CN102124027B - 产生富含分泌型免疫球蛋白的乳组分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过对含有S-IgA的乳进行分级而产生富含分泌型IgA(S-IgA)的组合物的方法。该组合物可特别用于在有以下治疗需要的个体中治疗和/或预防诸如胃肠道、泌尿生殖道、呼吸道、鼻腔或者口腔的粘膜表面的感染和/或炎症、治疗和/或预防肥胖症及相关疾病或者治疗和/或预防食物过敏症。简单而言，本发明提供使用一个或者多个微孔膜过滤步骤而产生富含分泌型免疫球蛋白A的乳组分的方法。本方法的优选流程涉及脱脂、微孔过滤和通过多个渗滤循环的超滤浓缩。本发明的方法，除获得了意料不到的高收率之外，还在可量测性、已有乳制品工厂中的应用以及影响S-IgA质量和稳定性的方法参数的可控性方面，提供了特别感兴趣的优势。

Description

产生富含分泌型免疫球蛋白的乳组分的方法
发明领域
本发明涉及通过对含有S-IgA的乳进行分级而产生富含分泌型IgA(S-IgA)的组合物的方法。例如，通过将所述组合物合并入药品、食物产品或者美容产品，可将该组合物特别用于在有以下治疗需要的人或者动物体中，治疗和/或预防诸如胃肠道、泌尿生殖道、呼吸道、鼻腔或者口腔的粘膜表面的感染和/或炎症、治疗和/或预防肥胖症及相关疾病或者治疗和/或预防食物过敏症中的一个或者多个。本发明特别涉及产生该乳组分的方法，所述方法包括脱脂、过滤和浓缩步骤。本发明还涉及可通过本方法获得的乳组分、含有该乳组分的产品以及所述产品的用途。
发明背景
抗体在科学和医学上有很多应用。产生针对靶标的新抗体是非常容易的。对于大多数应用，抗体由所谓的杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系来自产生抗体的B细胞与永生化细胞系的融合。可容易地培养这些杂交瘤细胞并且可以从培养上清收获抗体。产生抗体的另一个方法是从免疫的动物的血清中收获。家畜繁殖技术是普遍的并且家畜圈养相对便宜。
在几十年前，在家畜的乳腺分泌产物中产生免疫原特异性的抗体已经被证实是可行的。最初，最佳结果是在初乳中获得的，即分娩幼崽后的雌性产生的最初的乳液。初乳阶段后，雌性产生的乳在本文被称为成熟乳。初乳是非常特有的产物，其来自乳腺的不同生理和功能状态。在反刍动物中，初乳和成熟乳之间的主要成分差别在于非常高含量的初乳免疫球蛋白，其80％-90％是IgG类。成熟乳中的抗体水平基本上低于初乳中所能达到的水平约1个数量级(Hodgkinson et al.，WO 98/54226；Hastings，美国专利第5,017,372号)。因此，最初大部分临床和临床前研究中使用的乳来源的抗原特异性的抗体实际上是初乳来源的并且主要属于IgG类(Tollemar et al.，Bone Marrow Transpl.23：283-290(1999)；Bostwick et al.，美国专利第5,773,000号；Cordle et al.，美国专利第5,260,057号)。
免疫球蛋白A(IgA)是在粘膜免疫中起关键作用的抗体。在分泌物中发现IgA处于特定形式，被称为S-IgA，其包含通过所谓的J链连接的IgA单体的二聚体，并且还包含分子量约为435kDa的所谓的分泌组分。在IgA的分泌形式中，IgA是粘液分泌物中主要的免疫球蛋白，所述粘液分泌物包括眼泪、唾液、人初乳/成熟乳、胃肠液、阴道液和来自前列腺和呼吸上皮的分泌物。因此，它们可见于来自胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道和口腔/鼻腔的粘膜部位，并且作用于防止病原体定居。分泌型IgA可以经受诸如消化道和呼吸道的恶劣环境，从而提供针对在机体分泌物中繁殖的微生物的保护。这些性质使S-IgA成为在用于改善和/或保持健康，特别是治疗和/或预防诸如胃肠粘膜和呼吸道粘膜以及皮肤粘膜的粘膜表面的感染和/或炎症的产品应用中优选的免疫球蛋白。这些产品的实例包括肠配方，例如婴儿配方、临床营养、功能性食物和保健食品；药物制剂、皮肤制剂和喷雾制剂。因此，投入大量的努力在反刍动物乳中产生增高水平的(分泌型)IgA是不足为奇的。
US 6,974,573讨论了通过粘膜通道或者气道使家畜对于抗原超免疫并且随后将该抗原通过乳腺或者乳腺上淋巴结给予的方法。US 6,974,573讨论了直接使用这样获得的乳或者进一步加工用于纯化抗原特异性(IgA)抗体。
