CN102154257B

CN102154257B - μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程制备方法

Info

Publication number: CN102154257B
Application number: CN2010105888124A
Authority: CN
Inventors: 李晖; 董钦; 李凤兰; 管荟苓; 李金波; 马健慧; 赵雪娇; 蒋倩倩
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Medical University
Priority date: 2010-12-15
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2030-12-15
Also published as: CN102154257A

Abstract

本发明公开了一种μ-芋螺毒素--KIIIA的基因工程制备方法，包括：将μ-芋螺毒素KIIIA基因插入带有Trx-tag的原核表达载体构建得到重组原核表达载体；将所述的重组原核表达载体转化大肠杆菌，诱导目的蛋白的表达；收集并纯化所表达的蛋白，即得。本发明利用Trx和Orgami2(DE3)对蛋白空间构成的特殊性质，建立了表达了融合蛋白μ-芋螺毒素KIIIA的基因工程方法，所制备的融合蛋白具备与天然蛋白相同的构像、活性。动物实验证实，所制备的融合蛋白具有优秀的镇痛活性。本发明方法具有融合蛋白产量大，易于提取、纯化方便，中间流程少等特点，建立了一个方便、经济的获得μ-KIIIA的途径。

Description

μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程制备方法

技术领域

本发明涉及μ-芋螺毒素-KIIIA的制备方法，尤其涉及μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程制备方法，属于μ-芋螺毒素-KIIIA的制备领域。

背景技术

近年来，随着分子生物学与电生理，尤其是膜片钳技术的发展，人们认识到Na⁺通道的结构和功能变化是慢性疼痛的病理生理机制，应用特异性的Na⁺通道亚型阻止药治疗慢性顽固性疼痛可取得良好的效果。

μ-芋螺毒素是高度特异的Na⁺通道阻滞剂，可以区分Na⁺通道的不同亚型(Shon K，Olivera BM，Watkins M，et al.μ-Conotoxin PIIIA，a newpeptide for discriminating among tetrodotoxin-sensitive Na channelsubtypes.)，因其序列短，活性高，选择性强，已证实具有显著的镇痛效果(Fusetani N.Drugs from the sea.Karger：Basel Freiburg Paris London NewYork.2000；1-5.)，对于发展钠通道探针及镇痛药物具有重要意义。

高选择性的TTX-R钠通道抑制剂对神经性疼痛或炎症痛非常有效，且副作用低。作用于TTX-R VSSCs的芋螺毒素μ-SmIIIA、SIIIA和KIIIA等，已发现具有显著的镇痛作用(Haefner B.Drugs from the deep：marine natural products as drug candidates.Drug Discov Today.2003；8(12)：536-544.)，目前芋螺毒素的获得主要是直接提取或人工化学合成(权娅茹，罗素兰，林秋金，长孙东亭，张本.芋螺毒素RNA的提取及其cDNA合成的研究.中国海洋药物杂志.2005；24(2)：1-5.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用基因工程获得μ-芋螺毒素--KIIIA的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种μ-芋螺毒素--KIIIA的基因工程制备方法，包括：将μ-芋螺毒素KIIIA基因插入带有Trx-tag的原核表达载体构建得到重组原核表达载体；将所述的重组原核表达载体转化大肠杆菌，IPTG诱导目的蛋白的表达；收集并纯化所表达的蛋白，即得。

其中，所述的μ-芋螺毒素-KIIIA基因是通过合成单链DNA序列，形成双链目的DNA序列而获得的；

所述的带有Trx-tag的原核表达载体优选为pET-32a(+)；硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)是一组小分子蛋白质，分子量约为12Kd，广泛存在于真核生物和原核生物中，它们都包含二硫键活性位点序列-Cys-Gly-Pro-Cys-，是巯基-二硫键氧化还原酶。其主要作用是可以增加重组蛋白的可溶性，使蛋白质在大肠杆菌中可溶性表达，有利于蛋白纯化和活性的研究。大肠杆菌表达系统是目前基因工程中比较成熟、经典的表达方法。而PET表达体系则为该系统中的经典，本发明采用了pET载体作为蛋白表达载体，该载体的特点是带有Trx-tag，会产生Trx和目的蛋白的融合蛋白。

所述的重组表达载体的构建包括以下内容：pET-32a(+)载体的酶切；酶切产物的胶回收及纯化；目的序列和载体的连接；连接产物的鉴定。连接产物的鉴定包括：制备感受态细胞、转化反应、重组质粒提取和鉴定。

