CN102154134A

CN102154134A - 红酵母及其产海藻糖的方法

Info

Publication number: CN102154134A
Application number: CN2011100423619A
Authority: CN
Inventors: 赵玉巧; 杜云建; 顾玲玲
Original assignee: Huaihai Institute of Techology
Current assignee: Huaihai Institute of Techology
Priority date: 2011-02-22
Filing date: 2011-02-22
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明是一种红酵母2-14(Rhodotorulasp.2-14)CGMCC NO.4445。红酵母2-14细胞呈圆形或椭圆形，其大小4.5~5.1×6.3~7.2μm，繁殖方式为芽殖，无假菌丝、子囊孢子及掷孢子形成。本发明还公开了采用红酵母2-14制备海藻糖的方法。本发明菌株的海藻糖产量高，培养基及培养过程简单，提取过程节能环保。产海藻糖方法具有简单实用、成本低廉的优点，容易在工业生产上推广应用。

Description

红酵母及其产海藻糖的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物，特别是来自海洋的红酵母2-14(Rhodotorula sp. 2-14)CGMCC NO. 4445（已于2010年12月08日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0. 4445）；本发明还涉及利用该菌株产海藻糖的方法。

背景技术

海藻糖由两分子的吡喃葡萄糖单体以α-1，1糖苷键连接而成，其化学名为α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖苷，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，相对分子量为378.33（含两分子结晶水），比旋光度［α］_D＝+178°(20℃)，熔点为97℃，加热会失去结晶水。由于其分子结构对称，无半缩醛基，所以既无还原性，也无变旋光性。其结构式为：

海藻糖是白色晶体，带有两分子结晶水，能溶于水、冰醋酸和热乙醇中，不溶于乙醚、丙酮。海藻糖的理化性质非常稳定，不能使斐林试剂还原，也不能被α-糖苷酶水解，但在强酸条件下能被水解为两个葡萄糖分子。

海藻糖无毒无害，对人体无副作用，基本性质与其它双糖相似。但其自身具有非特异性保护作用，能使干燥脱水后的生物体以极低乃至停止新陈代谢的形式将其保护，一旦环境许可，生物体即能复活，但不损生命物质，因此海藻糖广泛用于食品的干燥保藏，而且也可用于医学、卫生、美容等方面。

关于海藻糖的合成，归纳起来主要有以下几种方法：

(1) 微生物抽提法。

微生物抽提法是以乳酸菌、酵母、霉菌及其它一些含海藻糖的菌体为提取源，首先通过干燥、改变渗透压等方法处理菌体，使其体内积累更多的海藻糖，然后经过乙醇等有机溶剂抽提、精制，从而得到较高纯度的海藻糖晶体。这是传统的海藻糖生产方法，由于酵母中海藻糖含量较高，可达细胞干重的20%，通常以酵母提取为主。酵母提取法是最早使用的海藻糖提取方法，工艺经过不断改进，已相当成熟，至今仍然是生产海藻糖的重要方法。国内外对选育高产海藻糖的酵母菌种和提取、纯化工艺进行了大量研究，CoMgs等分离出两个裂殖酵母菌株，它们在热条件下大量积累海藻糖;李于等对酵母中海藻糖的提取和纯化工艺进行了研究，其纯度可达98%以上。然而从微生物中提取海藻糖成本高，提取源有限，很难实现大规模工业化生产。

(2) 发酵法。

发酵法是在一定的基质上培养微生物，通过微生物发酵生产海藻糖，再从发酵液中提取精制而成，其中能利用基质发酵生产海藻糖的微生物包括节杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、诺卡氏菌属、丝核菌属、微球菌属等。

(3) 酶转化法。

酶转化法是采用葡萄糖、麦芽糖或淀粉等为底物，通过与海藻糖合成有关的酶的作用转化成海藻糖。根据其作用底物，主要分为葡萄糖、麦芽糖、淀粉为底物三种生产方法。

(4) 基因重组法。

基因重组法包括两个方面：一是利用工程微生物和酶工程改进海藻糖生产，提高产量，降低成本；二是利用与合成海藻糖相关的基因构建具有抗逆性的转基因植物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的可以产海藻糖的红酵母菌株。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了上述红酵母菌株产海藻糖的方法，以克服现有技术存在的产量低、提取成本高的问题。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。

本发明的特征包括红酵母2-14(Rhodotorula sp. 2-14)菌株本身，以及利用该菌株产海藻糖的方法。

本发明所涉及的菌株是红酵母2-14(Rhodotorula sp. 2-14)，该红酵母2-14(Rhodotorula sp. 2-14)于2010年12月08日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.4445，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

一、本发明菌株红酵母2-14的筛选方法。

该菌株红酵母2-14是通过如下的方法筛选获得的：

把海水样品在5000 r/min离心15min得海水沉淀物(海泥取适量，海洋鱼贝类取内脏)，接种到液体富集培养基中(含葡萄糖 20g，蛋白胨10g ，酵母膏5g，KH₂PO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O 2g，链霉素30 mg，补煮沸过滤陈海水至1000mL，pH 6.3~6.5)进行富集培养；富集后取少许培养液，稀释涂平板(培养基组成同上)培养，再挑取单菌落在三角瓶中用液体培养基(蔗糖31g，酵母膏9.9g，蛋白胨9.9g，氯化铵2.2g，磷酸二氢钾0.4g，磷酸氢二钠0.4g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.2g，三氯化铁0.2g，煮沸过滤陈海水1000mL，pH5.5)培养60 h，取培养液离心收集菌体用硫酸-蒽酮法测定菌体中海藻糖含量。最后从120株侯选菌株中选出一株产海藻糖的微生物：红酵母2-14。

二、红酵母2-14菌株的性质。

具有如下的性质：

(1) 形态特征：细胞呈圆形或椭圆形，其大小约4.5~5.1×6.3~7.2μm，繁殖方式为芽殖，无假菌丝、子囊孢子及掷孢子形成。

(2) 培养特征：发酵液清，表面无醭、无环、无气泡、无沉淀。菌落饱满潮湿，颜色为红色，边缘整齐，无褶皱，好氧。

(3) 生理生化实验结果：

① 糖发酵试验结果：菌株2-14对乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、L-山梨糖、D-木糖、D-果糖、L-鼠李糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇、核糖、葡萄糖、蔗糖、琥珀酸、柠檬酸均不发酵。

② 碳源同化试验结果：见表1。

表1 菌株2-14碳源同化试验结果

③ 氮源同化试验结果：见表2。

表2 菌株2-14氮源同化试验结果

④ 其他生理生化试验结果：菌株2-14不液化明胶，脲酶阳性，葡萄糖氧化阴性，DBB阳性，类淀粉化合物形成结果为阴性，石蕊牛奶试验产碱，在37 ℃条件下能正常生长。

根据菌株2-14的形态特征、培养特征及生理生化特征，该菌株与《酵母的特征与鉴定手册》中红酵母属(Rhodotorula)的分类特征最相符，所以初步鉴定菌株2-14为红酵母属，定名为：红酵母(Rhodotorula sp.) 2-14。

（4）pH对红酵母生长的影响

该红酵母的最适生长pH为5.5，对酸性条件耐受性好，在pH3.0仍可大量生长，pH小于3及pH大于9均对菌体的生长产生抑制。

（5）温度对红酵母生长的影响

该红酵母的最适生长温度为28℃，在37℃仍可大量生长，低温生长较慢，温度低于15℃及高于40℃均对菌体的生长产生抑制。

（6）NaCl对红酵母生长的影响

该红酵母在NaCl浓度为9 %时仍可正常生长，但当NaCl浓度高于12%时，对生长影响较大。

三、产海藻糖方法。

1、红酵母2-14(Rhodotorula sp.2-14)CGMCC NO. 4445产海藻糖的方法步骤如下：

(1) 菌种的准备：将红酵母2-14菌株在灭过菌的丰富培养基平板上划线，于30℃静置培养2天后，挑取单菌落进行丰富培养基斜面培养2天后保存于4℃冰箱中备用；所述的丰富培养基为：马铃薯20%，蔗糖 2%，琼脂1.5%；

(2) 细胞的培养：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，在20~35℃，100~200 r/min，的摇床上培养18~30h后得种子液，将种子液按5%的接种量接种于含有75mL液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，160 r/min摇床培养50~60h后取出，在5000 r/min离心除去上清液，所得菌体细胞用0.85% NaCl溶液洗涤一次，置于4℃冰箱中贮存备用；所述的液体培养基为：蔗糖31g，酵母膏9.9g，蛋白胨9.9g，氯化铵2.2g，磷酸二氢钾0.4g，磷酸氢二钠0.4g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.2g，三氯化铁0.2g，煮沸过滤陈海水1000mL，pH5.5；

(3) 海藻糖的提取：向菌体细胞中加入蒸馏水，每40g菌体细胞中加入1L蒸馏水，于80℃水浴提取，离心，取上清液加活性炭脱色，过滤除去活性炭，上清液真空浓缩到原体积的1/4～1/5，用截留分子量为500的超滤膜超滤除去大分子杂质，采用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂进行离子交换除去离子，真空浓缩，冷却结晶，恒温干燥，即得食用级海藻糖产品。

步骤（2）中：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中， 25~30℃，140~180 r/min摇床上培养18~30h得种子液；进一步优选于28℃，160 r/min摇床上培养24h得种子液。

2、产物海藻糖的结构鉴定

分析设备：TENSOR 27傅里叶红外光谱仪（FT-IR）(德国布鲁克光谱仪器亚太有限公司)(Bruker Optik GmbH)。

分析设定条件：分辨率4cm-1；样品扫描时间16 scans；背景扫描时间16scans；波数范围4000-400cm-1；扫描速度10Hz，样品制备：KBr。

红外光谱分析结果：化合物名称：D-(+)海藻糖，分子式：C₁₂H₂₂O₁₁H₂O；

二水海藻糖纯度：99%。

本发明菌株的海藻糖产量高，培养基及培养过程简单，提取过程节能环保。产海藻糖方法具有简单实用、成本低廉的优点，容易在工业生产上推广应用。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1。一种红酵母2-14(Rhodotorula sp. 2-14)CGMCC NO. 4445。该菌株具有以下特征：

(1) 形态特征：细胞呈圆形或椭圆形，其大小4.5~5.1×6.3~7.2μm，繁殖方式为芽殖，无假菌丝、子囊孢子及掷孢子形成；

(2) 培养特征：发酵液清，表面无醭、无环、无气泡、无沉淀；菌落饱满潮湿，颜色为红色，边缘整齐，无褶皱，好氧；

(3) 生理生化特征：菌株对乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、L-山梨糖、D-木糖、D-果糖、L-鼠李糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇、核糖、葡萄糖、蔗糖、琥珀酸、柠檬酸均不发酵；菌株不液化明胶，脲酶阳性，葡萄糖氧化阴性，DBB阳性，类淀粉化合物形成结果为阴性，石蕊牛奶试验产碱，在37 ℃条件下正常生长。

实施例2。一种如实施例1所述的红酵母2-14(Rhodotorula sp.2-14)CGMCC NO. 4445产海藻糖的方法，其步骤如下：

(2) 细胞的培养：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，在20℃，100 r/min摇床上培养18h后得种子液，将种子液按5%的接种量接种于含有75mL液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，160 r/min摇床培养50h后取出，在5000 r/min离心除去上清液，所得菌体细胞用0.85% NaCl溶液洗涤一次，置于4℃冰箱中贮存备用；所述的液体培养基为：蔗糖31g，酵母膏9.9g，蛋白胨9.9g，氯化铵2.2g，磷酸二氢钾0.4g，磷酸氢二钠0.4g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.2g，三氯化铁0.2g，煮沸过滤陈海水1000mL，pH5.5；

(3) 海藻糖的提取：向菌体细胞中加入蒸馏水，每40g菌体细胞中加入1L蒸馏水，于80℃水浴提取，离心，取上清液加活性炭脱色，过滤除去活性炭，上清液真空浓缩到原体积的1/4，用截留分子量为500的超滤膜超滤除去大分子杂质，采用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂进行离子交换除去离子，真空浓缩，冷却结晶，恒温干燥，即得食用级海藻糖产品。

实施例3。一种如实施例1所述的红酵母2-14(Rhodotorula sp.2-14)CGMCC NO. 4445产海藻糖的方法，其步骤如下：

(2) 细胞的培养：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，在35℃，200 r/min摇床上培养30h后得种子液，将种子液按5%的接种量接种于含有75mL液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，160 r/min摇床培养60h后取出，在5000 r/min离心除去上清液，所得菌体细胞用0.85% NaCl溶液洗涤一次，置于4℃冰箱中贮存备用；所述的液体培养基为：蔗糖31g，酵母膏9.9g，蛋白胨9.9g，氯化铵2.2g，磷酸二氢钾0.4g，磷酸氢二钠0.4g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.2g，三氯化铁0.2g，煮沸过滤陈海水1000mL，pH5.5；

(3) 海藻糖的提取：向菌体细胞中加入蒸馏水，每40g菌体细胞中加入1L蒸馏水，于80℃水浴提取，离心，取上清液加活性炭脱色，过滤除去活性炭，上清液真空浓缩到原体积的1/5，用截留分子量为500的超滤膜超滤除去大分子杂质，采用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂进行离子交换除去离子，真空浓缩，冷却结晶，恒温干燥，即得食用级海藻糖产品。

实施例4。一种如实施例1所述的红酵母2-14(Rhodotorula sp.2-14)CGMCC NO. 4445产海藻糖的方法，其步骤如下：

(2) 细胞的培养：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，在28℃，160 r/min，的摇床上培养24h后得种子液，将种子液按5%的接种量接种于含有75mL液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，160 r/min摇床培养55h后取出，在5000 r/min离心除去上清液，所得菌体细胞用0.85% NaCl溶液洗涤一次，置于4℃冰箱中贮存备用；所述的液体培养基为：蔗糖31g，酵母膏9.9g，蛋白胨9.9g，氯化铵2.2g，磷酸二氢钾0.4g，磷酸氢二钠0.4g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.2g，三氯化铁0.2g，煮沸过滤陈海水1000mL，pH5.5；

实施例5。一种如实施例1所述的红酵母2-14(Rhodotorula sp.2-14)CGMCC NO. 4445产海藻糖的方法，其步骤如下：

在一容积1L的大摇瓶中装入300 mL生长培养基(蔗糖31g，酵母膏9.9g，蛋白胨9.9g，氯化铵2.2g，磷酸二氢钾0.4g，磷酸氢二钠0.4g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.2g，三氯化铁0.2g，煮沸过滤陈海水1000mL，pH5.5)，灭菌后按5 %的接种量接入2-14种子培养液，在28℃，160 r/min的摇床上培养60h。

取离心后的湿菌体50g，加入200mL 蒸馏水于80℃恒温提取，离心的上清液加入0.5%的活性炭，混合均匀后，在60℃条件下搅拌脱色20分钟，过滤除去活性炭，上清液在60 ℃的旋转蒸发仪上浓缩到原体积的1/4～1/5，用超滤膜（截留分子量为500）超滤除去大分子杂质，采用732阳离子交换树脂和717阴离子交换树脂进行离子交换除去离子，再次在上述条件下真空浓缩至海藻糖的浓度为40%～50%，加入4～5倍体积的无水乙醇冷却结晶，在60℃ 条件下恒温干燥，即成含海藻糖96%的食用级海藻糖产品。

实施例6。一种如实施例1所述的红酵母2-14(Rhodotorula sp.2-14)CGMCC NO. 4445产海藻糖的方法，其步骤如下：

在5-L发酵罐中装入3.5 L生长培养基(蔗糖31g，酵母膏9.9g，蛋白胨9.9g，氯化铵2.2g，磷酸二氢钾0.4g，磷酸氢二钠0.4g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.2g，三氯化铁0.2g，煮沸过滤陈海水1000mL，pH5.5)，灭菌后按5%的接种量接入2-14种子培养液，在温度为28℃、搅拌转速为400r/min和通气速率为0.8 vvm的条件下发酵，至 54h放罐时菌浓为13g/L (干重)，海藻糖含量为18.9g/100g cell。

取离心后的湿菌体100g，加入400mL 蒸馏水于80℃恒温提取，离心的上清液加入0.5%的活性炭，混合均匀后，在60℃条件下搅拌脱色20分钟，过滤除去活性炭，上清液在65 ℃~70 ℃，78~82KPa真空度下浓缩到原体积的1/3～1/4，用超滤膜（截留分子量为500）超滤除去大分子杂质，采用732阳离子交换树脂和717阴离子交换树脂进行离子交换除去离子，再次在上述条件下真空浓缩至海藻糖的浓度为60%～70%，缓慢冷却到5℃条件下结晶25h左右，离心得湿晶体在60℃ 条件下恒温干燥，即成含海藻糖95%的食用级海藻糖产品。

Claims

1.一种红酵母2-14(Rhodotorula sp. 2-14)CGMCC NO. 4445。

2.根据权利要求1所述的红酵母2-14(Rhodotorula sp.2-14)CGMCC NO. 4445，其特征在于，该菌株具有以下特征：

3.一种如权利要求1所述的红酵母2-14(Rhodotorula sp.2-14)CGMCC NO. 4445产海藻糖的方法，其特征在于，其步骤如下：

(3)海藻糖的提取：向菌体细胞中加入蒸馏水，每40g菌体细胞中加入1L蒸馏水，于80℃水浴提取，离心，取上清液加活性炭脱色，过滤除去活性炭，上清液真空浓缩到原体积的1/4～1/5，用截留分子量为500的超滤膜超滤除去大分子杂质，采用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂进行离子交换除去离子，真空浓缩，冷却结晶，恒温干燥，即得食用级海藻糖产品。

4.根据权利要求3所述的产海藻糖的方法，其特征在于：步骤（2）中：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中， 25~30℃，140~180 r/min摇床上培养18~30h得种子液。

5.根据权利要求3所述的产海藻糖的方法，其特征在于：步骤（2）中：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，160 r/min摇床上培养24h得种子液。