CN102154111B

CN102154111B - 一种广谱降解有机磷杀虫剂的真菌菌剂

Info

Publication number: CN102154111B
Application number: CN201010522942A
Authority: CN
Inventors: 谢宝恩; 王继雯; 甄静; 周伏忠; 陈国参; 李冠杰; 刘莹莹
Original assignee: HENAN ACADEMY OF SCIENCES BIOLOGICAL RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: HENAN ACADEMY OF SCIENCES BIOLOGICAL RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2010-10-28
Filing date: 2010-10-28
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2030-10-28
Also published as: CN102154111A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种广谱降解土壤有机磷杀虫剂的真菌菌剂，其由下述方法制得：将黑曲霉菌株J4和J6，分别接种于PDA斜面制成斜面菌种，再经PDA培养基培养至孢子成熟后分别加入葡萄糖基础盐培养基中，培养至孢子萌发成孢子种子液，将两种种子液以体积比0.1～3∶1配制而成。所述黑曲霉菌株J4在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC NO.4219，J6的保藏号为：CGMCC NO.4220。该真菌菌剂能有效降解硫代磷酸酯类(P＝S键)、磷酸酯类(P＝O键)有机磷杀虫剂，降解酶系丰富，应用范围广，降解率高，降解时间短。

Description

一种广谱降解有机磷杀虫剂的真菌菌剂

一、技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及利用微生物降解农药残留的技术，特别涉及一种广谱降解土壤有机磷杀虫剂残留的真菌菌剂。

二、技术背景

我国是农药生产和使用大国，每年农药使用量约80万吨，居世界第一位，农药生产总量从1990年起一直名列世界第二位，仅次于美国。目前，我国农药产品结构仍以杀虫剂为主，杀虫剂的生产量占农药总产量70％左右，其中有机磷杀虫剂占杀虫剂总产量的70％，在年产量万吨以上的6个杀虫剂品种中，有5个是有机磷杀虫剂。有机磷杀虫剂从分子结构上分主要有磷酸酯类(P＝O键)和硫代磷酸酯类(P＝S键)两大类，目前在我国注册登记并广泛使用的有机磷杀虫剂主要有：甲拌磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲胺磷、乐果、氧化乐果、敌百虫、马拉硫磷等。按毒性划分，有机磷杀虫剂又分为剧毒类(甲拌磷、对硫磷、内吸磷等)、高毒类(甲基对硫磷、甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏等)、中毒类(乙硫磷、敌百虫等)和低毒类(辛硫磷、马拉硫磷等)。有机磷杀虫剂的主要特点是杀虫谱广、杀虫迅速、见效快且价格便宜，因此，在相当长的时期内，有机磷杀虫剂的使用不可避免。和其他农药一样，有机磷农药的残留危害是一个非常严重的问题，尤其是造成对土壤的污染。一般情况下有机磷农药的有效利用率仅为20～30％，大部分都残留在土壤或水体之中，水田中施用的有机磷农药几乎有90％左右都残留在农田。有机磷农药残留对土壤的破坏主要表现在对田间有益昆虫的杀灭、对后茬作物的毒害、对土壤动物、微生物及其群落结构的负面影响、有害物质或其分解产物在土壤中逐渐积累等，进而引起土壤本身的物理、化学性质发生改变，土壤结构和生态系统受到破坏，失去原有的土壤功能，出现土壤板结、肥力降低、土壤被毒化等现象；污染物还可以通过雨水淋溶，从土壤传入地下水或地表水，造成水质的污染和恶化；受污染土壤上生长的生物，吸收、积累和富集土壤污染物后，通过食物链或饲料进入人或畜禽体内，造成多种危害，如引起人或畜禽的急、慢性中毒、神经毒性疾病、诱变致畸、致癌以及降低家畜生产性能等。有机磷杀农药留通过“土壤-水体-大气-生物”的链接循环，破坏农田土壤及水体中物种多样性和生态平衡，污染人类生存环境，威胁人类健康。有效地解决土壤有机磷杀虫剂残留问题，已成为当前各国的共同目标。据统计，我国耕地面积为18亿亩，约有13％受农药污染，面积约为2.4亿亩。以上述两个70％计，有机磷农药残留显然是造成土壤农药污染的主要种类，这其中有机磷杀虫剂的总量最大，因此，有效地降解有机磷杀虫剂在土壤中的残留具有非常重要的意义。