针对于μ-芋螺毒素二硫键较多结构较复杂的特点，本发明优选大肠杆菌Origami2(DE3)为大肠杆菌宿主菌。Orgami2(DE3)为K-12衍生的宿主菌，具有硫氧还蛋白还原酶突变型(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)突变型基因，具有增加胞浆内二硫键的形成的特性。Orgami2(DE3)表达的活性蛋白量比其它大肠杆菌宿主菌高10倍以上，是表达富含二硫键蛋白的理想宿主。即使和其他大肠杆菌宿主菌的总体表达水平相似，Orgami2(DE3)表达的活性蛋白比其它宿主菌高10倍以上。Orgami宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于pET-32载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。

本发明对IPTG诱导目的蛋白的表达条件进行了优化和筛选，结果发现，初始菌浓度(OD₆₀₀)以及诱导时间对于蛋白表达量有着较为显著的影响，进一步的实验发现，当OD₆₀₀＝1.0左右时，蛋白表达量最高。当诱导时间为20h，蛋白的表达量增加率最高。

所述的蛋白的纯化方式包括：将重组蛋白上Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析，收集洗脱峰，用Sephadex G25凝胶过滤除盐，即得。

本发明利用Trx和Orgami2(DE3)对蛋白空间构成的特殊性质，建立了表达了融合蛋白μ-芋螺毒素KIIIA(Trx-CTX)的基因工程方法，本发明基因工程表达的融合蛋白μ-芋螺毒素KIIIA具备与天然蛋白相同的构像、活性。小鼠福尔马林实验，小鼠扭体模型，小鼠热板模型等实验证实具有优秀的镇痛活性。本发明基因工程方法具有融合蛋白产量大，易于提取、纯化方便，中间流程少等特点，建立了一个方便、经济获得μ-芋螺毒素KIIIA的途径，为将μ-芋螺毒素-KIIIA开发成临床镇痛药奠定了基础。

附图说明

图1为本发明目的基因电泳图；1.单链目的DNA；2.单链目的DNA；3.DNA marker；4.双链目的基因。

图2为本发明重组质粒酶切鉴定图；1.DNA marker；2.pET-32a；3.被BamH I消化的pET-32a；4.重组质粒；5.被BamH I消化的重组质粒。

图3为本发明重组质粒中目的基因序列测定图。

图4为本发明Trx-CTX的免疫印迹分析图。

图5为本发明不同OD600值时诱导表达结果图；1.未诱导；2.蛋白标准marker；3.0.11；4.0.23；5.0.47；6.0.65；7.0.77；8.0.94；9.1.16。

图6为本发明不同诱导剂浓度诱导蛋白表达结果图；1.未诱导2.诱导的pET-32a；3.标准蛋白markers；4.0.1mmol/L；5.0.2mmol/L；6.0.4mmol/L；7.0.6mmol/L；8.0.8mmol/L；9.1.0mmol/L；10.1.2mmol/L。

图7为本发明不同时间诱导蛋白表达结果图；1.标准蛋白markers；2.未诱导；3.1h；4.2h；5.4h；6.6h ；7.8h；8.10h；9.20h。

图8为本发明所制备的蛋白过镍琼脂糖凝胶的电泳结果图。

图9为本发明蛋白过镍琼脂糖凝胶洗脱曲线。

图10为本发明蛋白经凝胶过滤除盐洗脱曲线；1.纯化的Trx-CTX；2.imidazole和其它。

图11为本发明Trx-CTX对小鼠福尔马林实验的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验试剂

限制性内切酶Kpn I、EcoR I NEB

限制性内切酶BamH I TakaRa

T₄-DNA连接酶 NEB

T₄多核苷酸激酶 TakaRa

酵母粉上海生工

胰蛋白胨上海生工

氨苄青霉素哈尔滨制药总厂

氯化钠国产分析纯

琼脂粉上海生工

SDS-PAGE(5％浓缩胶，15％分离胶)

