发明内容
本发明的技术方案是提供了莲子心或其提取物的新用途。
本发明提供了莲子心或其提取物在制备预防或/和治疗糖尿病肾病的药物或保健食品中的用途。
其中,所述的莲子心提取物为莲子心的水或有机溶液提取物或酸碱提取物。其中,所述的莲子心提取物是莲子心水或有机溶剂提取物。所述的莲子心提取物,可以是用莲子心的水提物,如水煎,水煎液的浓缩液,或莲子心水提醇沉后经喷雾干燥得到的粉剂;可以是以乙醇或其他有机溶剂对莲子心进行提取;可以是以酸液渗漉对莲子心进行提取;可以是以离子交换树脂对莲子心进行提取;可以是以膜分离技术对莲子心进行提取等。
其中,所述的莲子心提取物为莲子心总生物碱。
其中,所述的药物是减轻肾小球基膜增厚,减少肾小球上皮细胞足突融合,恢复肾小球机械屏障和电荷屏障的药物。
其中,所述的莲子心总生物碱中总生物碱的百分含量为5%~95%,含有莲子心碱的重量百分含量为1%~80%。进一步优选地,所述的莲子心总生物碱提取物中总生物碱的重量百分含量为30%~70%,含有莲子心碱的重量百分含量为10%~30%。
本发明的活性成分莲子心总生物碱的含量以莲子心碱为标准计算。含量测定采用紫外分光光度法测定莲子心碱含量,莲子心碱在282nm处有最大吸收,根据莲子心碱的含量计算总生物碱的含量,也可采用HPLC法测定。(参考文献:郭毛娣,李兰贵.中国大陆产莲子心中生物碱成分的研究[J].中草药,1984,15(7):3.袁小红.莲子心微囊中总生物碱的含量测定[J].时珍国医国药,2006,17(7):1141-1142;柳伟,王宏洁,司南等.莲子心总生物碱滴丸的制备工艺及含量测定[J].中国中药杂志,2007,32(7):581-584;陈锦容.HPLC法测定不同炮制工艺莲子心中生物碱的含量[J].海峡药学,2009,21(9):33-36)
本发明还提供了一种治疗糖尿病肾病的药物组合物,它是由有效量的莲子心或其提取物为活性成分,加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
其中,所述的制剂是口服制剂、注射制剂。
本发明莲子心及其活性成分制成的药剂、保健食品和食品添加剂中,可以是临床上能够使用的各种不同剂型。如片剂、口服液、丸剂、胶囊剂、注射剂(包括静脉输液剂)、膏剂、酊剂、散剂、冲剂、栓剂、霜剂、透皮制剂等。也可添加到食品、饮料等保健食品中。当然也可以将莲子心原药直接制备成单方或复方的制剂、保健食品和食品添加剂。
本发明莲子心用于预防或/和治疗糖尿病肾病,药效明确,且用药安全,为临床提供了一种新的用药选择。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明莲子心总碱的制备
取莲子心,粉碎,加水2~6倍,煎煮3次,每次0.5~2h,合并滤液,回流浓缩,过滤,加入2~8倍乙醇,使水提溶液中乙醇浓度达50~60%。静置12~24h,过滤,滤液减压回收乙醇至尽,并浓缩之相对密度为1.20~1.40,减压干燥,得莲子心提取物,即得莲子心总碱。含量测定采用紫外分光光度法,结果:总生物碱的重量百分含量为70%,以莲子心碱计,重量百分含量为30%。
实施例2本发明莲子心总碱的制备
取莲子心,粉碎,用2~5倍量70~85%乙醇回流提取2~4次,每次回流提取0.5~1.5h,滤过合并滤液,减压回收乙醇,浓缩之相对密度为1.01~1.10的浓缩液。浓缩液用硫酸调pH至2.0~4.0,静置,离心,离心液用10~20%氨碱化调pH至8~10,静置,过滤取沉淀,加乙醇加热溶解,静置,过滤,滤液减压回收乙醇至尽,并浓缩之相对密度为1.20~1.40,减压干燥,得莲子心提取物,即得莲子心总碱。总生物碱含量50%,以莲子心碱计占10%。含量测定采用紫外分光光度法。
