CN102094049B - 利用细胞工程法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的工业化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用细胞工程法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的工业化方法。该方法以离体器官为原始材料，诱导咖啡豆离体器官形成愈伤组织，愈伤组织继代培养后，经过筛选高产悬浮单细胞系，分离咖啡豆细胞，获得2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸。诱导咖啡豆离体器官形成愈伤组织是经消毒处理的咖啡豆在诱导愈伤组织的培养基中，控制温度25～30℃，pH值5-6，暗或弱光培养3-6周，离体器官形成愈伤组织；所述诱导愈伤组织的培养基是在MS基础培养基中添加维生素，生长素和细胞分裂素；2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸对蔗糖及其它甜味剂均有甜味抑制的作用。
Description
技术领域
本发明属于食品科学领域，具体涉及一种利用细胞工程法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的方法。
背景技术
甜味抑制剂是通过阻塞甜度和味觉的受体，从而控制或降低含糖食品的甜度的一类新型添加剂。国内很多传统食品，如蜜饯、月饼、巧克力等，都是以蔗糖作为防腐剂的，在达到防腐的同时，不同程度的存在着过甜的问题。而使用了甜味抑制剂后，既能发挥蔗糖的防腐、改善质构等功能，又不会使食品过甜而影响口感。因此甜味抑制剂的应用前景十分广泛。
2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸是一种对蔗糖及其它甜味剂都有效的甜味抑制剂，其天然存在于咖啡豆中，属天然等同香料。国际食品香料工业组织（IOFI）指出2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸及其钠盐具有相同的性质，是一种安全的、可以在食品工业生产中添加食用添加剂，其添加量为50-150mg/L。目前，生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的主要作物为咖啡豆，但天然咖啡豆中的2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸含量仅为0.55~1.2mg/kg。植物提取法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸受季节气候等条件的影响，产量较低，使其在食品工业中的应用受到了限制。此外，化学合成法也用于生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸，但合成过程易产生副产物及化学异构体。
咖啡树属茜草科的常绿乔木，属是国际市场上重要的农产品之一。咖啡的种植主要集中在非洲和印度尼西亚及中南美洲，正常种植的咖啡树一般3~5年才开始产果。咖啡干豆含有40~50%的多糖类、粗蛋白、有机酸、生物碱和丰富的矿物元素。目前，在我国咖啡豆主要依靠进口获得，尽管近年来世界咖啡豆产量持续增，但相对于日益增长的消费需求仍显不足。关于咖啡豆的细胞组织培养很早就引起了人们的重视，咖啡各种器官和外植体在广泛的培养基上都能有效诱导产生愈伤组织。在所用培养基中，采用加入细胞分裂素和生长素的MS培养基能使大多数外植体愈伤组织发育最好。目前，咖啡豆细胞培养主要集中在生产咖啡芳香剂和研究咖啡因、绿原酸合成等，关于通过咖啡豆细胞悬浮培养生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸没有报道。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术存在的上述缺陷，提供一种利用植物细胞培养技术，通过咖啡豆细胞悬浮培养法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的方法，具有生产周期短，产率高，成本低等特点。
本发明具体的技术方案如下：
一种利用咖啡豆细胞生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的方法，包括以下步骤：
（1）诱导咖啡豆离体器官形成愈伤组织：经消毒处理的咖啡豆在诱导愈伤组织的培养基中，控制温度25~30℃，pH值5-6，暗或弱光培养3-6周，离体器官形成愈伤组织；所述诱导愈伤组织的培养基是在MS基础培养基中添加维生素，生长素和细胞分裂素；以在改良MS培养基中的浓度计，其中维生素添加量为：10~15mmol/L泛酸钙、0.5~0.6mmol/L肌醇、8.0~8.5μmol/L烟酸、3.0μmol/L盐酸硫胺素、5.0μmol/L盐酸吡哆醇和0.04mmol/L生物素；所述生长素添加量为1~12μmol/L，采用2,4-二氯苯氧乙酸（简称2,4-D），萘乙酸（简称NAA）或吲哚乙酸（简称IAA）；所述细胞分裂素添加量为0.4~0.5μmol/L，采用6-呋喃甲基腺嘌呤（简称KT）、6-苄基腺嘌呤（简称6-BA）和玉米素（zeatin）中的一种；
（2）愈伤组织的继代培养；优选生长良好，祛除发黄生长不良的愈伤组织进行继代培养，继代培养所用培养基同步骤（1）的诱导愈伤组织的培养基，培养温度25~30℃，暗培或间歇光照培养2~3周，更换新鲜培养基1~3次；