对诸如乳的复合组合物进行过滤分级来生产富含免疫球蛋白的组分在本领域已有描述，但是绝大多数这类现有技术公开内容涉及IgG分离，由于IgG是牛乳分泌产物中的主要免疫球蛋白，所以这也是不足为奇的。US 2004/0167320讨论了使用改进的切向流过滤方法从复合混合物中分离目的分子的方法和装置。根据US 2004/0167320所述，合适的目的分子包括免疫球蛋白。该美国专利申请包括用渗滤从原乳中纯化IgG1的实例，其中详细描述了所述方法的条件和参数。然而，从乳中分离更大的S-IgA免疫球蛋白还未被公开。
US 2003/0059512讨论了分离乳和乳产物的方法和装置，其涉及一个或者多个交叉流过滤步骤。特别是，US 2003/0059512提示将脱脂乳分离为富含酪蛋白的保留物组分和缺少酪蛋白的透过物组分，使所透过物流经随后的交叉流过滤单元，所述交叉流过滤单元适于形成富含诸如白蛋白和免疫球蛋白的大分子的保留物组分，随后例如使用层析法或者交叉流过滤法分离并纯化该保留物组分，从而形成白蛋白和免疫球蛋白。US 2003/0059512没有包括任何关于制备富含IgA的乳组分的具体信息或实施例，更未涉及S-IgA。
US 4,644,056讨论了通过加工初乳或者乳来制备乳或者初乳免疫球蛋白溶液的方法。按照该文件，初乳被酸化到pH值为4.0-5.5并且在平均孔径为0.1-0.2μm的过滤单元中进行交叉流过滤，随后通过在分离限为5-80kDa的另一过滤单元中进一步交叉流过滤的手段将低分子量组分去除。该文实施例讨论了使用该过滤单元的酸化初乳的渗滤，产生了主要含有IgG的溶液，尽管使用免疫电泳法也发现了溶液中IgA、S-IgA和IgM的存在。然而，US 4,644,056公开的方法根本不足以用于从(非初乳或者成熟的)乳中高收率地有效制备富含S-IgA的组分。
基于在IgA和IgG之间以及S-IgA和IgG之间存在分子量和形状上的巨大差异的事实，将现有技术中IgG分离方法应用于分离S-IgA根本不能直接适用，在需要高效操作和足够的收率，即使该方法适于工业规模生产时就更不可能。从上文可以清楚知道，现有技术并不能满足可用于有效产生富含S-IgA的(非初乳)乳组分的方法的需要。本发明的目的是提供这样的方法。
发明概述
本发明人已经成功开发了满足上述需要的方法。简单而言，本发明提供使用一个或者多个微孔膜过滤步骤来产生富含分泌型免疫球蛋白A的乳组分的方法。因此，按照本发明方法获得的浓缩乳组分适于合并入药剂、食品产品或者美容产品中，而且也考虑到其他下游工序。本方法的优选流程涉及脱脂、微孔过滤和通过多个渗滤循环的超滤浓缩。本发明人发现，本发明方法在这些操作之前不需要将乳酸化。本方法不需要任何类型涉及对免疫球蛋白有害的高温的操作。
正如在下文的实施例中将详细说明的，本方法容易地允许收率高达最初存在于乳中的S-IgA的75％及更高，尤其可高达85％。本领域技术人员应当理解，在优选方面中，本发明涉及加工具有高抗原特异性S-IgA含量的乳，例如按照上文所述的粘膜超免疫家畜的方法中获得的乳。
本发明的方法，除获得了意想不到的高收率之外，在可量测性、已有乳制品工厂中的应用以及影响S-IgA质量和稳定性的方法参数的可控性方面，还提供了特别有益的优势。
附图说明
图1：按照本发明的一个实施方案产生分泌型IgA(S-IgA)乳组分的完整方法的流程图，包括乳脱脂装置(1)、第一贮存箱(4)、微孔过滤单元(6)、第二贮存箱(10)、超滤单元(11)、喷雾干燥装置(12)和水源(8)。在流程图中，(2)表示UF透过物流，(3)表示MF保留物流，(7)表示MF透过物流以及(9)表示UF保留物流。
图2A：相对于总透过物体积的微孔过滤透过物中总S-IgA的累积百分比。带●的线表示透过物，带■的线表示保留物以及带▲的线表示总S-IgA，合并的透过物和保留物的值。带▲的线的百分比以平均值表示。
图2B：相对于总透过物体积的微孔过滤透过物中艰难梭菌(C.difficile)毒素A特异性S-IgA的累积百分比。带●的线表示透过物，带■的线表示保留物以及带▲的线表示总艰难梭菌毒素A特异性S-IgA，合并的透过物和保留物的值。带▲的线的百分比以平均值表示。
图2C相对于总透过物体积的微孔过滤透过物中艰难梭菌毒素A特异性IgG的累积百分比。带●的线表示透过物，带■的线表示保留物以及带▲的线表示总艰难梭菌毒素A特异性IgG，合并的透过物和保留物的值。带▲的线的百分比以平均值表示。
发明的详细描述
因此，在一方面，本发明提供了产生富含分泌型IgA(S-IgA)的乳组分的方法，所述方法包括：
-通过在低于55℃的温度下从乳中分离脂肪，将pH超过5.5的一定量的原乳的脂肪含量降低到低于0.5wt％的值；