TEMED Bio-Rad

过硫酸铵 Bio-Rad

聚丙烯酰胺 Promaga

甲叉聚丙烯酰胺 Promaga

蛋白质Marker TakaRa

DNA Marker TakaRa

十二烷基硫酸钠(SDS) Sigma

异硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG) TakaRa

考马斯亮蓝G250 TakaRa

Tris Sigma

甘氨酸 Sigma

EDTA Boehringer Mannheim

溴酚兰国产分析纯

考马斯亮蓝测蛋白试剂盒南京建成生物工程研究所

Ni-NTA树脂 Novagen

Sephadex G-25 Amersham

生理盐水国药集团化学试剂有限公司

醋酸丹东市胜利化工厂

盐酸吗啡沈阳第一制药厂批号：050501

大肠杆菌Origami2(DE3) Novagen

Pet-32a(+) NEB

实施例1μ-芋螺毒素-KIIIA基因的表达和纯化

一、实验方法

(一)、μ-芋螺毒素-KIIIA基因的获得

1、合成单链DNA序列

根据μ-芋螺毒素-KIIIA氨基酸序列，按照大肠杆菌偏爱密码子设计其DNA序列，5’端添加Kpn I酶切位点和肠激酶识别序列，3’端添加TAA终止密码子及EcoR I酶切位点。具体序列如下：

5′-C GAC GAC GAC GAC AAG TGC TGC AAC TGC AGC AGC AAA TGG TGC CGTGAT CAT AGC CGC TGC TGC TAA G-3′

3′-CATGG CTG CTG CTG CTG TTC ACG ACG TTG ACG TCG TCG TTT ACC ACGGCA CTA GTA TCG GCG ACG ACG ATT CTTAA-5′；

2、形成双链目的DNA序列：

将上述合成的两条单链DNA分别用T₄多核苷酸激酶磷酸化、退火成为双链DNA，具体步骤如下：

首先将合成的DNA单链分别溶于300μL与200μL去离子水中，终浓度约为10μmol/L；将两条单链5′端磷酸化，反应体系见表1：

表1

反应条件：37℃，30min；

磷酸化后的两条单链按相同的比例混合于一个Eppendorf管中，置于沸水浴中，让其缓慢降温，则互补的两条单链退火形成双链DNA。

(二)、重组表达载体构建

1、pET-32a(+)载体的酶切

将载体pET-32a(+)用Kpn I和EcoR I双酶切，参照NEB公司的限制酶说明书，反应体系及条件见表2：

表2

10×缓冲液 5.0μL

100×BSA 0.5μL

pET-32a(+)质粒 2.0μg

KpnI(20U/μL) 1.0μL

EcoR I(20U/μL) 1.0μL

ddH₂O Up to 50.0μL

37℃水浴反应过夜，65℃热失活20min。

2、酶切产物的胶回收及纯化

取上述双酶切反应产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外下观察下切取特异片段，放入1.5mL的Eppendorf管中。使用上海华舜生物公司胶回收纯化系统，按操作说明书推荐方法进行。纯化后的载体，用核酸蛋白检测仪测定载体浓度。

3、目的序列和载体的连接

将已正确处理的目的DNA序列与双酶切后的载体定向连接，反应体系和反应条件按照NEB公司的连接酶反应说明书进行，载体和目的DNA的摩尔量比在1∶1～1∶5之间，同时作阴性对照，具体体系见表3：

表3

16℃连接16h。

4、连接产物的鉴定

(1)制备感受态细胞：从新培养的大肠杆菌JM109平板上挑取单个菌落，移至10mL LB培养基中，37℃，150rpm震荡培养约5h，待OD₆₀₀值达到0.3～0.4之间，吸取1.5mL于离心管中，4℃，5000g离心5min，弃上清；用冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂ 200μL重悬菌体沉淀，置于冰上30min；4℃，5000g离心5min，弃上清；加入冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂ 100μL，轻轻吹打菌体沉淀，混匀即为新鲜制备的感受态。

(2)转化反应：取50μL感受态细胞于1.5mL Eppendorf管，置于冰上，加入连接反应产物或阴性对照(只有质粒载体无外源DNA)5μL，轻弹混匀，于冰上放置30min；42℃水浴中热休克90s，移至冰上，冷却2min；加入200μL LB培养基，37℃温箱孵育0.5h后150rpm震荡摇菌1h；取200μL均匀涂布于预热的LB/Amp+平板上，完全吸收后倒置于37℃培养箱中，培养过夜(12～16h)。

(3)重组质粒提取和鉴定：挑取经氨苄青霉素筛选的阳性(Amp+)克隆菌落于10mL Amp+的LB培养基中，37℃震荡培养至一定浓度，取1.5mL菌液，按上海华舜生物公司质粒提取系统提取质粒。用BamH I限制酶酶切初步验证，酶切体系如前所示。将酶切正确的质粒送至生物公司进行序列鉴定。