（3）筛选高产悬浮单细胞系；优选生长良好，颗粒状的愈伤组织放入内含液体培养基中，转速为100-120r/min，温度为25-30℃条件下，暗培养6-10天，培养出悬浮单细胞系，将悬浮单细胞系再接种于平板固体培养基上，25~30℃，暗培养18-22天，形成新的细胞团，筛选高速增殖的细胞团作为高产悬浮单细胞系；所述液体培养基是在步骤（1）的诱导愈伤组织的培养基中添加0.2~0.8mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和0.05~0.2mg/L 6-呋喃甲基腺嘌呤；所述平板固体培养基的组成与步骤（1）的诱导愈伤组织的培养基相同；
（4）高产悬浮细胞系的悬浮培养；将筛选出的高产悬浮细胞系按照300~1000mg/100mL的密度接种于悬浮细胞培养基中，培养条件为25~30℃，摇床120±5r/min，黑暗培养12-14d；所述悬浮细胞培养基是在步骤（1）的诱导愈伤组织的培养基中添加0.2~0.8mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和0.05~0.2mg/L 6-呋喃甲基腺嘌呤；收获咖啡豆细胞；
（5）分离咖啡豆细胞，获得2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸。
为进一步实现本发明目的，其中步骤（1）中，所述的离体器官是离体器官指咖啡豆果皮切段或者咖啡豆种子的胚的子叶切段。
其中步骤（4）悬浮培养的条件为：所述收获咖啡豆细胞是采用微孔过滤或者离心的方法收获。
其中步骤（5）分离咖啡豆细胞的方法是：将咖啡豆细胞破碎后用二氯甲烷萃取，将萃取液30~40℃真空蒸发干燥；残余液溶入乙醚后，采用过色谱柱，收集含有2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的部分，丙酮萃取，丙酮相萃取液真空蒸发干燥，收集干燥产物得到含有2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的粗产品，粗产品在酸性条件下重结晶得到终产品。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
（1）生产周期短，不受地区、气候条件的影响；
（2）生产成本低，提取工艺简单；
（3）咖啡豆细胞中的2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸钠得率高达1%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
（1）诱导咖啡豆离体器官形成愈伤组织：咖啡豆果皮切段，作为离体器官，用次氯酸钙进行消毒处理。配制诱导愈伤组织的培养基（即改良MS培养基）：在MS基础培养基中（以在培养基中的浓度计，组成为（mg/L）：KNO31900，NH4NO31650，K2HPO4170，MgSO4·7H2O 370，CaCl2·2H2O 440，KI 0.83，H3BO36.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O8.6，NaMoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，Na2·EDTA 37.3，FeSO4·7H2O 27.8，蔗糖20000），添加维生素，生长素和细胞分裂素；以在改良MS培养基中的浓度计，其中维生素添加量为：10mmol/L泛酸钙，0.5mmol肌醇，8.0μmol/L烟酸，3.0μmol/L盐酸硫胺素，5.0μmol/L盐酸吡哆醇和0.04mmol/L生物素；生长素采用1μmol/L 2,4-二氯苯氧乙酸；细胞分裂素为0.4μmol/L 6-呋喃甲基腺嘌呤。将消毒后的咖啡豆离体器官接种于上述诱导愈伤组织的培养基中，温度为25℃，pH值5，暗光培养3周出现愈伤组织；
（2）愈伤组织继代培养：在步骤（1）中获得的愈伤组织，优选生长良好，祛除发黄生长不良的愈伤组织，转移到与步骤（1）相同的培养基（即诱导愈伤组织的培养基）中进行继代培养，采用暗培，培养时间为2周，期间更换新鲜培养基1次；
（3）高产悬浮单细胞系的筛选：在步骤（2）中继代培养的愈伤组织，优选生长良好，颗粒状的愈伤组织放入内含40mL液体培养基的125mL摇瓶内，液体培养基配方与愈伤组织培养基相同，温度为25℃，120r/min暗培养6天，培养出悬浮单细胞系；将悬浮单细胞系再接种于平板固体培养基上，25℃条件下，避光培养18天，形成新的细胞团，筛选高速增殖的细胞团作为高产悬浮单细胞系；
（4）愈伤组织悬浮培养：用经过3次继代培养后的愈伤组织，筛选出高产的悬浮单细胞系，按照300mg/100mL的密度接种于悬浮细胞培养基中，进行悬浮培养；悬浮细胞培养基是由改良MS培养基中添加0.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和0.05mg/L 6-呋喃甲基腺嘌呤；培养条件为25℃，摇床120±10r/min，黑暗培养12d，采用离心的方法收获咖啡豆细胞，细胞生长可达接种时的19倍；