实施例3本发明莲子心总碱的制备
取莲子心,粉碎,放入渗漉器中,加入2~6‰HCl浸渍膨胀24~48h,然后不断添加新的2~6‰HCl,自上而下使其渗透过药材,从渗漉器下部流出并收集浸出液,合并所有滤液,用10~20%氨碱化至pH值为8~10,过滤得到沉淀,减压干燥,即得莲子心总碱,总生物碱含量30%,以莲子心碱计占15%。含量测定采用紫外分光光度法。
实施例4
莲子心碱、异莲子心碱、甲基莲子心碱可从莲子心总碱通过如下方式提取路线制备。
莲子心总碱→用制备高效液相分离
莲子心总碱→胶束电动色谱分离
其中,莲子心碱、异莲子心碱、甲基莲子心碱三个化合物分离纯化方法可参考如下文献:朱金花,李德亮.胶束电动色谱中大体积进样法分离测定莲子心中的莲子心碱、异莲子心碱和甲基莲子心碱.分析化学,2009,37(10):126;陈昌国.大孔吸附树脂分离纯化莲子心中莲子心总碱的研究.时珍国医国药2009,20(4):981-983;张先洲,胡学民,罗顺德等.高效液相色谱法测定莲子心中3种生物碱的含量.药物分折杂志,1997,17(2):110-112,或直接通过市售购买化合物标准品。这里所说的活性成分主要为双苄基异喹啉-(7-0-11′)-单醚键生物碱衍生物及类似物,主要为莲子心碱、异莲子心碱、甲基莲子心碱,可从睡莲科植物的不同部位,如莲子心、莲须、荷叶等或通过全合成或半合成方法制备。
以下通过具体药效学试验或临床试验进一步证明本发明的有益效果。
试验例1本发明提取物的药效学实验
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1动物清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠100只,体重180~200g,购自四川大学华西实验动物中心。在室温(22±1)℃、相对湿度(55±5)%、光照周期12h~12h环境中适应饲养1wk后试验。
1.1.2药物莲子心提取物,由实施例1方法制备,使用时用生理盐水配制灌胃;开博通(卡托普利)片,上海中美施贵宝药业有限公司生产,批号:1003052。
1.1.3主要试剂链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ),Sigma公司,临用前溶解在0.01mol/L枸橼酸缓冲液中,pH 4.5;兔抗大鼠nephrin、podocin与HPA多克隆抗体,武汉博士德;生物素标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG及山羊血清封闭液,北京博奥森生物科技有限公司;动物组织总RNA提取试剂盒(离心柱型)及RT-PCR试剂盒,天根生化科技有限公司;PCR引物,上海生工生物工程技服务有限公司。
1.2方法
1.2.1动物模型的建立及分组 大鼠单次腹腔注射1%STZ 65mg/kg,72h后尾静脉采血,血糖仪测定全血血糖,以空腹12h后血糖≥11.1mmol/L者入选糖尿病大鼠模型。正常对照组(n=10,)单次腹腔注射等量枸橼酸缓冲液。选取造模成功后的大鼠随机分为莲子心提取物高剂量组(n=10),含莲子心提取物4mg·kg-1,莲子心提取物中剂量(n=10),含莲子心提取物2mg·kg-1,莲子心提取物低剂量(n=10),含莲子心提取物1mg·kg-1,开博通组(n=10),含开博通3.6mg/kg(按照人与鼠体表面积换算,相当于成人37.5mg/d)灌胃,糖尿病肾病模型组(n=10),正常对照组(n=10),正常对照组和模型组口服等量生理盐水。每天给药一次,持续8wk。所有大鼠在整个实验期间均喂标准饮食,自由饮水,不应用胰岛素,保持垫料干燥,定期断尾取血监测血糖,观察8wk。