-使用平均孔径范围在0.1-0.45μm的多孔膜将所述pH超过5.5的低脂肪乳进行微孔过滤，产生含有S-IgA的透过物和富含酪蛋白的保留物；以及
-将所述微孔过滤透过物浓缩，产生富含S-IgA的乳组分。
如本文所使用的术语“分泌型IgA”或者“S-IgA”是指由两个IgA单体组成的二聚体免疫球蛋白，正如在粘液分泌物中所发现的，所述粘液分泌物包括眼泪、唾液、初乳和成熟乳、肠液和来自呼吸上皮的分泌物。正如上面提到的，该IgA二聚体还包含J链和所谓的分泌组分，导致分子量约为435kDa。
术语“富含S-IgA的乳组分”是指通过本发明方法获得的产物，以干物质为准，所述产物含有的S-IgA的相对量显著高于未处理的原乳。特别是，本方法目的在于将S-IgA与诸如脂质和酪蛋白的大量乳成分分离。本方法还可以引起诸如小的乳清蛋白、单糖、二糖和盐的小的有机和无机的乳物质的去除。因此，本发明的富含S-IgA的乳组分通常包含免疫球蛋白(S-IgA、IgA、IgM和IgG)的组合和其它乳清蛋白，微量的单糖、二糖和乳清中通常发现的其它组分。通过本方法产生的产物可以为(浓缩的)液体以及干燥固体形式，这将在下文中进行解释。
在本文件及其权利要求书中，动词“包括(to comprise)”及其动词的变化以其非限制性含义使用，表示包括该词后面的项，而不排除未具体提及的项。此外，不定冠词“a”或“an”涉及的元件不排除多于一个的所述元件存在的可能性，除非文中明确要求有一个且仅有一个元件。因此不定冠词“a”或“an”通常表示“至少一个”。
本文使用的术语“原乳”是指直接获自哺乳动物的乳。在按照本发明处理之前，可以在常规乳加工中处理原乳，例如通过冷却或者冷藏用于保存等。然而，该处理不应当涉及过高温度或者添加可以导致免疫球蛋白变质的化学物和/或酶。应当注意到，正如本领域技术人员所理解的，加热导致的免疫球蛋白的任何损害的程度取决于施加的温度以及乳或者乳组分暴露于所述温度下的持续时间。在本发明的优选实施方案中，提供了这样的方法，所述方法不包括任何温度超过60℃、持续时间超过5分钟、2分钟、1分钟、0.5分钟或0.1分钟的步骤或者操作，优选不包括任何温度超过55℃、持续时间超过5分钟、2分钟、1分钟、0.5分钟或0.1分钟的步骤，更优选不包括任何温度超过50℃、持续时间超过5分钟、2分钟、1分钟、0.5分钟或0.1分钟的步骤。应当想到，规定的要求使方法中包括至少一个巴氏灭菌步骤。因此，在本发明的另一个实施方案中，本方法包括这样的步骤，所述步骤包括加热乳或者乳组分，通常于温度在70℃以上的温度，时间长至40秒，优选长至30秒。
如上文所示，本发明方法包括降低一定量的原乳的脂肪含量的步骤，所述原乳的pH超过5.5，优选超过5.6，更优选5.7，最优选5.8。根据本方法特别优选的实施方案，原乳的pH范围为6-7.5，最优选范围为6.3-7。正如本领域技术人员已知的，原乳的pH通常位于6.5-6.8的范围。根据本发明特别优选的实施方案，本方法不包括添加使酪蛋白发生聚集的量的酸。不希望受理论的限制，本发明人认为微孔过滤前的酪蛋白聚集将显著影响MF膜通量，从而降低总体方法效率。此外，酪蛋白聚集过程中的低pH对免疫球蛋白有害。最优选地，原乳在进行本方法之前不进行酸化。
哺乳动物产生的乳中含有的脂肪95％以上是以直径范围为0.1-20μm的球形存在。可以使用本领域已知的任何方法降低原乳的脂肪含量。从乳中分离脂肪球，即所谓的脱脂，通常基于球和液体之间存在的体积重量差异(密度)。两种脱脂类型是常规公认的：所谓的自发脱脂，提供富含聚集脂肪球的层，于5-10℃下实施操作，持续10-16小时；和离心脱脂，其中将全乳在许多圆锥盘中以约4000-5000rpm进行离心旋转，以便连续分离乳脂和脱脂乳。按照本发明特别优选的实施方案，原乳的脂肪含量被降低至少于0.1wt％的水平，优选少于0.075wt％。微孔过滤前降低乳的脂肪含量能显著提高方法效率，因为乳中通常存在的脂肪球可以对过滤过程有不利影响，例如滤器堵塞、降低通量。
脱脂后，pH超过5.5的乳进行微孔过滤(MF)。本文中术语“微孔过滤”应当理解为具有其过滤方法的通常含义，其涉及通过多微孔膜，除了所保留的分子大小的方面之外，与超滤和纳米过滤无本质上差异。微孔过滤是压力驱动的分离过程，其利用给定孔径的膜、根据溶液或者悬浮液中组分的大小差异来将其分离。尽管可以通过使用非膜或者深度滤器去除较大颗粒，但是只有具有精确规定的孔径的膜滤器才能确保定量保留。