（5）分离细胞，获得2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸：将收获的咖啡豆细胞破碎后用二氯甲烷萃取，将萃取液在40℃真空蒸发干燥，残余液加入乙醚（乙醚与残余液的用量体积比为1：1）后，采用色谱柱过滤，收集含有2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的部分，丙酮萃取，萃取液真空蒸发干燥，合并上述两干燥产物得到含有2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的粗产品，粗产品在pH=1~3的酸性环境下重结晶，即可得到所需终产品。
实施例2
（1）诱导咖啡豆离体器官形成愈伤组织：咖啡豆种子的胚的子叶切段作为离体器官，次氯酸钙和次氯酸钠进行消毒处理；配制诱导愈伤组织的培养基（即改良MS培养基）：在MS基础培养基中（以在培养基中的浓度计，组成为（mg/L）：KNO31900，NH4NO31650，K2HPO4170，MgSO4·7H2O 370，CaCl2·2H2O 440，KI 0.83，H3BO36.2，MnSO4·4H2O22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，NaMoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，Na2·EDTA 37.3，FeSO4·7H2O 27.8，蔗糖50000），添加维生素，生长素和细胞分裂素；以在改良MS培养基中的浓度计，其中维生素添加量为：12.5mmol/L泛酸钙，0.55mmol肌醇，8.25μmol/L烟酸，3.0μmol/L盐酸硫胺素，5.0μmol/L盐酸吡哆醇，0.04mmol/L生物素；生长素添加量为1μmol/L萘乙酸；细胞分裂素添加量为0.4μmol/L6-苄基腺嘌呤。将消毒后的咖啡豆离体器官接种于上述愈伤组织培养基中，温度为28℃，pH值5.5，弱光培养4.5周出现愈伤组织；
（2）愈伤组织继代培养：在步骤（1）中获得的愈伤组织，优选生长良好，祛除发黄生长不良的愈伤组织，转移到上述相同的改良MS培养基中进行继代培养，培养采用间歇光照，培养时间为3周，期间更换新鲜培养基2次；
（3）高产悬浮单细胞系的筛选：在步骤（2）中继代培养的愈伤组织，优选生长良好，颗粒状的愈伤组织放入内含40mL液体培养基的125mL摇瓶内，液体培养基配方与改良MS培养基相同，温度为28℃，120r/min暗培养8天，培养出悬浮单细胞系；将悬浮单细胞系再接种于平板固体培养基上，在28℃条件下，避光培养20天，形成新的细胞团，筛选高速增殖的细胞团作为高产悬浮单细胞系；
（4）愈伤组织悬浮培养：用经过3-4次继代培养后的愈伤组织，筛选出高产的悬浮单细胞系，按照600mg/100mL的密度接种于悬浮细胞培养基中，进行悬浮培养；悬浮细胞培养基是由改良MS培养基添加0.5mgL萘乙酸和0.12mg/L6-苄基腺嘌呤；培养条件为28℃，摇床120±10r/min，间歇光照培养13d，采用离心的方法收获咖啡豆细胞，细胞生长可达接种时的20倍；
（5）分离细胞，获得2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸：将收获的咖啡豆细胞破碎后用二氯甲烷萃取，将萃取液在40℃真空蒸发干燥，残余液加入乙醚（乙醚与残余液的体积比为2:1）后，采用色谱柱过滤，收集含有2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的部分，丙酮萃取，萃取液真空蒸发干燥，合并上述两干燥产物得到含有2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的粗产品，粗产品在酸性环境下重结晶，即可得到所需终产品。
实施例3
（1）诱导咖啡豆离体器官形成愈伤组织：咖啡豆的果皮切段作为离体器官，用乙醇和氯化汞进行消毒处理；配制诱导愈伤组织的培养基（即改良MS培养基）：在MS基础培养基中（以在培养基中的浓度计，组成为（mg/L）：KNO31900，NH4NO31650，K2HPO4170，MgSO4·7H2O 370，CaCl2·2H2O 440，KI 0.83，H3BO36.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，NaMoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，Na2·EDTA 37.3，FeSO4·7H2O 27.8，蔗糖30000），添加维生素，生长素和细胞分裂素；以在改良MS培养基中的浓度计，其中维生素添加量为：15mmol/L泛酸钙，0.6mmol肌醇，8.5μmol/L烟酸，3.0μmol/L盐酸硫胺素，5.0μmol/L盐酸吡哆醇，0.04mmol/L生物素；生长素添加量为1μmol/L吲哚乙酸；细胞分裂素添加量为0.4μmol/L玉米素。将经过消毒处理的咖啡豆离体器官接种于上述愈伤组织培养基中，温度为30℃，pH值为6，暗光培养6周出现愈伤组织；
（2）愈伤组织继代培养：在步骤（1）中获得的愈伤组织，优选生长良好，祛除发黄生长不良的愈伤组织，转移到上述相同的改良MS培养基中进行继代培养，培养采用间歇光照，培养时间为3周，期间更换新鲜培养基3次；
（3）高产悬浮单细胞系的筛选：在步骤（2）中继代培养的愈伤组织，优选生长良好，颗粒状的愈伤组织放入内含40mL液体培养基的125mL摇瓶内，液体培养基配方与改良MS培养基相同，温度30℃，120r/min暗培养10天，培养出悬浮单细胞系；将悬浮单细胞系再接种于平板固体培养基上，在30℃条件下，避光培养22天，形成新的细胞团，筛选高速增殖的细胞团作为高产悬浮单细胞系；