1.2.2标本收集处死前准确收集24h尿液,离心分装后保存于-20℃冰箱中待测尿蛋白和尿白蛋白含量。尾静脉采血,血糖仪测定空腹12h后的全血血糖水平。称量体重。末次给药24小时后颈椎脱臼处死大鼠,迅速取出双侧肾脏,用4℃预冷的生理盐水反复清洗,去包膜滤纸吸干血迹后称重左肾,左肾重(KW)和体质量的比值作为肾脏指数(KI)的指标。右肾纵剖为二,一半用10%中性福尔马林固定,留做病理学,免疫组织化学研究。另一半用2.5%戊二醛固定,留做透射电镜研究。左肾置于DEPC水处理过的冻存管中,液氮冻透后转入-70℃冰箱待测RT-PCR。
1.2.3测定方法
24小时尿蛋白定量(Upro),采用考马斯亮兰法;尿白蛋白测定,采用放射免疫法,由北京北方生物技术研究所提供大鼠专用尿蛋白试剂盒,用SN-682型自动γ免疫计数器检测。
1.2.4病理学检查
光镜标本制作:肾组织经常规脱水、包埋、切片厚4μm,进行HE染色。
电镜标本制作:样品经3%戊二醛预固定,1%四氧化锇再固定,丙酮逐级脱水,Epon812包埋,半薄切片光学定位,超薄切片,醋酸铀及枸橼酸铅双重染色,日立H-600IV型透射电镜观察。
1.2.5免疫组化研究采用SP法,石蜡切片厚4μm,常规脱蜡至水,3%H2O2阻断内源性过氧化物酶后,在柠檬酸钠溶液中微波抗原修复,10%正常山羊血清封闭。滴加一抗nephrin(1∶100)、podocin(1∶120)和HPA(1∶100),4℃冰箱过夜。PBS洗片后滴加山羊抗兔IgG工作液,37℃孵育20min;辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育20min;DAB显色,复染、脱水、透明、封片。每例切片随机选取10个不重复的肾小球视野(×400),应用Image Proplus 6.0软件,检测肾小球内阳性信号的平均光密度和面积,用阳性指数(PI)表示阳性物质的相对含量,计算公式为:PI=阳性信号平均光密度×阳性信号面积/肾小球面积。
1.2.6RT-PCR研究由基因库分别查得大鼠nephrin、podocin、HPA及β-actin的mRNA核苷酸序列,PCR引物用Primer引物设计软件设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,见表1。
表1大鼠nephrin、podocin、HPA及β-actin引物序列
取肾皮质25mg,加液氮研碎后,用动物组织总RNA提取试剂盒提取总RNA。提取的总RNA用微量紫外可见分光光度计测OD值:OD260/OD280值在1.8~2.0之间。分别取1μg总RNA以M-MLV为逆转录酶作逆转录反应,cDNA产物保存于-20℃。取2μlcDNA作为模板,用nephrin、podocin、HPA与β-actin引物进行PCR扩增,反应条件为:94℃预变性3min,94℃变性45s,(nephrin55℃,podocin 53℃,HPA 53℃,β-actin 56℃)退火45s;72℃延伸60s,循环35次;72℃延伸5min至4℃。取PCR扩增产物5μl在1.2%琼脂糖中电泳,紫外灯下观察,Quantity One凝胶成像系统照相,并对扩增产物电泳条带进行光密度扫描,测定电泳条带光密度值(OD值)。nephrin、podocin、HPA mRNA的相对表达量以nephrin、podocin、HPA mRNA的OD值与β-actinOD值的比值来表示。
2统计学方法统计学处理计量资料用表示,应用SPSS13.0统计软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析。
3实验结果
