CN102146062B

CN102146062B - 噻唑烷类神经氨酸酶抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN102146062B
Application number: CN 201110021052
Authority: CN
Inventors: 徐文方; 刘瑜; 方浩
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2011-01-19
Filing date: 2011-01-19
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2031-01-19
Also published as: CN102146062A

Abstract

本发明涉及一种噻唑烷类神经氨酸酶抑制剂及其应用。所述噻唑烷类神经氨酸酶抑制剂是具有式I的化合物以及其光学异构体、非对映异构体和消旋体混合物。式I化合物在预防或治疗与神经氨酸酶活性相关的疾病的药物的应用。

Description

噻唑烷类神经氨酸酶抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一类具有噻唑烷骨架的神经氨酸酶抑制作用的化合物、制备方法及其应用，还涉及所述化合物的活性试验和含该化合物的组合物，以及这些组合物的用途。

背景技术

神经氨酸酶(NA)即唾液酸酶，其酶学代码为EC 3.2.1.18，是存在于A，B型流感病毒表面的糖蛋白，在流感病毒复制和感染过程中起关键酶的作用(Calfee，D.P.；Hayden，F.G.Drugs，1998，56，537.)。神经氨酸酶能催化裂解宿主细胞表面受体末端的唾液酸残基与糖蛋白、糖脂和寡聚糖之间的α-糖苷键，从而促进新形成的病毒粒子从宿主细胞的唾液酸残基释放，促进病毒粒子从感染的呼吸道粘膜向周围组织扩散，并阻止病毒从宿主细胞释出后的凝聚。同时神经氨酸酶可通过裂解呼吸道黏膜中的唾液酸，阻止病毒灭活，促进病毒渗入呼吸道上皮细胞。神经氨酸酶对流感病毒的致病性也有作用，它能改变血凝素的糖基部分，从而增强一些菌株的毒力；神经氨酸酶也能直接激活潜在的转移生长因子β，这种细胞因子水平的增高能引起细胞凋亡。神经氨酸酶还能刺激炎症细胞因子的产生，从而增强流感期间的症状和呼吸道炎症反应(Schultz，C.S.；Hinshaw，V.S.J Virol，1996，70，8624-8629.)。

神经氨酸酶是由4个相同的亚基通过二硫键连接形成的。其一级结构包括4个区域，分别为氨基酸端胞浆尾、非极性跨膜区、茎部和球状头部4部分(Gong，J.Z.；Wu，W.F.；Zhang，J.Curr Med Chem，2007，14，113.)。在每一个流感病毒表面，大约含有100个这种蘑菇状的表面糖蛋白四聚体，每个四聚体包括一个盒子状的头部和一个细长的茎部。NA的每个亚基包含6个反平行的β折叠片状结构，每个折叠又由4条反平行排列的肽链形成。每个折叠的立体构型相同，这些片状结构好像螺旋桨的叶片以亚基的中心为轴线均匀排列分布(Colman，P.M.；Varghese，J.N.；Laver，W.G.Nature，1983，303，35.)。在所有的A型和B型流感病毒中，NA的活性位点都位于每一个糖蛋白亚基的口袋中。尽管NA在精确的氨基酸序列上有所差异但其活性部位的的结构却不会改变。它存在于表面上的一道较深的裂隙中，是由所有的A型及B型流感病毒均高度保守的11个氨基酸残基排列而成的。

流感病毒神经氨酸酶的三维结构在20世纪80年代被确定后，成为抗病毒药物研究的靶点，并在两种神经氨酸酶抑制剂zanamivir和oseltamivir的发现过程中起了重要的作用。神经氨酸酶抑制剂通过对神经氨酸酶的作用而抑制流感病毒在机体内的扩散，达到预防和治疗流感的目的。

神经氨酸酶蛋白氨基酸残基的变化，是产生耐药性及新型病毒形成的一个重要根源。近年来，已有的两种上市的神经氨酸酶抑制剂zanamivir和oseltamivir相继出现严重的副作用及耐药性，因此新型的神经氨酸酶抑制剂的研发刻不容缓。已有文献报道或专利的神经氨酸酶抑制剂包括唾液酸类似物类、环己烯类、苯甲酸类、环戊烷类、吡咯烷类、呋喃环类、多聚体类等几大类型。