按照本发明，使用了平均孔径范围为0.01-1.0μm的多微孔膜。孔径(或者孔直径)是孔的直径的测量。特别优选使用平均孔径为0.1-0.45μm的多微孔膜。孔径范围可以是正态分布的且展布很窄(例如最大与最小的比可以小于2)。对于大的展布和不均一性，与窄孔径分布的膜相比，这样的孔径更不易于预测流速。优选这样的分布孔径，使孔径的标准偏差少于平均孔径的20％。在其它的优选实施方案中，孔径的标准偏差少于平均孔径的15％、10％、5％或2％。测定MF多微孔膜的孔径特征的方法是本领域技术人员已知的。
可以(商业)获得包括微筛在内的不同类型的MF膜，所述MF膜由陶瓷材料、半导体材料或者聚合物材料制成，包括例如氧化铝、氧化锆、氧化钛或其混合物，氮化硅或者其它基于硅的化合物或其混合物，聚砜、含氟聚合物、纤维素、聚烯烃树脂和聚醚砜。本发明的多孔膜优选为陶瓷膜。不希望受任何理论的限制，本发明人认为陶瓷膜在坚固性、寿命、经济上、CIP和小的孔径分布方面提供超过聚合物膜的优势。适用于本方法的陶瓷微孔过滤膜的优选实例包括Membralox陶瓷膜，其由多孔氧化铝支持物和氧化铝、氧化锆或二氧化钛的过滤层组成。
本发明并不特别限制MF过滤模式和/或滤器单元的布局。基本上公认两种不同过滤模式：即直接流过滤(DFF)，也称为“终端”过滤，其中进料流垂直施加在膜面，试图使100％的液体通过膜；和切向流过滤(TFF)，也称为交叉流过滤，其中进料流平行流经膜，一部分通过膜(透过物)，同时剩余部分(保留物)重新循环回进料贮存室。可以用于这些过滤模式之一的本领域已知的不同滤器单元的实例包括中空纤维单元、螺旋缠绕单元、管状单元和平板单元。
根据需要，可以改变微孔过滤时施加的条件，以提高总S-IgA收率和/或优化过程时间和/或效率。在本发明的典型方法中，以10-100l/m2小时的流量过滤脱脂乳，优选10-60l/m2小时，最优选20-50l/m2小时以及特别是30-35l/m2小时。MF过程通常涉及滤器前的入口压力，其范围为1-6bar，优选为2-4.5bar并且特别为3-4bar。出口压力通常为0.5-5bar，优选为1-3.5bar。优选地，施加的压力导致范围为1.5-5bar，更优选为2-4.5bar，最优选为3-4bar的跨膜压。对于MF过程，温度通常保持在10-55℃的范围，优选在15-40℃的范围，最优选在20-35℃的范围，并且特别在25-30℃的范围。本发明人认为这些温度提供了通量、S-IgA透过和分子免疫球蛋白稳定性之间最佳的折中方案。
按照本发明，微孔过滤产生含S-IgA的透过物和富含酪蛋白的保留物。正如本领域技术人员应当理解的，这表示保留物含有大部分的乳的酪蛋白并且透过物含有大部分的包括乳的免疫球蛋白在内的乳的乳清蛋白。因此，以干燥固体重量为准，透过物S-IgA含量高于原乳S-IgA含量。
按照本发明，随后将微孔过滤透过物浓缩。本文背景中使用的术语“浓缩”表示从透过物组分去除大量的水，包括单糖、二糖和其它小的乳组分的任何过程。可以应用本领域技术人员已知的任何过程，但是按照某些实施方案，其不应涉及超过55℃的温度，优选为10-15℃。
在本发明的特别优选实施方案中，提供了按照上文定义的过程，其中通过使微孔过滤透过物进行超滤来对其进行浓缩。超滤(UF)是膜过滤，其中流体静力压迫使液体压迫半透过性膜。保留了悬浮固体和高分子量溶质，同时水和低分子量溶质通过膜。除了所保留的分子大小的方面外，超滤与微孔过滤或者纳米过滤无本质上区别。
按照本发明，可以使用过滤截留值范围为1-100kDa的多孔膜。“分子量截留值”(“MWCO”)以其通常含义使用，表示多微孔膜保留溶液中给定百分比的一定分子量的分子的能力(通常90％保留)。特别优选使用膜分子量截留值范围为10-100kDa的膜，最优选范围为50-100kDa的膜。
可以(商业)获得不同类型的UF膜，所述UF膜由陶瓷材料、半导体材料或者聚合物材料制成，包括例如氧化铝、氧化锆、氧化钛或其混合物，氮化硅或者其它基于硅的化合物或其混合物，聚砜、含氟聚合物、纤维素、聚烯烃树脂和聚醚砜。本发明的多孔UF膜优选为聚合物多孔膜，但是本发明也考虑到使用陶瓷膜。本发明并不特别限制UF过滤模式和/或滤器单元的布局。直接流过滤(DFF)模式和切向流过滤(TFF)模式都可适用于本发明的目的。可以用于这些过滤模式之一的本领域已知的不同滤器单元的实例包括中空纤维单元、螺旋缠绕单元、管状单元和平板单元。
本领域技术人员应当理解，超滤中应用的条件取决于很多变量。本领域技术人员在具体情况下可以进行并优化该过程。在本发明的典型过程中，以1-50l/m2小时的通量过滤微孔过滤透过物，优选为2.5-40l/m2小时并特别为5-30l/m2小时。UF过程通常涉及滤器前的入口压力，其范围为1-6bar。出口压力通常为0.5-5bar。优选地，施加的压力导致范围为1.5-6bar的跨膜压。对于UF过程，温度通常保持在10-40℃的范围，优选为10-25℃的范围。