3.1一般情况正常对照组大鼠饮食、饮水情况,精神状态,日常活动均正常。糖尿病肾病组大鼠于注射STZ 3d后出现多饮、多食、多尿症状。在2周时症状明显,随病程延长上述症状更加显著,到8周时糖尿病肾病组大鼠体重减轻、毛色黯淡、精神萎靡。
3.2各组大鼠血糖 造模后的各组大鼠血糖明显升高,经莲子心提取物治疗后血糖水平下降,但未完全恢复正常。见表2
3.324h尿蛋白(Pro,mg/24h)、24h尿白蛋白及肾脏指数变化与模型组相比,高剂量组和低剂量组的24h尿蛋白指标明显改善(P<0.01),但并未降至正常组水平,而低剂量组与高剂量组之间的24h尿蛋白指标差异也有统计学意义(P<0.05)。高剂量组和低剂量组的肾脏指数与模型组相比明显下降(P<0.05)。见表2
注:与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01;与正常组相比,#P<0.05,##P<0.01;与高剂量组相比,●P<0.05;BG:血糖;ALB:白蛋白
3.4HE染色光镜与正常组比较,模型组表现为肾小球体积增大,系膜细胞显著增生,基底膜增厚,肾小动脉膜内增生,管壁增厚,肾小球毛细血管管腔狭窄,并可见部分肾小管上皮细胞空泡变性,少数肾小球出现轻度硬化。而低剂量组、高剂量组与模型组相比上述病理改变有不同程度的改善。
3.5透射电镜透射电镜下可见正常组大鼠足细胞结构完整,足突分布均匀,裂孔膜结构清楚。模型组足细胞有脱落,足突增宽,甚至融合,局部裂孔隔膜消失,基底膜弥漫性增宽。高剂量组、中剂量组、低剂量组与模型组相比上述病变则有所减轻,表现为裂孔膜恢复,基底膜增宽减轻,高剂量组恢复接近正常,开博通组与低剂量组恢复接近。正常组肾小管上皮细胞结构清晰,线粒体等细胞器清晰可见;模型组肾小管上皮细胞核染色质聚集,核变空,胞质内线粒体肿胀;高剂量组、中剂量组、低剂量组与模型组相比上述病变则有所减轻,高剂量组恢复接近正常,开博通组与低剂量组恢复接近。
3.6肾皮质nephrin、podocin、HPA mRNA免疫组化分析正常组大鼠可见棕黄色的nephrin、podocin表达于肾小球裂孔膜位置,肾小管及肾小囊无表达。模型组大鼠棕黄色变淡甚至消失。莲子心提取物干预后nephrin、podocin表达较模型组均明显增加(P<0.01)。正常组大鼠HPA几乎不表达,模型组大鼠HPA表达显著增加,高剂量组、中剂量组、低剂量组HPA表达与模型组相比差异有极显著统计学意义(P<0.01)。开博通组与模型组比较无统计学差异(P>0.05),见表3.
表3大鼠肾组织nephrin、podocin、HPA的阳性指数(PI)分析
注:与模型组相比,**P<0.01;与正常组相比,##P<0.01;与高剂量组相比,●●P<0.01
3.7肾皮质nephrin、podocin、HPA mRNA表达高剂量组、中剂量组、低剂量组和正常组大鼠肾组织nephrin mRNA的表达较模型组显著上升(P<0.01),高剂量组、中剂量组、低剂量组和正常组podocin mRNA的表达较模型组显著上升(P<0.01)。高剂量组、中剂量组、低剂量组HPA mRNA下降,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。开博通组与模型组比较无统计学差异(P>0.05),见表4。
表4大鼠肾组织nephrin、podocin、HPA mRNA的相对表达量
注:与模型组相比,**P<0.01;与正常组相比,##P<0.05;与高剂量组相比,●●P<0.05
3.8大鼠肾足细胞计数、足突宽度、足突融合率和基底膜平均厚度有明显影响,高剂量组、中剂量组、低剂量组与模型组有统计学差异(P<0.01);开博通组与模型组比较有统计学差异(P<0.05),见表5。
表5各组大鼠足细胞数、足突宽度及融合率、基底膜厚度变化