本发明中所设计的噻唑烷类化合物作为神经氨酸酶抑制剂是具有全新结构母核的，对于神经氨酸酶抑制活性筛选发现几个药物分子其活性微弱于目前唯一上市的用于预防或治疗流感的流感病毒神经氨酸酶抑制剂oseltamivir。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种噻唑烷类神经氨酸酶抑制剂及其制备与应用。

本发明以半胱氨酸为原料，与醛缩合成噻唑烷类中间体，再通过与苯乙酰氯、氯乙酰氯缩合分别得到两类产物；后者的缩合产物再通过氨化、Boc保护及脱保护得到第三类产物。

本发明的技术方案如下：

具有通式I的化合物，以及其光学异构体、非对映异构体和消旋体混合物，或其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药。

其中，

R₁是烃基，芳基，芳烃基；被卤素、氧、硫、氮、氰基取代的烃基，芳基或芳烃基；

R₂是氢，烃酰基，芳酰基，芳烃酰基；被卤素、氧、硫、氮、氰基取代的氢，烃酰基，芳酰基或芳烃酰基。

R₃是OH或NHOH。

所述烃基是C1-C16烷基，C1-C8环烷基，C1-C12烯基或C1-C12炔基；

所述芳基是C5-C12芳基或C4-C11杂芳基。

*是立体构型为S或R光学纯度或其消旋体。

根据本发明优选的，具有通式I的化合物，式I中：R₁是芳基或被卤素、氧、硫、氮、氰基取代的芳基；R₂是氢，芳烃酰基或被卤素、氮取代的烃酰基；R₃是OH。

根据本发明，进一步优选的，上述通式I的化合物具体包括如下化合物之一：

(1)3-氯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-羧基苯基)-4-噻唑烷酸，

(2)3-氯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-氰基苯基)-4-噻唑烷酸，

(3)3-氯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-硝基苯基)-4-噻唑烷酸，

(4)3-氯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-羟基-3-甲氧基苯基)-4-噻唑烷酸，

(5)3-氯乙酰基-(2RS，4R)-2-呋喃基-4-噻唑烷酸，

(6)3-苯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-羧基苯基)-4-噻唑烷酸，

(7)3-苯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-氰基苯基)-4-噻唑烷酸，

(8)3-苯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-硝基苯基)-4-噻唑烷酸，

(9)3-苯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-羟基-3-甲氧基苯基)-4-噻唑烷酸，

(10)3-苯乙酰基-(2RS，4R)-2-呋喃基-4-噻唑烷酸，

(11)3-氨基乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-羧基苯基)-4-噻唑烷酸，

(12)3-氨基乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-氰基苯基)-4-噻唑烷酸，

(13)3-氨基乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-硝基苯基)-4-噻唑烷酸，

(14)3-氨基乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-羟基-3-甲氧基苯基)-4-噻唑烷酸，

(15)3-氨基乙酰基-(2RS，4R)-2-呋喃基-4-噻唑烷酸。

为叙述方便简洁，以上序号(1)-(15)将作为所述化合物的编号，例如3-氯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-羧基苯基)-4-噻唑烷酸记为目标化合物(1)，以此类推。

制备所述通式I的化合物的中间体，其特征在于，是(2RS，4R)-2-(2-羧基苯基)-4-噻唑烷酸、(2RS，4R)-2-(2-氰基苯基)-4-噻唑烷酸、(2RS，4R)-2-(2-硝基苯基)-4-噻唑烷酸、(2RS，4R)-2-(2-羟基-3-甲氧基苯基)-4-噻唑烷酸、(2RS，4R)-2-呋喃基-4-噻唑烷酸或(2RS，4R)-2-苯基-4-噻唑烷酸。