超滤操作产生作为保留物的富含S-IgA的乳组分和含S-IgA很少的透过物，该透过物主要包含盐和小的有机分子。
通常，以干燥固体重量为准，获得的UF保留物含有30-90wt％，优选40-85wt％的量的蛋白。所述蛋白包括目的免疫球蛋白与其它乳蛋白的组合，所述其它乳蛋白主要为乳清蛋白，微量的单糖、二糖和其它小的乳组分。根据所用的膜，可以优化UF步骤以从含有S-IgA的UF保留物中去除分子量低于10kDa，优选分子量低于50kDa，最优选分子量低于100kDa的乳清蛋白组分(以及其他蛋白)。为了该目的，优选使用MWCO范围分别为5-15kD或者40-60kDa或者80-120kDa的UF膜。较小的有机分子以及无机分子也能透过UF膜。因此，UF浓缩步骤也能去除大量诸如乳中含有的盐、单糖和二糖的物质组分。
按照本发明的优选实施方案，提供了按照上文定义的过程，所述过程包括一个或者多个渗滤循环，其中将微孔过滤保留物与渗滤液合并，将所述微孔过滤保留物与渗滤液的合并物进行随后的微孔过滤和浓缩步骤。有几种实施渗滤的方式。在连续渗滤中，将渗滤液加入MF样品进料贮存室，优选以与过滤液生成相同的速率进行添加。在不连续渗滤中，先将溶液稀释并随后浓缩回初始体积。然后，重复该过程，直到从MF进料中获得所需收率的S-IgA。在本方法中，优选使用连续渗滤操作模式。在本方法中，伴随每个渗滤体积或者渗滤循环，提取部分的初始包含在MF样品进料贮存室中的S-IgA。本文将“渗滤体积(diafiltration volume)”(或“渗滤体积(diavolume)”)定义为与MF保留物的量相比的回收的过滤液的体积。当去除的过滤液体积与渗滤操作开始时的保留物体积相等时，处理了1渗滤体积。因此，术语“渗滤循环”是指从MF样品进料贮存室中处理，即去除或收集，1渗滤体积。通常，将从所有渗滤循环和/或完整渗滤体积获得的S-IgA MF透过物组分共同进行上游的浓缩步骤。
按照本发明，适于用作渗滤液的液体包括水和水性溶液。优选地，渗滤液为水或者乳的水性组分。按照本发明的特别优选实施方案，渗滤液是超滤透过物。
按照本发明的优选实施方案，提供了按照上文定义的过程，所述过程包括至少6个渗滤循环，表示除最初的MF透过物体积之外，收集了渗滤开始时的MF保留物体积的6倍的MF透过物体积。更优选地，提供的按照上文定义的过程包括至少6、8、10或12个渗滤循环，仍然更优选地至少13或14个渗滤循环，最优选地至少15个渗滤循环。基于实践的原因，本过程中的渗滤循环数不超过30，优选不超过20。
术语“体积浓缩因子”(VCF)描述初始进料体积与保留物体积的比。例如，如果处理20L原料直到18L已通过达到过滤液并且2L留在保留物中，则已进行了10倍浓缩，因此体积浓缩因子为10。优选地，微孔过滤步骤时VCF的范围为1.5-8，更优选的范围为2-6，最优选的范围为2.5-4。超滤步骤时VCF的范围通常为10-30，最优选的范围为15-25。
在其他的优选实施方案中，提供按照上文定义的过程，其中在为了去除单糖和二糖以及其它小的乳组分而将MF透过物进行UF步骤时，用水或水性溶液，优选用无菌水稀释所述MF透过物。当本方法如上文所述使用超滤透过物作为渗滤液时，这是特别感兴趣的。通常，在VCF为10-30的初始UF浓缩后，将水以保留物体积的40-60％的体积添加到UF样品进料贮存室中。
当完成本发明的渗滤过程时，将包含在UF样品进料贮存室中的富含S-IgA的组分进行其他下游处理，例如，为了去除水和/或进一步纯化S-IgA。
在本发明的优选方面中，提供按照上文定义的过程，其中收集了最终渗滤操作后获得的富含S-IgA的组分，随后例如通过使用真空蒸发仪将水从所述组分去除和/或将所述组分进行随后的过滤步骤用于降低其微生物含量和/或将所述组分进行喷雾干燥、冷冻干燥或者作为用于S-IgA纯化的层析处理的进料。
通常实施上文提及的后续的过滤步骤，从而减少富含S-IgA的组分的细菌承载，这对于首次微孔过滤步骤未将所述细菌承载减少到足够的程度和/或因为在随后的操作中，例如在系统的“被污染的”部分中可能引入新的微生物污染的情况是理想的。优选地，该步骤包括使用多微孔膜的终端型过滤，所述多微孔膜的平均孔径为0.05-0.5μm，更优选为0.1-0.3μm。
