CN102083860B - 抗il-6抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

提供了结合人IL-6的抗体和其抗原结合部分。还提供的是编码此类抗体和抗原结合部分的核酸、制备此类抗体和抗原结合部分的方法、包含此类抗体或抗原结合部分的组合物以及此类抗体或抗原结合部分的用途。

Description

抗IL-6抗体及其用途

交叉引用相关专利和专利申请

本申请要求2008年6月18日提交的美国临时专利申请系列案61/073430的权益，其以其全文通过引用合并入本文。

联合研究协议

本文中的公开内容和权利要求由在Pfizer Inc.与Medarex，Inc.之间的联合研究协议的范围内进行的活动产生，所述协议在产生所请求保护的发明的日期当天或之前有效。

背景

本发明涉及结合人IL-6的抗体和其抗原结合部分。本发明还涉及编码此类抗体和其抗原结合部分的核酸；制备此类抗体和其抗原结合部分的方法；包含此类抗体或其抗原结合部分的组合物；以及此类抗体或其抗原结合部分的用途。

也称为干扰素B2(IFNB2)的白细胞介素-6(IL-6)是属于gp130配体家族并且由许多细胞类型包括T淋巴细胞、成纤维细胞和单核细胞产生的多效性细胞因子(pleiotropic cytokine)。IL-6以低水平组成型产生并且易于由感染性刺激物或炎性细胞因子诱导。IL-6结合特定受体IL-6R(gp80)，所述受体与细胞结合的或可溶性gp130异二聚化以形成功能性受体复合物。IL-6与其受体的结合启动了细胞事件，包括JAK-STAT3途径和ras-介导的MAP激酶信号转导的激活。IL-6可引发不同效应例如B细胞和单核细胞的增殖和分化、T细胞活化、造血作用、破骨细胞活化、角质形成细胞生长、神经元生长、肝细胞活化和来自肝细胞的急性期蛋白诱导。

IL-6在B细胞异常中起着重要作用，如在系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤和淋巴组织增殖性疾病中所证实的。类似地，IL-6还牵涉自身免疫和炎性疾病例如类风湿性关节炎和骨关节炎的发病机制。最近，间接证据表明IL-6与慢性阻塞性肺疾病和2型糖尿病的胰岛素抗性之间的关联。IL-6在免疫系统中具有促炎和抗炎作用，这表明该细胞因子可能在调控对疾病的生理应答中起着中心作用。因此，靶向IL-6可潜在地在多种疾病领域提供治疗益处。

已在许多疾病中观察到IL-6的产生增加，所述疾病包括：阿尔茨海默病、自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、炎症、心肌梗塞、佩吉特病(Paget′s disease)、骨质疏松症、肝纤维化、实体瘤(肾细胞癌)、前列腺和膀胱癌、神经癌(neurological cancer)和B细胞恶性肿瘤(例如，卡斯尔曼病(Castleman′s disease)，某些淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病和多发性骨髓瘤)。研究已显示，IL-6与许多此类疾病，特别地癌症和类风湿性关节炎的发病机制相关，从而阻断IL-6应当转化为临床益处。

概述

产生了特异性结合IL-6并且可用作IL-6受体拮抗剂的分离的抗体或其抗原结合部分，以及包含所述抗体或部分的组合物。

提供了组合物，所述组合物包含(i)抗IL-6抗体的重链和/或轻链、其可变结构域或其抗原结合部分，或编码它们的核酸分子；和(ii)药学可接受的载体。组合物还可包含另一种成分例如治疗剂或诊断剂。

还提供了诊断和治疗方法。类似地，提供抗IL-6抗体和其抗原结合部分以制造治疗炎性和非炎性病症的药剂。

提供了包含所述核酸分子的载体和宿主细胞以及重组产生由所述核酸分子编码的多肽的方法。

附图概述

图1显示重链和轻链可变区的种系氨基酸序列分别与抗IL-6抗体9C8、9C8N68T T83S和22B5的重链和轻链可变区相比较的比对(对于9C8、9C8N68T T83S和22B5抗体只显示错配)。CDR以下划线标示并且错配缺口以井号(pound sign)(#)标示。

图2显示对于媒介物和9C8N68T T83S IgG₂抗体的总血清C反应蛋白(CRP)，如通过电化学发光免疫测定法测定的。各点代表来自用0.5mg/kg和5.0mg/kg媒介物或抗IL-6抗体9C8N68T T83S IgG₂给药的3只食蟹猴(cynomolgus monkey)的血清CRP的平均值(±SE)。利用Meso Scale Discovery(MSD)测量血清CRP。在第0小时的时间点上施用LPS。

详述

定义和一般技术

术语“抗体”与免疫球蛋白同义并且被理解为本领域内通常理解的意义。特别地，术语抗体不受产生抗体的任何特定方法限制。例如，术语抗体包括，特别地，重组抗体，单克隆抗体和多克隆抗体。

基本抗体结构单位是四聚体。各四聚体由2个相同的多肽链对组成，各对具有一个“轻”链(大约25kDa)和一个“重”链(大约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包含大约100至120或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。各链的羧基末端部分界定了主要负责效应子功能的恒定区。人轻链分类为κ和λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区与恒定区通过大约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。

各重链/轻链对的可变区(V_H和V_L)分别形成抗原结合部位。因此，完整的IgG抗体，例如，具有2个结合部位。除了在双功能或双特异性抗体中外，两个结合部位是相同的。

重链和轻链的可变区展示通过3个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接相对保守的构架区(FR)的相同的一般结构。术语“可变的”是指，可变结构域的某些部分在抗体之间在序列上差异很大并且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而可变性在抗体的整个可变结构域中不是均匀分布的，其集中在CDR中，所述CDR被更高度保守的FR分隔。来自各对的两条链的CDR通过FR对齐，使得能够结合特定的表位。从N端至C端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸至各结构域的分配依照KabatSequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等人Nature 342：878-883(1989)(其公开内容通过引用合并入本文)中的定义。

如本文中所使用的，以编号提及的抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。例如，抗IL-6单克隆抗体9C8是与从杂交瘤9C8或其亚克隆获得的抗体相同的抗体。

术语“类似物”或“多肽类似物”表示包含与一些参照氨基酸序列具有大体上的同一性的区段并且具有与参照氨基酸序列大体上相同的功能或活性的多肽。通常，多肽类似物相对于参照序列包含一个或多个保守氨基酸置换(或插入或缺失)。类似物可以是至少20或25个氨基酸长或可以是至少50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸长或更长，并且通常可与全长多肽一样长。一些实施方案包括与参照氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个置换的多肽类似物。在一些情况下，参照氨基酸序列是种系序列。抗体或免疫球蛋白分子的类似物可由本领域技术人员容易地制备。

如本文中所论述的，对IL-6抗体或其抗原结合部分的氨基酸置换是这样的氨基酸置换，其通常：(1)减少对蛋白酶解的易感性，(2)减少对氧化的易感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)缺失或产生用于糖基化的位点，或(4)提供或改进此类类似物的其他物理化学或功能性质但仍然保持对IL-6的特异性结合。

类似物可包括对正常发生的肽序列的不同置换。例如，可在正常发生的序列中产生单个或多个氨基酸置换，优选保守氨基酸置换。保守氨基酸置换通常基本上不改变亲本序列的结构特征。

术语抗体的“抗原结合部分”是指保持特异性结合抗原(例如，IL-6)的能力的抗体片段。已显示，可通过全长抗体的片段进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”中包括的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)结构域抗体，(dAb)(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由V_H结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域V_L和V_H由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的连接体连接它们，所述合成的连接体使得它们能够产生为其中V_L和V_H区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv))。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。还包括其他形式的单链抗体，例如双抗体(diabody)。双抗体是二价的双特异性抗体，其中V_H和V_L结构域在单个多肽链上表达，但在相同链的两个结构域之间使用太短以致不允许配对的连接体，从而迫使结构域与另一条的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位。此外，来自抗体的一个或多个CDR可被整合入更大的多肽链，该更大的多肽链可被共价或非共价地连接至另一个多肽链。在具有一个或多个结合部位的实施方案中，结合部位可彼此相同或可以不同。

此外，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白质或肽的共价或非共价结合而形成的更大的免疫粘附素分子的部分。此类免疫粘附素分子的实例包括使用链霉抗生物素蛋白核心区域制备四聚体scFv分子和使用半胱氨酸残基、标志物肽和C末端多组氨酸标签制备二价和生物素化的scFv分子。其他实例包括其中将来自抗体的一个或多个CDR共价或非共价地整合入分子以使其成为特异性结合目的抗原例如IL-6的免疫粘附素。在此类实施方案中，可将CDR整合为更大的多肽链的部分，可将其共价连接至另一条多肽链，或可将其非共价地整合。可使用任何合适的技术(例如分别地完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶降解)来从完整抗体制备抗体部分(例如Fab和F(ab′)₂片段)。此外，可使用各种重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附素分子。

术语“嵌合抗体”意指包含来自两个或更多个不同的抗体(包括来自不同物种的抗体)的区域的抗体。例如，嵌合抗体的一个或多个CDR可来源于人IL-6抗体。在一个实例中，可将来自人抗体的CDR与来自非人抗体例如小鼠或大鼠的CDR组合。在另一个实例中，所有CDR可来源于人IL-6抗体。在另一个实例中，可在嵌合抗体中组合来自多于一个人IL-6抗体的CDR。例如，嵌合抗体可包含来自第一人IL-6抗体的轻链的CDR1、来自第二人IL-6抗体的轻链的CDR2和来自第三人IL-6抗体的轻链的CDR3，并且来自重链的CDR可来源于一个或多个其他IL-6抗体。此外，构架区可来源于从其获得一个或多个CDR的IL-6抗体之一或来源于一个或多个不同人抗体。此外，术语“嵌合抗体”意欲包括任何上述组合，其中所述组合包括人和非人抗体。

术语“竞争”意指第一抗体或其抗原结合部分与第二抗体或其抗原结合部分竞争结合，其中与在第二抗体不存在的情况下第一抗体的结合相比较，在第二抗体存在的情况下，第一抗体与其相应表位(cognate epitope)的结合可检测地减少。其中第二抗体与其表位的结合在第一抗体存在的情况下也可检测地减少的另一情况可以存在，但不是必须存在。即，第一抗体可抑制第二抗体对其表位的结合而无需第二抗体抑制第一抗体对其各自表位的结合。然而，在各抗体可检测地抑制另一个抗体与其相应表位或配体的结合的情况下，无论程度相同、更大还是更小，抗体被认为彼此“交叉竞争”对它们各自表位的结合。无论这样的竞争或交叉竞争发生的机制是什么(例如，空间位阻、构象变化或对共同表位或其部分的结合)，基于本文中提供的教导，本领域技术人员将理解，此类竞争性和/或交叉竞争性抗体可用于本文中公开的方法。

术语“保守氨基酸置换”意指氨基酸残基被具有拥有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基置换。一般地，保守氨基酸置换将基本上不改变蛋白质的功能性质。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此相异在于保守置换的情况下，可上调百分比序列同一性以就置换的保守性质进行修正。用于进行该调整的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置换组可以例如是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。

保守置换也可以是在Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992)(通过引用合并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250log-likelihood matrix)中具有正值的任何变化。“中度保守的”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。

“接触”是指以使抗体可影响IL-6的生物学活性的方式，使抗体或其抗原结合部分与靶IL-6或其表位在一起。这样的“接触”可在体外例如在试管、培养皿等中完成。在试管中，接触可只包括抗体或其抗原结合部分与IL-6或其表位或其可包括完整细胞。还可将细胞维持或培养在细胞培养皿中并且在该环境中与抗体或其抗原结合部分接触。在本说明书中，可在对更复杂的活生物体体内使用抗体之前测定特定抗体或其抗原结合部分影响IL-6相关病症的能力，即抗体的IC₅₀。对于生物体外部的细胞，存在将IL-6与抗体或其抗原结合部分接触的多种方法，并且所述方法对于本领域技术人员来说是熟知的。

术语“ELISA”是指酶联免疫吸附测定。该类型的测定对于本领域技术人员来说是熟知的。

术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体或与分子相互作用的任何蛋白质决定簇(determinant)。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的相互作用的所有点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。一旦确定抗原上的期望的表位，就可产生抗该表位的抗体。实现这一点的方法是进行交叉竞争研究以发现彼此竞争结合的抗体，即抗体竞争对抗原的结合。基于它们的交叉竞争“划分(binning)”抗体的高通量方法描述于国际专利公开案WO 03/48731中。

术语“表达控制序列”，如本文中所使用的，意指进行与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和当需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质视宿主生物体而不同；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，一般而言，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意欲包括，在最低程度上，其存在是表达和加工所必需的所有元件，并且还可包括其存在是有利的额外组件，例如前导序列和融合伴侣序列。

术语“种系”是指当抗体基因和基因区段通过生殖细胞从亲本传递给后代时抗体基因和基因区段的核苷酸序列。该种系序列不同于成熟B细胞中编码抗体的核苷酸序列(其已在B细胞成熟过程中通过重组和高突变事件而被改变)。