土壤由于自身的特性，具有一定的缓和和减少污染的自净能力，但十分有限，对污染土壤进行修复技术的研究是国内外学者的共识。对污染土壤的修复技术分为物理法、化学法和生物修复(Bioremediation)法等，生物修复法最为大家认可，它包括微生物法、农耕法和植物修复等，其中微生物修复技术具有独特的优势，最重要的是它安全且没有二次污染，微生物修复技术的核心是微生物具有降解农药残留的功能。对农药的微生物降解的研究最早从有DDT和有机氯农药开始，已有几十年的历史，已报道的能降解农药的微生物有细菌、真菌、放线菌和藻类等，其中以细菌为最多。国内文献报道的相关研究有：王善银等分离到一株黄杆菌(Flavobacterium sp.P3-2)该菌具有广泛的底物适应能力可降解对硫磷、水胺硫磷、甲基对硫磷等；2004年福州大学的徐升等人从农药厂污泥中分离到一株较高降解氧化乐果活性的真菌，对氧化乐果的降解率为55.75％；中山大学的刘阳和刘玉焕等从农药污染土壤中分离出的一株具有广谱降解有机磷杀虫剂的能力的真菌，经初步鉴定为米曲霉。国内外研究比较多的是对对硫磷、甲基对硫磷和甲胺磷等有机磷杀虫剂的微生物降解，分离得到的微生物多是专一性裂解P＝O键或P＝S键，仅起到降解某一类有机磷杀虫剂的作用，降解范围具有局限性。除了单菌株的应用的报道外，曾有以细菌多菌株矿化对硫磷的报道，许多研究、实验还仅处于实验室阶段。微生物生长速率或生长量低是生物修复技术研究的一个主要问题，与细菌相比，真菌具有遗传性状稳定而且产孢子真菌在自然条件下具有较强的生存能力、抗逆性强、耐高温等优点，筛选具有广谱降解有机磷杀虫剂特性的真菌是处理大面积有机磷杀虫剂污染的有效途径。到目前为止，未见有利用两种或两种以上真菌联合降解有机磷杀虫剂残留的报道。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种对有机磷杀虫剂残留具有广谱降解作用的真菌菌剂，用于土壤中多种有机磷杀虫剂残留的降解。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

将有机磷杀虫剂污染的土壤样品制成混悬液，接种于基础盐培养基，通过基础液培养、传代驯化、分离纯化出两株真菌黑曲霉Aspergillus niger菌株J4和J6，然后将菌株J4和J6分别接种于PDA斜面制成斜面菌种，再经PDA培养基(组分为：去皮马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15-20g，pH自然，下同)培养至孢子成熟后分别加入葡萄糖基础盐培养基中，培养至孢子萌发成孢子种子液，将两种种子液以体积比0.1～3∶1组配成具有广谱降解有机磷杀虫剂的真菌菌剂。

其中，黑曲霉(Aspergillus niger)菌株J4在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC NO.4219，保藏日期2010年10月12日；黑曲霉(Aspergillus niger)菌株J6在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC NO.4220，保藏日期2010年10月12日。菌株J4和J6的保藏单位地址均为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体地，所述广谱降解有机磷杀虫剂的真菌菌剂的制备方法为：将黑曲霉菌株J4和J6分别接种于PDA斜面制成斜面菌种，-4℃保存；再将斜面菌种接种于PDA培养基平板上，于25-32℃培养3-5天，孢子成熟后用灭菌的葡萄糖基础盐培养基冲洗平板，配制成密度约3×10⁸个/ml的菌悬液，加入葡萄糖基础盐培养基中，30℃培养6h后孢子萌发得孢子种子液，将两种种子液以体积比0.1～3∶1组配而得。

所述葡萄糖基础盐培养基的组分为：NaCl 0.1％、KH₂PO₄0.05％、K₂HPO₄0.15％、NH₄NO₃ 0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.01％、葡萄糖0.1-0.3％，pH 5.5-7.5，各组分均指重量百分比。

本发明的真菌菌剂用于土壤有机磷杀虫剂残留的降解，其优点在于：

1.该真菌菌剂生物量大、抗逆性强、耐高温、遗传性状稳定，且降解酶系丰富，降解底物范围广，它不仅能降解以甲拌磷、辛硫磷为代表的硫代磷酸酯类(P＝S键)有机磷杀虫剂，还能降解以氧化乐果为代表的磷酸酯类(P＝O键)有机磷杀虫剂。