喷雾干燥是指涉及将液体混合物散成小滴(雾化)并且在喷雾干燥装置中迅速从所述混合物中去除溶剂的任何方法，在所述喷雾干燥装置中存在强驱动力用于从滴中蒸发溶剂。通过将富含S-IgA的UF保留物喷雾到温度为100-200℃、优选为125-175℃的空气中可以合适地完成本发明的喷雾干燥适宜。
“冷冻干燥”或者“冻干法”是任何冷干燥的方法，其涉及将UF保留物液体冷冻，随后通过升华作用将水去除或蒸发。
S-IgA的进一步纯化通常涉及离子交换、疏水相互作用、混合模式、亲和层析和/或尺寸排阻层析或任意其它已知的层析法，所有上述方法在免疫球蛋白纯化的领域都是普遍使用的。在本发明的特别优选实施方案中，提供了上文所述的过程，其包括将富含S-IgA的组分进行亲和层析纯化的额外步骤。在亲和层析中，基于蛋白与配体的可逆相互作用来分离蛋白。本发明的亲和层析过程通常是基于免疫球蛋白或者更具体而言(S-)IgA与配体之间的特异性相互作用。将所述配体连接在层析介质上。可以使用对以下区具有高亲和力的配体：轻链即κ或λ链，重链即α链，分泌组分或J链，或两个或更多个区或区的特定部分的组合，例如，重链和分泌组分，重链和J链，重链、分泌组分和J链。这样的配体的合适实例包括，基于来源于哺乳动物、鸟类或其他物种来源的抗体或抗体片段的天然配体或者组织培养配体，例如单克隆、Fab部分、单链可变结构域部分或者本领域已知的任何其他配体。在上述的描述后可以进行另外的纯化，如果已知富含S-IgA的组分含有针对特定抗原的抗体，例如，如果乳获自针对特定抗原进行免疫的动物并且目的是专门获得高纯度的这些抗体，则所述特定抗原可以用作亲和纯化(S-)IgA的配体。按照本发明，任选地在诸如浓缩的适当的预处理操作之后，在利于(S-)IgA与配体特异性结合的条件下，将UF保留物组分施加于层析柱。(S-)IgA配体结合是特异性的并且是可逆的，未结合的材料通过柱洗出。通过将条件改变为利于靶(S-)IgA的洗脱来回收靶(S-)IgA，或者特异性地利用竞争性配体或者非特异性地通过改变pH、离子强度或极性。随后以纯化、浓缩形式收集(S-)IgA。
本发明另一方面涉及在上述描述的方法中用作原乳的乳。按照优选实施方案，如上文所述，所述乳获自家畜。在本发明的特别优选方面中，提供了上文定义的方法，其中所述乳是从初乳阶段后的家畜收获的成熟乳、优选为选自初乳阶段后的牛和羊的家畜收获的成熟乳。术语“成熟乳”和“非初乳”在本文可以替换使用，是指初乳阶段后分泌的乳，所述初乳阶段包括分娩后的最初4-7天。正常的成熟乳与初乳区别在于成熟乳含有较低量的蛋白，其中包括抗体，并且成熟乳的成分通常持续高达300天保持不变。
在本发明的特别优选实施方案中，所述乳获自用一种或者多种抗原免疫过的，为了诱导对于所述抗原特异性的S-IgA分泌进乳中的动物。通常，按这种方式产生的成熟乳含有抗原特异性的S-IgA，其量至少为0.5μg/ml，更优选为至少15μg/ml，最优选为至少50μg/ml。US6,974,573和相关专利US 7,074,454中描述了免疫家畜获得含有高抗原特异性滴度的S-IgA的非初乳的乳。在本发明的特别优选方面中，提供了上文所述的方法，其中免疫动物包括通过粘膜或者气道给予所述动物包含所述一种或者多种抗原的第一组合物，从而使动物超免疫，并且随后将包含所述一种或者多种抗原的第二组合物给予所述动物的乳腺或者乳腺上淋巴结。US 6,974,573描述了该免疫方法，特别引用该公开的公开用于本方法的详细解释和优选实施方案。
尽管本发明不被限制于任何特定的抗原和/或抗原特异性抗体，但是特别感兴趣的抗原包括来源于梭菌(Clostridium spp)、葡萄球菌(Staphylococcus spp)、链球菌(Streptococcus spp)、螺杆菌(Helicobacter spp)、埃希氏菌(Escherichia spp)、弯曲杆菌(Campylobacter spp)、沙门氏菌(Salmonella spp)、霍乱弧菌(Cholera spp)、莫拉克斯氏菌(Moraxella spp)、嗜血杆菌(Heamophilus spp)、病毒(例如轮状病毒、诺瓦克病毒)、寄生虫(例如蓝氏贾第鞭毛虫(Gardia lambria))、酵母(例如假丝酵母(Candida spp))和霉菌的那些抗原。按照本发明，目的抗原可以例如包括来源于目的微生物、优选来源于一种或多种上文提到的微生物的细胞组分、毒素、毒力因子、粘附因子、定殖因子、酶、肽、荚膜/膜结合多糖，以及来源于病毒，优选来源于上文提到的那些病毒的外膜蛋白和毒力因子。
本发明的另一个实施方案涉及上文描述的方法，其中乳获自未经受活性(超)免疫的家畜。
