CN102140520A - 用于双相情感障碍关联基因检测的引物、探针及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种分子生物技术领域的用于双相情感障碍关联基因检测的引物、探针及其试剂盒，该试剂盒由PCR试剂组和连接酶检测反应试剂组构成，PCR试剂组含有：缓冲液、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、纯水和如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物；连接酶检测反应试剂组含有：缓冲液、dNTP混合液、Taq DNA连接酶、纯水和如SEQ ID No.3所示的探针、如SEQ ID No.4所示的探针以及如SEQ ID No.5所示的探针。本发明操作简便，成本低廉，针对双相情感障碍而开发。结果可靠，稳定性好，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种分子生物技术领域的引物、探针及其试剂盒，具体是一种用于双相情感障碍关联基因检测的引物、探针及其试剂盒。
背景技术
连接酶可以对与目标序列完全互补的两条寡核苷酸片段进行连接，进而形成一条较长的寡核苷酸探针，如果两条寡核苷酸探针连接处的碱基与目标序列不完全互补，那么连接反应就不会发生，也就不会产生较长的寡核苷酸探针。根据这一原理，根据SNP位点的基因型设计不同长度的寡核苷酸探针，可以对SNP位点的基因型进行检测。根据最终产物的长度分类，可以确定SNP位点的基因型，这就是连接酶检测反应(Ligase Detection Reaction)。
人类基因组是遗传信息的最终载体，人类个体之间的差异根本原因也在于基因组序列的差异。单核苷酸多态性(SNP)正是表征这种差异的常用的遗传标记，在人类基因组上大概每一千个碱基对，就包含有一个SNP。双生子实验等证明，双相情感障碍是一种复杂的遗传疾病，遗传度高达80％左右。现代遗传学研究表明，各种遗传疾病都会被某些SNP位点所表征，也就是说，某些SNP位点与遗传疾病呈现出关联性。全基因组关联研究的出现，更为寻找关联位点提供了有力的技术支持。这些强关联SNP位点可以作为一种患病风险的表征。
经过对现有技术的检索发现，现在对SNP位点的分型，常用的方法有AB公司的TaqMan探针技术，测序技术等。TaqMan探针要从AB公司订制，周期较长而且价格较为昂贵。测序技术虽然结果较为可靠，但是对特定位点的SNP分型，该方法相对成本较高，花费时间也比较长。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于双相情感障碍关联基因检测的引物、探针及其试剂盒，操作简便，成本低廉，针对双相情感障碍而开发。结果可靠，稳定性好，灵敏度高。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种用于双相情感障碍关联基因检测的引物，含有：如Seq ID No.1的上游引物和如Seq ID No.2的下游引物。
本发明涉及一种用于双相情感障碍关联基因检测的探针，含有：如Seq ID No.3的探针、如Seq ID No.4的探针以及如Seq ID No.5的探针。
本发明涉及一种试剂盒，由PCR试剂组和连接酶检测反应试剂组构成，其中：
PCR试剂组含有：缓冲液、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、纯水和所述引物；
连接酶检测反应试剂组含有：缓冲液、dNTP混合液、Taq DNA连接酶、纯水和所述探针。
所述的缓冲液中Tris·HCl的浓度为10nM；
所述的dNTP混合液的浓度为10nM；
所述的Taq DNA聚合酶的浓度为2unit/μL；
所述的Taq DNA连接酶的浓度为40unit/μL；
所述引物及所述探针均为2OD的干粉形式，使用前须先8000rpm离心十分钟，然后加入纯水溶解并震荡均匀。
本发明针对双相情感障碍关联的MDGA1基因内的rs1883901位点的基因型进行分型，建立了对一个位点快速，简便，且成本低廉的检测试剂盒，该试剂盒准确度高，灵敏性好，具有很强的实用价值。利用该多态性位点，作为生物标志物之一，可以用作药物设计的分子靶标，用于新的药物开发。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.血液样本收集和总DNA的提取
采集志愿者的外周血制备总DNA。直接采用Qiagen的DNA提取试剂盒进行DNA的抽提，抽提方法按照试剂盒的说明进行。抽提之后用NanoDrop检测各个DNA样本的浓度，然后将每份样本调节到10ng/μL，置于-20度保存备用。
2.PCR反应
采用本发明中所述试剂盒对上述SNP位点rs1883901的周围区域进行PCR扩增。下面为检测过程：
(1)特异性PCR引物序列如下：
SEQ ID NO.1：5’-AGCTCACCAGCAAATTCCTC-3’
SEQ ID NO.2：5’-GCTTCACACCCTTGAGGTTC-3’
连接酶检测反应所用探针序列如下：
SEQ ID NO.3：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTGAATGCCAGATGAATTTTCTCACA-3’
SEQ ID NO.4：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTGAATGCCAGATGAATTTTCTCACG-3’
SEQ ID NO.5：
5’-Pi-GTGCTTCCTGCCTGAGCCATACACTTCGACTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’