本发明上述通式I的化合物的制备方法，以半胱氨酸为原料，碱性条件下与醛缩合成噻唑烷类中间体，所得中间体在碱性条件下通过与氯乙酰氯或苯乙酰氯缩合，分别得到含氯乙酰基的目标化合物(1)-(5)或含苯乙酰基的目标化合物(6)-(10)；所得含氯乙酰基的目标产物再通过氨化、Boc保护及脱保护得到含氨基乙酰基的目标化合物(11)-(15)。

本发明设计合成了一类具有全新结构母核的神经氨酸酶抑制剂。体外试验表现出显著的体外抑制神经氨酸酶活性，可成为一类抗病毒候选药物。

本发明所述的化合物在预防或治疗与神经氨酸酶活性相关的疾病的药物的应用。

本发明所述的化合物作为神经氨酸酶抑制剂在制备预防或治疗流感的药物中的应用。神经氨酸酶抑制剂通过对神经氨酸酶的作用而抑制流感病毒在机体内的扩散，实现对流感的预防与治疗。

本发明还涉及具有式I的化合物的药物组合物。

一种药物组合物，包含(i)本发明上述任一种式I的化合物，和(ii)一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

此外，本发明还包括一种适于口服给予哺乳动物的药物组合物，包含(i)本发明上述任一种式I的化合物，和(ii)药学上可接受载体，包含(iii)一种或多种药学上可接受的赋形剂。

此外，本发明还包括一种适于胃肠外给予哺乳动物的药物组合物，包含(i)本发明上述任一种式I的化合物，和(ii)药学上可接受载体，包含(ii)一种或多种药学上可接受的赋形剂。

发明详述

所用的定义和术语

“药学上可接受的盐”是指式(I)化合物具有疗效且无毒的盐形式。其可由任一酸性基团(如羧基)形成阴离子盐，或由任一碱性基团(如氨基)形成阳离子盐。本领域已知许多这样的盐。在任何酸性基团(如羧基)上形成的阳离子盐，或是在任何碱性基团(如氨基)上形成的阴离子盐。这些盐由许多式本领域已知的，如阳离子盐包括碱金属(如钠和钾)和碱土金属(如镁和钙)的盐以及有机盐(如铵盐)。还可通过使用相应的酸处理碱性形式的(I)方便地获得阴离子盐，这样的酸包括无机酸如硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸如乙酸、丙酸、羟基乙酸、2-羟基丙酸、2-氧代丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、2-羟基-1，2，3-丙三酸、甲磺酸、乙磺酸、苯甲磺酸、4-甲基苯磺酸、环己基亚磺酸、2-羟基苯甲酸、4-氨基-2-羟基苯甲酸等。这些盐式熟练技术人员熟知的，熟练的技术人员可制备本领域知识所提供的任何盐。此外，熟练技术人员可根据溶解度、稳定性、容易制剂等取某种盐而舍另一种盐。这些盐的测定和最优化在熟练技术人员的经验范围内。

“溶剂合物”是溶质(如神经氨酸酶抑制剂)和溶剂(如水)组合形成的配合物。参见J.Honig等，The Van Nostrand Chemist’s Dictionary，p.650(1953)。本发明采用的药学上可接受的溶剂包括不干扰神经氨酸酶抑制剂的生物活性的那些溶剂(例如水、乙醇、乙酸、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜以及该领域技术人员所知的或容易确定的溶剂)。

本文所用的“光学异构体”、“对映体”、“非对映体”、“消旋体”等定义了本发明化合物或其生理上的衍生物所有可能的立体异构体的形式。除非另有指示，本发明化合物的化学命名包括所有可能的立体化学形式的混合物，所属混合物包含基本结构分子的所有非对映体和对映体，以及基本纯净的本发明化合物的单个异构体形式，即其中含有低于10％，优选低于5％，特别是低于2％，最优选低于1％的其它异构体。本发明的化合物各种立体异构体形式均明显包含于本发明的范围内。