2.该真菌菌剂两种曲霉配比实现了优势互补，有效地提高了对有机磷杀虫剂的降解率，缩短了降解时间。对甲拌磷的降解率最高达92％，对辛硫磷降解率最高达96％，对氧化乐果降解率最高达95％，比单菌菌剂的降解率高10～40％。

3.该真菌菌剂对有机磷杀虫剂污染的土壤修复效果良好，环保效果明显。生产采用通用发酵设备，生产工艺简单，生产原料易得，成本低，应用操作方便，无污染产生，易于推广应用。

四、附图说明

图1为黑曲霉菌株J4在PDA培养基上的正面和背面形态学特征照片；

图2为黑曲霉菌株J6在PDA培养基上的正面和背面形态学特征照片。

五、具体实施方式

(一)黑曲霉Aspergillus niger菌株J4和J6的分离过程：

1、基础液制取

取含有有机磷杀虫剂污染的土壤样品配制成混悬液，以10％接种量接种于基础盐培养基(组分为：NaCl 0.1％，KH₂PO₄0.05％，K₂HPO₄0.15％，NH₄NO₃0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，均为重量百分比)中，加入甲拌磷使其终浓度为100mg/L，摇床培养，摇速140-200r/min，培养条件为：25-32℃，pH5.5-7.5，培养时间3d，成基础液。

2、传代驯化

取上述基础液10ml接入基础盐培养基中(配方同上)，加入甲拌磷使其终浓度为200mg/L，总量100ml，培养3d后，再次传代培养，连续转接3次，每次使用甲拌磷使终浓度增加100mg/L，至500mg/L为止，完成传代驯化。

3、分离纯化

取上述驯化液1ml，加入9ml无菌水稀释，从中取0.1ml涂布于含100mg/L甲拌磷的基础盐培养基(配方同上)平板上培养3-5d，得到两株真菌菌株，经鉴定为黑曲霉Aspergillusniger菌株J4(其基因序列在GenBank上的登录号为HM347449)和黑曲霉Aspergillus niger菌株J6(其基因序列在GenBank上的登录号为HQ397705)，将菌株J4和J6分别接种于PDA斜面上成斜面菌种，于-4℃保存。

(二)黑曲霉Aspergillus niger菌株J4和J6的鉴定结果：

所得黑曲霉菌株J4的形态学特征为(见图1)：将J4菌株点植于PDA培养基平板上，30℃培养5d。菌落直径达3～4cm，菌落蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状；背面无色或中央略带黄褐色，有时在新分离的菌株中能找到白色、圆形、直径约1mm的菌核。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一；顶囊球形，双层小梗。根据该菌株的特征，查阅《常见与常用真菌》手册，初步鉴定菌株J4为曲霉属(Aspergillus sp.)。

经PCR扩增、18S rDNA序列测定后获得全长为1670bp的18S rDNA基因序列，在GenBank上进行全序列比对，结果与序列号为AM270051.1的黑曲霉(Aspergillus niger)百分之百相似，因此J4为黑曲霉。

所得黑曲霉菌株J6的形态学特征为(见图2)：将J6菌株点植于PDA培养基平板上，30℃培养5d。菌落直径达5～6cm，菌落呈厚绒状；菌落表面为黑色，中央部分凸起，边缘黄色呈同心园纤毛状，反面中央部分略带黄褐色，且产生辐射状皱褶，挑起菌落表面有液态透明的物质；进一步观察发现，菌株具有分生孢子头，分生孢子梗自基质生出，长短不一。根据该菌株特征，查阅《常见与常用真菌》手册，初步鉴定菌株J6为曲霉属(Aspergillus sp.)。

经PCR扩增、18S rDNA序列测定后获得全长为1669bp的18S rDNA基因序列，在GenBank上进行全序列比对，结果与序列号为D63697.1的黑曲霉(Aspergillus niger)百分之百相似，因此J6为黑曲霉。