术语“人抗体”是指其中可变和恒定结构域序列是人序列的任何抗体。该术语包括具有来源于人基因的序列(包括已被改变以例如减少可能的免疫原性、增加亲和力、消除可能引起不期望的折叠的半胱氨酸残基等的序列)的抗体。该术语还包括在非人细胞中重组产生的此类抗体，所述非人细胞可能赋予与人细胞赋予的典型糖基化形式不同的糖基化。可以以许多方法制备此类抗体。

术语“人源化抗体”是指非人来源的抗体，其中作为非人物种的抗体序列的特征的氨基酸残基被人抗体的相应位置中发现的残基替代。该“人源化”过程可减少所得抗体在人中的免疫原性。可使用本领域内熟知的任何合适的技术来人源化非人来源的抗体。可利用重组DNA技术用相应的人序列置换CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或构架结构域，从而对目的抗体进行工程改造。术语“人源化抗体”在其意义内还包括嵌合人抗体和CDR移植抗体。嵌合人抗体包括非人物种的抗体的V_H和V_L以及人抗体的C_H和C_L结构域。CDR-移植抗体通过用除了人以外的动物的抗体的V_H和V_L的CDR分别置换人抗体的V_H和V_L的CDR来产生。

术语“分离的多核苷酸”，如本文中所使用的，意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其组合，根据其来源，“分离的多核苷酸”(1)不与和“分离的多核苷酸”一起被天然发现的多核苷酸的全部或部分结合，(2)有效地连接至与其非天然连接的多核苷酸，或(3)不作为更大的序列的一部分天然发生。

术语“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”是指根据其来源或衍生的来源：(1)不与在天然状态下与其相伴的天然结合的组分结合；(2)不含来自相同物种的其他蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；或(4)非天然发生的蛋白质、多肽或抗体。因此，例如通过化学方法合成或在与其所天然源自的细胞不同的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分相“分离的”。还可使用任何合适的蛋白质纯化技术通过分离使得蛋白质大体上不含天然结合的组分。

分离的抗体的实例包括已使用IL-6亲和纯化的IL-6抗体和通过细胞系体外合成的IL-6抗体。

术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的结合亲和力平衡常数。当K_D≤1mM，优选≤100nM和最优选≤10nM时，抗体被认为特异性结合抗原。可利用表面等离子体共振技术，例如使用实施例7中描述的BIACORE^TM系统来测量K_D结合亲和力常数。

术语“k_off”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。可利用表面等离子体共振技术，例如使用实施例7中描述的BIACORE^TM系统来测量k_off解离速率常数。

术语“天然发生的核苷酸”，如本文中所使用的，包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”，如本文中所使用的，包括例如具有修饰的或取代的糖基的核苷酸。本文中提及的术语“寡核苷酸连接”包括寡核苷酸连接例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。需要时，寡核苷酸可以包含用于检测的标记物。

“有效连接的”序列包括与目的基因邻近的表达控制序列和以反式或在远距离起作用以控制目的基因的表达控制序列。

术语“百分比序列同一性”，在核酸序列的背景中，是指当就最大相应性对齐时，两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以是至少大约9个核苷酸，通常至少大约18个核苷酸，更通常至少大约24个核苷酸，通常至少大约28个核苷酸，更通常地至少大约32个核苷酸和至少大约36、48或更多个核苷酸。存在许多本领域内已知的可用于测量核苷酸序列同一性的不同算法。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit(其为Wisconsin Package Version 10.0，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序)比较多核苷酸序列。FASTA，其包括例如程序FASTA2和FASTA3，提供质询序列与搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分比序列同一性(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000)；Pearson，Methods Enzymol.266：227-258(1996)；Pearson，J.Mol.Biol.276：71-84(1998)；通过引用合并入本文)。通常使用特定程序或算法的缺省参数。例如，可使用FASTA和其缺省参数(6的字长和用于评分矩阵的NOPAM因子)或使用GCGVersion 6.1(通过引用合并入本文)中提供的Gap和其缺省参数来测定核酸序列之间的百分比序列同一性。

除非另外指出，否则核酸序列包括其互补序列。因此，具有特定序列的核酸应当理解为包括具有其互补序列的其互补链。

术语“百分比序列同一性”在氨基酸序列的背景中是指，当就最大相应性对齐时两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以是至少大约5个氨基酸，通常至少大约20个氨基酸，更常见地至少大约30个氨基酸、通常至少大约50个氨基酸，更常见地至少大约100个氨基酸和甚至更常见地大约150、200或更多个氨基酸。存在许多本领域内已知的可用于测量氨基酸序列同一性的不同算法。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit(其为Wisconsin Package Version 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序)比较氨基酸序列。

通常使用序列分析软件测量多肽的序列同一性。蛋白质分析软件使用分配给不同置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)的相似性的量度来匹配序列。例如，GCG包括程序例如“Gap”和“Bestfit”，所述程序(使用由程序指定的缺省参数)可用于测定密切相关的多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其类似物之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG Version 6.1(University of Wisconsin，WI)。还可使用缺省或推荐的参数利用FASTA比较多肽序列，参见GCG Version 6.1。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供质询序列与搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分比序列同一性(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000))。当将序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库相比较时，另一个算法是计算机程序BLAST，特别地blastp或tblastn(使用程序提供的缺省参数)。参见，例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)。

术语“重组宿主细胞”(或简称“术语细胞”)，如本文中所使用的，是指已向其中引入了重组表达载体的细胞。应当理解，“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅指特定受试细胞而且还指这样的细胞的后代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在连续世代中发生，因此，这样的后代可能实际上与亲本细胞并不完全一致，但其仍然包括在本文中使用的术语“宿主细胞”的范围内。

当至少大约60至75％的样品展示单一类别的多肽时，蛋白质或多肽是“大体上纯的”、“大体上均一的”或“大体上纯化的”。多肽或蛋白质可以是单体或多聚体。大体上纯的多肽或蛋白质通常可包含蛋白质样品的大约50％、60％、70％、80％或90％w/w，更通常地大约95％，和优选纯度可以高于99％。蛋白质的纯度或同质性可通过任何合适的方法来显示，例如进行蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在用染料对凝胶染色后显现单个多肽条带。如本领域技术人员将认识到的，可使用HPLC或用于纯化的其他方法提供更高的分辨率。

术语“大体上的相似性”或“大体上的序列相似性”，当指核酸或其片段时，是指当通过适当的核苷酸插入或缺失与另一个核酸(或其互补链)最佳对齐时，在至少大约85％、至少大约90％和至少大约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，如通过任何熟知的序列同一性算法例如FASTA、BLAST或Gap(如上论述的)测量的。

当用于多肽时，术语“大体上的同一性”或“大体上的相似性”，是指两个氨基酸序列，当例如使用程序GAP或BESTFIT，利用程序提供的缺省缺口权重，进行最佳对齐时，共有至少70％、75％或80％的序列同一性，优选至少90％或95％的序列同一性，和更优选至少97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施方案中，不相同的残基位点相异于保守氨基酸置换。

术语“表面等离子体共振”是指允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的改变(例如使用BI ACORE^TM系统(Pharmacia BiosensorAB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.))来分析实时生物特异性相互作用的光学现象。关于进一步描述，参见Jonsson U.等人，Ann.Biol.Clin.51：19-26(1993)；Jonsson U.等人，Biotechniques 11：620-627(1991)；Jonsson B.等人，J.Mol.Recognit.8：125-131(1995)；和Johnsson B.等人，Anal.Biochem.198：268-277(1991)。

“治疗有效量”是指可将待治疗的病症的一个或多个症状缓解至一定程度的施用的治疗剂的量。关于类风湿性关节炎的治疗，治疗有效量是指具有至少一个下列作用的量：减轻关节的结构损伤；抑制(即，减缓至一定程度，优选停止)液体在关节面(joint area)中的积累；和将与类风湿性关节炎相关的一个或多个症状缓解至一定程度(或，优选，消除)。

“治疗”、“医治”和“疗法”是指减轻或消除生物学病症和/或其伴随症状的方法。

术语“利用”，就特定基因而言，是指在B细胞成熟过程中，抗体中特定区域的氨基酸序列最终来源于该基因。例如，短语“利用人V_H-3家族基因的重链可变区氨基酸序列”是指其中抗体的V_H区在B细胞成熟过程中来源于基因区段的VH-3家族的情况。在人B细胞中，存在超过30个不同的用以产生抗体的功能性重链可变区基因。因此，特定重链可变区基因的使用在结合抗原和功能活性的组合性质方面表示抗原-抗体相互作用的结合基序。如将认识到的，基因利用分析只提供了抗体结构的有限概观。由于人B细胞随机产生V-D-J重链或V-Jκ轻链转录物，因此存在许多发生的次级过程，包括但不限于体细胞高度突变、添加和CDR3延伸。参见，例如，Mendez等人Nature Genetics15：146-156(1997)。

术语“载体”，如本文中所使用的，是指能够转运已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一些情况下，载体是质粒，即，可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA片段。例如，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接入病毒基因组。在另一种情况下，载体能够在已向其中引入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在另一个实例中，载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后被整合入宿主细胞的基因组，从而可随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称，“表达载体”)。

术语“标记”或“标记的”是指将另一个分子整合在抗体中。例如，标记是可检测的标志物，例如，整合放射性标记的氨基酸或连接至具有生物素基部分(其可通过标记的抗生物素蛋白(例如，含有可通过光学或比色法来检测的荧光标志物或酶促活性的链霉抗生物素蛋白)来检测)的多肽。在另一个实施方案中，标记物或标志物可以是治疗剂，例如，药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的各种方法在本领域内是熟知的并且可被使用。用于多肽的标记物的实例包括但不限于下列：放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标记物(例如，FITC，罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记物(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标志物、生物素基团、被第二报道分子识别的预先确定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合部位、金属结合结构域、表位标签)、磁性试剂例如钆螯合剂、毒素例如百日咳毒素、泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及其类似物或同源物。在一些情况下，通过不同长度的间隔臂连接标记物以减少潜在的空间位阻。

使用的治疗方法

还提供了通过给有此需要的患者施用IL-6抗体来抑制IL-6活性的方法。可治疗性使用本文中描述的任何抗体或其抗原结合部分。在优选实施方案中，IL-6抗体是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在另一个优选实施方案中，IL-6是人的并且患者是人患者。可选择地，患者可以是表达IL-6(IL-6抗体与其交叉反应)的哺乳动物。可给表达IL-6的、用作人疾病的动物模型的非人哺乳动物施用抗体。此类动物模型可用于证明抗体的治疗功效。

可给表达异常高水平的IL-6的患者施用IL-6抗体或其抗体部分。可施用抗体一次，或可施用抗体多次。可以以每天3次至每6个月或更长时间1次施用抗体。施用可以按计划进行，例如每天3次，每天2次，每天1次，每2天1次，每3天1次，每周1次，每2周1次，每个月1次，每2个月1次，每3个月1次和每6个月1次。还可通过微型泵(minipump)连续施用抗体。可通过粘膜、口腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌内、胃肠外或瘤内途径施用抗体。可施用抗体1次，至少2次或进行至少一段时间直至状况得到治疗、缓解或治愈。通常只要状况存在，就施用抗体。通常将抗体作为本文中描述的药物组合物的部分来施用。抗体的剂量通常在0.1至100mg/kg、0.5至50mg/kg、1至20mg/kg和1至10mg/kg的范围内。抗体的血清浓度可通过任何合适的方法来测量。

还提供了用于治疗哺乳动物包括人的异常细胞浸润的方法，其包括给哺乳动物施用治疗有效量的在治疗异常细胞浸润中有效的IL-6抗体或其抗原结合部分，如本文中描述的。

IL-6抗体或其抗原结合部分可用于治疗类风湿性关节炎。它们还可用于治疗其中牵涉IL-6的其他疾病。可使用IL-6抗体或其抗原结合部分治疗的其他疾病的实例包括骨关节炎，特别地与骨关节炎相关的疼痛、卡斯尔曼病、青少年特发性关节炎、成人斯蒂尔病(adult-onset Still′s disease)、骨质疏松症、脓毒症、多发性骨髓瘤、肾细胞癌和克罗恩病。

下面论述可使用抗体或其抗原结合部分治疗的一些疾病。

类风湿性关节炎(RA)被认为是产生发炎的关节(其最终肿胀、变得疼痛和经历关节的软骨、骨和韧带的降解)的慢性自身免疫和炎性疾病。RA的结果是关节的变形、不稳定和僵硬以及关节内的结瘢。关节以高度可变的速率恶化。许多因素包括遗传易感性(geneticpredisposition)可影响疾病的模式。患类风湿性关节炎的人可具有温和的病程，在无病的情况下长时间才消退的偶尔潮红，或稳定地进行的疾病(其可以是慢的或快的)。类风湿性关节炎可突然发作，并且许多关节同时发炎。更常见地，其令人不易察觉地开始，逐渐影响不同的关节。炎症对于受累身体两侧上的关节通常是对称的。通常手指、足趾、手、足、腕、肘和踝中的小关节首先开始发炎，然后是膝盖和髋部的关节发炎。

类风湿性关节炎疼痛通常是躯体性伤害性关节疼痛。肿胀的腕关节可挤压神经并且导致因腕管综合征(carpal tunnel syndrome)而引起的麻木或麻刺感。囊肿可在受累膝盖的后边发生，其可破裂，从而引起小腿的疼痛和肿胀。

骨关节炎的特征在于关节软骨的丧失和骨的肥大。骨关节炎的发作通常是渐进的，疼痛是共同的早期症状。随着骨关节炎的进展，关节活动减少，并且可发生压痛和骨擦感(grating sensation)。骨关节炎通常影响手、足、脊柱和大的承重关节例如髋部和膝盖。通常基于症状或利用X射线(其可显示关节间隙的变窄、增加的软骨下骨的密度、关节外围骨赘的形成和软骨下骨髓中假性囊肿的形成)诊断骨关节炎。进行血液检测以排除可模拟骨关节炎的其他状况。此外，在诊断骨关节炎时，可进行关节穿刺术，其中使用消毒的针取出关节液。关节液分析用于排除痛风、感染和其他关节炎病因。骨关节炎也称为退行性关节病、退行性关节炎或骨关节炎。

莱特尔综合征(Reiter′s syndrome)(反应性关节炎)是关节和附着在关节上的腱的炎症，通常伴随眼结膜和粘膜(例如口和泌尿生殖道的粘膜)的炎症以及伴随特征性皮疹(rash)。莱特尔综合征也称为反应性关节炎，因为关节炎症似乎是对源于肠或生殖道中的感染的反应。该综合征在20至40岁男性中最常见。存在2种形式的莱特尔综合征：一种通过性传播疾病例如衣原体感染而发生，另一种通常在肠道感染例如志贺氏菌病或沙门氏菌病后发生。(患有此类感染的大多数人不发生莱特尔综合征)。在暴露于这些感染后发生莱特尔综合征的人似乎对该类型的反应具有遗传易感性(其与在患有强直性脊柱炎的人中发现的相同基因部分相关)。

感染性关节炎是由滑液或关节周组织的细菌、真菌或病毒感染引起的关节炎症。感染性关节炎的危险因素包括老年(即，60岁以上)；酒精中毒；贫血；关节穿刺术或手术；慢性医学疾病(例如，肺病或肝病)；糖尿病；血友病；免疫缺陷，包括HIV；免疫抑制治疗，包括皮质类固醇；IV药物使用；恶性肿瘤；假体关节植入；肾衰竭；类风湿性关节炎；镰刀形细胞病；皮肤感染和系统性红斑狼疮。类风湿性关节炎患者处于细菌性关节炎的显著增加的危险中。关节感染可以是急性的，其中关节疼痛和肿胀突然发作(例如，在数小时至数天内)，或慢性的，其中轻微的症状隐伏发展。急性细菌性关节炎通常伴随中度至严重的关节疼痛、温热(warmth)、压痛和受限制的运动。慢性细菌性关节炎通常伴随逐渐的肿胀、轻度温热、关节面的极轻微发红或不发红以及酸痛(其可以是轻微的)。

银屑病关节炎是在少数银屑病患者中发生以及在一些获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者中日益增加地发生的影响关节的炎性关节炎。银屑病关节炎可以是轻微的或可产生与在类风湿性关节炎中观察到的关节变化相似的严重的关节变形。可受银屑病关节炎影响的关节包括手指和足趾的远端指节间(DIP)关节，和通常大关节和小关节例如骶髂和脊柱的不对称受累。皮肤或指甲(趾甲)的银屑病可在关节受累之前或之后。银屑病关节炎的时程特征在于可以与或可以不与皮肤恶化和好转同步的关节炎恶化和好转，并且可发生至慢性关节炎的进展。诊断包括银屑病、银屑病的家族史、显示DIP关节受累的X线表现、不对称大关节受累、用于排除类风湿性关节炎的类风湿性因子的阴性血液检测和在一些患者中HLA-B27抗原的存在(尤其是当脊柱受累时)的诊断。

多关节炎是牵涉5个或更多个关节的任何类型的关节炎。2、3或4个关节的关节炎称为寡关节炎或少关节炎。多关节炎最常见地由自身免疫病症例如类风湿性关节炎、银屑病关节炎或红斑狼疮引起，但也可由感染引起。多关节炎在任何年龄都可发生并且无性别特异性。

青少年关节炎(Juvenile arthritis)是在16岁之前开始的关节炎。存在几种不同类型的青少年关节炎。最常见的类型是青少年类风湿性关节炎(JRA)，也称为青少年特发性关节炎。JRA包括全身发病型JRA、少关节型JRA(其影响5个以下的关节)，和多关节型JRA(其影响5个或更多个关节)。JRA的诊断包括考虑症状，拍摄x射线照片和进行血液分析。医生可用于诊断JRA的特定试验包括完全血细胞计数、针对感染的血液培养、骨髓检查、红细胞沉降率的检查、类风湿性因子抗体测定、抗核抗体测定和骨扫描。

青少年类风湿性关节炎是与类风湿性关节炎相似的关节的持久性或复发性炎症，其始于16岁以前并且特征在于关节或结缔组织的炎症。存在几种类型的青少年类风湿性关节炎，其通过在疾病的第一个月期间发生的症状和受影响的关节数目来确定。这些类型包括少关节青少年类风湿性关节炎、多关节炎和全身性疾病(斯蒂尔病)。在少关节青少年类风湿性关节炎中，4个或更少的关节(通常腿的关节)受到影响。在多关节炎中，5个或更多个(有时多至20至40个)关节受影响。在全身性疾病(斯蒂尔病)中，可牵涉任何数目的关节。

青少年反应性关节炎是与反应性关节炎相似的关节的持久性或复发性炎症，但其始于16岁以前。

青少年银屑病关节炎是患者中始于16岁以前的银屑病关节炎，并且特征在于慢性关节炎和银屑病的存在；或慢性关节炎和至少两个下列状况的存在：指炎、甲异常(nail abnormality)(例如，蚀损斑或甲剥离)和至少一个直系亲属的银屑病的家族史。如在患有银屑病关节炎的成人中，关节炎可在皮肤状况之前发生。青少年银屑病关节炎发作时的主要模式是小关节和大关节的不对称寡关节炎(通常具有指炎)。

在一个方面，IL-6介导的病症的特征在于纤维化。术语“纤维化”，如本文中所使用的，是指特征在于响应组织损伤的纤维变性材料(例如，细胞外基质)的过度沉积和代谢的病理状况。在许多情况下，纤维化代表正常修复过程(即，伤口愈合)，其由于慢性或过度组织损伤而出错，从而导致成纤维细胞或星形细胞活化和增殖以及胶原积累。纤维化状况包括，与血管疾病例如心脏病、脑病和外周血管病以及所有主要组织和器官系统例如眼、皮肤、肾、肺、肠和肝相关的纤维增生性病症(Wynn，Nature Reviews 4：583-594(2004)；Bataller，R和Brenner，D.，J.Clin.Invest.115：209-218(2005))。其他来源是化学治疗药物、辐射诱发的纤维化以及损伤和烧伤。虽然纤维化状况包括一大类病理状况，但据信对于大多数此类状况，导致纤维变性组织积累的一般机制具有许多共同的元素。通常状况响应炎性细胞的流入而被起始，然后被浸润细胞(例如，巨噬细胞、T细胞)与组织内的驻留细胞(resident cell)(例如，星形细胞、成肌纤维细胞、枯否细胞)之间的细胞因子信号转导途径保持。此外，周细胞是参与硬皮病发生的至关重要的纤维发生细胞类型，并且已显示PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)减缓周细胞的增殖以及抑制患有该进行性疾病的患者的皮肤损伤。在肾中，白细胞浸润在介导慢性肾病中的肾小管间质性炎症和纤维化中起主要作用。

如本文中所使用的，也将“纤维化”与“成纤维细胞积累和胶原沉积”同义地使用。成纤维细胞是结缔组织细胞，其分散在整个躯体的结缔组织中。成纤维细胞分泌含有I型和/或III型胶原的非刚性细胞外基质，附近的成纤维细胞或星形细胞迁移入伤口、增殖并且产生大量的胶原细胞外基质。胶原是富含甘氨酸和脯氨酸的纤维状蛋白，其为细胞外基质和结缔组织、软骨和骨的主要成分。胶原分子是称为α链的三链螺旋结构，其在绳状螺旋中彼此相互缭绕。胶原以几种形式或类型存在；其中，I型(最常见的)，发现于皮肤、腱和骨中；III型发现于皮肤、血管和内部器官中。示例性纤维化状况包括但不限于：

(I)与纤维化相关的肺病，例如，特发性肺纤维化、辐射诱发的纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、硬皮病、博来霉素诱发的肺纤维化、慢性哮喘，硅肺，石棉诱发的肺纤维化、急性肺损伤和急性呼吸窘迫(包括细菌性肺炎诱发的，创伤诱发的，病毒性肺炎诱发的，呼吸机诱发的，非肺性(non-pulmonary)脓毒症诱发的和吸入(aspiration)诱发的)；

(II)与损伤/纤维化(肾纤维化)相关的慢性肾病，例如，狼疮、糖尿病、硬皮病、肾小球肾炎、局灶节段性肾小球硬化、IgA肾病、高血压、同种异体移植、狼疮和Alport；

(III)肠纤维化，例如，硬皮病和辐射诱发的肠纤维化；

(IV)肝纤维化，例如，肝硬化，酒精诱发的肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胆管损伤，原发性胆汁性肝硬化，感染或病毒诱发的肝纤维化(例如慢性HCV感染)和自身免疫肝炎；

(V)头颈纤维化，例如，辐射诱发的；

(VI)角膜瘢痕形成，例如，LASIX^TM、角膜移植和小梁切除术(trabeculectomy)；

(VII)肥厚性瘢痕形成和疤痕疙瘩，例如，烧伤诱发的和手术诱发的；和其他纤维化疾病，例如，肉瘤样病、硬皮病、脊髓损伤/纤维化、骨髓纤维化、血管再狭窄、动脉粥样硬化、韦格纳氏肉芽肿(Wegener′sgranulomatosis)、混合性结缔组织病和佩罗尼氏病(Peyronie′sdisease)。

术语“纤维肌痛”也称为纤维肌痛综合征。纤维肌痛的AmericanCollege of Rheumatology(ACR)1990分类标准包括3个月以上的慢性泛发性疼痛史和体检时在18个压痛点中的11个(或更多个)点上疼痛的存在，其中压痛点在腰部以上和以下以及在躯体两侧都有发生(参见例如，Wolfe等人，Arthritis Rheum.，1990；33：160-172)。纤维肌痛患者通常展示以异常性疼痛(响应正常非疼痛刺激的疼痛)和痛觉过敏(增加的对疼痛刺激的敏感性)形式存在的疼痛感觉异常。人患者中纤维肌痛的影响可使用下列来评估：ACR标准、纤维肌痛指数问卷(FIQ)总分、疼痛严重度指数(例如，VAS或Likert疼痛等级)和干扰、压痛点的数目或疼痛阈值评估。

虽然慢性泛发性疼痛是纤维肌痛的标志性症状，但患者通常还展现其他症状，包括下列症状的一个或多个：疲劳、睡眠障碍、偏头痛或紧张性头痛、肠易激综合征、尿频率的变化、晨僵、麻木和麻刺感、痛经、多种化学物质过敏(multiple chemical sensitivities)、难以集中注意力和影响皮肤小血管的循环问题(雷诺现象(Raynaud′sphenomenon))。与引起慢性疼痛的许多状况一样，纤维肌痛患者还可经历纤维肌痛诱发的焦虑、抑郁或两者。一些纤维肌痛患者发现，冷、潮湿的天气、情绪压力、用力过度和其他因素加重他们的症状。

与纤维肌痛相关的疼痛是指与纤维肌痛综合征相关的任何疼痛，包括作为纤维肌痛的标志的慢性泛发性疼痛和与纤维肌痛的其他症状相关的疼痛。

强直性脊柱炎是引起脊柱和骶髂关节的关节炎的风湿性疾病。其从终生存在的背痛的间歇性发作变化至攻击脊柱、外周关节和其他身体器官的严重慢性疾病。一般地，第一症状是在数周或数月的过程中逐渐发生的腰部和臀部的频繁疼痛和僵硬。疼痛通常是隐约的和弥漫性的，而不是局部性的。强直性脊柱炎通常通过彻底的体检包括x-射线、个体医疗史和强直性脊柱炎的家族史以及血液工作(包括对HLA-B27的检测)来诊断。

银屑病是可折磨所有年龄的人的慢性炎性皮肤病症。临床上，银屑病最常影响肘、膝、头皮、腰骶部、臀沟或龟头的皮肤。受银屑病影响的皮肤通常包含一个或多个干燥损伤(其包含界限清楚的、粉红色至鲑鱼色的斑(由特征性银白色的、疏松粘着的鳞屑覆盖))。在大约30％的银屑病患者中，指甲(趾甲)也受到例如蚀损斑或甲剥离影响。涉及所有形式的银屑病，包括环状银屑病(psoriasis annularis)和环形银屑病(psoriasis annulata)，其也称为环状银屑病(psoriasiscircinata)；关节病性银屑病；弥漫性银屑病或弥散性银屑病；剥脱性银屑病；屈侧银屑病；地图状银屑病；回旋状银屑病；钱币形银屑病；掌银屑病；点状银屑病；和称为Zambusch型普通脓疱性银屑病或简称脓疱性银屑病的罕见变型。在形态学上，已确定的银屑病损伤具有熟知的组织学特征例如表皮增厚和角化不全的鳞屑。在病理上，银屑病目前被认为是T细胞介导的自身免疫疾病。银屑病的发作通常是渐进的，并且典型时程特征在于慢性好转和复发以及偶尔急剧恶化。银屑病的诊断通过评估患者的临床体征和症状以及银屑病的家族史来进行。仅通过目视检查患者的皮肤损伤来诊断银屑病很少是困难的，因此这通常是完整诊断所需要的全部。然而，有时将皮肤活检组织经历组织学分析以寻找银屑病的体征。

系统性红斑狼疮(″SLE″)，也称为散布性红斑狼疮，是原因不明的慢性炎性结缔组织病症，其可累及关节、肾、浆液性表面和血管壁并且主要在年轻妇女中但也在儿童中发生。90％的SLE病例在妇女中发生。SLE可以以发热突然开始(模拟急性感染)或可在数月或数年中隐伏发展(伴随发热和身体不适)。血管性头痛，癫痫或精神病可能是初始的发现。可能显现与任何器官系统有关的表现。范围从间歇性关节痛至急性多关节炎的关节症状在大约90％的患者中发生并且可在其他表现出现之前存在数年。在长期疾病中，具有明显的继发关节变形的掌指关节上的囊性插入糜烂(capsular insertional erosion)可发生，而无明显边缘糜烂(Jaccoud′关节炎)的X射线证据。然而，大多数狼疮多关节炎是非破坏性的和非致畸形的。

系统性红斑狼疮在5岁以下是罕见的，大多数具有SLE的儿童在青春期发生该疾病。青少年SLE的体征和症状与成人中的类似。然而，儿童具有特别高水平的从盘状至全身性疾病的转换。

痛风(也称为痛风性关节炎)是由于体内积累太多的尿酸(所述尿酸形成晶体，沉积在关节中并且引起炎症)而引起的外周关节的复发性急性或慢性关节炎。在痛风的急性发作期间，在关节中，通常在大趾的关节中存在肿胀、炎症和剧痛。慢性痛风可在发作数年后开始，永久性损伤关节和使关节变形并且破坏肾细胞。大多数情况发生在男性中并且第一次发作极少在30岁以前发生。

未分化脊椎关节病(USpA)是用于描述不满足强直性脊柱炎或相关疾病的明确诊断的标准的人中的脊柱炎的症状和体征的术语。许多明确确定的综合征包括在脊椎关节病家族中，包括强直性脊柱炎、银屑病关节炎、炎性肠病的关节炎、莱特尔综合征、慢性反应性关节炎和起止点炎(enthesitis)相关青少年关节炎。随着时间流逝，一些具有USpA的人将发展明确确定形式的脊柱炎例如强直性脊柱炎。

青少年脊椎关节炎(JSpA)，也称为青少年脊椎关节病是用于一组儿童风湿性疾病的医学术语，其在16岁以前引起关节炎并且可持续终生。青少年脊椎关节病包括未分化脊椎关节病、青少年强直性脊柱炎、青少年银屑病关节炎、与炎性肠病相关的关节炎(肠致病性关节炎(enteropathogenic arthritis))、反应性关节炎、(莱特尔综合征是反应性关节炎的一种类型)和SEA综合征(血清阴性、起止点病、关节病)。JSpA通常引起身体下部例如骨盆、髋、膝和踝的关节的疼痛和炎症。身体的其他部位也可受到影响，例如脊柱、眼、皮肤和肠。也可发生疲劳和昏睡(lethargy)。

克罗恩病是通常影响末端回肠和结肠但可在GI道的任何部位发生的非特异性慢性透壁炎性疾病。慢性腹泻伴随腹痛、发热、厌食、体重减轻和右下部肿块或发胀是最常见的克罗恩病症状。较不常见的症状包括食欲不振、发热、盗汗、直肠痛和直肠出血。克罗恩病可影响结肠、直肠和小肠并且，在罕见的情况下，也影响胃、口和食道。克罗恩病病理的最常见模式是(1)特征在于右下部腹痛和压痛的炎症；(2)由肠狭窄引起并且导致严重的绞痛、腹胀、便秘和呕吐的复发性部分梗阻；(3)弥散性空肠回肠炎(diffuse jejunoileitis)，伴随导致营养不良和慢性衰弱的炎症和阻塞；和(4)腹瘘和脓肿，通常在晚期发生，通常引起发热、疼痛性腹部肿块和全身性消瘦。在患有上述炎性或梗阻症状的患者中和不具有显著GI症状但具有肛周瘘或脓肿或具有原因不明的关节炎、结节性红斑、发热、贫血或生长矮小(在儿童中)的患者中应当怀疑患有克罗恩病。实验室检查所见是非特异性的并且可包括贫血、白细胞增多、低白蛋白血症和增加的急性期反应物水平(反映在升高的ESR、C反应蛋白或血清类粘蛋白中)。伴随升高的碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶的结肠病通常反映原发性硬化性胆管炎。诊断通常利用x射线来进行。

在晚期的情况下，可看到拉丝征(string sign)，伴随明显的回肠狭窄和肠袢的分离。在早期的情况下，x射线诊断有时可能非常困难，但气钡双重造影灌肠剂(air double-contrast barium enema)和灌肠法可显示浅表口疮和线性溃疡。结肠镜检查和活组织检查可帮助确认克罗恩结肠炎的诊断并且允许直接显现和活组织检查回肠末端。上GI内窥镜检查法可鉴定具有上GI症状的克罗恩病患者的胃和十二指肠受累。

溃疡性结肠炎是在结肠粘膜中产生的慢性、炎性和溃疡性疾病，其最常见的特征在于出血性腹泻。不同强度和持续时间的出血性腹泻之间存在无症状间隔，这是溃疡性结肠炎的最常见症状。通常发作隐伏性地始于增加的排便紧迫性、轻微的下腹部绞痛以及粪便中的血和粘液。然而，发作可以是急性的和爆发性的，伴随突然强烈的腹泻、发热、腹膜炎的体征和深度的毒血症。一些病例在有记载的感染(例如，阿米巴病、杆菌性痢疾)后发生。当溃疡被限制在直肠乙状结肠时，粪便可以是正常的或硬的和干燥的，但在排便之间伴随或发生含有红细胞和白细胞的粘液的直肠排放。全身性症状是轻微的或不存在。如果溃疡邻近地延伸，那么粪便就会变得松散，并且患者可具有大于10次排便/天，并通常伴有严重的绞痛并和令人痛苦的直肠里急后重(tenesmus)，在晚上也不停息。粪便可以是水样的，可含有粘液，并且通常几乎完全由血和脓组成。全身乏力、发热、贫血、厌食症、体重减轻、白细胞增多和低白蛋白血症可伴随广泛活动的溃疡性结肠炎存在。患者的病史和粪便检查允许假定地诊断溃疡性结肠炎(其应当总是通过乙状结肠镜检查确认，所述乙状结肠镜检查提供疾病活动的直接即时的指征)。在早期病例中，粘膜是细小颗粒状和易碎的，丧失正常血管模式并且通常具有分散的出血区；极微小的创伤(易碎性)引起多个极小点中的出血。粘膜迅速破裂成红色的海绵状表面，其上点布有许多微小的渗出血和脓的溃疡。随着粘膜进行性受累，炎症和出血延伸入肠肌肉。具有大量脓性渗出物的大粘膜溃疡表征严重的疾病。相对正常的或增生性炎性粘膜的岛(假息肉)突出在溃疡粘膜区域的上方。活组织检查可以是非特异性的并且有时不能排除急性感染(自限性)结肠炎；然而，表明慢性的特征(例如，扭曲的隐窝结构、隐窝萎缩、慢性炎性浸润)支持溃疡性结肠炎的诊断。甚至在无症状间隔期间，乙状结肠镜检查的表现极少正常；一定程度的易碎性或颗粒性几乎总是存在。正常血管模式丧失，并且活组织检查显示慢性炎症的证据。腹部的普通x射线检查(plain x-ray)有时通过显示袋形成(haustration)的丧失、粘膜水肿和患病肠中成形粪便的不存在来帮助判断结肠炎的严重度和接近程度。然而，在疾病过程的晚期，应当评估整个结肠以确定受累的程度。全结肠镜检查是最灵敏的且广泛使用的方法，虽然钡灌肠也可提供信息。结肠镜检查和活组织检查是评估狭窄的性质所必须进行的。如果炎症是高度局灶性的或如果能看到肉芽肿，那么活组织检查还可帮助区分溃疡性结肠炎与克罗恩病。

肠易激综合征(IBS)是牵涉整个GI道，引起复发性上GI或下GI症状包括不同程度的腹痛、便秘和/或腹泻以及腹部气胀的运动性病症。肠易激综合征(IBS)的病因还不清楚。未发现解剖学病因。情绪因素、饮食、药物或激素可加重或恶化加强的GI运动性。IBS的特征是可通过排便来缓解的疼痛、肠排便习惯的交替模式、腹胀、粘液便(mucus in the stool)和在排便后不完全排空的感觉。一般而言，疼痛的特征和部位、促发因素和排便模式对每一个患者来说都不相同。IBS患者还可具有肠外症状(例如，纤维肌痛、头痛、性交困难、颞下颌关节综合征)。已描述了IBS的两个主要临床类型。在便秘型IBS中，便秘是共同的，但肠排便习惯可发生变化。大多数患者在结肠的至少一个区域具有疼痛，其与周期性便秘和更正常的大便频率交替相关。粪便通常含有清亮或白色的粘液。疼痛是疝气痛的，突如其来的或持续钝痛；其可通过排便来缓解。饮食通常触发症状。还可发生胃气胀、肠胃气胀、恶心、消化不良和胃灼热。腹泻型IBS的特征在于在起床时或在饮食过程中或其后立即发生的急促腹泻。夜间腹泻是不常见的。疼痛、胃气胀和直肠急迫是共同的，并且可发生失禁。IBS的诊断基于特征性排便模式、疼痛的时间和特征以及通过体检和常规诊断测试对其他疾病过程的排除。由于在该综合征中缺乏可容易辨认的结构或生物化学异常，因此医学界已开发了称为罗马标准(Romecriteria)的共同定义和标准来帮助诊断IBS。根据罗马标准，IBS通过下列来指征：腹痛或不适(其(1)通过排便来缓解和/或(2)与大便的频率或稠度的变化相关)，加上2个或更多个下列指征：改变的大便频率、改变的大便组成、改变的大便排泄、粘液排泄和胃气胀或腹胀的感觉。腹部的触诊可显示压痛，特别在左下部，有时与可触知的触痛的乙状结肠相关。应当对所有患者进行常规直肠指诊和对妇女进行骨盆检查。

肠易激病(Irritable bowel disease，IBD)，也称为炎性肠病，特征在于GI道中不同部位上的慢性炎症。IBD包括两个已知的临床亚型，克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。疾病模式中的某些差异表明了克罗恩病与溃疡性结肠炎之间的区别。

与IBD和IBS相关的疼痛可表现为慢性或急性疼痛。例如，IBS的特征是可通过排便缓解的急性疼痛，而慢性腹痛是克罗恩病的特征。虽然与IBD和IBS相关的疼痛可在肠外或内脏外发生，但通常这些疾病产生内脏痛。内脏痛是与内脏(包括腹腔的器官)相关的疼痛。这些器官包括性器官、脾、肠、结肠、直肠和消化系统的其他器官。内脏痛具有5个重要的临床特征：(1)其不是从所有内脏引起(器官例如肝、肾、大多数实体内脏和肺实质对疼痛不敏感)；(2)其并非总是与内脏损伤关联；(3)其是弥散性的并且难以定位；(4)其涉及其他位置；以及(5)其伴随着运动反射和自主反射，例如恶心、呕吐和在肾绞痛中发生的腰部肌肉紧张。

疼痛是用于警告来自外部环境的潜在有害刺激的危险的重要的生理保护机制。系统通过一套特殊的初级感觉神经元运转并且通过外周传导机制由有害性刺激激活(关于综述，参见Millan，1999，Prog.Neurobiol.，57，1-164)。这些感觉纤维称为伤害感受器，其是具有慢传导速度的特征性小直径轴突。伤害感受器编码有害刺激的强度、持续时间和性质以及刺激的位置(通过它们至脊髓的区域组织性投射(topographically organized projection))。在感受伤害的神经纤维上发现伤害感受器，所述神经纤维存在两种主要类型，A-δ纤维(有髓鞘的)和C纤维(无髓鞘的)。在背角中进行复杂加工后，将通过伤害感受器输入而产生的活性直接或通过脑干中继核而转移至腹侧基底丘脑(ventrobasal thalamus)，然后传递至皮层，并在皮层中产生疼痛的感觉。

疼痛通常可分类为急性或慢性疼痛。急性疼痛突然开始并且是短暂的(通常12周或更短)。其通常与明确的原因例如明确的损伤相关并且通常是急剧且严重的。其是可在由手术、牙科工作、拧伤或扭伤导致的特定损伤后发生的疼痛类型。急性疼痛通常不导致任何持续的心理反应。相反地，慢性疼痛是长期疼痛，通常持续3个月以上并且导致严重的心理和情绪问题。慢性疼痛的常见实例是神经性疼痛(例如糖尿病性神经痛(painful diabetic neuropathy)、疱疹后神经痛)、腕管综合征、背痛、头痛、癌症痛、关节炎痛和慢性手术后疼痛。

当通过疾病或创伤对身体组织产生重大损伤时，伤害感受器激活的特征被改变，并且在外围，围绕损伤局部和伤害感受器终止的中心，存在敏化作用(sensitisation)。这些效应导致提高的疼痛的感觉。在急性疼痛中，这些机制在促进可更好地确保修复过程发生的保护性行为中是有用的。正常预期是，在损伤愈合后，敏感性回复至正常。然而，在许多慢性疼痛状态中，超敏性远比愈合过程更持久并且通常因神经系统损伤而产生。该损伤通常导致与适应不良和异常活性相关的感觉神经纤维的异常(Woolf & Salter，2000，Science，288，1765-1768)。

在临床上，当不适和异常敏感性特征存在于患者的症状中时，疼痛存在。患者倾向于是十分异质性的并且可呈现不同的疼痛症状。此类症状包括：1)自发性疼痛(其可以是钝痛、灼痛或刺痛)；2)对有害刺激的夸大的疼痛响应(痛觉过敏)；和3)由正常无害刺激产生的疼痛(异常性疼痛-Meyer等人，1994，Textbook of Pain，13-44)。虽然患有不同形式的急性和慢性疼痛的患者可具有相似的症状，但背后的机制可以不同，从而可能需要不同的治疗策略。因此，疼痛还可按照不同的病理生理学分成许多不同的亚型，包括伤害性、炎性和神经性疼痛。

伤害性疼痛由组织损伤或具有引起损伤的潜能的强烈刺激诱发。疼痛传入通过损伤部位上的伤害感受器对刺激的传导而被激活，然后以它们结束时的水平激活脊髓中的神经元。然后其顺着脊径向上分程传递至大脑，在大脑中疼痛被感知(Meyer等人，1994，Textbook ofPain，13-44)。伤害感受器的活化激活了两种类型的传入神经纤维。有髓鞘的A-δ纤维快速传递并且负责剧痛和刺痛感，而无髓鞘的C纤维以较慢的速率传递并且传递钝痛或酸痛。中度至严重的急性伤害性疼痛是来自中枢神经系统创伤、拧伤/扭伤、烧伤、心肌梗塞和急性胰腺炎的疼痛、手术后疼痛(在任何类型的手术过程后的疼痛)、创伤后疼痛、肾绞痛、癌症痛和背痛的显著特征。癌症痛可以是慢性疼痛例如肿瘤相关疼痛(例如骨痛、头痛、面部疼痛或内脏痛)或与癌症治疗相关的疼痛(例如化疗后综合征、慢性手术后疼痛综合征或辐射后综合征)。癌症痛也可响应化学治疗、免疫治疗、激素治疗或放射治疗而发生。背痛可由突出的或破裂的椎间盘(intravertebral disc)或腰椎小关节、骶髂关节、椎旁肌或后纵韧带的异常而引起。背痛可自然消退，但在一些患者中，其持续12周以上，变成可使人特别虚弱的慢性状况。

神经性疼痛目前被定义为由神经系统中的原发性损伤或功能障碍引发或引起的疼痛。神经损害可由创伤和疾病引起，从而术语“神经性疼痛”包括具有不同病因学的许多病症。此类病症包括但不限于周围神经病变、糖尿病性神经病变、疱疹后神经痛、三叉神经痛、背痛、癌症神经病变、HIV神经病变、幻肢痛、腕管综合症、中枢性中风后疼痛以及与慢性酒精中毒、甲状腺功能减退、尿毒症、多发性硬化、脊髓损伤、帕金森病、癫痫和维生素缺乏相关的疼痛。神经性疼痛是病理性的，因为其不具有保护作用。其通常在最初病因已消失后仍然存在，并且通常持续数年，大大地降低了患者的生活质量(Woolf和Mannion，1999，Lancet，353，1959-1964)。神经性疼痛的症状难以治疗，因为它们甚至在具有相同疾病的患者之间通常都不同(Woolf &Decosterd，1999，Pain Supp.，6，S141-S147；Woolf和Mannion，1999，Lancet，353，1959-1964)。它们包括自发性疼痛，其可以是连续的和阵发的或异常引起的疼痛，例如痛觉过敏(增加的对有害刺激的敏感性)和异常性疼痛(对正常无害刺激的敏感性)。

炎性过程是一系列复杂的响应组织损伤或外来物质的存在而被激活的生物化学和细胞事件，其导致肿胀和疼痛(Levine和Taiwo，1994，Textbook of Pain，45-56)。关节炎痛是最常见的炎性疼痛。类风湿病是发达国家中最常见的慢性炎性状况之一并且类风湿性关节炎是失能(disability)的共同原因。类风湿性关节炎的确切病因学还不清楚，但目前的假说认为遗传和微生物因素可能是重要的(Grennan &Jayson，1994，Textbook of Pain，397-407)。据估计几乎1600万美国人患有症状性骨关节炎(OA)或退行性关节病，其中大部分在60岁以上，随着人口年龄的增加，预期这将增加至4000万人，从而使得这成为巨大的公共卫生问题(Houge & Mersfelder，2002，AnnPharmacother.，36，679-686；McCarthy等人，1994，Textbook of Pain，387-395)。大多数骨关节炎患者由于相关的疼痛而寻求医疗照顾。关节炎对心理社会和躯体功能具有显著影响，并且已知是后期生活中失能的首要原因。强直性脊柱炎也是风湿性疾病，其引起脊柱和骶髂关节的关节炎。其从终生存在的背痛的间歇性发作变化至攻击脊柱、外周关节和其他躯体器官的严重慢性疾病。

另一种类型的炎性疼痛是包括与炎性肠病(IBD)相关的疼痛的内脏痛。内脏痛是与内脏(包括腹腔器官)相关的疼痛。此类器官包括性器官、脾和消化系统的部分。与内脏相关的疼痛可分成消化性内脏疼痛和非消化性内脏疼痛。通常遇到的引起疼痛的胃肠道(GI)病症包括功能性肠紊乱(FBD)和炎性肠病(IBD)。此类GI病症包括目前只能适度控制的许多疾病状态，包括，对于FBD，胃食管反流、消化不良、肠易激综合征(IBS)和功能性腹痛综合征(FAPS)，以及对于IBD，克罗恩病、回肠炎和溃疡性结肠炎，其全都有规律地产生内脏痛。其他类型的内脏痛包括与痛经、膀胱炎和胰腺炎相关的疼痛和骨盆痛。

应当指出，一些类型的疼痛具有多种病因学，从而可分类在多于一个领域中，例如背痛和癌症痛具有伤害性和神经性成分。

其他类型的疼痛包括：

·由肌肉骨骼病症引起的疼痛，所述病症包括肌痛、纤维肌痛、脊柱炎、血清阴性(非类风湿性)关节病、非关节性风湿病、抗肌营养不良蛋白病(dystrophinopathy)、糖原分解、多肌炎和化脓性肌炎；

·心脏和血管疼痛，包括由咽痛、心肌梗塞、二尖瓣狭窄、心包炎、雷诺现象、硬化病(scleredoma)和骨骼肌局部缺血引起的疼痛；

·头痛，例如偏头痛(包括有先兆的偏头痛和无先兆的偏头痛)、丛集性头痛、紧张型头痛混合性头痛和与血管病症相关的头痛；和

·口面疼痛，包括牙痛、耳痛、口灼伤综合征和颞下颌肌筋膜痛。

可将IL-6抗体或其抗原结合部分与一种或多种其他治疗剂组合使用。例如，可将抗体或其抗原结合部分与COX-2抑制剂例如塞来考昔一起用于治疗疾病例如类风湿性关节炎、骨关节炎和疼痛。可以在相同剂型中或在不同剂型中给患者施用IL-6抗体其抗原结合部分和其他治疗剂。此外，可同时或在不同时间施用它们。下面是一些可与抗IL-6抗体或其抗原结合部分组合使用的治疗剂的实例。

类风湿性关节炎

IL-6抗体和其抗原结合部分还可用于协同治疗(co-therapy)。合适的抗炎协同治疗化合物包括：

环孢菌素、唑来膦酸、依法珠单抗、阿来法塞、依托度酸、氯诺昔康、OM-89、伐地考昔、托珠单抗、阿巴他塞、美洛昔康、依那西普、萘丁美酮(nambumetone)、利美索龙、153Sm-EDTMP、prosorba、水杨酸咪唑、奥普瑞白介素、透明质酸、萘普生、吡罗昔康、双醋瑞因、lumericoxib、他克莫司、醋氯芬酸、阿克他利、替诺昔康、罗格列酮、地夫可特、阿达木单抗、来氟米特、利塞膦酸钠、米索前列醇和双氯芬酸、SK-1306X、英利昔单抗、阿那白滞素、塞来考昔、双氯芬酸、依托考昔和联苯乙酸、reumacon、戈利木单抗、地舒单抗、奥法木单抗、10rT1抗体、培比洛芬、利考非隆、坦罗莫司、依库珠单抗、艾拉莫德和泼尼松。其他合适的抗炎药包括CP-481715、ABN-912、MLN-3897、HuMax-IL-15、RA-1、紫杉酚、Org-37663、Org 39141、AED-9056、AMG-108、芳妥珠单抗、培那西普、普那卡生、阿匹莫德、GW-274150、AT-001、681323(GSK)K-832、R-1503、奥瑞珠单抗、DE-096、Cpn10、THC+CBD(GW Pharma)、856553(GSK)、ReN-1869、免疫球蛋白、mm-093、阿美卢班、SCIO-469、ABT-874、LenkoVAX、LY-2127399、TRU-015、KC-706、阿莫沙平(amoxapinet)和双嘧达莫、TAK-715、PG 760564、VX-702、泼尼松龙和双嘧达莫、PMX-53、贝利木单抗、普立贝瑞、CF-101、tgAAV-TNFR：Fc、R-788、泼尼松龙和SSRI、CP-690550和PMI-001。

骨关节炎

还可将IL-6抗体和其抗原结合部分与用于治疗骨关节炎的一个或多个指征的一种或多种试剂共施用以治疗骨关节炎。用于与抗IL-6抗体或其抗原结合部分组合的用于治疗骨关节炎的一个或多个指征的试剂的实例包括基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂、聚集蛋白聚糖酶抑制剂、诱导型氮氧化物(iNOS)抑制剂、胰岛素样生长因子(IGF)的表达或活性的抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)的表达或活性的抑制剂、CD44的表达或活性的抑制剂、白细胞介素(IL)的表达或活性的抑制剂、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达或活性的抑制剂、肿瘤坏死因子诱导蛋白6(TSG-6)的表达或活性的抑制剂、Bikunin的表达或活性的抑制剂、β-分泌酶(BACE)的抑制剂、PACE-4的抑制剂、细胞核受体rev-ErbAα(NR1D1)的表达或活性的抑制剂、内皮分化鞘脂G蛋白偶联受体1(EDG-1)的表达或活性的抑制剂、蛋白酶活化受体(PAR)的表达或活性的抑制剂、软骨源性视黄酸敏感蛋白(CD-RAP)的表达或活性的抑制剂、蛋白激酶Cζ(PKCz)的抑制剂、抵抗素的表达或活性的抑制剂、解联蛋白和金属蛋白酶8(ADAM8)的抑制剂，补体成分1s亚成分(C1s)的表达或活性的抑制剂、甲酰基肽受体样1(FPRL1)的表达或活性的抑制剂。

用于与IL-6抗体和其抗原结合部分组合的试剂的另外的实例包括MMP-2、-3、-9或-13的抑制剂；聚集蛋白聚糖酶-1或-2的抑制剂；IGF-1或-2的表达或活性的抑制剂；FGF-2、-18或-9的表达或活性的抑制剂；和IL-1、-4或-6的表达或活性的抑制剂。

用于与IL-6抗体和其抗原结合部分组合的试剂的另外的实例包括IGF-1或-2抗体；FGF受体-2或-3拮抗剂、CD 44抗体、IL-1、-4或-6抗体、TNF-α抗体；TSG-6抗体；bikunin抗体；NR1D1拮抗剂；EDG-1拮抗剂；PAR拮抗剂、CD-RAP抗体、抵抗素抗体、C1s抗体和FPRL1抗体。

疼痛

可将IL-6抗体或其抗原结合部分与一种或多种用于治疗疼痛的另外的药物活性化合物组合施用。可以以单个剂型同时施用或以分开的剂型(其可以是相同或不同的)施用化合物。可选择地，可相继施用化合物。药物活性化合物的药学可接受的盐也可用于组合中。

可与IL-6抗体或其抗原结合部分一起施用的化合物的实例包括：

环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂例如塞来考昔、罗非考昔、帕瑞考昔、伐地考昔、地拉考昔、依托考昔和lumiracoxib；阿片类镇痛药例如吗啡、氢吗啡酮、羟吗啡酮、芬太尼、可待因、双氢可待因、羟考酮、氢可酮、丁丙诺啡、曲马朵和纳布啡；非类固醇类抗炎药物(NSAID)例如阿司匹林、双氯芬酸、二氟尼柳、布洛芬、非诺洛芬、萘普生、奈帕芬胺和对乙酰氨基酚；磷酸二酯酶V抑制剂(PDEV)例如西地那非；α-2-δ配体例如加巴喷丁和普瑞巴林；和局部麻醉药例如苯佐卡因、利多卡因、罗哌卡因、薄荷脑、樟脑和水杨酸甲酯。

可与IL-6抗体和其抗原结合部分组合使用的化合物的其他类型和分类的实例包括：巴比妥酸盐镇静药；苯二氮卓类；具有镇静作用的组胺H₁拮抗剂；镇静药；骨骼肌松弛药；N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂；α-肾上腺素能药物；三环类抗抑郁药；抗惊厥药例如卡马西平；速激肽(NK)拮抗剂，特别是NK-3、NK-2或NK-1拮抗剂；毒蕈碱拮抗剂；精神安定药；辣椒素(vanilloid)受体激动剂或拮抗剂；β肾上腺素能药物；皮质类固醇；血清素(5-HT)受体激动剂或拮抗剂例如5-HT_1B/1D、5-HT_2A和5-HT₃受体拮抗剂；胆碱能(烟碱)镇痛药；大麻素；代谢型谷氨酸受体亚型1(mGluR1)拮抗剂；血清素再摄取抑制剂例如舍曲林；正甲肾上腺素(去甲肾上腺素)再摄取抑制剂例如瑞波西汀，特别地(S，S)-瑞波西汀；双血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂例如度洛西汀；诱导型氮氧化物合酶(iNOS)抑制剂例如：S-[2-[(1-亚氨基乙基)氨基]乙基]-L-高半胱氨酸、S-[2-[(1-亚氨基乙基)-氨基]乙基]-4，4-二氧-L-半胱氨酸、S-[2-[(1-亚氨基乙基)氨基]乙基]-2-甲基-L-半胱氨酸、(2S，5Z)-2-氨基-2-甲基-7-[(1-亚氨基乙基)氨基]-5-庚烯酸、2-[[(1R，3S)-3-氨基-4-羟基-1-(5-噻唑基)-丁基]硫代]-5-氯-3-氰基吡啶；2-[[(1R，3S)-3-氨基-4-羟基-1-(5-噻唑基)丁基]硫代]-4-氯苯腈、(2S，4R)-2-氨基-4-[[2-氯-5-(三氟甲基)苯基]硫代]-5-噻唑丁醇、2-[[(1R，3S)-3-氨基-4-羟基-1-(5-噻唑基)丁基]硫代]-6-(三氟甲基)-3氰基吡啶、2-[[(1R，3S)-3-氨基-4-羟基-1-(5-噻唑基)丁基]硫代]-5-氯苯腈、N-[4-[2-(3-氯苄基氨基)乙基]苯基]噻吩-2-羧胺和胍基乙基二硫化物(guanidinoethyldisulfide)；乙酰胆碱酯酶抑制剂；前列腺素E₂亚型4(EP4)拮抗剂例如N-[({2-[4-(2-乙基-4，6-二甲基-1H-咪唑[4，5-c]吡啶-1-基)苯基]乙基}氨基)-羰基]-4-甲苯磺酰胺或4-[(1S)-1-({[5-氯-2-(3-氟苯氧基)吡啶-3-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸；白三烯B4拮抗剂例如1-(3-联苯基-4-基甲基-4-羟基-色原-7-基)-环戊烷羧酸；5-脂氧合酶抑制剂；和钠通道阻断剂。

纤维肌痛综合征

产品：镇痛药例如对乙酰氨基酚、萘普生钠、布洛芬、曲马朵、曲唑酮；环苯扎林；阿司匹林、塞来考昔、伐地考昔、吲哚美辛和其他NSAID；抗抑郁药例如三环类抗抑郁药和选择性血清素再摄取抑制药，例如抗抑郁药例如阿米替林、丙咪嗪、去甲替林、多塞平、氟西汀、舍曲林和帕罗西汀；肌肉松弛药例如环苯扎林；睡眠辅助药例如唑吡坦。

分类：去甲肾上腺素-血清素再摄取抑制剂(NSRI和SNRI)；去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)；选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)；三环类抗抑郁药；选择性环氧化酶2(COX-2)抑制剂；非类固醇类抗炎药(NSAID)；镇痛药。

强直性脊柱炎

产品：镇痛药例如对乙酰氨基酚、萘普生钠、布洛芬、曲马朵、阿司匹林、塞来考昔、伐地考昔、吲哚美辛和其他NSAID；缓解疾病的抗风湿药(DMARD)例如柳氮磺吡啶或甲氨蝶呤；皮质类固醇；和肿瘤坏死因子(TNF)阻断剂例如依那西普和英利昔单抗。

分类：镇痛药；NSAID；COX-2抑制剂；DMARD；皮质类固醇；TNF阻断剂。

银屑病

产品：光疗法，包括补骨脂素紫外线A(补骨脂素UVA或PUVA)疗法、窄带紫外线B(UVB)疗法和组合光疗法；局部用皮质类固醇；维生素D类似物例如卡泊三烯；地蒽酚；局部用维生素A类(即维生素A衍生物)例如阿维A和他扎罗汀；丙酸氯倍他索；甲氨蝶呤；硫唑嘌呤；环孢菌素；羟基脲；和免疫调节药例如阿来法塞、依法珠单抗和依那西普。

分类：光疗法；皮质类固醇；维生素D类似物；维生素A衍生物。

痛风

产品：NSAID例如对乙酰氨基酚、萘普生钠、布洛芬、曲马朵、阿司匹林、塞来考昔、伐地考昔和吲哚美辛；和皮质类固醇例如泼尼松。

分类：镇痛药；NSAID；COX-2抑制剂；和皮质类固醇。

克罗恩病

产品：镇痛药例如对乙酰氨基酚、萘普生钠、布洛芬、曲马朵、阿司匹林、塞来考昔、伐地考昔、吲哚美辛和其他NSAID；抗炎药；柳氮磺吡啶、氨水杨酸、巴柳氮和奥沙拉嗪；和皮质类固醇例如泼尼松和布地奈德；免疫抑制剂例如硫唑嘌呤、巯嘌呤、TNF阻断剂例如英利昔单抗和阿达木单抗、甲氨蝶呤和环孢菌素；抗生素例如甲硝唑和环丙沙星；止泻药例如洛哌丁胺；和轻泻药。

分类：镇痛药；NSAIDs；COX-2抑制剂；抗炎药；TNF阻断剂；抗生素；止泻药；和轻泻药。

溃疡性结肠炎

分类：镇痛药例如对乙酰氨基酚、萘普生钠、布洛芬、曲马朵、阿司匹林、塞来考昔、伐地考昔、吲哚美辛和其他NSAID；抗炎药；柳氮磺吡啶、氨水杨酸、巴柳氮和奥沙拉嗪；皮质类固醇；免疫抑制药例如硫唑嘌呤、巯嘌呤、TNF阻断剂例如英利昔单抗和阿达木单抗、甲氨蝶呤和环孢菌素；止泻药例如洛哌丁胺；和轻泻药。

分类：NSAID；COX-2抑制剂；抗炎药；TNF阻断剂；皮质类固醇；免疫抑制剂；Janus激酶-3(Jak-3)抑制剂；TNF阻断剂；止泻药；和轻泻药。

肠易激综合征

产品：止泻药例如洛哌丁胺；轻泻药；抗胆碱能药；抗抑郁药例如三环类抗抑郁药和选择性血清素再摄取抑制剂，例如抗抑郁药例如阿米替林、丙咪嗪、去甲替林、多塞平、氟西汀、舍曲林和帕罗西汀；阿洛司琼；和替加色罗。

分类：止泻药；轻泻药；抗胆碱能药；去甲肾上腺素-血清素再摄取抑制剂(NSRI和SNRI)；去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)；选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)；三环类抗抑郁药。

药物组合物和施用

还提供了用于治疗哺乳动物包括人中异常细胞浸润的药物组合物，其包含在异常细胞浸润的治疗中是有效的量的本文中描述的IL-6抗体或其抗原结合部分，和药学可接受的载体。组合物为患有炎症和自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、肉芽肿病、多发性硬化、哮喘和癌症中的一种或多种疾病的患者提供了治疗益处。

可将IL-6抗体和其抗原结合部分掺入适合于给受试者施用的药物组合物。通常，药物组合物包含IL-6抗体或其抗原结合部分，和药学可接受的载体。如本文中所使用的，“药学可接受的载体”是指生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的一些实例是水、盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等以及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学可接受的物质的另外的实例是湿润剂或少量辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的贮存期限或功效。

本发明的组合物可以以多种形式存在，例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。形式取决于期望的施用模式和治疗应用。典型的组合物以可注射或可输注溶液的形式存在，例如与用于人的被动免疫的组合物相似的组合物。在一种情况下，施用模式是胃肠外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在另一种情况下，通过静脉内输注或注射施用抗体。在另一种情况下，通过肌内或皮下注射施用抗体。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿瓶中或多剂量容器中，并且具有或不具有添加的防腐剂。组合物可采取形式例如悬浮液、溶液或油性或水性媒介物中的乳剂，并且可包含配制试剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地，活性成分可以以粉剂形式存在，其可在使用前用合适的媒介物例如灭菌无热原水重构。可通过将IL-6抗体以需要的量与上面列举的成分之一或组合(需要时)一起掺入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备无菌可注射液。在一种情况下，将抗体以无菌水溶液形式的制剂施用，所述无菌水溶液具有范围在约5.0至大约6.5之间的pH并且含有大约1mg/ml至大约200mg/ml的抗体，大约1mM至大约100mM的组氨酸缓冲剂，大约0.01mg/ml至大约10mg/ml聚山梨酯80或聚山梨酯20，大约100mM至大约400mM的非还原糖(选自但不限于海藻糖或蔗糖)、大约0.01mM至大约1.0mM的EDTA二钠二水合物，和任选地包含除了螯合剂外的药学可接受的抗氧化剂。合适的抗氧化剂包括但不限于甲硫氨酸、硫代硫酸钠、过氧化氢酶和铂。例如，组合物可以包含1mM至大约100mM，特别地大约27mM浓度的甲硫氨酸。在一些情况下，制剂在20mM柠檬酸钠，pH 5.5，140mM NaCl和0.2mg/ml聚山梨酯80的缓冲液中包含5mg/ml的抗体。要指出的是，剂量值可随待缓解的状况的类型和严重度而变化。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，合适的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自之前其灭菌过滤的溶液的任何另外想要的成分的粉剂。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持需要的颗粒大小，和通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可注射组合物的延长的吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来产生。

可通过许多方法施用IL-6抗体或其抗原结合部分，虽然对于许多治疗应用，施用的途径/模式可以是皮下、肌内或静脉内输注。如本领域技术人员所理解的，施用的途径和/或模式可根据期望的结果而改变。

在某些情况下，可使用载体制备IL-6抗体组合物，所述载体将保护抗体免于快速释放，例如控释制剂，包括埋植剂、透皮贴剂和微型胶囊递送系统。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯和聚乳酸。可使用用于制备此类制剂的许多方法。参见，例如，Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，MarcelDekker，Inc.，New York，1978，其通过引用合并入本文。

还可将另外的活性化合物掺入组合物。在一些情况下，将抑制性IL-6抗体与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用。此类试剂包括但不限于结合其他靶的抗体、抗肿瘤剂、抗血管生成剂、信号转导抑制剂、抗增殖剂、化学治疗剂或抑制IL-6的肽类似物。此类联合治疗可需要更低剂量的抑制性IL-6抗体以及共施用的试剂，从而避免与各种单一治疗相关的可能的毒性或并发症。

组合物可包含“治疗有效量”或“预防有效量”的抗体或抗原结合部分。“治疗有效量”是指在剂量上和在所需的一段时间内有效地实现期望的治疗结果的量。治疗有效量的抗体或抗原结合部分可根据因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或抗体部分在个体中引发期望的应答的能力而变化。治疗有效量也是其中抗体或抗原结合部分的任何毒性或有害效应被治疗有益效应超越的剂量。“预防有效量”是指在剂量上和在所需的一段时间内有效地实现期望的预防结果的量。通常，因为预防性剂量在疾病之前或在其早期用于受试者，因此预防有效量可低于治疗有效量。

可调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗性或预防性应答)。例如，可施用单次团注，可在一段时间内施用几个分开的剂量或可根据治疗情况的紧迫性而相应地减少或增加剂量。以剂量单位形式配制胃肠外组合物对于施用的容易性和剂量的一致性是特别有利的。剂量单位形式，如本文中所使用的，是指用于待治疗的哺乳动物受试者的适合作为单元剂量的物理上分开的单位；各单位包含预先确定量的IL-6抗体或其抗原结合部分，所述量经计算与需要的药物载体一起产生期望的治疗效果。

IL-6抗体或抗体部分的治疗有效量或预防有效量的示例性非限定性范围是0.025至50mg/kg，0.1至50mg/kg，0.1-25，0.1至10或0.1至3mg/kg。在一种情况下，将IL-6抗体或其抗体部分以无菌水溶液形式的制剂施用，所述无菌水溶液具有范围在约5.0至约6.5之间的pH并且含有大约1mg/ml至大约200mg/ml的抗体，大约1mM至大约100mM的组氨酸缓冲剂，大约0.01mg/ml至大约10mg/ml聚山梨酯80，大约100mM至大约400mM的海藻糖和大约0.01mM至大约1.0mM的EDTA二钠二水合物。要指出的是，剂量值可随待缓解的状况的类型和严重度而变化。还应理解，对于任何特定的受试者，应当随时间根据个体需要以及施用或指导组合物的施用的人的专业判断来调整特定剂量方案，并且本文中所示的剂量范围只是示例性的并且无意限定所请求保护的组合物的范围或施用。

本文中提供的另一个方面是包括IL-6抗体或抗原结合部分或含有这样的抗体或抗原结合部分的组合物的试剂盒。除了抗体或组合物以外，试剂盒还可包括诊断剂或治疗剂。试剂盒还可包括用于诊断或治疗方法的说明书。在一种情况下，试剂盒包括抗体或包含抗体的组合物以及可用于本文中描述的方法的诊断剂。在另一种情况下，试剂盒包括抗体或包含抗体的组合物以及一种或多种可用于本文中描述的方法的治疗剂。

使用的诊断方法

本文中提供的另一个方面是诊断方法。抗IL-6抗体或其抗原结合部分可用于体内或体外检测生物样品中的IL-6。一个方面提供了用于在有此需要的受试者中诊断表达IL-6的细胞的存在或定位的方法，其包括步骤：将抗体注射入受试者，通过定位抗体结合的地方来确定IL-6在受试者中的表达，将受试者中的表达与正常参照受试者或标准的表达相比较，以及诊断细胞的存在或定位。抗IL-6抗体还可用作炎症和/或免疫细胞例如单核细胞和T细胞至组织的浸润的标记物。

抗IL-6抗体可用于任何合适的免疫测定，包括但不限于，ELISA、RIA、流式细胞术、组织免疫组织化学、Western印迹或免疫沉淀。抗IL-6抗体或其抗原结合部分可用于检测来自人的IL-6。在另一种情况下，抗IL-6抗体可用于检测来自食蟹猴、猕猴和啮齿类动物例如小鼠和大鼠的IL-6。

用于检测生物样品中的IL-6的方法通常包括将生物样品与抗IL-6抗体或其抗原结合部分接触，然后检测结合的抗体。在一种情况下，用可检测的标记物直接标记抗IL-6抗体或其抗原结合部分。在另一种情况下，不标记抗IL-6抗体(一抗)，而是标记可结合抗IL-6抗体的二抗或其他分子。选择能够特异性结合特定类别和种类的一抗的二抗。例如，如果抗IL-6抗体是人IgG，则二抗可以是抗人IgG。可结合抗体的其他分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，其两者都可例如从Pierce Chemical Co商购获得。

本文中公开了用于抗体或二抗的合适的标记物，其包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；以及合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

还可使用用可检测物质标记的IL-6标准和未标记的抗IL-6抗体通过竞争性免疫测定来测定生物样品中的IL-6。在该测定中，将生物样品、标记的IL-6标准和抗IL-6抗体组合，然后测定结合至未标记的抗体的经标记的IL-6标准的量。生物样品中IL-6的量与结合至抗IL-6抗体的经标记的IL-6标准的量成反比。

可将此类免疫测定用于许多目的。例如，可将抗IL-6抗体或其抗原结合部分用于检测培养的细胞中的IL-6。在一种情况下，将抗IL-6抗体或其抗原结合部分用于测定已用不同化合物处理的细胞的表面上的IL-6的量。该方法可用于鉴定调控IL-6蛋白水平的化合物。根据该方法，用受试化合物处理一个细胞样品一段时间，同时让另一个样品不接受处理。如果要测量总IL-6的表达，则裂解细胞，使用任何合适的免疫测定来测量总IL-6的表达。将经处理的细胞与未经处理的细胞中的总IL-6表达相比较以测定受试化合物的作用。

用于测量总IL-6表达的免疫测定包括流式细胞术和免疫组织化学。如果要测量细胞表面IL-6表达，则不裂解细胞，使用上述免疫测定之一测量IL-6的细胞表面水平。用于测定IL-6的细胞表面水平的优选免疫测定包括步骤：用可检测的标记物例如生物素或¹²⁵I标记细胞表面蛋白，用抗IL-6抗体免疫沉淀IL-6，然后检测标记的IL-6。

用于确定IL-6的定位例如细胞表面水平的另一个免疫测定是使用免疫组织化学。用于检测IL-6的细胞表面水平的免疫测定包括：结合用适当的荧光团例如荧光素或藻红蛋白标记的抗IL-6抗体，然后使用流式细胞术检测一抗。在另一个实例中，不标记抗IL-6抗体，而标记可结合抗IL-6抗体的二抗或其他分子。方法例如ELISA、RIA、流式细胞术、Western印迹、免疫组织化学、膜蛋白质的细胞表面标记以及免疫沉淀在本领域内都是熟知的。参见，例如，Harlow和Lane。此外，为了就IL-6的激活或抑制检测大量化合物，可将免疫测定按比例放大以进行高通量筛选。

抗IL-6抗体或其抗原结合部分还可用于测定组织中或来源于组织的细胞中IL-6的水平。在一些实例中，组织是患病组织或活检组织。可通过上述方法在免疫测定中使用组织或活检组织来测定例如总IL-6表达、IL-6的细胞表面水平或IL-6的定位。此类方法可用于确定组织是否表达高水平的IL-6，高表达水平可表示组织是用抗IL-6抗体进行治疗的靶。

还可将IL-6抗体和其抗原结合部分用于体内鉴定表达IL-6的组织和器官。在一些情况下，抗IL-6抗体用于鉴定表达IL-6的细胞。与非人来源的抗体或与人源化或嵌合抗体不同，人抗IL-6抗体可在体内安全使用而不会在施用后引起针对抗体的显著免疫应答。

该方法包括步骤：将可检测地标记的抗IL-6抗体或包含其的组合物施用给需要这样的诊断测试的患者，然后使患者经历成像分析以确定表达IL-6的组织的位置。成像分析在医学领域内是熟知的，其包括但不限于x射线分析、磁共振成像(MRI)或，计算机x射线断层摄影(computed tomography，CT)。可用适合于体内成像的任何试剂例如造影剂例如钡(其可用于x射线分析)或磁性造影剂例如钆螯合剂(其可用于MRI或CT)来标记抗体。其他标记试剂包括但不限于放射性同位素例如⁹⁹Tc。在另一种情况下，不标记抗IL-6抗体，而可通过施用可检测的并且可结合抗IL-6抗体的二抗或其他分子来进行成像。在一个实例中，从患者获得活检组织以测定目的组织是否表达IL-6。

可检测地标记的抗IL-6可包含荧光团。在某些情况下，荧光团选自近红外荧光染料、二硝基苯基、荧光素和其衍生物、罗丹明、罗丹明的衍生物、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺、德克萨斯红、罗丹明绿、Oregon green、Cascade blue、藻红蛋白、CY3、CY5、CY2、CY7、香豆素、红外线40、MR 200、IRD 40、Alexa Fluor、Cascade Blue、四甲基罗丹明、Pacific Blue、SYBR和BODIPY。在另一个实例中，荧光团包括下列化合物之一(在括号中以nm标示它们的最大发射)：Cy2.TM.(506)、GFP(Red Shifted)(507)、(509)、-1(509)、钙黄绿素(517)、FITC(518)、(519)、(520)、罗丹明110(520)、5-FAM(522)、Oregon500(522)、Oregon488(524)、(525)、Rhodamine(527)、罗丹明123(529)、Magnesium(531)、Calcium(533)、TO--1(533)、-1(533)、JOE(548)、530/550(550)、Dil(565)、(568)、558/568(568)、564/570(570)、(570)、546(570)、TRITC(572)、Magnesium(575)、藻红蛋白R&B(575)、罗丹明鬼笔环肽(575)、Calcium(576)、派洛宁Y(580)、罗丹明B(580)、TAMRA(582)、Rhodamine(590)、Cy3.(596)、ROX(608)、Calcium Crimson.TM.(615)、594(615)、TexasRed.RTM.(615)、Nile Red(628)、YO--3(631)、-3(631)、R-藻青蛋白(642)、C-藻青蛋白(648)、TO--3(660)、-3(660)、DiD DilC(5)(665)、Cy5.TM.(670)、Thiadicarbocyanine(671)和Cy5.5(694)。

在另外的实例中，抗IL-6抗体还可用于测定细胞例如淋巴细胞或单核细胞上IL-6的表面细胞表达的减少。

人抗IL-6抗体或其抗原结合部分使对非人或非人衍生的单克隆抗体(Mab)固有的免疫原性和变应性应答降至最低，从而增加施用的抗体或其抗原结合部分的功效和安全性。

另一个方面提供了部分由种系序列编码的人抗IL-6抗体。基于序列同源性将V_H、V_κ、V_λ基因分类入家族中。如果它们在超过80％的位点上共有相同的核苷酸序列，则两个V_H、V_κ或V_λ基因属于相同家族。抗IL-6抗体可包含人κ轻链(V_κ)或人λ轻链(V_λ)或从其衍生的氨基酸序列。在一些包含λ轻链的情况下，轻链可变结构域(V_L)部分由人V_λ1、V_λ2、V_λ3、V_λ4、V_λ5、V_λ6、V_λ7、V_λ8、V_λ9或V_λ10家族基因编码(WilliamsS.C.等人J.Mol.Bio.264：220-232，1996)。在一些包含κ轻链的情况下，轻链可变结构域(V_L)部分由人V_κI、V_κII、V_κIII、V_κIV、V_κV或V_κVI家族基因(Cox J.P.L.等人，Eur.J.Immunol 24：827-836，1994)，优选V_κI、V_κII、V_κIII或V_κIV家族基因和优选V_κI或V_κVI家族基因编码。在一些情况下，轻链种系序列选自人Vκ序列，包括但不限于，A1、A10、A11、A14、A17、A18、A19、A2、A20、A23、A26、A27、A3、A30、A5、A7、B2、B3、L1、L10、L11、L12、L14、L15、L16、L18、L19、L2、L20、L22、L23、L24、L25、L4/18a、L5、L6、L8、L9、O1、O11、O12、O14、O18、O2、O4和O8。在某些情况下，该轻链人种系构架选自V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-2、V1-20、V1-22、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V2-1、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、V2-6、V2-7、V2-8、V3-2、V3-3、V3-4、V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、V5-1、V5-2、V5-4和V5-6。抗IL-6抗体可包含由人V_H1、V_H2、V_H3、V_H4、V_H5、V_H6或V_H7家族基因编码的重链可变结构域(V_H)。在特定的实例中，该重链人种系构架选自VH1-18、VH1-2、VH1-24、VH1-3、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH1-8、VH2-26、VH2-5、VH2-70、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-7、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH3-9、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-4、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1和VH7-81。在特定的情况下，轻链可变区和/或重链可变区包含构架区或至少部分的构架区(例如，包含2或3亚区，例如FR2和FR 3)。在某些情况下，至少FRL1、FRL2、FRL3或FRL4是完全人的。在其他实例中，至少FRH1、FRH2、FRH3或FRH4是完全人的。在一些情况下，至少FRL1、FRL2、FRL3或FRL4是种系序列(例如，人种系)或包含特定构架的人共有序列(可容易地在本文中描述的已知的人Ig序列的来源中获得)。在其他实例中，至少FRH1、FRH2、FRH3或FRH4是种系序列(例如，人种系)或包含特定构架的人共有序列。