式(I)噻唑类化合物还可以其它被保护的形式或衍生物的形式存在，这些形式对本领域技术人员而言是显而易见的，均应该包含于本发明的范围内。

如上所述的取代基自身还可被一个或多个取代基取代。这样的取代基包括在C.Hansch和A.Leo，Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology(1979)中列出的那些取代基。优选的取代基包括，例如烷基，烯基，烷氧基，羟基，氧基，硝基，氨基，氨基烷基(如氨甲基等)，氰基，卤，羧基，羰基烷氧基(如羰基乙氧基等)，硫基，芳基，环烷基，杂芳基，杂环烷基(如哌啶基，吗啉基，吡咯基等)，亚氨基，羟烷基，芳基氧基，芳基烷基，及其结合。

合成

上述通式I的化合物的制备方法，本发明以半胱氨酸1为原料，碱性条件下与醛2缩合成噻唑烷类中间体3，再通过与氯乙酰氯或苯乙酰氯在碱性条件下缩合，分别得到目标化合物(4)或(9)；化合物(4)再通过氨化、Boc保护及脱保护得到目标化合物(14)。

下面以邻香草醛(邻羟基间甲氧基苯甲醛)为例，说明该类化合物的合成路线及制备方法。

合成路线：

试剂：a.碳酸氢钠，乙醇/水；b.氯乙酰氯，碳酸氢钠/水；c.苯乙酰氯，碳酸氢钠/水；d.氨水；二碳酸二叔丁醇酯(BOC₂O)，碳酸氢钠，四氢呋喃；氯化氢饱和的乙酸乙酯。

所述化合物制备的具体操作步骤在实施例中将加以详细说明。

本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率，他们可据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度，可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如T.Greene，Protecting Groups in OrganicSynthesis.

显然，上述路线为立体选择性合成，可通过上述路线还可制备得到其光学活性的化合物。例如将原料L-半胱氨酸替换为其光学异构体(R构型)。本领域技术人员可方便地获得噻唑烷类衍生物的各种其他异构体，并可通过常规的分离手段纯化，如手性盐或手性层析柱等。

通式I的化合物的体外抑酶试验证明该化合物为一种噻唑烷类神经氨酸酶抑制剂。目标化合物抑制神经氨酸酶的活性试验将在实施例中详细说明。

本发明的噻唑类衍生物在空间上与神经氨酸酶的活性位点相匹配，因此在体外显示了较高的抑制活性。

制剂，药物组合物，剂量和服用

本发明的噻唑类衍生物可以游离形式或以盐形式存在。本领域熟练人员已知许多化合物类型的药学上可接受的盐及其制备方法。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐，包括这样的化合物碱与无机或有机酸形成的季铵盐。

本发明的化合物可形成水合物或溶剂合物。本领域熟练人员已知将化合物与水一起冻干时所形成的水合物或在溶液中与合适的有机溶剂浓缩时形成溶剂合物的方法。

本发明包含含有治疗量本发明化合物的药物，和一种或多种药学上可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。载体包括如盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它们的结合物，下文更详细地论述。如果需要，该组合物还可以包含较小量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。该组合物可以是液体，悬浮液，乳剂，片剂，丸剂，胶囊，持续释放制剂或粉末。该组合物可以用传统的黏合剂和载体如三酸甘油酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体如药物品级的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素和碳酸镁等等。视需要制剂而定，配制可以设计混合，制粒和压缩或溶解成分。在另一个途径中，该组合物可以配制成纳米颗粒。

使用的药物载体可以为，例如，固体或者液体。

典型的固体载体包括乳糖，石膏粉，蔗糖，滑石，凝胶，琼脂，果胶，阿拉伯胶，硬脂酸镁，硬脂酸等等。固体载体可以包括一种或多种可能同时作为增香剂，润滑剂，增溶剂，悬浮剂，填料，助流剂，压缩助剂，粘合剂或片剂-崩解剂的物质；它还可以是包封材料。在粉末中，载体为精细粉碎的固体，它与精细粉碎的活性成分的混合。在片剂中，火星成分与具有必要的压缩性质的载体以合适的比例混合，以需要的形状和大小压缩。粉末和片剂优选包含至多99％活性成分。合适的固体载体包括，例如，磷酸钙，硬脂酸镁，滑石，糖，乳糖，糊精，淀粉，凝胶，纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠盐，聚乙烯吡咯烷酮烷酮，低熔点蜡和离子交换树脂。