(三)、重组质粒在大肠杆菌Origami2(DE3)的诱导表达

1、表达条件优化

将正确重组的质粒按前述方法转化大肠杆菌Origami2(DE3)，取新鲜阳性单克隆菌于10mL的含氨苄青霉素20μg/mL、链霉素50μg/mL、四环素25μg/mL的LB培养基中37℃振荡培养12～16h，次日，以1∶50接种于10mL LB大培养基中37℃振荡培养至OD₆₀₀值达一定值时加入IPTG，同时以不加诱导剂的菌体作为阴性对照。采用单因素变量法，分别改变诱导时间(1h～20h)、初始菌浓度OD600(0.1～1.2)、诱导剂IPTG的浓度(0.1mM～1.2mM)，摸索最佳表达条件。

2、SDS-PAGE鉴定

各种条件诱导表达菌及阴性对照菌1mL分别于4℃、5000g离心10min，收集菌体沉淀，加入150μL 2×SDS上样缓冲液，重悬菌沉淀，煮沸裂解5min，取20μL进行SDS-PAGE电泳，压缩胶浓度为5％，分离胶浓度为15％，检测蛋白表达情况，分析表达最佳条件。

3、Western Blot鉴定

(1)样品制备蛋白溶液中加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，冰上冷却，稍事离心。

(2)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)固定电泳槽，灌入适量的15％分离胶(大约为胶板的2/3)，异丙醇封胶，室温聚合1h，弃去异丙醇，用去离子水洗胶数次，滤纸条吸净残余液体。灌入5％浓缩胶，插入梳子(避免产生气泡)，聚合30min。拔梳子，加入电极缓冲液以每泳道50μg细菌总蛋白上样，空白孔加入1×SDS上样缓冲液。开始电泳，初始电压为80V，待溴酚蓝进入分离胶后，将电压调至120V，当溴酚蓝涌至胶底部时停止电泳。

(3)转膜剪6张与胶同样大小的Whatman3#滤纸和1张硝酸纤维素膜，将胶、膜、滤纸、海绵均在转膜缓冲液中浸泡10min。从负极到正极按3张滤纸，胶，膜，3张滤纸的顺序安装转移装置。加入转膜缓冲液，调整电流为200mA，4℃转移1h。

(4)杂交1×TBST洗膜后，用含5％脱脂奶粉的1×TBST(含0.05％Tween20)室温封闭1.5h，与一抗(兔抗人Trx的抗体，1∶1000稀释)孵育，37℃孵育1h30min，1×TBST洗膜，再与二抗(HRP标记的羊抗兔IgG，1∶5000稀释)37℃孵育1h，1×TBS洗膜，ECLplus检测。

(四)、重组表达蛋白的可溶性鉴定及纯化目的蛋白

1、菌体裂解

(1)接种含重组质粒的菌株，按小培养条件放大体积至500mL，5000r/min离心10min，将收集的菌体沉淀称重，即为湿菌重；

(2)按每1g湿菌重加入裂解缓冲液4mL，并悬浮；

(3)置于冰浴中，超声波破碎菌体，工作5s，间歇10s，功率为400w，超声20min；

(4)将超声波破碎后的菌液移至离心管中，4℃、12000r/min离心30min左右，收集上清；

(5)沉淀重悬于1×SDS样品缓冲液中，使沉淀溶解后体积与上清体积相同；

(6)取相同体积的上清和沉淀进行15％SDS-PAGE，分析是否为可溶性表达。

2、重组蛋白的Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析

(1)取2mL50％Ni-NTA树脂与8mL 1×Bind buffer轻微混匀，树脂沉降后，弃8mL上清；

(2)将超声后收集的12mL上清与2mL树脂混匀，4℃、200r/min孵育60min；

(3)孵育后，将混合液移入层析柱中，连接核酸仪和记录仪，收集液体；

(4)用Wash buffer洗涤杂蛋白至基线平稳，收集液体；

(5)用Elute buffer洗脱目的蛋白，收集液体，进行15％SDS-PAGE分析。

3、Sephadex G25凝胶过滤

将上步收集液体经凝胶过滤除盐，洗脱液为PBS。

二、实验结果

(一)本发明目的基因载体构建及鉴定：设计、合成的μ-芋螺毒素KIIIA两条互补的单链DNA序列，经过T₄多核苷酸激酶磷酸化，于沸水浴缓慢降温，退火形成双链DNA，即为所需目的基因。温度降得过快不利于互补链的退火，结果电泳见图1；