本发明的另一方面涉及可通过上述描述方法获得的产物。本领域技术人员应当理解，这些产物通常为干粉形式和/或浓缩液形式并且通常含有的S-IgA的量占总干重的至少0.02wt％，优选至少为0.10wt％并且最优选至少0.25wt％。除免疫球蛋白和其它乳来源的固体外，本发明产物可以含有大量的水或其它载体材料。在微孔过滤和浓缩后、不进行任何其他纯化步骤(或进行任何其他纯化步骤之前)所获得的产物通常含有占干重高达5wt％的S-IgA。本领域技术人员应当理解，在本发明的微孔过滤和浓缩步骤之后进行的其他纯化步骤，尤其是上文描述的亲和层析方法可以使产物含有高达100wt％的S-IgA。
上文描述的产物非常适于合并到各种健康保持和/或改善的产品中，尤其是合并到药品、美容产品和/或食品产品中，用于预防和/或治疗有需要的个体中粘膜和/或皮肤的感染和/或炎症。所述个体可以是人也可以是动物。在优选实施方案中，所述个体是人。按照本发明的这些产品的优选实例包括诸如片剂、胶囊剂、粉剂和丸剂的固体药物口服剂型，以及通常用于口服或局部给药或注射的半固体或液体剂型，例如溶液、悬液、乳膏、软膏和气溶胶制剂。在一个实施方案中，所述产品是肠配方，特别是婴儿配方；临床营养；功能食品和/或保健食品。本文使用的术语“保健食品”和“功能食品”是指这样的食品和饮料，其作为正常饮食的部分被摄取并且在基本营养功能以上，表现出具有生理益处和/或降低慢性病的风险。在另一个实施方案中，所述产品是用于皮肤的治疗或美容组合物，例如乳膏、洗液或软膏。在另一个实施方案中，提供的产品用于给予下呼吸道，例如气溶胶制剂，或给予上呼吸道，例如口服液。在另一个实施方案中，提供了用于给予口腔和/或鼻腔的粘膜的组合物，例如溶液、悬液或软膏。在本发明的另一个实施方案中，提供了用于给予泌尿生殖道的组合物，例如乳膏、洗液或其它液体形式。
因此，本发明的其它方面涉及包含通过上文所述的方法获得的产物的产品和通过上文所述的方法获得的产物在制备任何所述产品中的用途，所述产品选自片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、溶液、悬液、液体或固体食品、饮料、洗液、乳膏、软膏和气溶胶制剂。所述产品可以用于一般保健并且通常用于治疗和/或预防诸如胃肠道、泌尿生殖道、呼吸道、鼻腔或口腔的粘膜表面的感染和/或炎症、治疗和/或预防肥胖症及相关疾病、治疗和/或预防食物过敏症中的一种或多种。
实施例
实施例1
从3只荷斯坦牛(Holstein-Friesian)中收集了含有靶向针对艰难梭菌及其毒素(毒素A和毒素B)的特异性免疫球蛋白的原乳。乳挤出后，不进行冷却而是直接加热到40℃。将40℃的原乳在处理能力为125L/h的ClairMilky离心机上进行处理，从而从乳中分离乳脂。将获得的脱脂乳(40L)置于微过滤试验设备的系统箱中。配备了7个梯度孔隙率EP3730Membralox 0.1μm滤器、总过滤面积为2.52m2的TetraPak MSF-7试验设备被用于分离乳清蛋白和酪蛋白。所述过程中乳的温度保持在25-30℃。
用分子量截留为50kDa、滤器面积为2.0m2的滤器完成超滤。该过程的透过物被用作微孔过滤的渗滤液。在室温进行超滤，并且按照以下方式控制通量：使得产生足够的渗滤液来进行微孔过滤中的渗滤。因此，超滤中的通量约为40L/m2小时。
在实验开始时，用水运行试验设备。使用梯度孔隙率滤器单元确保整个膜面积上均等的跨膜压。以滤器前的入口压为3.75bar并且滤器后的出口压为2.55bar进行本实验。这导致跨膜压为3.15bar以及压力下降为1.2bar。在实验进程中，压力未明显改变。透过物流和保留物流被引入系统箱中。稳定10分钟后，其中脱脂乳与存在于试验设备的死区体积中的水(15L)混合，透过物流被引入收集容器中并且收集10L体积的透过物。每收集10L后，获取透过物和保留物的样品进行分析。40L透过物后，试验设备的系统箱已空并且脱脂的乳浓缩物占据试验设备的死区体积。此时，将10L超滤透过物加到系统箱中。重复该步骤直到在300L透过物时终止实验。