典型的液体载体包括糖浆，花生油，橄榄油，水，等等。液体载体用于制备溶液，悬浮液，乳剂，糖浆，酊剂和密封的组合物。活性成分可以溶解或悬浮于药学上可接受的液体载体如水，有机溶剂，二者的混合物或药学上可接受的油类或脂肪。液体载体可以包含其他合适的药物添加剂如增溶剂，乳化剂，缓冲剂，防腐剂，增甜剂，增香剂，悬浮剂，增稠剂，颜料，粘度调节剂，稳定形或渗透压-调节剂。用于口服和肠胃外给药的液体载体的合适的例子包括水(部分地包含如同上述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠盐溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)和它们的衍生物，和油类(例如分馏椰子油和花生油)。用于肠胃外给药的载体还可以为油脂如油酸乙酯和异丙基肉豆蔻酸盐。无菌的液体载体用于肠胃外给药的无菌的液态组合物。用于加压组合物的液体载体可以为卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。无菌溶液或悬浮溶液液体药物组合物可以用来，例如，静脉内，肌内，腹膜内或皮下注射。注射时可单次推入或逐渐注入，入30分钟的经脉内灌注。该化合物还可以以液体或者固体组合物的形式口服给药。

载体或赋形剂可以包括本领域已知的时间延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，还可包括蜡，乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，异丁烯酸甲酯等等。当制剂用于口服时，公认PHOSALPG-50(phospholipid与1，2-丙二醇浓缩，A.Nattermann & Cie.GmbH)中的0.01％吐温80用于其他化合物的可接受的口服制剂的配制，可以适应于本发明各种化合物的配制。

给予本发明化合物时可以使用各式各样的药物形式。如果使用固体载体，制剂可以为片剂，被放入硬胶囊中的粉末或小药丸形式或锭剂或糖锭形式。固体载体的量在很大程度上变化，但是优选从约25mg到约1.0g。如果使用液体载体，制剂可以为糖浆，乳剂，软胶囊，在安瓿或小瓶或非水的液体悬浮液中的无菌注射溶液或悬浮液。

为了获得稳定的水溶性的剂型，可以将化合物或其药学上可接受的盐溶于有机或无机酸的水溶液，0.3M琥珀酸或柠檬酸溶液。选择性地，酸性的衍生物可以溶于合适的碱性溶液。如果得不到可溶形式，可将化合物溶于合适的共溶剂或它们的结合。这样的合适的共溶剂的例子包括，但是不局限于，浓度范围从0-60％总体积的乙醇，丙二醇，聚乙二醇300，聚山梨酸酯80，甘油，聚氧乙烯脂肪酸酯，脂肪醇或甘油羟脂肪酸酯等等。

各种释放系统是已知的并且可以用于化合物或其他各种制剂的给药，这些制剂包括片剂，胶囊，可注射的溶液，脂质体中的胶囊，微粒，微胶囊，等等。引入的方法包括但是不局限于皮肤的，皮内，肌内，腹膜内的，静脉内的，皮下的，鼻腔内的，肺的，硬膜外的，眼睛的和(通常优选的)口服途径。化合物可以通过任何方便的或者其它适当的途径给药，例如通过注入或快速浓注，通过上皮的或粘膜线路(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜，等等)吸收或通过负载药物的支架以及可以于其他生物活性剂一起给药。可以全身或局部给药。用于鼻，支气管或肺疾病的治疗或预防时，优选的给药途径为口服，鼻给药或支气管烟雾剂或喷雾器。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。