重组质粒的鉴定：BamH I酶切位点位于载体pET-32a(+)多克隆位点Kpn I和EcoR I之间，重组质粒上没有BamH I酶切位点。Kpn I和EcoR I酶切重组质粒结果见图2，BamH I未将质粒切开，说明外源片段已插入其中；用正向引物对插入的外源片段进行序列测定(由上海生工生物工程技术公司完成)，结果与设计的μ-KIIIA基因完全一致(图3)。Western Blot印迹分析在18.9KD处有一条杂交带出现，说明目的蛋白表达(图4)。

(二)目的蛋白诱导表达条件优化及蛋白纯化结果：

1、诱导前最适OD₆₀₀的确定

将初始菌浓度作为变量，开始诱导表达。通过凝胶成像软件分析，随着初始菌浓度的增加，蛋白表达量逐渐增大。当OD₆₀₀＝1.0左右时，蛋白表达量最高(图5)。

2、不同诱导剂(IPTG)浓度的确定

将诱导剂浓度作为变量，开始诱导表达。通过凝胶成像软件分析，随着诱导剂浓度的增加，蛋白表达量增加并不十分显著(图6)。

3、最佳诱导时间的确定

将诱导时间作为变量，进行蛋白表达，随着诱导时间的延长，蛋白的表达量逐渐增加，诱导20h，蛋白的表达量增加率最高(图7)。

(三)目的蛋白的可溶性鉴定、纯化及含量测定

重组质粒在大肠杆菌中最佳表达条件为培养菌液OD₆₀₀值达1.0时，加入IPTG终浓度为0.1mmol/L，16℃下诱导20h，重组蛋白表达量最高。通过凝胶成像软件分析，重组蛋白表达量占总蛋白的50％以上，菌体超声处理后，收集上清和沉淀，经15％SDS-PAGE电泳分析，重组蛋白大部分在上清中，为可溶性(图8)。菌体超声处理后收集的上清，经Ni-NTA琼脂糖树脂亲和纯化，收集洗脱峰(图9)，经凝胶过滤除盐(图10)，进行15％SDS-PAGE电泳分析和凝胶成像分析，纯化后的蛋白质纯度最高可达90％以上(图8)。蛋白质浓度约为0.4g/L。

实验例1生物学活性测定实验

一、实验材料与方法

1、实验动物

ICR小鼠，体重20g-30g，♂♀兼用，由本校转基因动物室提供。

2、福尔马林实验方法(Steinar Hunskaar，Ole Bernt Fasmer and KjellHole.Formalin test in mice，a useful technique for evaluating mildanalgesicsJournal ofNeuroscience Methods，1985；14：69-76)

小鼠福尔马林致痛模型：实验分成两组，实验组为纯化Trx-CTX蛋白溶液，对照组为生理盐水组。腹腔注射蛋白或者生理盐水15min后，在小鼠右后足跖部皮下注射20μL5％福尔马林溶液，立即置于圆柱形玻璃笼中观察。以舔注射足时间为小鼠痛反应指标，以5min为纪录单位，记录小鼠在0～50min的累计舔足时间。

3、小鼠扭体模型实验方法(Koster R，Anderson M，De Beer EJ：Acetic acid for analgesic screening.Fed Proc，1959，18，412.)

1)将小鼠按照随机法分组，分为正常对照组、模型对照组；

2)模型组腹腔注射融合蛋白1mg/kg；3mg/kg；5mg/kg；7mg/kg，对照组给予同体积生理盐水；作用45min后，腹腔注射0.6％冰醋酸；观察20min内小鼠扭体反应，计算扭体反应抑制率；

3)模型组腹腔注射融合蛋白7mg/kg。对照组给予同体积生理盐水；分别作用15min，30min，45min，60min，4h；腹腔注射0.6％冰醋酸；观察20min内小鼠扭体反应计算扭体反应抑制率。

抑制率％＝生理盐水组扭体均数-给药组扭体均数/生理盐水组扭体均数×100％。

4、小鼠热板模型试验方法(Hunskaar S，Berge OG，Hole K.Amodified hot-plate test sensitive to mild analgesics.Behav Brain Res.1986Aug；21(2)：101-8.)

