CN102093962B - 一种乳酸乳球菌诱变菌株及其培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种乳链菌肽的乳酸乳球菌诱变菌株及其培育方法，以Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC11454为出发菌株，通过硫酸二乙酯进行诱变处理，筛选获得乳链菌肽高产诱变菌株，其保藏号为CGMCC NO.3050。该菌株在玉米浆、糖醪、KH₂PO₄、NaCl配制成的发酵培养基中培养时，乳链菌肽的效价为5000-7000IU/mL，比野生菌提高3.94-5.51倍。在葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、NaCl、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O的化学试剂发酵培养基中培养时，乳链菌肽的效价为8000-11000IU/mL，比野生菌提高6.30-8.66倍。本发明的乳酸乳球菌新菌株经10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性。

Description

一种乳酸乳球菌诱变菌株及其培育方法

技术领域

本发明公开一种乳酸乳球菌诱变菌株，为一种新的菌株品种，本发明还提供了该菌株的培育方法，属于微生物技术领域。 

背景技术

乳链菌肽是由乳酸乳球菌(lactococcus lactis)产生的一种小分子多肽物质，对许多革兰氏阳性菌，包括葡萄球菌、链球菌、微球菌、分枝杆菌、利斯特氏菌和乳杆菌等有强烈的抑制作用。乳链菌肽作为一种高效、天然、无毒的食品防腐剂，已经广泛应用于肉类、鱼类、牛奶、干酪、蛋类、水果、蔬菜、果汁饮料、啤酒酿造和豆制品等食品的防腐处理。随着应用研究的深入，乳链菌肽应用范围已扩展到造纸、活性食品包装、农业饲料、生殖避孕和医学移植等领域。 

在国外，乳链菌肽早就开始了工业化大生产，乳链菌肽的应用也很普遍。但我国在此领域的研究比较落后，进入20世纪90年代后才对乳链菌肽进行系统研究，而且大多研究集中在培养基和发酵过程的优化方面，乳链菌肽效价较低，是制约乳链菌肽大规模生产的瓶颈。在本发明中，选育了一株高产乳链菌肽的乳酸乳球菌诱变菌株，对乳链菌肽的深入研究和广泛应用具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳链菌肽的乳酸乳球菌诱变菌株，为一种新的菌株，其产生的乳链菌肽效价和野生菌相比有显著提高。 

本发明还提供了该菌株的培育方法，适用于工业化生产。 

本发明的乳酸乳球菌诱变菌株：在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期：2009年5月4日，登记号：CGMCC NO.3050，分类命名：乳酸乳球菌乳亚种，Lactoccuslactis subsp lactis。 

本发明所述的乳酸乳球菌菌株培育方法，包括以下步骤： 

1)将Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC11454冻干粉末接入液体小试管培养基中进行活化后，转接至液体摇瓶培养基中，30-38℃恒温箱中培养8-24h，连续传代5次后，接种新的种子液，接种量为5％(v/v)，装液量为100mL(摇瓶容量250mL)，将培养8h的菌液，8000r/min离心10min，菌体用无菌水清洗两遍，加30-50mL水，在有玻璃珠的三角瓶中30℃振荡1h，用血球计数板进行计数后，8000r/min离心10 min，取菌体沉淀； 

2)在菌体沉淀中加入1％-3％(v/v)的0.1mol/L的硫酸二乙酯磷酸盐缓冲液(使菌体浓度为1×10⁸个/mL)，pH 7.0，放入150r/min摇床振摇15-40min； 

3)采用25％硫代硫酸钠进行终止诱变反应，将诱变菌液逐级稀释至1×10⁶倍，涂布乳链菌肽抗性梯度平板，30-38℃恒温箱中培养8-24h，对乳链菌肽高产菌株进行初筛，采用双层琼脂扩散法进行复筛； 

4)将筛选获得的菌株在摇瓶中复苏，30℃，150r/min恒温摇床中培养8-24h，连续传代10次，测定每代的乳链菌肽效价，即得。 

本发明所述的高产乳链菌肽突变株的特征为： 

1)诱变菌株SYZXD2在玉米浆80-90mL，糖醪10-15mL，KH₂PO₄ 1-2g，NaCl0.1-0.5g，配制成的100mL废料发酵培养基中培养时，乳链菌肽的效价为5000-7000IU/mL，比野生菌提高3.94-5.51倍。 

2)诱变菌株SYZXD2在葡萄糖15-20g/L，蛋白胨20-30g/L，酵母浸粉22-28g/L，NaCl4-7g/L，KH₂PO₄ 8-12g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g/L的化学试剂发酵培养基中培养时，乳链菌肽的效价为8000-11000IU/mL，比野生菌提高6.30-8.66倍。 

3)诱变菌株SYZXD2最适发酵条件为：培养温度30-38℃，摇瓶转速120-180rpm，装液量80mL-110mL、接种量2-5％，初始pH值为6.2-7.5。 