实施例1.中间体(2RS，4R)-2-(2-羟基-3-甲氧基苯基)-噻唑烷-4-羧酸(1)的制备

将邻香草醛12.1g(0.11mol)溶于200mL乙醇中，剧烈搅拌下加到L-半胱氨酸盐酸盐15.7g(0.1mol)和碳酸氢钠11.7g(0.11mol)的200mL水溶液中。室温搅拌6h。静置，过滤，沉淀用乙醇、水洗涤，干燥后得产物23g，产率92％，mp 137-138℃。¹H-NMR(DMSO-d⁶，300MHz)：2.931-3.040(m，1H，5-H)，3.171-3.368(m，1H，5-H)，3.777-3.858(m，3H，-OCH₃)，3.836(t，0.46H，4-H)，4.207(t，J＝5.4Hz，0.54H，4-H)5.671(s，0.46H，2-H)，5.865(s，0.54H，2-H)，6.704-6.971(m，3H).HRMS：m/z 256.0643。

实施例2.3-氯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-羟基-3-甲氧基苯基)-噻唑烷-4-羧酸(4)

实施例1制备的中间体(2RS，4R)-2-(2-羟基-3-甲氧基苯基)-噻唑烷-4-羧酸2.6g(0.01mol)和碳酸氢钠2.1g(0.02mmol)溶于100mL水中，冰浴条件下滴加氯乙酰氯0.9mL(0.011mmol)，搅拌反应4h。反应液用碳酸氢钠调pH 8-9，用二氯甲烷洗涤3次每次用量50mL(50mL×3)后，水相用柠檬酸调pH 2-3，二氯甲烷萃取3次每次用量50mL(50mL×3)，合并有机相，干燥，蒸干，柱层析纯化得终产物2g，产率60.4％，mp 130-132℃，¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：3.325-3.464(m，2H，5-H)，3.773-3.818(d，1H，J＝13.5Hz，Cl-CH₂-)，3.916(s，3H，-OCH₃)，4.010-4.055(d，1H，J＝13.5Hz，Cl-CH2-)，5.043(t，1H，J＝6.9Hz，4-H)，6.486(s，1H，2-H)，6.849-6.942(m，2H)，7.352(dd，1H).HRMS：m/z 332.0357。

实施例3.3-苯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-羟基-3-甲氧基苯基)-噻唑烷-4-羧酸(9)的制备。

实施例1制备的中间体(2RS，4R)-2-(2-羟基-3-甲氧基苯基)-噻唑烷-4-羧酸2.6g(0.01mol)和碳酸氢钠2.1g(0.02mmol)溶于100mL水中，冰浴条件下滴加苯乙酰氯1.4mL(0.011mmol)，搅拌反应4h。反应液用碳酸氢钠调pH 8-9，用二氯甲烷洗涤3次每次用量50mL(50mL×3)，然后，水相用柠檬酸调pH 2-3，二氯甲烷萃取3次每次用量50mL(50mL×3)，合并有机相，干燥，蒸干，柱层析纯化得终产物2.4g，产率64.2％，mp148-150℃，¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：3.244-3.685(m，4H，5-H，Ph-CH₂-)，3.914(s，3H，-OCH₃)，4.981(t，1H，J＝6.9Hz，4-H)，5.977(s，0.5H，2-H)，6.473(s，0.5H，2-H)，6.840-7.316(m，8H).HRMS：m/z 374.1053.

实施例4.3-氨基乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-羟基-3-甲氧基苯基)-噻唑烷-4-羧酸(14)的制备。

实施例2制备的产物3-氯乙酰基-(2RS，4R)-2-(2-羟基-3-甲氧基苯基)-噻唑烷-4-羧酸3.3g(0.01mol)，置于50ml浓氨水中搅拌反应3d，反应液加入碳酸氢钠2.3g(0.02mmol)，冰浴条件下，滴入含二碳酸二叔丁醇酯2.3g(BOC₂O，0.011mmol)的50mL四氢呋喃溶液中。搅拌过夜。反应液减压蒸出四氢呋喃，柠檬酸调pH 2-3后，用乙酸乙酯萃取3次，每次用量50mL，合并有机相，干燥，蒸干，柱层析得到纯化中间体1g。加入20mL氯化氢饱和的乙酸乙酯溶液中，搅拌24h，过滤，乙酸乙酯洗涤，得终产物0.8g，此步骤总产率25.6％，mp 152-155℃，¹H-NMR(H₂O-d⁶，300MHz)：3.204-3.305(m，2H，5-H)，3.702(s，3H)，3.996-4.107(m，2H，NH₂-CH₂-)，5.407(m，1H，4-H)，6.280，6.331(2s，1H，2-H)，6.829-7.235(m，3H).HRMS：m/z313.0851.。