(2)通过PCR扩增目标SNP所在的DNA片段。过程简述如下：制备混合体系，包含1x PCR缓冲液，0.13U DNA聚合酶，0.2μM上游引物(SEQ ID NO.1)，0.2μM下游引物(SEQ IDNO.2)，100μM的每种dNTP，2μL基因组DNA(10ng/uL)。
操作过程在冰上进行，最后加入DNA聚合酶，加试剂过程注意更换枪头，避免造成交叉污染。按照权利要求中的程序，在PCR仪上进行反应。
PCR反应程序：94℃5分钟，35个循环(94℃30秒，57℃40秒，72℃1分钟)，72度十分钟。
所述PCR反应，目的在于为后面的LDR提供反应的模板，PCR产物应先经过纯化再用于LDR，各反应的体系及程序都已在权利要求书中阐述，在此不再重复。
3.PCR产物检测
PCR反应完成后，将2μL的产物与0.5uL的loading dye(主要成分是溴酚蓝)混合，然后在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电压设置在100V，时间20-30分钟。然后通过Bio-Rad凝胶成像系统，应用GelDoc 2000程序观察产物条带，若产生唯一一条明显的条带，且大小与目的片段相符，说明扩增成功。
4.PCR产物的纯化。
采用醋酸钠-乙醇沉淀的方法来纯化PCR产物。具体过程如下：取5uLPCR产物，加入1uL3M的醋酸钠，震荡混匀并离心，然后再加入15uL的乙醇，震荡混匀，3700rpm离心30分钟，结束时，取下倒置，进行最高速不超过500rpm的离心。然后再加入25uL70％的乙醇，3700离心15分钟，结束时，重复上述倒置离心的过程。风干后，加入10uL去离子水溶解DNA。
5.LDR反应
应用纯化后的PCR产物作为连接酶检测反应的模板，检测rs1883901位点的基因型。过程如下：反应体系：20uL包含1x DNA连接酶的缓冲液，25nM(500fmol)LDR探针，1000fmol纯化的PCR产物，8U DNA连接酶。
反应条件：95℃2.0分钟，然后94度30秒，65度1分钟维持20个循环，最后95度条件下10分钟。
注意，操作过程在冰上进行，最后加入DNA连接酶，加试剂过程注意更换枪头，避免造成交叉污染。按照权利要求中的程序，在PCR仪上进行反应。
6、LDR产物检测
可以采用ABI377，或者ABI3730等仪器进行检测，根据相应仪器的操作规范进行操作。根据产物的长度判断各种基因型。若产生两种长度的条带，那么就是杂合子。如果只有一种长度的条带，那么就是纯合子，需要根据条带间的长度对比判断具体的基因型。
其他位点的基因型检测过程与上述过程完全相同，只是采用其他位点的特异性引物及探针。
本实施例可以针对双相情感障碍关联的MDGA1基因内的rs1883901位点的基因型进行分型。利用该多态性位点，可用作药物设计，本实施例建立的检测试剂盒，准确度高，灵敏性好。
Claims (8)
1.一种用于双相情感障碍关联基因检测的引物，其特征在于，含有：SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物。
2.一种用于双相情感障碍关联基因检测的探针，其特征在于，含有：SEQ ID No.3所示的探针、SEQ ID No.4所示的探针以及如SEQ ID No.5所示的探针。
3.一种用于双相情感障碍关联基因检测的试剂盒，其特征在于：由PCR试剂组和连接酶检测反应试剂组构成；
PCR试剂组含有：缓冲液、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、纯水和SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物；
连接酶检测反应试剂组含有：缓冲液、dNTP混合液、Taq DNA连接酶、纯水和SEQ ID No.3所示的探针、SEQ ID No.4所示的探针以及如SEQ ID No.5所示的探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是，所述的缓冲液中Tris·HCl的浓度为10mM。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是，所述的dNTP混合液的浓度为10mM。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是，所述的Taq DNA聚合酶的浓度为2unit/μL。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是，所述的Taq DNA连接酶的浓度为40unit/μL。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是，所述的引物及所述探针均为2OD的干粉形式。
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| CN2011100273147A CN102140520A (zh) | 2011-01-21 | 2011-01-21 | 用于双相情感障碍关联基因检测的引物、探针及其试剂盒 |
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|---|---|
| CN (1) | CN102140520A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021184412A1 (zh) * | 2020-03-18 | 2021-09-23 | 浙江大学 | 基于肠道微生物的双相情感障碍生物标志物及其筛选应用 |
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2011
- 2011-01-21 CN CN2011100273147A patent/CN102140520A/zh active Pending
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