注:与模型组相比,**P<0.01;与正常组相比,#P<0.05;与高剂量组相比,●P<0.05
4讨论
蛋白尿是糖尿病肾病临床表现之一,作为肾小球滤过屏障结构主要成分的肾小球基底膜和足细胞及其裂孔隔膜的结构和功能的改变,其中nephrin与podocin蛋白其机械屏障密切相关,而硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)所带负电荷形成了肾小球滤过时的电荷屏障。机械屏障和电荷屏障是阻止尿蛋白漏出的关键因素。本实验显示,莲子心提取物能降低DN大鼠的24h尿蛋白和24h尿白蛋白,恢复足细胞数、减少足突宽度、降低融合率和减少基底膜增厚,其机理可能是通过上调nephrin和podocin的表达,下调HPA的蛋白表达,从而对DN大鼠的肾小球滤过屏障(机械屏障和电屏障)损伤起到一定的保护作用。
试验例2本发明药物的临床试验
1.1受试药物莲子心提取物,由实施例1方法制备,再将莲子心提取物装入胶囊。卡托普利胶囊,海南亚洲制药有限公司生产。安慰剂(模拟剂胶囊,含等量淀粉)。
1.2研究对象共有180例糖尿病肾病(III期或IV期)患者进入研究,随机分配至莲子心胶囊组、卡托普利胶囊组和安慰剂组。莲子心胶囊组60例,男28例,女32例;年龄57.15±10.12岁;病程8.67±5.12;卡托普利胶囊组60例,男24例,女36例;年龄56.37±7.92岁;病程8.36±5.56;安慰剂组60例,男26例,女34例;年龄56.23±7.76岁;病程7.99±4.82;三组病例在性别、年龄、病程及临床症状差异无显著性(P>0.05),具有可比性。
三组患者均符合以下条件:(1)符合糖尿病肾病,按Mogensen糖尿病肾病分期属III期或IV期,尿蛋白≤4.5g/24h患者;(2)24h尿蛋白连续3次测定>30mg/24h(3)排除原发性肾脏病及其它肾脏疾病、原发性高血压、肿瘤、发热及剧烈运动等引起的尿蛋白增多等原因。
1.3治疗方法所有受试者在试验期间糖尿病基础治疗不变。莲子心胶囊组:1粒/次,3次/d,口服;卡托普利胶囊组:1粒(25mg)/次,3次/d,口服;安慰剂组:模拟剂胶囊1粒/次,3次/d,口服;治疗8周后统计疗效。
1.4疗效指标观察及方法观察项目包括尿24h微量白蛋白(UAE,mg·24h-1)、24h尿蛋白定量(UPQ,mg·24h-1),采用OLYMPUS AU640全自动生化分析仪,治疗前和疗程结束时(8周)各检查1次。
1.5疗效判定标准本研究参照欧洲AIPRI研究中采用的疗效评价方法及中国中医药学会糖尿病(消渴病)专业委员会制定的标准评定。临床控制:24小时尿微量白蛋白排泄量<30mg,肾功能正常;显效:24小时尿微量白蛋白排泄量比治疗前减少≥50%,肾功能正常;有效:24小时尿微量白蛋白排泄量比治疗前减少≥20%,肾功能正常或基本正常(与正常值相差不超过15%);无效:各项指标达不到以上标准。
2试验结果,见表6,7。
表63组糖尿病肾病治疗后临床疗效比较
注:莲子心胶囊组和安慰剂组,卡托普利胶囊和安慰剂组,有统计学差别分别用*,△表示
表73组糖尿病肾病治疗前后UAE和UPQ疗效比较
注:与同组治疗前比较*P<0.01;与安慰剂比较△P<0.01;
3讨论
在试验期间糖尿病基础治疗不变的基础上,莲子心胶囊对糖尿病肾病(III期或IV期)患者有较好的治疗作用,能降低24h微量白蛋白(UAE)和24h尿蛋白(UPQ),其作用机理主要通过减轻肾小球基膜增厚,减少肾小球上皮细胞足突融合,恢复肾小球机械屏障和电荷屏障,从而减少蛋白的漏出。
综上所述,本发明莲子心及其提取物用于预防或/和治疗糖尿病肾病,药效明确,且用药安全,为临床提供了一种新的用药选择。