实施例5、目标化合物抑制神经氨酸酶的活性试验(In vitro)

1原理：化合物MUNANA是神经氨酸酶的特异性底物，在神经氨酸酶作用下产生的代谢产物在355nm照射激发下，可以产生460nm荧光，荧光强度的变化，可以灵敏地反应神经氨酸酶的活性，间接反映出抑制剂对酶活性抑制程度的大小。

2材料与方法：

神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒(包括神经氨酸酶NA、神经氨酸酶荧光底物MUNANA、缓冲溶液、Mili-Q水)购自Beyotime公司

溶液的配制：

各样品溶解在DMSO中配成2000μg/mL，400μg/mL，80μg/mL，16μg/mL，3.2μg/mL的溶液，放置冰箱备用。

3神经氨酸酶活性分析：

按照表1所示，96荧光酶标板所设的样品组各孔内分别加入70μL神经氨酸酶缓冲溶液，10μL神经氨酸酶，10μL神经氨酸酶抑制剂样品，再加入Mili-Q水补足90μL。振动混匀1min，37℃孵育2min使抑制剂和酶充分作用。每孔再加入10μL神经氨酸酶荧光底物，震动混匀1min。37℃孵育20min进行荧光测定。激发波长为360nm，发射波长为440nm。

每板均设对照组，以奥司他韦羧酸(Oseltamivir carboxylate)作对照，加样量与样品组相同(表1所示)。

每板均设空白及酶值，加样量分别如表2、3所示。

表1、样品及对照组

缓冲溶液(μL)	70
		神经氨酸酶(μL)	10
待测样品(μL)	10
		Mili-Q水	0
神经氨酸酶荧光底物	10

表2、空白组

缓冲溶液(μL)	70
		Mili-Q水	20
神经氨酸酶荧光底物	10

表3、酶值

缓冲溶液(μL)	70
		神经氨酸酶(μL)	10
Mili-Q水	10
		神经氨酸酶荧光底物	10

按照如下公式计算抑制率：

抑制率＝(样品荧光强度-空白)/(酶值荧光强度-空白)

根据化合物的浓度与相应的抑制率，利用origin7.5软件拟合药效曲线，计算各化合物的IC₅₀。

表4、体外抑酶试验结果

Claims

1.神经氨酸酶抑制剂，包括下列化合物：

3-氯乙酰基-(2RS,4R)-2-（2-氰基苯基）-4-噻唑烷酸，

3-氯乙酰基-(2RS,4R)-2-（2-硝基苯基）-4-噻唑烷酸，

3-氯乙酰基-(2RS,4R)-2-（2-羟基-3-甲氧基苯基）-4-噻唑烷酸，

3-氯乙酰基-(2RS,4R)-2-呋喃基-4-噻唑烷酸，

3-氨基乙酰基-(2RS,4R)-2-（2-氰基苯基）-4-噻唑烷酸，

3-氨基乙酰基-(2RS,4R)-2-（2-硝基苯基）-4-噻唑烷酸，

3-氨基乙酰基-(2RS,4R)-2-（2-羟基-3-甲氧基苯基）-4-噻唑烷酸，

3-氨基乙酰基-(2RS,4R)-2-呋喃基-4-噻唑烷酸，

3-氨基乙酰基-(2RS,4R)-2-苯基-4-噻唑烷酸。

2.权利要求1所述化合物在制备预防或治疗与神经氨酸酶有关的疾病的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的化合物作为神经氨酸酶抑制剂在制备预防或治疗流感的药物中的应用。

4.一种药物组合物，包含权利要求1任一种化合物，和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。