在300L透过物时，已对乳有效进行17.3次渗滤，最初40L透过物是乳的浓缩。脱脂乳的浓缩因子在浓缩阶段为0.73-2.67并且在渗滤中为1.60-2.67。在300L透过物时，透过物中总S-IgA、艰难梭菌毒素A特异性S-IgA和艰难梭菌毒素A特异性IgG的百分比分别为96.6％、97.1％和105.4％。正如所预想的，总S-IgA和艰难梭菌毒素A特异性S-IgA具有相似的透过曲线。然而，这些曲线慢于艰难梭菌毒素A特异性IgG。在140L透过物时，即6.7次渗滤时，IgG水平已经达到97％。S-IgA需要再多约10次渗滤才能达到相同水平。IgG(由两条轻链和两条重链组成)、S-IgA(具有另外的J链和分泌组分的二聚体)和IgM(结合了J链的五聚体结构)的分子量分别为180kDa、435kDa和900kDa。S-IgA和IgG结构不同，其中IgG被认为是球蛋白，而S-IgA以及其Fc部分上的尾-尾构型更像是马笼头样(halter-like)形状。该形状和大小的差异很可能在需要从乳中过滤以高收率S-IgA的渗滤的差异中起作用。具有提及的参数(25-30℃、Pi 3.75bar、Po 2.55bar)的微孔过滤膜上的通量是30-35L/m2小时。
在图2A、2B和2C中，可分别见到总S-IgA、艰难梭菌毒素A特异性S-IgA和IgG的透过。在表1中，给出了回收IgG和S-IgA所进行的渗滤循环数的差异。
表1.S-IgA和IgG的回收的比较。透过物百分比表示为初始存在于原乳中的量的百分比。
  透过物百分比％   渗滤数   透过物体积(L)
  S-IgA   ＞75％   ＞16   ＞280L
  IgG   ＞95％   6   130L
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅为举例说明的目的，并且根据本文实施例和实施方案所做出的各种修改或改变对于本领域技术人员是显而易见的，并且将包括在本申请的实质和范围以及所附权利要求的范围内。对于所有目的，将文中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用的方式并入本文。

Claims (14)

1.产生富含分泌型IgA(S-IgA)的乳组分的方法，所述方法包括：
通过在低于55℃的温度下从乳中分离脂肪而将一定量的pH超过5.5的原乳的脂肪含量降低到低于0.5wt％的值；
使用平均孔径范围为0.1-0.45μm的多孔膜将所述pH超过5.5的低脂肪乳进行微孔过滤，产生含有S-IgA的透过物和富含酪蛋白的保留物；以及
通过超滤并利用至少16个渗滤循环的超滤透过物来浓缩所述微孔过滤透过物，产生富含S-IgA的乳组分。
2.如权利要求1所述的方法，其中在微孔过滤中所述乳的pH范围为6-7.5。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中通过使用滤器截留值为1-100kDa的多孔膜将所述微孔过滤透过物进行超滤来浓缩所述微孔过滤透过物，产生作为保留物的富含S-IgA的乳组分和S-IgA含量低的透过物。
4.如权利要求3所述的方法，其中用来浓缩所述微孔过滤透过物的多孔膜的滤器截留值为50-100kDa。
5.如权利要求3所述的方法，其中在包括所述渗滤循环的方法中，所述微孔过滤保留物与渗滤液合并，并且将微孔过滤保留物和渗滤液的合并物进行随后的微孔过滤和浓缩步骤。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中使用陶瓷膜进行微孔过滤并且使用聚合物膜进行超滤。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法不包括任何在高于60℃的温度下持续超过2分钟的步骤或者操作。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中收集了最终渗滤操作之后获得的超滤保留物并且进行喷雾干燥、冷冻干燥或者作为用于S-IgA纯化的层析处理的进料。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中所述乳是从初乳阶段后的家畜收获的成熟乳。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述家畜选自牛和羊。
11.如权利要求9所述的方法，其中用一种或者多种抗原免疫所述家畜，从而诱导对于所述抗原特异性的S-IgA分泌入乳中。
12.如权利要求11所述的方法，其中免疫动物包括通过粘膜或者气道给予动物包含所述一种或者多种抗原的第一组合物，从而使动物超免疫，并且随后将包含所述一种或者多种抗原的第二组合物给予所述动物的乳腺或者乳腺上淋巴结。
13.可通过前述权利要求中任一项所述的方法获得的产物，其中所述产物为富含S-IgA的组分。
14.包含权利要求13所述的产物的组合物，所述组合物选自药品、食品和美容产品。
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