（4）愈伤组织悬浮培养：用经过4次继代培养后的愈伤组织，筛选出高产的悬浮单细胞系，按照1000mg/100mL的密度接种于悬浮细胞培养基中，进行悬浮培养；悬浮细胞培养基是由改良MS培养基添加0.8mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和0.2mg/L 6-呋喃甲基腺嘌呤；培养条件为30℃，摇床120±10r/min，间歇光照培养13d，采用微孔过滤的方法收获咖啡豆细胞，细胞生长可达接种时的19.5倍；
（5）分离细胞，获得2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸：将收获的咖啡豆细胞破碎后用二氯甲烷萃取，将萃取液在40℃真空蒸发干燥，残余液加入乙醚（乙醚与残余液的体积比为1:2）后，采用色谱柱过滤，收集含有2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的部分，丙酮萃取，萃取液真空蒸发干燥，合并上述两干燥产物得到含有2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的粗产品，粗产品在酸性环境下重结晶，即可得到所需终产品。
Claims (4)
1.一种利用细胞工程法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的工业化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)诱导咖啡豆离体器官形成愈伤组织：经消毒处理的咖啡豆在诱导愈伤组织的培养基中，控制温度25～30℃，pH值5-6，暗或弱光培养3-6周，离体器官形成愈伤组织；所述诱导愈伤组织的培养基是在MS基础培养基中添加维生素，生长素和细胞分裂素；以在改良MS培养基中的浓度计，其中维生素添加量为：10～15mmol/L泛酸钙、0.5～0.6mmol/L肌醇、8.0～8.5μmol/L烟酸、3.0μmol/L盐酸硫胺素、5.0μmol/L盐酸吡哆醇和0.04mmol/L生物素；所述生长素添加量为1～12μmol/L，采用2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸或吲哚乙酸；所述细胞分裂素添加量为0.4～0.5μmol/L，采用6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤和玉米素中的一种；
(2)愈伤组织的继代培养；优选生长良好，祛除发黄生长不良的愈伤组织进行继代培养，继代培养所用培养基同步骤(1)的诱导愈伤组织的培养基，培养温度25～30℃，暗培或间歇光照培养2～3周，更换新鲜培养基1～3次；
(3)筛选高产悬浮单细胞系；优选生长良好，颗粒状的愈伤组织放入内含液体培养基中，转速为100-120r/min，温度为25-30℃条件下，暗培养6-10天，培养出悬浮单细胞系，将悬浮单细胞系再接种于平板固体培养基上，25～30℃，暗培养18-22天，形成新的细胞团，筛选高速增殖的细胞团作为高产悬浮单细胞系；所述液体培养基是在步骤(1)的诱导愈伤组织的培养基中添加0.2～0.8mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.05～0.2mg/L 6-呋喃甲基腺嘌呤；所述平板固体培养基的组成与步骤(1)的诱导愈伤组织的培养基相同；
(4)高产悬浮细胞系的悬浮培养；将筛选出的高产悬浮细胞系按照300～1000mg/100mL的密度接种于悬浮细胞培养基中，培养条件为25～30℃，摇床120±5r/min，黑暗培养12-14d；所述悬浮细胞培养基是在步骤(1)的诱导愈伤组织的培养基中添加0.2～0.8mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.05～0.2mg/L 6-呋喃甲基腺嘌呤；收获咖啡豆细胞；
(5)分离咖啡豆细胞，获得2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸。
2.根据权利要求1所述的利用细胞工程法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的工业化方法，其特征在于，其中步骤(1)中，所述的离体器官是咖啡豆果皮切段或者咖啡豆种子的胚的子叶切段。
3.根据权利要求1所述的利用细胞工程法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的工业化方法，其特征在于，其中步骤(4)悬浮培养的条件为：所述收获咖啡豆细胞是采用微孔过滤或者离心的方法收获。
4.根据权利要求1所述的利用细胞工程法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的工业化方法，其特征在于，其中步骤(5)分离咖啡豆细胞的方法是：将咖啡豆细胞破碎后用二氯甲烷萃取，将萃取液30～40℃真空蒸发干燥；残余液溶入乙醚后，采用过色谱柱，收集含有2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的部分，丙酮萃取，丙酮相萃取液真空蒸发干燥，收集干燥产物得到含有2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的粗产品，粗产品在酸性条件下重结晶得到终产品。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |