CN104510901A - 一种治疗心脑血管疾病的复方中药制剂 - Google Patents

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Abstract

为了满足临床需要，更好的治疗心脑血管疾病，提高人民的健康水平，本发明提供了一种新的用于治疗心脑血管疾病的药物组合物及其制备方法，该药物组合物主要由山楂叶提取物，薤白和黄精提取物制备而成，在用于制备治疗心脑血管疾病方面，产生了意想不到的效果。

Description

一种治疗心脑血管疾病的复方中药制剂
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种用于治疗心脑血管疾病的主要由山楂叶提取物，薤白和黄精提取物制成的药物组合物的制剂及其制备方法。
背景技术
心血管疾病，又称为循环系统疾病，是一系列涉及循环系统的疾病。循环系统指人体内运送血液的器官和组织，主要包括心脏、血管(动脉、静脉、微血管)，可以细分为急性和慢性，一般都是与动脉硬化有关。
心血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，随着生活水平的提高和生活节奏的改变，被称为“富贵病”的“三高症”(即高血压、高血糖和高血脂)日益增多。随着年龄的增长，高血压患病率逐渐增加。60岁以上老年人中40％～45％患有高血压的同时还患有高血糖或高血脂，据国外的资料显示，50％左右的糖尿病人都合并有高血压、高血脂等多种老年疾病。心绞痛、心肌梗死、缺血性心脏病等共同的病理基础都是心肌缺血，心肌供血、供氧不足导致心肌代谢紊乱，能量供应不足，心肌收缩功能下降，血液输出量降低，进而影响整个机体的功能，乃至引起心肌细胞死亡。脑缺血再灌注是临床上脑血管疾病治疗的关键。心脑缺血后影响能量代谢，继发乳酸堆积、钙超标、自由基损伤等多种变化；多靶点逆转或改善这些变化，提高综合疗效是药物治疗的重要目标。
山楂叶为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥叶。山楂叶主要成分是牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、芦丁、牡荆素、金丝桃苷、熊果酸、槲皮素和牡荆素等多种化学成分，药理作用主要体现在抗炎镇痛、降血脂、防治动脉粥样硬化、对心肌缺血的保护、对脑缺血的保护、对肝脏保护、对肾脏保护、抑制肿瘤细胞等方面。
薤白为百合科植物小根蒜Allium macrostemon Bge.或薤Allium chinensis G.Don的干燥鳞茎。薤白主要成分是亚油酸、棕榈酸、油酸和谷甾醇等组成的脂肪酸成分、总皂苷元及总生物碱。薤白的药理作用主要有抑菌消炎、解痉平喘、抗血小板聚集，抗氧化，降血脂，抗动脉粥样硬化，抗肿瘤等作用。
黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精Polygonatumsibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根茎。黄精主要成分是多糖、甾体皂苷、黄酮、蒽醌类化合物、氨基酸等活性成分。黄精的药理作用主要有降糖降脂、对心肌损伤的保护、对脑缺血损伤的保护、抗氧化、延缓衰老、改善记忆、抗肿瘤、抗疲劳、抑菌及抗氧化等方面。
目前利用山楂叶提取物，薤白和黄精提取物的相互作用，配伍组方用于治疗心脑血管疾病，还未见报道。
发明内容
为了满足临床需要，更好的治疗心脑血管疾病，提高人民的健康水平，本发明提供了一种新的用于治疗心脑血管疾病的药物组合物及其制备方法，该药物组合物主要由山楂叶提取物，薤白、黄精提取物制备而成，在用于制备治疗心脑血管疾病方面，产生了意想不到的效果。
按照本发明的一个方面，本发明提供了一种治疗心脑血管疾病的复方中药，其特征在于：该中药由包括以下成分和重量份数的中药提取物制成：
山楂叶提取物1～100份  薤白提取物与黄精提取物两种合计1～100份
按照优选的技术方案，该中药提取物的重量份数为：
山楂叶提取物1～10份  薤白提取物与黄精提取物两种合计1～10份
按照进一步优选的技术方案，该中药提取物的重量份数为：
山楂叶提取物2份薤白提取物与黄精提取物两种合计1～5份
特别优选的是，在该中药中，薤白提取物与黄精提取物的重量份数比例为1：2至2：1，所述山楂叶提取物和薤白提取物与黄精提取物分别为水或乙醇提取物，所述中药的剂型为任何一种临床上或药学上可接受的剂型。
优选所述剂型为滴丸、片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、口服液体制剂或注射剂。
更优选的是，所述中药的活性成分主要由山楂叶提取物、薤白提取物与黄精提取物组成。
进一步更优选的是，所述中药的活性成分由山楂叶提取物、薤白提取物与黄精提取物组成。
上文所述的药物组合物中的山楂叶、薤白、黄精可以用适宜的溶剂和方法单提或混提制备得到提取物，总提取物再与药学上可接受的辅料混合制成任意一制剂。其中所述的提取溶剂优选水或乙醇，提取方法可以为浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法或连续提取法。按照本发明的另一方面，本发明提供了一种治疗心脑血管疾病的复方中药的制备方法，包括以下步骤：
(1)山楂叶提取物的制备：按配比量称取山楂叶，用山楂叶重量2倍～40倍的溶剂浸泡时间O.1～10小时后，在30℃～100℃的条件下提取0.1～10小时，所述溶剂浸泡和提取操作可进行1次或重复进行多达6次，合并提取液，蒸馏回收溶剂，蒸馏液离心，用山楂叶药材重量0.1倍～100倍体积的溶剂洗涤沉淀一次或重复洗涤多达五次，合并离心后的上清液和洗涤沉淀的上清液，蒸馏浓缩至近干后干燥，粉碎，即得山楂叶提取物；所述溶剂是水或任何其它适于进行中药有效成分提取的溶剂，
(2)薤白、黄精提取物的制备：按配比量称取薤白和黄精，在50℃～100℃条件下第一次加入薤白和黄精总重量2倍～40倍溶剂提取O.1～10小时，提取过程可进行一次或多达5次，合并提取所得煎液，过滤并将滤液蒸馏浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得薤白、黄精提取物；所述溶剂是水或任何其它适于进行中药有效成分提取的溶剂，
(3)根据上述步骤(1)获得的山楂叶提取物和上述步骤(2)获得的薤白、黄精提取物混合均匀后，加入适当的附加剂，制成注射剂、口服固体制剂或口服液体制剂，所述口服固体制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、或软胶囊，所述口服液体制剂为口服液或糖浆剂，所述的附加剂为填充剂、赋形剂、矫味剂或防腐剂中的一种或多种。按照优选的技术方案，上述治疗心脑血管疾病复方中药的制备方法，还包括：
(a)将上述步骤(1)获得的山楂叶提取物，用1/2量的石油醚脱脂后，弃去石油醚液，再用乙酸乙酯萃取，萃取液减压回收乙酸乙酯并浓缩至干，加入适量水使溶解，加于聚酰胺柱卜。先用2倍杵体积的水洗脱，弃去水洗液，然后用3倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩至60℃相对密度约1.02～1.08的浓缩液，干燥，得山楂叶总黄酮提取物；
(b)将上述步骤(2)获得的薤白、黄精提取物，用二倍体积的95％的乙醇沉淀，反复进行4次，用透析膜透析掉小分子物质，再次醇沉，最后用同等体积的无水乙醚和适量的丙酮洗涤沉淀物，干燥，得薤白和黄精粗多糖提取物；
(c)将上述步骤(a)获得的山楂叶总黄酮提取物和上述步骤(b)获得的薤白、黄精粗多糖提取物混合均匀后，加入适当的附加剂，制成10份粉针剂、小容量注射剂或大容量注射剂。
本发明提供了山楂叶提取物优选提取工艺，山楂叶提取物可以根据由下述方法制得，但不仅限于下述方法：
称取山楂叶7份，第一次用药材总重量的2倍～40倍的溶剂浸泡时间O.1～10小时后，在30℃～100℃的条件下提取0.1～10小时，第二次用药材总重量的2倍～20倍的溶剂在30℃～100℃的条件提取O.1～10小时，第三次用2倍～20倍量溶剂在30℃～100℃的条件提取0.1～10小时，第四次用2倍～20倍量溶剂在30℃～100℃的条件提取0.1～10小时，合并提取液，蒸馏回收溶剂，蒸馏液离心，用药材量0.1倍～100倍体积的溶剂洗涤沉淀三次，合并离心后的上清液和洗涤沉淀的上清液，蒸馏浓缩至近干后干燥，粉碎，即得。
通过上述工艺制备的提取物得率为10％～35％，总黄酮的含量以无水芦丁(C21H20O12)计，不低于20％；牡荆素鼠李糖苷(C27H34O14)的含量不低于2％。
本发明提供了薤白、黄精提取物的优选提取工艺，薤白、黄精提取物可以根据由下述方法制得，但不仅限于下述方法：
称取薤白3.5份和黄精1.5份，在50℃～100℃条件下第一次加入药材总重量的2倍～40倍溶剂提取0.1～10小时，第二次加入2倍～20倍溶剂提取0.1～10小时，合并煎液，滤液浓缩至药材总重量0.1倍～20倍，加乙醇使含醇量为20％～90％，静止或离心，取上清液，过滤，蒸馏回收乙醇，继续蒸馏浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得。
通过上述工艺制备的薤白、黄精提取物得率为25％～45％，含多糖以无水葡萄糖(C6H12O6)计不低于4％。
以上组成是按重量比作为配比的，在生产时可按照相应比例增大或减少，如大规模生产可以以千克为原料，或以吨为单位，小规模生产也可以以克为单位，重量可以增大或者减小，但各组份之间重量配比的比例不变。
以上重量配比的比例是经过科学筛选得到的，对于特殊病人，可以相应调整组成的比例，增加或者减少不超过100％。
本发明药物组份的用量是经过发明人进行大量试验摸索总结得出的，各组份用量在上述重量份范围内都具有较好疗效。
本发明提供了一种用于制备治疗心脑血管疾病方面的药物组合物，主要用于治疗脑血栓、冠心病、心绞痛、脉管炎、心肌梗塞及高脂血症等方面疾病。
本发明药物组合物可以加一种或多种药学上可接受的载体，以口服或肠胃外给药的方式适用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊、分散片、口服液、颗粒、咀嚼片、口崩片、滴丸、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油悬浮剂等，如水针、冻干粉针、无菌粉针、输液等。优选的形式是胶囊、片剂和注射剂。
本发明药物组合物可采用现有制药领域中的常规方法生产，需要的时候可以添加各种药学上可接受的载体。所述的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
本发明药物组合物在制成注射剂时，为了增加其溶解度，可以加入吐温-80等增溶剂。输液中可以加入用于调节渗透压的等渗调节剂，例如，氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、乳酸钠、葡萄糖、木糖醇、山梨醇和右旋糖苷等，优选氯化钠或葡萄糖。粉针中可加入赋形剂，例如，甘露醇、葡萄糖等。
本发明药物组合物具有以下优点：
(1)提供了一种新的用于治疗心脑血管疾病的药物组合物及其制备方法，满足了临床急需。
(2)首次对本发明药物组合物的相互作用和配伍组方进行了药效学研究，结果如下：
①该药物组合物能改善S-T段抬高；能明显降低血清心肌酶中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性；使ATP酶活性降低，乳酸(LD)及游离脂肪酸(NEFA)含量降低；使丙二醛(MDA)含量减少，总超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性升高；各给药组全血粘度降低、血浆粘度降低、红细胞压积降低、血沉降低，说明该药物组合物能抑制红细胞聚集，降低红细胞脆性，增强其变形性，使升高的心率趋于正常、左室收缩压升高、左室舒张压降低，左室最大上升速率升高、左室最大下降速率升高、终末舒张压降低。治疗组病变与模型组比较明显减轻心肌细胞紊乱、断裂程度较轻，核固缩及胞浆嗜酸性变明显减少，心肌梗死面积明显减少，说明该药物组合物对心肌缺血模型大鼠各项指标的改变具有的改善和治疗作用。
②该药物组合物能明显减少血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和载脂蛋白B(ApoB)的含量，增加高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和载脂蛋白A1(ApoA1)含量；能明显减少丙二醛(MDA)含量，增加一氧化氮(NO)的含量，升高总超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性；治疗组肝脂肪变性细胞减少，胞浆内脂滴减少或消失，细胞体积接近于正常组肝细胞。说明该药物组合物对高脂血症模型大鼠各项指标的改变具有改善和治疗作用。
③试验结果表明本发明药物组合物胶囊剂疗效明显优于单用山楂叶提取物、薤白提取物、黄精提取物。提示山楂叶提取物，薤白和黄精提取物配伍应用具有协同增效的作用，其结果是本技术领域的普通技术人员所意想不到的。
(3)对本发明组合物各配比进行了药效学研究，得出了本发明组合物的最优配比。
(4)本发明以中药提取物投料，制备工艺简单，不同批次药品间质量差异小，药品质量更均匀稳定。
(5)进行的急性毒性实验表明本发明药物组合物胶囊剂的最大耐受量相当于70kg体重人日最大用量的356倍，表明了本发明药物组合物低毒，安全性高。
(6)进行的稳定性实验表明本发明药物组合物胶囊剂各项指标均比较稳定，保证了临床用药的安全。
(7)本发明组合物配伍用药疗效确切，且减少了相对用药剂量，具有广泛的应用前景。
以下通过实验例来进一步阐述本发明所述药物组合物的有益效果。
实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于发明的范围。以上实例中各剂型的辅料可以用药学上可接受的辅料替换，或者减少、增加。
实施例1：山楂叶提取物的制备
称取山楂叶7份，第一次用药材总重量的8倍的45％乙醇浸泡时间2小时后，在80℃的条件下提取2小时，第二次用药材总重量的5倍的45％乙醇在80℃的条件提取1小时，第三次用4倍量45％乙醇在80℃的条件提取0.5小时，第四次用3倍量45％乙醇在80℃的条件提取0.5小时，合并提取液，蒸馏回收乙醇，蒸馏液用离心机在每分钟3000R的转速下离心30min，用药材量2倍体积的纯化水洗涤沉淀三次，合并离心后的上清液和洗涤沉淀的上清液，蒸馏浓缩至近干后干燥，粉碎，即得。
山楂叶提取物的鉴别
取本品50mg，加乙醇5ml，摇匀，超声处理5分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取芦丁对照品、金丝桃苷对照品，分别加乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年一部附录VIB)试验，吸取上述三种溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-丙酮-水(7：5：6)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，吹干，放置1小时后，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
山楂叶提取物的含量测定
对照品溶液的制备精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每1ml含无水芦丁0.20mg)。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25m1量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2010年一部附录VA)，以500nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法取本品0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，密塞，摇匀，超声处理5分钟，放置3小时以上，滤过，精密量取续滤液2ml，置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2ml，置25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸光度，同时精密量取供试品溶液2ml，置25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为空白溶液。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，计算，即得。
牡荆素鼠李糖苷
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以四氢呋喃-甲醇-乙腈-乙酸-水(38：3：3：4：152)为流动相；检测波长为330nm。理论板数按牡荆素鼠李糖苷峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备精密称取在减压干燥器干燥12小时的牡荆素鼠李糖苷对照品适量，加稀乙醇稀释至刻度配制成每1mL含50μg牡荆素鼠李糖苷对照品溶液，即得。
供试品溶液的制备取重量差异项下的本品，研细，取约0.25g，精密称定，置50ml量瓶中，加稀乙醇40ml，超声处理30分钟，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5ml，置于10mL容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪测定，即得。
按上述工艺分别制得三批山楂叶提取物得率以及含量测定结果见表1。
表1山楂叶提取物得率以及含量测定结果
批次 得率(％) 总黄酮含量(％) 牡荆素鼠李糖苷含量(％)
1 25.34 28.38 2.70
2 25.65 29.25 2.65
3 26.00 29.05 2.73
平均 25.66 28.89 2.69
实施例2：薤白、黄精提取物的制备
称取薤白3.5份和黄精1.5份，在100℃条件下第一次加入10倍量水煎煮2小时，第二次加入8倍量水煎煮1小时，合并煎液，滤液浓缩至1：1，测定相对密度，加乙醇使含醇量为55％，离心，取上清液，过滤，蒸馏回收乙醇，继续蒸馏浓缩至适量，干燥，粉碎，即得。
薤白、黄精提取物的含量测定
对照品溶液的制备取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品33mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水葡萄糖0.33mg)。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置10ml具塞刻度试管中，各加水至2.0ml，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0.2％蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温10分钟，取出，立即置冰水浴中冷却10分钟，取出，以相应试剂为空白。照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2010年一部附录VA)，在582nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法取本品细粉约0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，加80％乙醇150ml，置水浴中加热回流1小时，趁热滤过，残渣用80％热乙醇洗涤3次，每次10ml，将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150ml，置沸水浴中加热回流1小时，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10ml，合并滤液与洗液，放冷，转移至250ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml具塞干燥试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至2.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含无水葡萄糖的重量(mg)，计算，即得。
按上述工艺分别制得三批薤白、黄精提取物得率以及含量测定结果见表2。
表2薤白、黄精提取物得率以及含量测定结果
批次 得率(％) 多糖含量(％)
1 36.50 4.63
2 37.93 4.81
3 37.34 4.98
平均 37.26 4.81
实施例3：组合物片剂的制备
处方
制法：按照处方量称取实施例1方法制备的山楂叶提取物，实施例2方法制备的薤白和黄精提取物和辅料，粉碎，分别过100目筛，备用。将山楂叶提取物，薤白和黄精提取物，淀粉，预胶化淀粉，微晶纤维素混合均匀，搅拌均匀，制成适宜软材。过18目筛制颗粒。颗粒在60℃的条件下烘干。干燥好的颗粒加入羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁，过18目筛整粒，混合均匀。取样，半成品化验。按照化验确定的片重压片。成品全检，包装入库。
实施例4：组合物胶囊剂的制备
处方
制法：按照处方量称取实施例1方法制备的山楂叶提取物，实施例2方法制备的薤白和黄精提取物和辅料，粉碎，分别过100目筛，备用。将山楂叶提取物，薤白和黄精提取物，淀粉混合均匀，搅拌均匀，制成适宜软材。过18目筛制颗粒。颗粒在60℃的条件下烘干。过18目筛整粒，混合均匀。取样，半成品化验。按照化验确定的重量装胶囊。成品全检，包装入库。
实施例5：组合物颗粒剂的制备
处方
制法：按照处方量称取实施例1方法制备的山楂叶提取物，实施例2方法制备的薤白和黄精提取物和辅料，粉碎，分别过100目筛，备用。将山楂叶提取物，薤白和黄精提取物，乳糖粉以等量递加的方法混合均匀，加入2％HPMC60％乙醇溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材。过18目筛制颗粒。颗粒在55℃的条件下烘干。干颗粒过18目筛整粒。取样，半成品化验颗粒中主药的含量，确定装量。包装，成品全检，包装入库。
实施例6：组合物软胶囊剂的制备
处方
]制法：按照处方量称取实施例1方法制备的山楂叶提取物，实施例2方法制备的薤白和黄精提取物，粉碎，分别过100目筛，备用。将处方量的大豆油和大豆磷脂、蜂蜡加热熔融，混匀，放冷，加入山楂叶提取物，薤白和黄精提取物研匀，压制成软胶囊，即可。
实施例7：山楂叶总黄酮提取物的制备
取实施例1的山楂叶提取物，用1/2量的石油醚脱脂后，弃去石油醚液，再用乙酸乙酯萃取，萃取液减压回收乙酸乙酯并浓缩至干，加入适量水使溶解，加于已处理好的聚酰胺柱上(粒度：30～60目，用95％乙醇湿法装柱，先用3倍柱体积的95％乙醇洗脱，后用3倍柱体积的水洗脱至无醇味，备用)，先用2倍柱体积的水洗脱，弃去水洗液，然后用3倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度约1.02～1.08(60℃)的浓缩液，干燥，得山楂叶总黄酮提取物。
按上述工艺分别制得三批山楂叶总黄酮提取物得率以及含量测定结果见表3。
表3山楂叶总黄酮提取物得率以及含量测定结果
批次 得率(％) 总黄酮含量(％) 牡荆素鼠李糖苷含量(％)
1 19.01 86.12 9.45
2 18.52 86.19 9.20
3 18.98 85.07 9.18
平均 18.84 85.79 9.27
实施例8：薤白和黄精粗多糖提取物的制备
取实施例2的薤白和黄精提取物，用二倍体积的95％的乙醇沉淀，反复进行4次。用透析膜透析掉小分子物质，再次醇沉，最后用同等体积的无水乙醚和适量的丙酮洗涤沉淀物干燥，得薤白、黄精粗多糖提取物。
按上述工艺分别制得三批薤白和黄精粗多糖提取物得率以及含量测定结果见表4。
表4薤白和黄精粗多糖提取物得率以及含量测定结果
批次 得率(％) 多糖含量(％)
1 12.50 14.19
2 12.72 14.26
3 12.81 14.81
平均 12.67 14.42
实施例9：组合物水针剂的制备
处方
制法：称取按照实施例7制备的山楂叶总黄酮提取物和按照实施例8制备的薤白和黄精粗多糖提取物。提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。将山楂叶总黄酮提取物和薤白和黄精粗多糖提取物加入配液量70％的注射用水中加热搅拌溶解完全，补加注射用水至全量。加入配液量0.05％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。经0.45um的微孔滤膜精滤。检查溶液的澄明度，半成品化验。将溶液灌封于玻璃安瓿中。100℃流通蒸汽灭菌30分钟。趁热将样品放入0.01％的亚甲蓝溶液中检漏。灯检，成品全检，包装入库。
实施例10：组合物粉针剂的制备
处方
制法：称取按照实施例7制备的山楂叶总黄酮提取物和按照实施例8制备的薤白和黄精粗多糖提取物。首先将配液用的容器具及抗生素玻璃瓶，胶塞等进行无菌处理。将山楂叶总黄酮提取物和薤白和黄精粗多糖提取物加入配液量40％的无菌注射用水中加热搅拌溶解完全。甘露醇加配液量的30％的无菌注射用水加热搅拌溶解完全，合并上述溶液，补加无菌注射用水至全量。加入配液量0.05％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。经0.22um的微孔滤膜精滤。检查溶液的澄明度，半成品化验。分装于抗生素玻璃瓶中，半压塞。将样品放入冻干机中冷冻干燥。按以下冻干工艺进行冻干：①预冻：降温至-35℃，保持温度5小时；②低温升华：-35℃保温，开真空泵抽真空保持2小时，然后缓慢升温，30小时左右将温度升至0℃；③高温干燥：2小时内升温至25℃，保温至2小时；④停机冻干结束。压塞，轧盖。成品全检，包装入库。
实施例11：组合物氯化钠注射液的制备
处方
制法：称取按照实施例7制备的山楂叶总黄酮提取物和按照实施例8制备的薤白和黄精粗多糖提取物。提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。将山楂叶总黄酮提取物和薤白和黄精粗多糖提取物加入配液量40％的注射用水中加热搅拌溶解完全，将氯化钠用配液量20％的注射用水溶解完全。合并上述溶液，补加注射用水至全量。加入配液量0.05％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。经0.45um的微孔滤膜精滤。检查溶液的澄明度，半成品化验。灌装于250ml的输液瓶中。115℃热压灭菌30分钟。灯检，成品全检，包装入库。
实施例12：组合物葡萄糖注射液的制备
处方
制法：称取按照实施例7制备的山楂叶总黄酮提取物和按照实施例8制备的薤白和黄精粗多糖提取物。提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。将山楂叶总黄酮提取物和薤白、黄精粗多糖提取物加入配液量40％的注射用水中加热搅拌溶解完全，将葡萄糖用配液量20％的注射用水溶解完全。合并上述溶液，补加注射用水至全量。加入配液量0.05％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。经0.45um的微孔滤膜精滤。检查溶液的澄明度，半成品化验。灌装于250ml的输液瓶中。115℃热压灭菌30分钟。灯检，成品全检，包装入库。
供试品稳定性考察
组合物胶囊剂，处方和制备方法参见实施例4胶囊剂的制备。
考察项目：性状、水分、含量。
加速试验和长期稳定性试验方法及结果：将本品置温度40℃±2℃、相对湿度75％±5％的条件下放置6个月和温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％的条件下放置24个月，各项指标均无明显变化，实验结果表明组合物胶囊剂长期放置基本稳定。
疗效观察
试验例1本发明组合物急性毒性试验的研究
取昆明种小白鼠20只，雌雄各半。禁食12小时，每只按0.4ml/10g灌服40％(g/mL)本发明组合物药粉(用纯化水配制)。已达最大浓度，最大给药体积。一日内灌服1次，连续观察7日内小鼠活动情况及死亡数量，结果小鼠按上述剂量口服给药后，7日内均无死亡，活动自如，饮食正常，毛有光泽，无稀便等。经计算小鼠的最大耐受量为16g/Kg，为临床成人用量的356倍。
试验例2本发明组合物一般药理研究的研究
1)对昆明种小鼠一般行为表现的影响
灌胃给药后，各给药组动物与空白组比较，活动正常、步态稳健、无流涎、肌颤等现象，未见产生不良反应。
2)对昆明种小鼠自发活动的影响
灌胃给药后0.5h将动物置小鼠活动计数仪活动箱内，适应5min后记录10min内的动物活动次数；各剂量组与空白组比较动物活动次数。结果给药后各组动物与空白组比较，活动次数未出现显著性差异，数据见表5。
表5药物对小鼠自主活动的影响
组别 剂量(mg/kg) 动物数 活动次数
空白组 - 10 236.4±21.64
高剂量组 2450 10 233.6±15.98
中剂量组 1220 10 239.7±18.79
低剂量组 409 10 231.5±18.59
注：*P＜0.05(与模型组比较)。
3)对阈下剂量戊巴比妥钠诱发昆明种小鼠入睡的影响
各组动物灌胃给药后1h，腹腔注射戊巴比妥钠32mg/kg(为预先测定的动物90％～100％小鼠翻正反射不消失的最大阈剂量)，记录戊巴比妥钠注射后15min以内翻正反射消失1min以上的鼠数。结果：各组实验动物在给予相应的药物后，对阈下剂量戊巴比妥钠诱发小鼠入睡未检测出差异，显示阈下剂量戊巴比妥钠诱发小鼠入睡未受影响，数据见表6。
表6对阈下剂量戊巴比妥钠诱发小鼠入睡的影响
组别 剂量(mg/kg) 动物数 入睡只数 雌雄 入睡率(％)
空白组 - 10 6 ♀4♂2 60
高剂量组 2450 10 8 ♀3♂5 80
中剂量组 1220 10 6 ♀4♂2 60
低剂量组 409 10 7 ♀5♂2 70
4)对戊巴比妥钠睡眠时间的影响
各组昆明种小鼠灌胃给灌胃给药后1h，腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg(为预先测定的动物100％入睡的最小剂量)，以翻正反射消失为入睡时间，从翻正反射消失至恢复时间为睡眠持续时间(min)。结果给药后各组动物与空白组比较，睡眠时间未出现显著性差异，数据见表7。
表7对戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响
组别 剂量(mg/kg) 动物数 入睡只数
空白组 - 10 30.85±1.38
高剂量组 2450 10 31.28±2.28
中剂量组 1220 10 29.07±2.74
低剂量组 409 10 30.88±2.47
注：*P＜0.05(与模型组比较)。
5)对小鼠协调运动的影响
取表面缠白胶布，直径1cm、长60cm铁棒，垂直固定。灌胃给药后1h，将小鼠放置于顶端，使其自然爬行，观察小鼠协调运动能力，并记录其爬到底端时间。结果各组动物与空白组比较，均稳步爬行，未有滑行及掉落现象，爬杆时间未出现显著性差异，数据见表8。
表8对小鼠爬杆时间的影响
组别 剂量(mg/kg) 动物数 爬杆时间(s)
空白组 - 10 11.94±0.68
高剂量组 2450 10 12.18±0.46
中剂量组 1220 10 12.23±0.52
低剂量组 409 10 11.57±0.89
注：*P＜0.05(与模型组比较)。
6)对Wistar大鼠心血管系统的影响
以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物，分离颈总动脉并与生物信号采集处理系统连接记录血压和心率；以肢体导联(II导联)描记心电图。灌胃给药前分别记录一次，再于灌胃给药后记录上述指标。结果给药后各组动物与空白组比较，心电及血压各项数值未出现显著性差异，数据见表9和表10。
表9对大鼠心电的影响
组别 剂量(mg/kg) 动物数 心率(次/分) 最大值(mV) 最小值(mV)
空白组 - 8 367.963±21.87 0.443±0.05 -0.27±0.13
高剂量组 1701 8 365.983±14.26 0.463±0.12 -0.27±0.11
中剂量组 850.5 8 366.263±43.52 0.503±0.02 -0.35±0.20
低剂量组 283.5 8 365.193±56.63 0.383±0.09 -0.27±0.20
注：*P＜0.05(与模型组比较)。
表10对大鼠血压的影响
组别 剂量(mg/kg) 动物数 收缩压(mmHg) 舒张压(mmHg)
空白组 - 8 73.06±12.99 45.52±13.04
高剂量组 1701 8 68.74±9.01 44.83±9.22
中剂量组 850.5 8 70.30±21.26 44.43±21.03
低剂量组 283.5 8 87.38±17.24 59.61±15.34
注：*P＜0.05(与模型组比较)。
7)对Wistar大鼠大鼠呼吸系统的影响
生物信号采集处理系统记录动物的呼吸频率、平均呼气峰压和平均吸气谷压。结果给药后各组动物与空白组比较，呼吸频率、呼气峰值及吸气谷值均未出现显著性差异，数据见表11。
表11对大鼠呼吸系统的影响
组别 剂量(mg/kg) 动物数 频率(次/分) 最大值(ml/s) 最小值(ml/s)
空白组 - 8 123.38±12.25 0.14±0.15 0.03±0.13
高剂量组 1701 8 119.43±7.00 0.25±0.12 0.14±0.14
中剂量组 850.5 8 117.34±17.03 0.24±0.10 0.11±0.10
低剂量组 283.5 8 113.86±1.93 0.27±0.16 0.20±0.19
注：*P＜0.05(与模型组比较)。
本发明组合物在一般药理学各项指标检测中，各给药组与空白组比较，未见显著性差异。说明本发明组合物对神经系统，心血管及呼吸系统不产生不良影响，可应用于临床。
试验例3本发明组合物药效学的研究一组合物治疗心肌缺血大鼠的药效学试验。
依照文献方法复制心肌梗死模型。以1％戊巴比妥钠(0.04g/kg)采用腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上。记录标准II导联心电图，行气管切开，与人工呼吸机相连通，开胸暴露心脏，于主动脉圆锥与左心耳之间用手术线穿过冠脉左室支，结扎左冠状动脉(假手术组只穿线不结扎)，心脏复位，鼓肺后迅速关闭胸腔，伤口处涂擦青霉素，预防创口感染。关胸后观察大鼠呼吸恢复情况，如有自主呼吸即可脱机放回鼠笼。以心电图ST段出现弓背抬高为心肌缺血造模成功。四周后形成慢性心肌缺血模型。
1)对冠状动脉结扎后心肌缺血大鼠S-T段的影响
将筛选后的心肌缺血大鼠除假手术组外随机均匀分为5组，假手术组、模型组、阳性药对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组6组，每组12只，共72只，一并饲养。给药组灌胃给予相应剂量的含药溶液，空白组、模型组灌胃给予等量的蒸馏水，每天一次，共10天。末次给药后各组大鼠用1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉，连接生物机能实验系统，监测肢体导联心电图，测量S-T段。组间比较用t检验表示，结果以X±S表示。结果各给药组与模型组比较能改善S-T段抬高，数据见表12。
2)对血清心肌酶的影响
实验动物分组及给药同上。于末次给药1小时，眼球取血，按试剂盒说明书操作，并用半自动生化分析仪检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性，记录数据。组间比较用t检验表示，结果以X±S表示。结果各给药组与模型组比较，本发明组合物能明显降低血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)，数据见表13。
[0125]表12对心电图ST段改变的影响
组别 动物数(只) 剂量(mg/kg) ST段改变(mv)
空白组 12 - 0.07±0.03
模型组 12 - 0.23±0.02*
高剂量组 12 1701 0.13±0.02#
中剂量组 12 850.5 0.13±0.01#
低剂量组 12 283.5 0.19±0.01#
阳性对照 12 324 0.13±0.02#
注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。
表13对血清心肌酶的影响(X±S)
注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。
3)对心肌代谢产物的影响
实验动物分组及给药同上。于末次给药1小时，眼球取血，按试剂盒说明书操作，并用756PC型紫外可见分光光度计检测血清乳酸(LD)、游离脂肪酸(NEFA)、Na-KATP酶指标。记录数据。组间比较用t检验表示，结果以表示。结果各给药组与模型组组比较，本发明组合物ATP酶活性降低，乳酸及游离脂肪酸含量降低，数据见表14。
表14对心肌代谢产物指标的影响
注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。
4)对血浆自由基损伤指标的影响
实验动物分组及给药同上。于末次给药1小时，眼球取血，按试剂盒说明书操作，并用756PC型紫外可见分光光度计检测丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)指标。记录数据。组间比较用t检验表示，结果以表示。结果各给药组与模型组比较，本发明组合物各给药组可以使丙二醛(MDA)含量减少，总超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性升高，数据见表15。
表15对心肌代谢产物指标的影响
注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05。
5)对血液流变学指标的影响
实验动物分组及给药同上。于末次给药1小时，腹主动脉取血，送与检验科检验。组间比较用t检验表示，结果以表示。结果各给药组与模型组比较，本发明组合物各给药组全血粘度降低、血浆粘度降低、红细胞压积降低、血沉降低，说明其能抑制红细胞聚集，降低红细胞脆性，增强其变形性，见表16。
表16对血液流变学的影响
注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05。
6)对血流动力学指标的影响
实验动物分组及给药同上。于末次给药1小时，将大鼠仰卧固定于手术台上，切开颈部皮肤，分离右侧颈总动脉，行动脉插管术，将含有0.1％肝素钠液的导管插入右侧颈动脉，经右颈总动脉插入左心室，根据显示器所示压力图形的改变来判断插管是否进入心室，心导管连接压力换能器，将信号输入生理记录仪中。并记录心率(HR)、左心室收缩压(LVSP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室舒张压(LVDp)、左心室舒张末期压力(LVDEp)、左心室内压最大下降速率(-dP/dtmax)。记录数据。组间比较用t检验表示，结果以表示。结果各给药组与模型组比较，本发明组合物各给药组可以使心率趋于正常、左室收缩压升高、左室舒张压降低，左室最大上升速率升高、左室最大下降速率升高、终末舒张压降低，见表17。
表17对血液流变学的影响
注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。
7)对心肌组织病理形态学的影响
实验动物分组及给药同上。于末次给药1小时，取出心脏，送于病理科检验。结果见表18。
表18对心肌组织病理形态学的影响
8)对心肌坏死面积测定
实验动物分组及给药同上。于末次给药1小时，处死大鼠，用镊子固定胸骨柄，剪开胸骨，将心脏整个剪下，用预冷的生理盐水冲洗除去血污，滤纸吸干水分，全心称重，-30℃冰冻半小时，在心脏结扎线下，沿左室长轴平行切成1～2mm厚的心肌片，均匀切成4～5片，置1％浓度的TTC溶液中(pH值7.4的PBS缓冲液)，37℃温孵15min，用水冲洗多余的染料，滤纸吸干水分，可见正常心肌为红色，缺血心肌为灰白色，剪去梗死心肌，称重，计算梗死范围(梗死区占全心重的百分比)。记录数据，组间比较用t检验表示，结果以 表示。结果各给药组与模型组比较，本发明组合物各给药组可以使心肌梗死面积明显减少，差异有显著性，见表19。
表19对心肌梗死面积的影响
组别 动物数(只) 剂量(mg/kg) 心肌梗死面积(％)
模型组 12 - 13.29±0.67
高剂量组 12 1701 7.03±0.83
中剂量组 12 850.5 5.66±0.36
低剂量组 12 283.5 9.71±1.27
阳性对照 12 324 7.21±0.70
注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05。
试验结论：本发明组合物对心肌缺血模型大鼠各项指标的改变具有的改善和治疗作用。
试验例4本发明组合物药效学的研究-组合物治疗高脂血症大鼠的药效学试验。
1)对高脂血症大鼠脂质代谢水平的影响
高脂饲料成分及制备：3％胆固醇，10％猪油，5％鸡蛋黄粉，0.3％胆酸钠，0.2％甲基硫氧嘧啶，81.5％基础饲料。10kg高脂饲料加1～2kg白糖。按比例先将胆固醇，鸡蛋黄粉，胆酸钠，丙基硫氧嘧啶，白糖研磨混合，然后加入温热的猪油中，再与基础饲料拌匀，即得。
造模：72只SD大鼠普通饲料喂养一周。随机抽选12只作为空白组鼠，称重标记，给予普通饲料喂养。其余60只鼠称重标记，给予高脂饲料喂养，均自由饮水，共喂养4周进行高脂血症模型的建立。分别记录开始造模后四周的大鼠体重，并于第四周末眼底静脉丛取血1.5～2ml于离心管内，静置，3500r·min-1离心15min，分离血清，用半自动生化分析仪测定其空腹血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量，检测方法遵照相应试剂盒的说明书。血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量均明显高于空白组时，说明高血脂动物模型制备成功。次日开始灌胃给药，阳性药以0.324g/kg灌胃给药，本发明组合物高，中，低剂量组分别以1.701g/kg，0.8505g/kg，0.2835g/kg灌胃给药，共10天。给药期间继续给予高脂饲料。于末次给药1小时后，眶内静脉丛取血2.5ml，4℃静置，3500r·min-1离心15min，分离血清，遵照相应试剂盒说明书，用半自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平以及载脂蛋白A1(ApoA1)和载脂蛋白B(ApoB)水平。组间比较用t检验表示，结果以X±S表示。结果各给药组与模型组相比较能明显减少血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和载脂蛋白B(ApoB)的含量，明显增加高密度脂蛋白胆固和载脂蛋白A1(ApoA1)含量，见表20。
2)对高脂血症大鼠脂质过氧化水平的影响
实验动物分组及给药同上。于末次给药1小时，眶内静脉丛取血，4℃静置，3500r·min-1离心15min，分离血清，遵照相应试剂盒说明书，用紫外可见分光光度计检测总超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，一氧化氮(NO)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。组间比较用t检验表示，结果以表示。结果各给药组与模型组比较能明显减少丙二醛(MDA)含量，明显增加一氧化氮(NO)的含量，升高总超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，见表21。
3)对高脂血症大鼠血液流变学指标的影响
实验动物分组及给药同上。于末次给药1小时，腹主动脉取血，送与检验科检验。组间比较用t检验表示，结果以表示。结果各给药组与模型组比较全血粘度降低、血浆粘度降低、红细胞压积降低、血沉降低，说明其能抑制红细胞聚集，降低红细胞脆性，增强其变形性，见表22。
[0153]表20对高脂血症脂质代谢水平的影响(X±S)
注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。
[0156]表21对高脂血症脂质过氧化水平的影响(X±S)
注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。
4)对高脂血症大鼠肝脏组织病理形态的影响
实验动物分组及给药同上。末次给药1h后，对肝组织进行常规取材，10％福尔马林溶液固定，常规HE染色。光学显微镜下观察肝脏组织形态。此项送于病理科检验。结果见表23。
表23对心肌组织病理形态学的影响
试验结论：对高脂血症模型大鼠各项指标的改变具有的改善和治疗作用。
[0159]表22对高脂血症血流变的影响(X±S)
注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。
试验例5本发明组合物长期毒性试验的研究。
实验目的：观察重复经口给予本发明组合物对大鼠所产生的毒性反应，出现的症状和严重程度，并提供毒副反应的靶器官及其损害的可逆程度，确定无毒反应剂量，以评价本发明组合物长期用药的安全性，为拟定临床试验剂量及观察指标提供参考。
试验动物：清洁剂SD大白鼠，雌雄各半，数量144只，体重80克～110克(6～9周龄)。
动物分组：动物首先在实验室正常饲养1周，剔除病鼠及异常鼠，取大鼠120只，按体重随机分为4组，每组30只，雌雄各半。分别为正常对照组，本发明组合物高、中、低三个剂量组。
给药剂量：小鼠的最大耐受量为16g/Kg，未出现毒性反应，因此，在此情况下，根据大鼠高剂量组给药应大于临床50倍以上的原则设计给药剂量。本发明组合物高剂量组大鼠按2.7g/kg给药(60倍临床拟用剂量)，中剂量组大鼠按1.35g/kg灌胃给药(30倍临床拟用剂量)，低剂量组大鼠按0.45g/kg灌胃给药(10倍临床拟用剂量)，体积为2ml/100g，正常对照组给予同体积蒸馏水。
给药时间：每周一至周六的上午8：30左右给药1次，周日不给药。连续给药6个月。
观察指标
1)一般症状观察
①观察时间：给药前和恢复期每天上午各笼观察，给药期间上、下午同时观察。
②观察例数：给药前全部购入动物，给药后全部试验动物。
③观察频度：从购入日到恢复期结束，每天一次。
④观察内容：观察动物的外观、被毛、步态、行为活动，对声音的反应，有无震颤、痉挛，呼吸是否平稳、有无异常。给药时及给药后，除注意观察上述反应外，还要特别观察有无嗜睡、呕吐、粪便形状及颜色等。给药同时还要观察捉拿动物时的反应性，眼、鼻、口周围的状态，下腹部、肛门处有无排泄物污染，皮肤颜色，有无外伤、肿瘤等，胸腹部的状态，肌紧张度等。
2)体重测定
①测定方法：采用电子天平测定。
②测定例数：给药前全部购入动物，给药后全部试验动物。
③测定频度：购入日和分组日(给药前)各测一次，给药期间以及恢复期每周称一次体重，另外，在进行解剖时先测定动物的体重。
3)摄食量测定
①测定方法：每组一共供应量减去一共剩余量即为每组每天摄食量，每组每天摄食量除以每组动物数即为每组每只动物每天摄食量。
②测定次数：给药前测定一次，给药期间和恢复期每周测量一次。
3)血液学及血液生化学检测
①检测时期：于给药3个月、6个月(给药结束)和恢复期结束各检测一次。
②检测例数：给药3个月、给药6个月(给药结束)和恢复期结束各组分别检测10只。
③采血方法：采血前大鼠禁食14小时以上，乌拉坦0.1g/100g体重腹腔注射麻醉，专用采血管和采血针从腹主动脉采血。血液学检测项目及方法见表24。
表24血液学检测项目及方法
项目 抗凝 测定法 使用仪器
红细胞计数(RBC) EDTA-K2 电阻法 动物血液分析仪
血红蛋白(HGB) EDTA-K2 光电比色法 动物血液分析仪
红细胞比积(HCT) EDTA-K2 直方图计算法 动物血液分析仪
平均红细胞体积(MCV) EDTA-K2 直方图计算法 动物血液分析仪
平均血红蛋白量(MCH) EDTA-K2 直方图计算法 动物血液分析仪
平均血红蛋白浓度(MCHC) EDTA-K2 直方图计算法 动物血液分析仪
白细胞计数(WBC) EDTA-K2 电阻法 动物血液分析仪
中性粒细胞百分比(GRAN％) EDTA-K2 直方图计算法 动物血液分析仪
淋巴细胞百分比(LYMPH％) EDTA-K2 直方图计算法 动物血液分析仪
单核细胞百分比(MONO％) EDTA-K2 直方图计算法 动物血液分析仪
血小板计数(PLT) EDTA-K2 直方图计算法 动物血液分析仪
注：当发现对造血系统有影响时，应进一步进行骨髓的检查。
④生化检测血样处理：腹主动脉采血后，室温静置1小时左右，离心3000rpm、10min，分离血清。血清如不能当日检测，将血清放入冻存管中，-80℃冻存。具体检测项目及方法参见现行版新药技术指导原则。具体检测项目及方法见表25。
表25血液生化指标检测项目及方法
项目 测定法 使用仪器
谷丙转氨酶(ALT) 连续监测法 全自动生化分析仪
谷草转氨酶(AST) 连续监测法 全自动生化分析仪
碱性磷酸酶(ALP) 连续监测法 全自动生化分析仪
肌酸磷酸激酶(CK) 连续监测法 全自动生化分析仪
尿素氮(BUN) 动力法 全自动生化分析仪
肌酐(CREA) 动力法 全自动生化分析仪
总蛋白(TP) 终点法 全自动生化分析仪
白蛋白(ALB) 终点法 全自动生化分析仪
球蛋白(GIB) 终点法 全自动生化分析仪
血糖(GLU) 终点法 全自动生化分析仪
总胆红素(TBIL) 终点法 全自动生化分析仪
总胆固醇(CHOL) 终点法 全自动生化分析仪
甘油三脂(TG) 终点法 全自动生化分析仪
钾离子(K＋)浓度 电极法 电解质分析仪
钠离子(Na＋)浓度 电极法 电解质分析仪
氯离子(Cl-)浓度 电极法 电解质分析仪
5)死亡或濒死动物的处理
①处理要求：尽早发现，及时解剖，尽力探求原因。
②濒死动物：记录濒死时间、体重、症状。
③死亡动物：记录死亡发现的时间、体重、尸检肉眼所见。
④生化检查：濒死动物处死前取血进行血液学及血生化学检测。
⑤病理检查：除确认由于灌胃所致死亡的动物外，其它濒死和死亡的动物均要进行病理组织学检查。
6)解剖
①解剖方法：用乌拉坦0.1g/100g体重腹腔注射进行麻醉。剖检前，对每个动物的情况进行全面检查；解剖时按系统逐一进行，观察脏器色泽、形态、位置关系以及脏器间有无黏连；脏器表面及消化管内膜有无淤血、充血、出血点、水肿、溃疡；胸腔、腹腔、心包腔有无积液等病理改变，如发现异常，在解剖所见记录的备注栏中准确记录其部位及病理变化类型。
②解剖时间：同检测时间
③解剖例数：给药3个月、给药6个月(给药结束)和恢复期1个月结束各组分别解剖10只。
7)脏器重量测定
测定方法：采用电子天平分别称量13个脏器(下表)的绝对重量(同时计算脏器系数)。
①测定时期：解剖时测定
②测定例数：同解剖例数相同
③脏器表：
序号 1 2 3 4 5 6 7
脏器 脑(大脑、小脑) 心脏 肝脏 脾脏 肺脏 肾脏 肾上腺
脏器 胸腺 子宫 卵巢 睾丸 附睾 前列腺
8)病理组织学检查
全部动物均按现行版新药技术指导原则取出所要求脏器组织，以及肉眼观察认为异常的组织及脏器。标本固定于10％福尔马林固定液内一周，修块之后再次固定12小时，组织(骨骼组织先脱钙)以梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，石蜡切片机切片，H.E.染色，中性树胶封固，光镜检查。记录病变的种类及程度。如某一组织发生病理改变，其它剂量组动物该组织也应进行组织病理学检查以确定剂量-反应关系。
观察脏器组织表：
实验结果
1)一般情况：各组动物在给药期间和四周恢复期，外观体征、行为活动正常，尿、粪性状无异样，饮食正常，各组动物体重增减无显著差异，组间差异不明显。进食量见表26、表27和表28。对体重的影响结果见表29、表30和表31。
表26用药3个月大鼠进食量(g/天/只)
表27用药3～6个月大鼠进食量(g/天/只)
表28恢复期大鼠进食量变化(g/天/只)
2)血液学指标检查结果
在大鼠给药90天和180天后24小时，各组大鼠各10只，腹主动脉采血，收集抗凝全血，用血球计数仪检测血液学各项指标。在最后一次给药后24小时，各组大鼠活杀10只后存留的10只大鼠停止给药，正常饲养，继续观察四周再全部活杀。在与用药6个月时的情况完全相同的条件下，检测的指标也完全相同。
给药90天后结果表明：与空白对照组比较，高剂量组红细胞总数(RBC)显著降低，红细胞平均体积(MCV)显著增大，单核细胞百分比(MON0％)显著下降；低剂量组淋巴细胞百分比(LYMPH％)显著下降。其余指标：如红细胞压积(HCT)、平均血红蛋白量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白(HGB)含量、白细胞总数(WBC)及其嗜中性粒细胞百分比(GRAN％)分类计数，各给药组与空白对照组比较，无显著差异，结果见表32和表33。
表32用药3个月对大鼠血常规的变化
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 l0 10
WBC(×109/L) 11.62±2.36 13.40±4.99 13.04±3.87 9.67±1.89
RBC(×1012/L) 8.65±1.09 7.37±1.08* 8.64±1.07 8.46±1.43
HGB(g/L) 152.0±13.79 135.2±21.87 147.3±13.55 146.0±17.10
HCT(％) 42.20±3.98 37.94±5.87 41.84±4.67 40.69±6.76
MCV(fL) 48.53±3.00 51.50±2.14* 48.11±1.56 48.77±1.82
MCH(pg) 17.69±0.66 18.40±0.94 17.06±0.79 17.52±1.10
MCHC(g／L) 361.69±14.19 357.11±19.48 355.91±18.72 361.13±26.64
PLT(×109/L) 545.48±59.08 570.47±111.40 564.87±72.45 542.25±84.24
注：与空白对照组比较，*P＜0.05。
表33用药3个月对大鼠WBC分类计数(％)的变化
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 10 10
GRAN％ 19.2l±9.41 29.02±20.14 23.83±12.10 23.44±13.50
LYMPH％ 58.81±10.49 48.15±21.79 47.69±18.74 40.84±21.72*
MONO％ 21.9±1.75 12.1±6.09*** 18.4±7.68 16.4±9.19
注：与空白对照组比较，*P＜0.05；***P＜0.001。
给药180天后结果表明：与空白对照组比较，高、低剂量组白细胞(WBC)总数明显降低(P＜0.05)，其中高剂量组降低最明显；中、低剂量组单核细胞百分比(MONO％)显著升高；高、中、低剂量组红细胞(RBC)总数、血红蛋白(HGB)含量及红细胞压积(HCT)显著降低，其中：中、低剂量组降低最明显；中剂量组平均血红蛋白量(MCH)及平均血红蛋白浓度(MCHC)明显升高；其余指标：如红细胞平均体积(MCV)、血小板计数(PLT)、白细胞总数(WBC)及其分类计数[淋巴细胞百分比(LYMPH％)及嗜中性粒细胞百分比(GRAN％)]，各给药组与空白对照组比较，组间无明显差异，结果见表34和表35。
四周恢复期结果表明：各给药组动物血液学指标与空白对照组比较，组间无明显差异，结果见表36和表37。’
[0227]3)血液生化指标检测结果
[0228]经过取抗凝全血的大鼠给药90天和180天后上述各组10只大鼠，继续收集血液，分离血清，用全自动生化分析仪，检测各项生化指标。在最后一次给药后24小时，各组大鼠活杀10只后存留的10只大鼠停止给药，正常饲养，继续观察四周再全部活杀。在与用药6个月时的情况完全相同的条件下，检测的指标也完全相同。
[0222]表34用药6个月对大鼠血常规的变化(X±SD)
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 10 10
WBC(×109/L) 14.63±2.69 8.82±2.76*** 12.46±4.06 10.72±3.51*
RBC(×1012/L) 10.60±1.43 8.57±1.74** 8.47±0.65*** 8.03±0.79***
HGB(g/L) 176.2±14.73 97.6±68.51** 152.2±6.03*** 126.9±25.82***
HCT(％) 52.38±4.77 42.30±8.43** 40.79±3.66* 39.94±2.49***
MCV(fL) 49.14±2.61 49.70±2.33 48.87±2.85 49.08±3.79
MCH(pg) 16.55±1.34 13.25±6.36 18.50±1.50* 15.88±3.14
MCHC(g/L) 339.47±139.82 266.91±121.25 377.84±19.36*** 319.65±62.17
PLT(×109/L) 843.62±141.04 726.50±135.12 854.09±110.99 813.99±150.79
注：与空白对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
[0223]表35用药6个月对大鼠WBC分类计数(％)的变化
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 10 10
GRAN％ 22.40±10.94 16.33±12.45 22.44±7.54 21.07±11.44
LYMPH％ 62.03±17.34 61.41±23.89 61.64±8.26 63.73±11.07
MONO％ 12.14±2.47 12.55±5.24 15.74±3.34* 15.42±2.74*
注：与空白对照组比较，*P＜0.05。
表36恢复期大鼠血常规的变化
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 10 10
WBC(×109/L) 14.29±4.96 10.10±4.12* 13.15±3.92 11.95±2.81
RBC(×1012/L) 9.02±1.22 8.50±0.56 8.71±0.71 8.45±1.16
HGB(g/L) 165.0±15.02 156.6±6.86 159.2±7.31 160.8±15.76
HCT(％) 43.46±4.42 41.84±2.18 42.44±2.56 41.71±4.63
MCV(fL) 48.29±2.46 49.42±3.15 48.75±2.00 49.39±3.19
MCH(pg) 18.24±1.24 18.46±1.35 18.29±0.87 19.08±1.68
MCHC(g/L) 378.50±10.16 374.61±11.21 375.01±9.97 385.19±12.57
PLT(×109/L) 820.35±86.69 773.22±145.35 819.78±165.77 794.92±120.18
注：与空白对照组比较，*P＜0.05。
表37恢复期大鼠WBC分类计数(％)的变化
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 10 10
GRAN％ 26.82±12.49 31.96±10.54 22.15±9.05 23.27±10.41
LYMPH％ 61.35±11.26 55.79±11.88 65.47±8.98 63.54±9.79
MONO％ 12.17±3.37 12.35±1.50 12.32±1.42 13.06±1.76
给药90天后结果表明：与空白对照组比较，中、低剂量组总蛋白(TP)含量显著升高，其中：低剂量组升高明显；低剂量组白蛋白含量(ALB)显著升高；高、中、低剂量组球蛋白(GIB)含量显著升高，其中：低剂量组升高最明显；高、中剂量组钠离子(Na＋)浓度显著升高；高剂量钾离子(K＋)浓度显著升高。其余指标：如谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、血糖(GLU)、总胆红素(TBIL)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、氯离子(Cl-)浓度各给药组与空白对照组比较组间差异不明显，无显著影响，结果见表38。
表38用药3个月对大鼠血液生化指标的影响
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 10 10
ALT(U/L) 80.82±53.35 82.08±18.88 57.94±16.45 66.65±18.80
AST(U/L) 218.53±143.08 148.53±36.36 151.28±16.75 174.52±38.92
ALP(U/L) 117.00±46.95 186.79±52.91 128.46±64.14 150.00±61.46
CK(U/L) 724.32±521.13 420.40±127.15 753.41±751.03 835.82±623.73
TP(g/L) 74.16±4.07 80.09±9.02 80.19±5.55* 84.46±6.42***
ALB(g/L) 32.62±2.20 32.21±5.58 34.26±2.31 35.01±1.64*
GIB(g/L) 41.40±2.74 48.08±9.00& 45*98±4.92* 49.35±5.68***
BUN(mmol/L) 6.39±1.28 7.74±2.43 7.29±1.48 6.51±1.61
CREA(μmol/L) 39.08±3.81 37.29±6.73 35.57±3.82 39.76±6.04
GLU(mmol/L) 5.12±0.68 4.42±0.99 4.67±0.87 5.02±0.64
TG(mmol/L) 0.54±0.30 0.88±0.46 0.79±0.89 0.62±0.28
CHOL(mmol/L) 1.76±0.39 1.65±0.36 1.96±0.40 1.87±0.20
TBIL(μmol/L) 0.58±0.35 0.61±0.40 0.68±0.36 0.45±0.25
K＋(mmol/L) 4.54±0.47 5.89±0.57* 5.02±1.00 5.49±1.35
Na＋(mmol/L) 142.75±1.76 144.68±2.47* 145.85±4.69* 145.05±4.87
Cl-(mmol/L) 101.32±1.94 101.32±2.53 101.63±2.62 101.87±2.31
注：与空白对照组比较，*P＜0.05；***P＜0.001。
给药180天后结果表明：与空白对照组比较，中、低剂量天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)、肌酐(CREA)含量显著降低，其中：低剂量组降低最明显；中、低剂量组总蛋白(TP)含量显著升高，中、低剂量组白蛋白含量(ALB)显著升高；高、低剂量组钠离子(Na＋)、氯离子(Cl-)浓度显著升高，其中：低剂量组升高最明显；其余指标：如丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、总胆红素(TBIL)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)各给药组与空白对照组比较组间差异不明显，无显著影响，结果见表39。
表39用药6个月对大鼠血液生化指标的影响
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 10 10
GPT(U/L) 111.72±86.66 100.99±42.43 83.18±35.37 72.79±13.09
GOT(U/L) 278.34±124.36 243.70±62.01 168.74±36.82 161.59±28.71**
AKP(U/L) 214.59±105.44 197.86±92.68 238.77±112.72 265.36±109.21
CK(U/L) 2009.38±1301.03 1694.36±941.84 1449.22±712.25 1163.54±402.84
BUN(mmol/L) 6.59±1.20 5.85±1.46 5.80±0.32 5.54±1.12
CR(μmol/L) 28.51±10.01 36.73±23.24 15.99±6.71** 18.22±8.76*
GLU(mmol/L) 10.11±5.40 10.85±3.91 5.23±0.51 5.05±0.59
TPR(g/L) 67.12±4.03 63.82±4.10 81.40±6.85 77.72±4.29***
ALB(g/L) 31.89±2.54 31.81±10.51 36.20±3.53 35.33±1.99**
TBIL(μmol/L) 0.81±0.51 0.58±0.92 1.26±0.64 1.17±0.35
CHO(mmol/L) 1.39±0.37 1.22±0.16 1.77±0.45 1.55±0.37
TG(mmol/L) 1.08±0.37 1.02±0.41 1.24±0.52 0.81±0.16
K＋(mmol/L) 5.14±0.64 4.94±0.25 5.01±0.46 4.60±0.31
Na＋(mmol/L) 137.95±1.76 140.84±2.11* 139.59±1.97 141.88±3.66**
Cl-(mmol/L) 99.59±1.47 100.49±2.56* 99.28±1.71 101.50±3.02**
注：与空白对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
四周恢复期结果表明：与空白对照组比较，中剂量组碱性磷酸酶(ALP)含量显著降低；高、低剂量组总蛋白(TP)含量显著升高；高、低剂量组白蛋白(ALB)含量显著升高；高、低剂量组球蛋白(GIB)含量显著升高，其中：低剂量组升高最明显；高剂量组钠离子(Na＋)浓度显著升高；其余指标：如谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、肌酸磷酸激酶(CK)、血糖(GLU)、总胆红素(TBIL)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、钾离子(K+)、氯离子(Cl-)浓度各给药组与空白对照组比较组间差异不明显，无显著影响，结果见表40。
表40恢复期大鼠生化指标的变化
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 10 10
ALT(U/L) 88.91±49.58 67.46±15.16 112.97±±10.61 63.59±11.69
AST(U/L) 149.82±34.56 133.24±19.90 208.58±80.67 142.86±37.03
ALP(U/L) 211.17±82.35 184.13±35.03 128.87±29.11** 248.77±99.21
CK(U/L) 635.88±196.52 873.03±292.43 838.57±305.67 926.19±729.85
TP(g/L) 70.70±3.55 76.18±2.41*** 67.25±7.40 80.54±3.19
ALB(g/L) 31.24±1.86 33.52±2.33*** 30.95±3.30 34.69±2.90*
GIB(g/L) 38.95±3.40 42.46±2.97* 37.12±5.36 45.80±3.71***
BUN(mmol/L) 7.67±1.39 7.61±0.99 6.74±1.40 7.29±0.95
CREA(μmol/L) 29.69±3.99 28.58±4.50 30.58±3.52 33.71±5.96
GLU(mmol/L) 6.28±1.18 5.03±0.32 6.49±1.55 5.34±0.78
TG(mmol/L) 0.68±0.28 0.99±0.49 0.72±0.44 1.00±0.46
CHOL(mmol/L) 1.39±0.40 1.46±0.27 1.49±0.39 1.67±0.38
TBIL(μmol/L) 0.25±0.11 0.27±0.19 0.27±0.36 0.31±0.24
K＋(mmol/L) 5.72±0.95 6.11±0.53 5.40±0.79 6.49±0.54
Na＋(mmol/L) 143.49±2.03 145.40±0.75* 140.93±1.22 145.53±3.43
Cl-(mmol/L) 101.20±1.18 102.28±1.24 99.82±1.84 101.45±2.14
注：与空白对照组比较，*P＜0.05；***P＜0.001。
4)系统尸检和病理组织学检查结果
给药90天后结果表明：各给药组脏器系数与空白对照组基本相近，说明药物对脏器重量无明显影响，见表41。空白对照组和各给药组大鼠的脏器病理组织学镜检，按半定量打分法统计结果。结果表明：除蒸馏水对照组及用药各组少数例见有轻度的心、肺、肾间质、小肠充血和肝脂肪变性，及少数例脾瘀血性肿大、淋巴结慢性炎，均未发现与药物毒性有关的病变，且有改变的动物各脏器散在各组，没有统计学意义。试验结果见表42。
给药180天后结果表明：三个给药剂量组的脏器系数与空白对照组基本一致，说明药物对脏器重量无明显影响，见表43。空白对照组和各给药组大鼠的脏器病理组织学镜检，按半定量打分法统计结果。结果表明：除蒸馏水对照组及用药各组少数例见有轻度的心、肝、膀胱、肺及少数例脾瘀血性肿大，淋巴结慢性炎，均未发现与药物毒性有关的病变，且有改变的动物各脏器散在各组，没有统计学意义。实验结果见表44。
四周恢复期结果表明：对脏器进行全面细致地肉眼尸检，未发现异常器官组织。各组动物脏器心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、子宫、脑、卵巢、胸腺等10个脏器组织的脏器系数与对照组基本相近，对脏器重量无明显影响，见表45。空白对照组和各给药组大鼠的脏器病理组织学镜检，按半定量打分法统计结果。结果表明：除蒸馏水对照组及用药各组少数例见有轻度的心、小肠、肝、肾、肺及少数例脾瘀血性肿大，淋巴结、胃、大肠慢性炎，均未发现与药物毒性有关的病变，且有改变的动物各脏器散在各组，没有统计学意义。实验结果见表46。
[0237]表41用药3个月对对大鼠脏器系数的影响
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 10 10
心占体重百分数(％) 0.38±0.08 0.35±0.06 0.38±0.09 0.36±0.10
肝占体重百分数(％) 3.21±0.65 2.91±0.57 3.38±0.72 3.08±0.45
脾占体重百分数(％) 0.16±0.10 0.19±0.04 0.18±0.09 0.19±0.02
肺占体重百分数(％) 0.61±0.29 0.59±0.11 0.60±0.05 0.63±0.19
肾占体重百分数(％) 0.32±0.05 0.27±0.05 0.28±0.06 0.28±0.04
肾上腺占体重百分数(％) 0.0131±0.0054 0.0118±0.0055 0.0116±0.0033 0.0130±0.0028
胸腺占体重百分数(％) 0.0710±0.0515 0.0683±0.0322 0.0844±0.0209 0.0777±0.0276
脑占体重百分数(％) 0.6746±0.0915 0.6744±0.1303 0.6770±0.1232 0.6938±0.0973
睾丸占体重百分数(％) 0.47±0.09 0.42±0.13 0.42±0.12 0.43±0.02
附睾占体重百分数(％) 0.22±0.05 0.25±0.04 0.23±0.04 0.23±0.05
前列腺占体重百分数(％) 0.14±0.08 0.13±0.04 0.15±0.05 0.13±0.06
子宫占体重百分数(％) 0.29±0.070 0.32±0.108 0.31±0.126 0.29±0.143
卵巢占体重百分数(％) 0.030±0.018 0.031±0.015 0.033±0.002 0.033±0.009
[0238]表42给药3个月大鼠病理检验结果
注：表中：“+”表示脏器有轻微病变；“-”表示脏器没有明显的病理改变；数字(1～10)表示动物的只数。
[0240]表43用药6个月对对大鼠脏器系数的影响
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 10 10
心占体重百分数(％) 0.38±0.09 0.38±0.06 0.40±0.06 0.35±0.05
肝占体重百分数(％) 3.29±0.59 3.34±0.52 3.26±0.71 3.23±0.46
脾占体重百分数(％) 0.19±0.05 0.14±0.03 0.16±0.03 0.19±0.07
肺占体重百分数(％) 0.51±0.06 0.46±0.08 0.47±0.08 0.54±0.06
肾占体重百分数(％) 0.27±0.07 0.29±0.05 0.30±0.05 0.28±0.06
肾上腺占体重百分数(％) 0.0123±0.0045 0.0127±0.0052 0.0110±0.0043 0.0119±0.0058
胸腺占体重百分数(％) 0.0945±0.0334 0.0927±0.0300 0.0907±0.0276 0.1013±0.0413
脑占体重百分数(％) 0.5837±0.0916 0.5920±0.0481 0.5709±0.0794 0.5843±0.0990
睾丸占体重百分数(％) 0.48±0.08 0.49±0.12 0.47±0.06 0.50±0.10
附睾占体重百分数(％) 0.16±0.02 0.16±0.06 0.14±0.01 0.18±0.03
前列腺占体重百分数(％) 0.15±0.03 0.15±0.03 0.13±0.06 0.15±0.06
子宫占体重百分数(％) 0.20±0.07 0.19±0.05 0.21±0.01 0.24±0.10
卵巢占体重百分数(％) 0.02±0.07 0.02±0.01 0.02±0.01 0.03±0.01
[0241]表44给药6个月大鼠病理检验结果
注：表中：“+”表示脏器有轻微病变；“-”表示脏器没有明显的病理改变；数字(1～10)表示动物的
只数。
表45恢复期大鼠脏器重量的变化
组别 对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数(只) 10 10 10 10
心占体重百分数(％) 0.35±0.10 0.35±0.06 0.33±0.06 0.31±0.05
肝占体重百分数(％) 3.12±0.85 3.20±0.56 3.06±0.53 3.18±0.43
脾占体重百分数(％) 0.19±0.06 0.19±0.05 0.17±0.07 0.16±0.06
肺占体重百分数(％) 0.54±0.09 0.54±0.09 0.53±0.10 0.52±0.12
肾占体重百分数(％) 0.28±0.05 0.33±0.05 0.30±0.04 0.29±0.04
肾上腺占体重百分数(％) 0.0106±0.0039 0.0092±0.0035 0.0097±0.0021 0.0101±0.0032
胸腺占体重百分数(％) 0.0728±0.0324 0.0760±0.0151 0.0771±0.0217 0.0698±0.0411
脑占体重百分数(％) 0.5507±0.0550 0.5721±0.0443 0.5671±0.0574 0.5579±0.0715
睾丸占体重百分数(％) 0.4200±0.06 0.3939±0.02 0.3983±0.12 0.4241±0.11
附睾占体重百分数(％) 0.1644±0.07 0.1422±0.06 0.1630±0.02 0.1525±0.04
前列腺占体重百分数(％) 0.1452±0.06 0.1340±0.06 0.1603±0.06 0.1387±0.07
子宫占体重百分数(％) 0.3613±0.02 0.3903±0.07 0.3534±0.09 0.3379±0.07
卵巢占体重百分数(％) 0.0211±0.006 0.0261±0.011 0.0249±0.003 0.0194±0.001
本发明组合物以10倍临床拟用剂量(0.45g/kg)、30倍临床拟用剂量(1.35g/kg)、60倍临床拟用剂量(2.7g/kg)，给大鼠连续灌胃180天，并进行实验中期(给药90天)和1个月恢复期实验观察。结果是：
(1)对大鼠生长发育和一般状况没有明显影响，仅在喂药初期时有一点影响，但在2周以后恢复正常。
(2)对大鼠血液学指标的影响
连续给药3个月，与空白对照组比较，本发明组合物对大鼠血液中红细胞、白细胞均有显著影响。其中：高剂量组能明显降低大鼠红细胞及白细胞中单核细胞百分比(MONO％)含量，能显著增大大鼠红细胞平均体积(MCV)；低剂量组显著降低大鼠白细胞中淋巴细胞百分比(LYMPH％)的含量。
连续给药6个月，与空白对照组比较，本发明组合物对大鼠血液中红细胞、白细胞、血红蛋白均有显著影响。其中：高、低剂量组能明显降大鼠血液中白细胞(WBC)含量；中、低剂量组能显著升高白细胞中单核细胞百分比(MONO％)的含量；高、中、低剂量组均能显著降低红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)含量及红细胞压积(HCT)；
停药1月后所有血液学指标均恢复正常。
[0244]表46大鼠长毒试验恢复期处死动物病理检查结果
注：表中：“+”表示脏器有轻微病变；“-”表示脏器没有明显的病理改变；数字(1～10)表示动物的只数。
(3)对大鼠血液生化指标的影响
连续给药3个月，与空白对照组比较，本发明组合物对大鼠血液中蛋白及电解质的含量影响较明显。其中：中、低剂量组能显著升高大鼠血液中总蛋白(TPR)含量；低剂量组能显著升高白蛋白含量(ALB)；高、中、低剂量组均显著升高球蛋白(GIB)含量；高、中剂量组显著升高钠离子(Na+)浓度且高剂量组还能显著升高钾离子(K＋)浓度。
连续给药6个月，与空白对照组比较，本发明组合物除对大鼠血液中蛋白及电解质的含量影响较明显外，还对天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)及肌酐(CREA)含量影响较大。其中：中、低剂量组能显著升高大鼠血液中总蛋白(TP)、白蛋白含量(ALB)含量；高、低剂量组能显著升高钠离子(Na+)、氯离子(Cl-)浓度。中、低剂量组能显著降低天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)、肌酐(CREA)含量。
停药1个月后，大鼠血液中天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)、肌酐(CREA)恢复正常；高、低剂量组中总蛋白(TPR)、白蛋白(ALB)及球蛋白(GIB)含量仍显著升高；中剂量组能显著降低碱性磷酸酶(ALP)的含量；高剂量组钠离子(Na＋)浓度仍显著升高。
(4)对大鼠脏器重量(心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、子宫、卵巢、睾丸、附睾、前列腺及脑共13个脏器)无明显影响，各组脏器系数基本相近。对脏器组织(除上述13个脏器外，还有胰腺、胃、回肠、结肠、脑垂体、脊髓、骨髓、淋巴结、膀胱、坐骨神经、甲状腺、甲状旁腺、主动脉、颌下腺、主动脉)病理组织学检查，未发现明显的与药物毒性有关的病理形态学改变。

Claims (12)

1.一种治疗心脑血管疾病的复方中药，其特征在于：该中药由包括以下成分和重量份数的中药提取物制成： 
山楂叶提取物1～100份  薤白提取物与黄精提取物两种合计1～100份 。
2.根据权利要求1所述的一种治疗心脑血管疾病的复方中药，其特征在于，中药提取物的重量份数为： 
山楂叶提取物1～10份  薤白提取物与黄精提取物两种合计1～10份 。
3.根据权利要求2所述的一种治疗心脑血管疾病的复方中药，其特征在于，中药提取物的重量份数为： 
山楂叶提取物2份  薤白提取物与黄精提取物两种合计1～5份 。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种治疗心脑血管疾病的复方中药，其特征在于：薤白提取物与黄精提取物的重量份数比例为1：2至2：1，所述山楂叶提取物和薤白提取物与黄精提取物分别为水或乙醇提取物，所述中药的剂型为任何一种临床上或药学上可接受的剂型。 
5.根据权利要求4所述的一种治疗心脑血管疾病的复方中药，其特征在于：所述剂型为滴丸、片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、口服液体制剂或注射剂。 
6.根据权利要求1至3任一项所述的一种治疗心脑血管疾病的复方中药，其特征在于：所述中药的活性成分主要由山楂叶提取物、薤白提取物与黄精提取物组成。 
7.根据权利要求6所述的一种治疗心脑血管疾病的复方中药，其特征在于：所述中药的活性成分由山楂叶提取物、薤白提取物与黄精提取物组成。 
8.根据权利要求1至3任一项所述的一种治疗心脑血管疾病的复方中药的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 
用水或任何其它适于进行中药有效成分提取的溶剂对山楂叶、薤白和黄精的每一种单独进行一次或多次的有效成分提取； 
或者用水或任何其它适于进行中药有效成分提取的溶剂对山楂叶、薤白和黄精任意两种或三种的混合物进行一次或多次的有效成分提取。 
9.根据权利要求1至3任一项所述的一种治疗心脑血管疾病的复方中药的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 
(1)山楂叶提取物的制备：按配比量称取山楂叶，用山楂叶重量2倍～40倍的溶剂浸泡时间0.1～10小时后，在30℃～100℃的条件下提取0.1～10小时，所述溶剂浸泡和提取操作可进行1次或重复进行多达6次，合并提取液，蒸馏回收溶剂，蒸馏液离心，用山楂叶药材重量0.1倍～100倍体积的溶剂洗涤沉淀一次或重复洗涤多达五次，合并离心后的上清液和洗涤沉淀的上清液，蒸馏浓缩至近干后干燥，粉碎，即得山楂叶提取物；所述溶剂是水或任何其它适于进行中药有效成分提取的溶剂， 
(2)薤白和黄精提取物的制备：按配比量称取薤白和黄精，在50℃～100℃条件下第一次加入薤白和黄精总重量2倍～40倍溶剂提取0.1～10小时，提取过程可进行一次或多达5次，合并提取所得煎液，过滤并将滤液蒸馏浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得薤白和黄精提取物；所述溶剂是水或任何其它适于进行中药有效成分提取的溶剂， 
(3)根据上述步骤(1)获得的山楂叶提取物和上述步骤(2)获得的薤白和黄精提取物混合 均匀后，加入适当的附加剂，制成注射剂、口服固体制剂或口服液体制剂，所述口服固体制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、或软胶囊，所述口服液体制剂为口服液或糖浆剂，所述的附加剂为填充剂、赋形剂、矫味剂或防腐剂中的一种或多种。 
10.根据权利要求9所述的一种治疗心脑血管疾病复方中药的制备方法，其特征在于： 
(1)称取山楂叶7份，第一次用山楂叶重量的8倍的45％乙醇浸泡时间2小时后，在80℃的条件下提取2小时，第二次用山楂叶重量的5倍的45％乙醇在80℃的条件提取1小时，第三次用山楂叶重量4倍量45％乙醇在80℃的条件提取0.5小时，第四次用山楂叶重量3倍量45％乙醇在80℃的条件提取0.5小时，合并提取液，蒸馏回收乙醇，蒸馏液用离心机在每分钟3000R的转速下离心30min，用药材量2倍体积的纯化水洗涤沉淀三次，合并离心后的上清液和洗涤沉淀的上清液，蒸馏浓缩至近干后干燥，粉碎，即得山楂叶提取物； 
(2)称取薤白3.5份和黄精1.5份，在100℃条件下第一次加入薤白和黄精总重量的10倍水煎煮2小时，第二次加入薤白和黄精总重量8倍水煎煮1小时，合并煎液，滤液浓缩至药材总重量1倍，加乙醇使含醇量为55％，静止或离心，取上清液，过滤，蒸馏回收乙醇，继续蒸馏浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得薤白和黄精提取物； 
(3)将步骤(1)获得的山楂叶提取物和步骤(2)获得的薤白和黄精提取物混合均匀后，加入适当的附加剂，制成10份口服固体制剂、软胶囊或口服液体制剂，所述的附加剂为：淀粉、乳糖、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁，蔗糖、甜菊糖、苯甲酸钠、大豆油或大豆磷脂中的一种或多种。 
11.根据权利要求9所述的一种治疗心脑血管疾病复方中药的制备方法，其特征在于还包括： 
(1)将权利要求9步骤(1)获得的山楂叶提取物，用1/2量的石油醚脱脂后，弃去石油醚液，再用乙酸乙酯萃取，萃取液减压回收乙酸乙酯并浓缩至干，加入适量水使溶解，加于聚酰胺柱上，先用2倍柱体积的水洗脱，弃去水洗液，然后用3倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩至60℃相对密度约1.02～1.08的浓缩液，干燥，得山楂叶总黄酮提取物； 
(2)将权利要求9步骤(2)获得的薤白和黄精提取物，用二倍体积的95％的乙醇沉淀，反复进行4次，用透析膜透析掉小分子物质，再次醇沉，最后用同等体积的无水乙醚和适量的丙酮洗涤沉淀物，干燥，得薤白和黄精粗多糖提取物； 
(3)将上述步骤(1)获得的山楂叶总黄酮提取物和上述步骤(2)获得的薤白和黄精粗多糖提取物混合均匀后，加入适当的附加剂，制成10份粉针剂、小容量注射剂或大容量注射剂。 
12.根据权利要求11所述的一种治疗心脑血管疾病复方中药的制备方法，其特征在于，在制成注射剂时，为了增加其溶解度，加入吐温-80增溶剂；粉针剂中加入赋形剂，所述赋形剂为甘露醇或葡萄糖；输液制剂中加入用于调节渗透压的等渗调节剂，所述等渗调节剂为氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、乳酸钠、葡萄糖、木糖醇、山梨醇和右旋糖苷中的一种或多种，优选氯化钠或葡萄糖。 
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