1)融合蛋白对热板测痛仪致痛的镇痛作用：取体质量为(20±2)g雌性小鼠，用热板测痛仪致痛，将小鼠置于55±0.5℃的热板上，记录自其足底接触热板至出现舔后足的时间即热板反应潜伏期作为痛阈指标。先踢除反应潜伏期＞30s或＜5s的反应迟钝或过敏小鼠。用药后小鼠潜伏期＞60s者停止实验并以60s计。

2)取预选合格小鼠50只，随机分为5组，分别为生理盐水组10只、盐酸吗啡组10只、融合蛋白5mg/kg组10只，10mg/kg组10只、15mg/kg组10只。

3)先测定基础痛阈，然后腹腔注射给药，分别于给药45min，90min，3h后，测痛阈值，将各组小鼠给药前后痛阈差值作自身比较，同时对各给药组与溶媒对照组进行组间比较。并计算痛阈提高百分率。

痛阈提高百分率＝(给药后痛阈值一给药前痛阈值)/给药前痛阈值×100％。

二、实验结果

1、目的蛋白的生物活性测定：

Zhang MM等人(Zhang MM，Green BR，Catlin P，Fiedler B，Azam L，Chadwick A，Terlau H，McArthur JR，French RJ，Gulyas J，Rivier JE，SmithBJ，Norton RS，Olivera BM，Yoshikami D，Bulaj G.Structure/functioncharacterization of μ-conotoxin KIIIA，an analgesic，nearly irreversibleblocker of mammalian neuronal sodium channels.J Biol Chem.2007；282(42)：30699-30706.)曾报道过化学合成的μ-芋螺毒素-KIIIA在小鼠福尔马林致痛模型中的强效阵痛作用，本实验中通过基因工程合成的Trx-CTX，显著降低在福尔马林致痛模型所引起第二时相疼痛反应(15-30min)，p＜0.01；而对第一时相(0-5min)疼痛反应影响不明显，p＞0.05。(图11)。

2、分别测定不同剂量Trx-CTX对小鼠扭体次数的影响。Trx-CTX能明显抑制小鼠扭体，1mg/kg(P＜0.005)体重时，药物镇痛率为35.5％，3mg/kg(P＜0.001)体重时，药物镇痛率为54.1％，5mg/kg(P＜0.001)体重时，药物镇痛率为71.0％，7mg/kg(P＜0.005)体重时，药物镇痛率为96.4％(表4)。

表4

＊P＜0.005 ＊＊P＜0.001

3、测定不同作用时间Trx-CTX对小鼠扭体次数的影响。作用15min时，P＜0.01，药物镇痛率为34.8％。15min时，P＜0.01，药物镇痛率为34.8％。30min时，P＜0.001，药物镇痛率为92.5％。45min时，P＜0.001，药物镇痛率为96.4％。60min时，P＜0.001，药物镇痛率为92.5％.4h时，P＜0.001，药物镇痛率为45.6％.在作用45min时，药物镇痛率最高(表5)。

表5

＊p＜0.01 ＊＊p＜0.001

4、测定不同剂量，作用不同时间Trx-CTX对小鼠热痛的影响，本实验结果表明，Trx-CTX能明显延长小鼠热板潜伏期(表6)。

表6

P＜0.5；＊＊P＜0.005；＊＊＊P＜0.001。

Claims

1.一种μ-芋螺毒素--KIIIA的基因工程制备方法，包括：将μ-芋螺毒素KIIIA基因插入带有Trx-tag的原核表达载体构建得到重组原核表达载体；将所述的重组原核表达载体转化大肠杆菌(E.Coli)，IPTG诱导目的蛋白的表达；收集并纯化所表达的蛋白，即得；

其中，所述的μ-芋螺毒素-KIIIA基因是通过合成单链DNA序列，形成双链目的DNA序列而获得的；所述的μ-芋螺毒素KIIIA基因的DNA序列为：

5′-C GAC GAC GAC GAC AAG TGC TGC AAC TGC AGC AGC AAA TGG TGC CGT GAT CAT AGCCGC TGC TGC TAA G-3′

3′-CATGG CTG CTG CTG CTG TTC ACG ACG TTG ACG TCG TCG TTT ACC ACG GCA CTAGTA TCG GCG ACG ACG ATT CTTAA-5′；

其中，所述的带有Trx-tag的原核表达载体为pET-32a(+)；

其中，所述大肠杆菌(E.Coli)是大肠杆菌Origami2(DE3)；

其中，IPTG诱导目的蛋白的表达的条件为培养菌液OD₆₀₀值达1.0时，加入IPTG，终浓度为0.1mmol/L，16℃下诱导20小时；

其中，所述的收集并纯化所表达的蛋白的方式包括：将重组蛋白上Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析，收集洗脱峰，用Sephadex G25凝胶过滤除盐，即得。