本发明的积极效果在于：诱变的乳酸乳球菌新菌株经10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性，并且乳链菌肽的效价远远比野生菌高出许多倍。 

具体实施方法 

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。 

实施例1： 

(1)乳酸乳球菌的诱变 

将Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC11454冻干粉末接入液体小试管培养基中进行活化后，转接至液体摇瓶培养基中，37℃恒温箱中培养12h，连续传代5次后，接种新的种子液，接种量为5％(v/v)，装液量为100mL(摇瓶容量250mL)，将培养8h的菌液，8000r/min离心10min，菌体用无菌水清洗两遍，加入30mL水，在有玻璃珠的三角瓶中30℃振荡1h，用血球计数板进行计数后，8000r/min离心10min，取菌体沉淀，加入2％(使菌体浓度为1×10⁸个/mL，)的0.1mol/L的硫酸二乙酯磷酸 盐缓冲液，pH 7.0，放入150r/min摇床振摇30min；采用25％硫代硫酸钠进行终止诱变反应，将诱变菌液逐级稀释至1×10⁶倍，涂布乳链菌肽抗性梯度平板，37℃恒温箱中培养12h。 

(2)乳链菌肽高产菌株的筛选 

乳链菌肽抗性梯度平板的制备：在无菌的平板中倒入15mL左右的下层固体培养基，将平板的一端垫起，使培养基在平板上凝固成斜面，再倒入12.5mL含乳链菌肽的上层发酵固体培养基，将平板平放，等待凝固。含有乳链菌肽的上层固体发酵培养基的pH值用2mol/L的HCl调到3.5，105℃灭菌10min。待乳链菌肽抗性梯度平板上的菌落生长成熟后，挑选乳链菌肽高浓度区的菌落挑到小试管液体培养基中进行活化，活化后经250mL摇瓶发酵(装液量为100mL)，双层琼脂扩散法测定乳链菌肽效价。将乳链菌肽高产菌株挑选出来并立即制成甘油管保存。再采用双层琼脂扩散法复筛。 

实施例2： 

以Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC11454为出发菌株，利用2％的硫酸二乙酯进行诱变处理，采用25％硫代硫酸钠进行终止诱变反应。利用乳链菌肽抗性梯度平板法对诱变菌株进行筛选，获得乳链菌肽高产诱变菌株SYZXD2。用工业废料对乳链菌肽高产菌株SYZXD2进行发酵培养基优化。通过单因素试验方法确定工业废料酒糟、玉米浆、糖醪发酵生产乳链菌肽的最佳浓度，然后采用Box-Behnken设计及响应面分析法确定乳链菌肽的最佳废料培养基组分为：玉米浆88mL，糖醪12mL，KH₂PO₄ 1.56g，NaCl 0.25g，配制成100mL的培养基，在此培养基的培养条件下乳链菌肽的效价为5590IU/mL。 

实施例3： 

以Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC11454为出发菌株，利用2％的硫酸二乙酯进行诱变处理，采用25％硫代硫酸钠进行终止诱变反应。利用乳链菌肽抗性梯度平板法对诱变菌株进行筛选，获得乳链菌肽高产诱变菌株SYZXD2。利用化学试剂对乳链菌肽高产菌株SYZXD2的发酵培养基进行优化。将Plackett-Burman试验设计，最陡爬坡试验和响应面分析法三种统计学方法综合应用于乳链菌肽高产菌株SYZXD2发酵培养基的优化，确定最佳的化学试剂培养基组分为：葡萄糖19.3g/L，蛋白胨28.6g/L，酵母浸粉24.1g/L，NaCl 5.9g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，在此培养基培养条件下，乳链菌肽效价为10070IU/mL。 

实施例4： 

以Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC11454为出发菌株，利用2％的硫酸二乙酯进行诱变处理，采用25％硫代硫酸钠进行终止诱变反应。利用乳链菌肽抗性梯度平板法对诱变菌株进行筛选，获得乳链菌肽高产诱变菌株SYZXD2。利用单因素试验法对该菌株的培养条件进行了优化。在废料培养基中，该菌株的最佳培养条件为：装液量100mL、接种量5％、培养温度37℃、转速160rpm、初始pH值为6.5，乳链菌肽发酵时间为10h，在此培养基条件下，乳链菌肽的效价为6500IU/mL。在化学试剂培养基中，该菌株的最佳培养条件为：装液量100mL、接种量3％、培养温度37℃、转速150rpm、初始pH值为6.8，乳链菌肽发酵时间为8h，在此培养基条件下，乳链菌肽的效价为10100IU/mL。 

Claims (1)

1.一种乳酸乳球菌诱变菌株，其特征在于：在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期：2009年5月4日，登记号：CGMCC NO.3050，分类命名：乳酸乳球菌乳亚种，Lactoccus lactis subsplactis。