所得黑曲霉菌株J4和J6的生理生化特性为：

注：“+”表示阳性或生长，“++”，表示发酵型，“-”表示阴性或不生长碳源利用实验

注：“+++”表示生长较好，“++”表示生长一般，“+”表示生长差，“-”表示基本不生长氮源利用实验

氮源

硝酸钾

硝酸铵

硝酸钠

硝酸钙

草酸铵

谷氨酸

L-苯丙氨酸

L-精氨酸

氨基乙酸

J4

+

J6

+

注：“+”表示阳性或生长，“-”表示阴性或基本不生长

(三)广谱降解有机磷杀虫剂的真菌菌剂制备

1、孢子种子液制备

将菌株J4和J6分别接种于PDA斜面上成斜面菌种，然后将斜面菌种分别接种于PDA培养基(去皮马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15-20g，pH自然)平板上，25-32℃培养3-5d，孢子成熟后用灭菌的葡萄糖基础盐培养基(组分为：NaCl 0.1％，KH₂PO₄0.05％，K₂HPO₄0.15％， NH₄NO₃0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，葡萄糖0.1％，pH5.5-7.5，均指重量百分比)冲洗平板，配制成密度约3×10⁸个/ml的菌悬液。再将菌悬液分别加入葡萄糖基础盐培养基(组分为：NaCl 0.1％，KH₂PO₄0.05％，K₂HPO₄0.15％，NH₄NO₃0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，葡萄糖0.1％，pH5.5-7.5，均指重量百分比)中，30℃培养6h后孢子萌发，成孢子种子液。

2、真菌菌剂配比筛选

取上述的孢子种子液配制真菌菌剂，配比筛选采用正交试验法，按两种孢子种子液体积比进行组合，每种组合分别按下述方法进行降解效果测定：

①按4-6％接种量将不同组合的孢子种子液接种于100ml以甲拌磷为唯一碳源的基础盐培养基中，同时以不接菌的基础盐培养基为对照，培养3-5天后，用气相色谱测定其对甲拌磷的降解效果；

②按4-6％接种量将不同组合的孢子种子液接种于100ml以辛硫磷为唯一碳源的基础盐培养基中，同时以不接菌的基础盐培养基为对照，培养3-5天后，用液相色谱测定其对辛硫磷的降解效果；

③按4-6％接种量将不同组合的孢子种子液接种于100ml以氧化乐果为唯一碳源的基础盐培养基中，同时以不接菌的基础盐培养基为对照，培养3-5天后，用气相色谱测定其对氧化乐果的降解效果；

最终筛选出两种黑曲霉J4和J6孢子种子液的最佳配比范围为0.1～3∶1。所得真菌菌剂对甲拌磷降解率为80～92％，耐受甲拌磷最高浓度为500mg/L；对辛硫磷降解率为85～96％，耐受辛硫磷最高浓度为500mg/L；对氧化乐果的降解率为80～95％，耐受氧化乐果最高浓度为5000mg/L。黑曲霉J4单菌菌剂对甲拌磷、辛硫磷和氧化乐果的降解率分别为40～55％、70～82％、46～72％，黑曲霉J6单菌菌剂对甲拌磷、辛硫磷和氧化乐果的降解率分别为65～70％、40～50％、43～71％。

3、土壤修复试验

将100mg/L甲拌磷水溶液均匀喷洒在200g灭菌试验土壤上，取20ml真菌菌剂接种于该试验土壤中混匀，加无菌水调节含水量至60％(重量百分比)的土壤湿度，将试验土壤置于30℃条件下培养，培养过程中加入无菌水保持60％(重量百分比)的土壤湿度，同时以不接菌的为空白对照，每隔1天取样用气相色谱测定甲拌磷残留量。施用后第5天甲拌磷降解率为82％。

以上述同样的方法，分别将200mg/L辛硫磷、1000mg/L氧化乐果水溶液均匀喷洒在200g灭菌试验土壤上，取20ml菌液分别接种于试验土壤中混匀，加无菌水调节含水量至60％的土壤湿度，将试验土壤置于30℃条件下培养，培养过程中加入无菌水保持60％的土壤湿度，同时以不接菌的为空白对照。每隔1天取样用液相色谱测定辛硫磷的残留量，用气相色谱测定氧化乐果的残留量，施用后第5天对辛硫磷降解率为72.9％，对氧化乐果降解率为81％。

实施例1

取黑曲霉J4和J6斜面菌种，分别接种于PDA培养基(去皮马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15-20g，pH自然)平板上，25-32℃培养5d，孢子成熟后用灭菌的葡萄糖基础盐培养基(NaCl0.1％，KH₂PO₄0.05％，K₂HPO₄0.15％，NH₄NO₃ 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，葡萄糖0.1％，pH5.5-7.5)冲洗平板，分别配制成密度约3×10⁸个/ml的悬浮液，再分别于葡萄糖基础盐培养基(NaCl 0.1％，KH₂PO₄0.05％，K₂HPO₄0.15％，NH₄NO₃0.1％，MgSO₄·7H₂O0.01％，葡萄糖0.1％，pH5.5-7.5)中30℃培养，6h后孢子萌发成孢子种子液。将黑曲霉J4和J6的孢子种子液以0.5∶1的体积比配制成真菌菌剂，菌剂按6％接种量接种于100ml以甲拌磷为唯一碳源(含甲拌磷300mg/L)的基础盐培养基中，同时以不接菌的为空白对照，培养5天，测得对甲拌磷的降解率为92％。

实施例2

以实施例1同样的方法，将黑曲霉J4和J6的孢子种子液以0.5∶1的体积比配制得真菌菌剂，将100mg/L甲拌磷水溶液均匀喷洒在200g灭菌试验土壤上，取20ml真菌菌剂接种于该试验土壤中混匀，加无菌水调节含水量至60％的土壤湿度，将试验土壤置于30℃条件下培养，同时以不接菌的为空白对照，每隔1天取样用气相色谱测定甲拌磷残留量，培养过程中加入无菌水保持60％的土壤湿度。培养5天，测得甲拌磷的降解率为82％。

实施例3

以实施例1同样的方法，将黑曲霉J4和J6的孢子种子液以3∶1的体积比配制得真菌菌剂，将1000mg/L氧化乐果水溶液均匀喷洒在200g灭菌试验土壤上，取20ml真菌菌剂接种于该试验土壤中混匀，加无菌水调节含水量至60％的土壤湿度，将试验土壤置于30℃条件下培养，同时以不接菌的为空白对照，每隔一天取样用气相色谱测定甲拌磷残留量，培养过程中加入无菌水保持60％的土壤湿度。培养5天，测得氧化乐果的降解率为81％。

实施例4

以实施例1同样的方法，将黑曲霉J4和J6的孢子种子液以0.1∶1的体积比配制得真菌菌剂，将200mg/L辛硫磷水溶液均匀喷洒在200g灭菌试验土壤上，取20ml真菌菌剂接种于该试验土壤中混匀，加无菌水调节含水量至60％的土壤湿度，将试验土壤置于30℃条件下培养，同时以不接菌的为空白对照，每隔一天取样用液相色谱测定辛硫磷残留量，培养过程中加入无菌水保持60％的土壤湿度。培养5天，测得辛硫磷的降解率为72.9％。

Claims

1.一种广谱降解有机磷杀虫剂的真菌菌剂，其特征在于，由下述方法制得：将黑曲霉菌株J4和J6，分别接种于PDA斜面制成斜面菌种，再经PDA培养基培养至孢子成熟后分别加入葡萄糖基础盐培养基中，培养至孢子萌发成孢子种子液，将两种种子液以体积比0.1～3∶1配制而成；所述黑曲霉菌株J6在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC NO.4220；所述黑曲霉Aspergillus niger菌株J4在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC NO.4219。

2.如权利要求1所述广谱降解有机磷杀虫剂的真菌菌剂，其特征在于，将黑曲霉菌株J4和J6分别接种于PDA斜面制成斜面菌种，-4℃保存；再将斜面菌种接种于PDA培养基平板上，于25-32℃培养3-5天，孢子成熟后用灭菌的葡萄糖基础盐培养基冲洗平板，配制成密度3×10⁸个/ml的菌悬液，加入葡萄糖基础盐培养基中，30℃培养6h后孢子萌发得孢子种子液。

3.如权利要求2所述广谱降解有机磷杀虫剂的真菌菌剂，其特征在于，所述葡萄糖基础盐培养基的组分为：NaCl 0.1％、KH₂PO₄ 0.05％、K₂HPO₄ 0.15％、NH₄NO₃ 0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.01％、葡萄糖0.1-0.3％，pH 5.5-7.5。