味剂及脂肪的替代品。
levan早在100多年前就被发现了，由于它的性质区别于其他多糖，所以引起了人们极大的兴趣。一开始只是用在医学上并且用量很少，因为成本很高，人们致力于大规模生产果聚糖(levan)，实现最大经济利益。
目前主要是利用运动单胞杆菌和枯草芽孢杆菌发酵生产果聚糖(levan)，生长周期较长，一般在24-72个小时，菌种耐受底糖浓度低，转化率低，造成成本较高，给应用推广带来很大阻力。
因此，提供一种工艺简单、效果显著的利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖(levan)的方法，成为该领域技术人员急待着手解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足之处，提供一种高效可行并可降低果聚糖(levan)生产成本，减小投资，易于生产应用的利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖的方法。
为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下：一种利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖的方法，其特征在于实施步骤如下：
（1）孢子菌悬液的制备：将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30℃恒温培养2-4天，加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为105-106个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L：葡萄糖2g、酵粉5g、蛋白胨10g、琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；其中所用菌种：地衣芽孢杆菌TJZKBA10658；
（2）将上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位1L：蔗糖20-60g、酵母粉4-8g、蛋白胨5-10g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；将液体种子培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比5-12%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于30-40℃、转速为120-200rpm的摇床上培养24小时，得到液体种子；
（3）将上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位1L：蔗糖100-500g、 酵母粉4-8g、蛋白胨5-10g；MgSO4 0.1-0.4g、NaCl 0.5-2.0g、K2HPO4 2-4g、KH2PO4 2-4g ，MnSO4 0.2-1g，FeCl2 0.2-1g，用蒸馏水定容至3L，pH值5.0-8.0，将发酵罐培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比5-12%的接种量将液体种子接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30-40℃，溶氧控制在30-40%，发酵时间14-30小时；
（4）发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量6000-8000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(levan)的产量为40-240g/L。
本发明的有益效果是：本发明利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖（levan），可以大大减短发酵周期，常见的使用枯草芽孢杆菌或运动单胞杆菌发酵工艺周期约是72h左右，但是地衣芽孢杆菌发酵周期可以降至20-24小时，可将生产效率提高有效的提高生产效率。并且不需要复杂的设备，处理方法简单，发酵过程简单易行，大大提高了各种底物的利用率。因此降低了生产成本，利于果聚糖（levan）的开发应用的推广。该方法具有很高的实际应用价值，市场优势非常明显，且适于工业化生产。
具体实施方式
以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：
实施例1
（1）孢子菌悬液的制备：将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30℃恒温培养2-4天，加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为105-106个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L：葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g， 琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；其中所用菌种：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）TJZKBA10658；
（2）上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位1L：蔗糖60g，酵母粉5g，蛋白胨10g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；将液体种子培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35℃、转速为160rpm的摇床上培养24小时，得到液体种子；
（3）上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位1L：蔗糖100g， 酵母粉4g，蛋白胨10g；MgSO4 0.2g，NaCl 1.0g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 2.0g，MnSO4 0.5g，FeCl2 1g，用蒸馏水定容至3L，pH值7.0，将发酵罐培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度40℃，溶氧控制在30%，发酵时间14小时；
（4）发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量8000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖（levan） 143.2g。
实施例2
（1）孢子菌悬液的制备：将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30℃恒温培养2-4天，加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为105-106个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L：葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g， 琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；其中所用菌种：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）TJZKBA10658；
（2）上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位1L：蔗糖40g，酵母粉4g，蛋白胨6g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；将液体种子培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35℃、转速为160rpm的摇床上培养24小时，得到液体种子；
（3）上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位1L：蔗糖250g， 酵母粉5g，蛋白胨8g；MgSO4 0.3g，NaCl 1.5g，K2HPO4 2.0g，KH2PO4 3.0g，MnSO4 0.2g，FeCl2 0.5g，用蒸馏水定容至3L，pH值6.5，将发酵罐培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度35℃，溶氧控制在40%，发酵时间20小时；
（4）发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量6000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖（levan） 326.8g。
实施例3
（1）孢子菌悬液的制备：将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30℃恒温培养2-4天，加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为105-106个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L：葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g， 琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；其中所用菌种：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）TJZKBA10658；
（2）上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位1L：蔗糖60g，酵母粉7g，蛋白胨7g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；将液体种子培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35℃、转速为160rpm的摇床上培养24小时，得到液体种子；
（3）上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位1L：蔗糖400g， 酵母粉6g，蛋白胨8g；MgSO4 0.15g，NaCl 0.5g，K2HPO4 2.0g，KH2PO4 2.5g，MnSO4 1g，FeCl2 0.2g，用蒸馏水定容至3L，pH值8.0，将发酵罐培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比8%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度37℃，溶氧控制在30%，发酵时间24小时；
（4）发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量8000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖（levan） 483.1g。
实施例4
（1）孢子菌悬液的制备：将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30℃恒温培养2-4天，加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为105-106个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L：葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g， 琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；其中所用菌种：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）TJZKBA10658；
（2）上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位1L：蔗糖50g，酵母粉8g，蛋白胨5g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；将液体种子培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35℃、转速为160rpm的摇床上培养24小时，得到液体种子；
（3）上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位1L：蔗糖500g， 酵母粉8g，蛋白胨10g；MgSO4 0.2g，NaCl 1.0g，K2HPO4 3.0g，KH2PO4 3.0g，MnSO4 0.4g、FeCl2 0.6g，用蒸馏水定容至3L，pH值7.5，将发酵罐培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比12%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度40℃，溶氧控制在40%，发酵时间30小时；
（4）发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量6000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖（levan） 683.4g。
上述参照实施例对利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖（levan）的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可根据所限定范围例举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖的方法，其特征在于实施步骤如下：
（1）孢子菌悬液的制备：将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30℃恒温培养2-4天，加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为105-106个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L：葡萄糖2g、酵粉5g、蛋白胨10g、琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；其中所用菌种：地衣芽孢杆菌TJZKBA10658；
（2）将上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位1L：蔗糖20-60g、酵母粉4-8g、蛋白胨5-10g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0；将液体种子培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比5-12%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于30-40℃、转速为120-200rpm的摇床上培养24小时，得到液体种子；
（3）将上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位1L：蔗糖100-500g、 酵母粉4-8g、蛋白胨5-10g；MgSO4 0.1-0.4g、NaCl 0.5-2.0g、K2HPO4 2-4g、KH2PO4 2-4g、MnSO4 0.2-1g、FeCl2 0.2-1g，用蒸馏水定容至3L，pH值5.0-8.0，将发酵罐培养基于121℃、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比5-12%的接种量将液体种子接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30-40℃，溶氧控制在30-40%，发酵时间14-30小时；
（4）发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量6000-8000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖levan。
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| CN104152510A (zh) * | 2013-05-15 | 2014-11-19 | 广州市白云区康顺饲料添加剂厂 | 一种利用胨冻样类芽孢杆菌发酵蔗糖生产多聚果糖的生产方法 |
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