IL-6抗体的V_L相对于人基因的种系氨基酸序列可包含一个或多个氨基酸置换。在一些情况下，IL-6抗体的V_L相对于种系氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换。在一个实例中，来自种系的一个或多个此类置换位于轻链的CDR区中。在一个实例中，相对于种系的氨基酸置换在一个或多个与抗体9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68T T83S IgG1、9C8N68T T83S IgG2、9C8E 31G N68T T83S IgG1、9C8E31G N68T T83S IgG2、9C8I24V N68T T83S IgG1、9C8I24V N68TT83S IgG2和22B5IgG1的任一个或多个V_L中相对于种系的置换相同的位点上。例如，IL-6抗体的V_L可包含一个或多个在抗体9C8IgG1的V_L中发现的与种系相比较的氨基酸置换。在一些情况下，氨基酸变化在一个或多个相同的位点上，但牵涉与参照抗体中的置换不同的置换。

在一些情况下，相对于种系的氨基酸变化发生在一个或多个与抗体9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68T T83S IgG1、9C8N68T T83S IgG2、9C8E31G N68T T83S IgG1、9C8E31G N68T T83S IgG2、9C8I24V N68TT83S IgG1、9C8I24V N68T T83S IgG2和22B5IgG1的任何V_L中的那些相同的位点上，但变化可代表这些位置上的保守氨基酸置换(相对于参照抗体中的氨基酸)。例如，如果这些抗体之一中的特定位点相对于种系已改变并且是谷氨酸，那么在该位点可用天冬氨酸进行置换。类似地，如果与种系相比较氨基酸置换是丝氨酸，那么可在该位点用苏氨酸保守置换丝氨酸。

在一些情况下，人抗IL-6抗体的轻链包含抗体9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68T T83S IgG1、9C8N68T T83S IgG2、9C8E31G N68T T83SIgG1、9C8E31G N68T T83S IgG2、9C8I24V N68T T83S IgG1、9C8I24VN68T T83S IgG2和22B5IgG1的V_L氨基酸序列或具有直至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸置换和/或总共直至3个非保守氨基酸置换的所述氨基酸序列。在一些情况下，轻链包含任一上述抗体的从CDR1开始至CDR3结束的氨基酸序列。

在一些情况下，轻链可包含分别独立地选自抗体9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68T T83S IgG1、9C8N68T T83S IgG2、9C8E31G N68T T83SIgG1、9C8E31G N68T T83S IgG2、9C8I24V N68T T83S IgG1、9C8I24VN68T T83S IgG2和22B5IgG1的轻链的轻链CDR1、CDR2和CDR3的CDR1、CDR2和CDR3区，或各自具有少于4或少于3个保守氨基酸置换和/或总共3个或更少的非保守氨基酸置换的CDR区。在一些情况下，抗IL-6抗体的轻链包含轻链CDR1、CDR2和CDR3，其各自独立地选自单克隆抗体9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68T T83S IgG1、9C8N68T T83SIgG2、9C8E31G N68T T83S IgG1、9C8E31G N68T T83S IgG2、9C8I24VN68T T83S IgG1、9C8I24V N68T T83S IgG2和22B5IgG1的轻链CDR1、CDR2和CDR3区。在些情况下，抗IL-6抗体的轻链包含抗体(其包含选自9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68T T83S IgG1、9C8N68T T83S IgG2、9C8E31G N68T T83S IgG1、9C8E 31G N68T T83S IgG2、9C8I24V N68TT83S IgG1、9C8I24V N68T T83S IgG2和22B5IgG1的抗体的V_L区的氨基酸序列)的轻链CDR1、CDR2和CDR3区，或各自具有少于4个或少于3个保守氨基酸置换和/或总共3个或更少的非保守氨基酸置换的CDR区。

在一些情况下，可变结构域(V_H)至少部分由人基因编码。在一些情况下，IL-6抗体的V_H序列相对于种系氨基酸序列包含一个或多个氨基酸置换、缺失或插入(添加)。在一些情况下，重链的可变结构域相对于种系氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个突变。在一些情况下，与种系氨基酸序列相比较，突变是非保守置换、缺失或插入。在一些实例中，突变位于重链的CDR区。在一些实例中，在一个或多个与抗体9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68T T83S IgG1、9C8N68T T83S IgG2、9C8E31G N68T T83S IgG1、9C8E31G N68T T83S IgG2、9C8I24V N68T T83S IgG1、9C8I24V N68TT83S IgG2和22B5IgG1的任何一个或多个V_H中的相对于种系的突变相同的位点上产生氨基酸变化。在其他实例中，氨基酸变化在一个或多个相同的位点上但牵涉与参照抗体中的突变不同的突变。

在一些情况下，重链包含抗体9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68T T83SIgG1、9C8N68T T83S IgG2、9C8E31G N68T T83S IgG1、9C8E 31G N68TT83S IgG2、9C8I24V N68T T83S IgG1、9C8I24V N68T T83S IgG2和22B5IgG1的V_H氨基酸序列，或具有直至1、2、3、4、6、8或10个保守氨基酸置换和/或总共直至3个非保守氨基酸置换的所述V_H氨基酸序列。在一些实例中，重链包含任一上述抗体的从CDR1开始至CDR3结束的氨基酸序列。

在一些情况下，重链包含抗体9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68TT83S IgG1、9C8N68T T83S IgG2、9C8E31G N68T T83S IgG1、9C8E31GN68T T83S IgG2、9C8I24V N68T T83S IgG1、9C8I24V N68T T83S IgG2和22B5IgG1的重链CDR1、CDR2和CDR3区，或各自具有少于8个、少于6个、少于4个或少于3个保守氨基酸置换和/或总共3个或更少的非保守氨基酸置换的CDR区。

在一些情况下，重链CDR区独立地选自抗体9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68T T83S IgG1、9C8N68T T83S IgG2、9C8E31G N68T T83S IgG1、9C8E31G N68T T83S IgG2、9C8I24V N68T T83S IgG1、9C8I24V N68TT83S IgG2和22B5IgG1的CDR区。在其他情况下，重链包含独立地选自从9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68T T83S IgG1、9C8N68T T83S IgG2、9C8E31G N68T T83S IgG1、9C8E31G N68T T83S IgG2、9C8I24V N68TT83S IgG1、9C8I24V N68T T83S IgG2和22B5IgG1中选择的两个或更多个V_H区的CDR区。

在其他情况下，抗体包含轻链和重链。在另外的实例中，轻链CDR和重链CDR来自相同的抗体。

可产生的一种类型的氨基酸置换是改变抗体中的一个或多个半胱氨酸，所述半胱氨酸可与另一个残基例如但不限于丙氨酸或丝氨酸化学反应。在一个实施例中，存在非典范(canonical)半胱氨酸的置换。可在抗体的可变结构域的CDR或构架区中或恒定结构域中产生置换。在一些情况下，半胱氨酸是典范的。

可产生的另一种类型的氨基酸置换是改变抗体中任何潜在的蛋白质水解位点。此类位点可发生在抗体的可变结构域的CDR或构架区中或恒定结构域中。半胱氨酸残基的置换和蛋白质水解位点的去除可减少抗体产物中任何异质性的风险，从而增加其同质性。另一种类型的氨基酸置换是通过改变天冬酰胺和甘氨酸中的一个或两个来消除形成潜在的脱酰胺位点的天冬酰胺-甘氨酸对。

在某些情况下，IL-6抗体的重链和轻链可任选地包括信号序列。

在一些情况下，抗体包含单克隆抗体9C8IgG1、9C8IgG2、9C8N68T T83S IgG1、9C8N68T T83S IgG2、9C8E31G N68T T83S IgG1、9C8E31G N68T T83S IgG2、9C8I24V N68T T83S IgG1、9C8I24V N68TT83S IgG2和22B5IgG1的重链和轻链的变体。如实施例3中更详细地描述的，产生许多重链和轻链变异突变以匹配种系CDR区域中的那些。通过比较种系与非种系抗体的序列，被突变以达到种系形式的特定氨基酸对于本领域技术人员来说是显然的。例如，在抗体9C8的重链中提供一个氨基酸置换，其中将残基24上的异亮氨酸改变成缬氨酸并且将其称为9C8I24V。第二个示例性氨基酸置换在抗体9C8的轻链中，用天冬酰胺置换残基92上的赖氨酸，并且将其称为9C8K92N。

如将意识到的，基因利用分析提供了抗体结构的有限概观。由于人B细胞随机产生V-D-J重链或V-Jκ轻链转录物，因此存在许多发生的次发过程，包括但不限于，体细胞高度突变、添加和CDR3延伸。因此，为了进一步检查抗体结构，从获自克隆的cDNA产生抗体的预测的氨基酸序列。此外，通过蛋白质测序获得N末端氨基酸序列。

抗IL-6抗体的种类和亚类

IL-6抗体的种类(例如，IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)和亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)可通过任何合适的方法来确定。一般地，使用特异于特定抗体种类和亚类的抗体来确定抗体的种类和亚类。此类抗体是可商购获得的。可以通过ELISA或Western印迹以及其他技术来确定种类和亚类。

可选择地，可通过下列来确定种类和亚类：测定抗体的轻链和/或重链的恒定结构域的全部或部分的序列，将它们的氨基酸序列与不同种类和亚类的免疫球蛋白的已知的氨基酸序列相比较，然后确定抗体的种类和亚类。IL-6抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。例如，IL-6抗体可以是为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的IgG。在一个实例中，IL-6抗体是IgG2亚类。在另一个实例中，IL-6抗体是IgG1亚类。

在一个方面，提供了将IL-6抗体的种类或亚类转换成另一个种类或亚类的方法。在一些情况下，使用任何合适的方法分离编码V_L或V_H的核酸分子，其不包含编码C_L或C_H的序列。然后将核酸分子有效地连接至编码来自期望的免疫球蛋白种类或亚类的C_L或C_H的核酸序列。这可使用包含C_L或C_H链的载体或核酸分子来实现，如上所述的。例如，可将本来是IgM的IL-6抗体类别转换成IgG。此外，类别转换可用于将一个IgG亚类转换成另一个亚类，例如将IgG1转换成IgG2。用于产生抗体(其包括期望的同种型)的另一个方法包括步骤：分离编码IL-6抗体的重链的核酸和编码IL-6抗体的轻链的核酸，分离编码V_H区的序列，将V_H序列连接至编码期望的同种型的重链恒定结构域的序列，在细胞中表达轻链基因和重链构建体，然后收集具有期望的同种型的IL-6抗体。

1L-6抗体对IL-6的结合亲和力

抗IL-6抗体对IL-6的结合亲和力和解离速率可使用任何合适的方法来测定。结合亲和力可使用ELISA、RIA、流式细胞术和表面等离子共振术例如BIACORE^TM来测量。解离速率可使用表面等离子共振术来测量。可通过使用任何合适的方法来确定抗体是否具有与抗IL-6抗体大体上相同的K_D。实施例7例举了用于测定抗IL-6单克隆抗体的亲和力常数的方法。

被抗IL-6抗体识别的IL-6表位的鉴定

可通过使用任何合适的方法来确定抗体是否与IL-6抗体结合相同的表位或交叉竞争结合。在一个实例中，让IL-6抗体在饱和条件下结合IL-6，然后测量受试抗体结合IL-6的能力。如果受试抗体能够与IL-6抗体同时结合IL-6，那么受试抗体结合与IL-6抗体不同的表位。然而，如果受试抗体不能同时结合IL-6，那么受试抗体结合相同的表位、重叠的表位或与人IL-6抗体所结合的表位十分靠近的表位。该实验可使用ELISA、RIA、BIACORE^TM或流式细胞术(FACS)来进行。

为了测试IL-6抗体是否与另一种IL-6抗体交叉竞争，可以以两个方向使用本文中描述的竞争方法，即，确定参照抗体是否阻断受试抗体和反之亦然。在一个实例中，使用ELISA进行实验。

产生抗体的方法

IL-6抗体或其抗原结合部分可使用多种技术来产生，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。还可使用用于产生单克隆抗体的其他技术例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。

用于制备杂交瘤的示例性动物系统是鼠系统。免疫方案和用于分离免疫的脾细胞以进行融合的技术在本领域内是已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。

可基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列制备嵌合或人源化抗体。可使用标准分子生物学技术从目的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并且对其进行工程改造以包含非鼠(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可使用本领域内已知的方法(参见例如，属于Cabilly等人的美国专利4,816,567)，将鼠可变区有效连接至人恒定区。为了产生人源化抗体，可使用本领域内已知的方法(参见例如，美国专利5,225,539和美国专利：5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)，将鼠CDR区插入人构架区。

在一种情况下，抗IL-6抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统的部分而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生此类抗IL-6的人单克隆抗体。此类转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb和KM的小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”。

HuMAb Inc.)包含人免疫球蛋白基因的微小基因座，所述基因座编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列以及使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如，Lonberg，等人(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠展示减少的小鼠IgM或κ的表达，并且响应免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等人(1994)；综述于Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113：49-101中；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb的制备和使用以及此类小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor，L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等人(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等人(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等人(1994)International Immunology 6：579-591；和Fishwild，D.等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有文献的内容以其全文通过引用明确地合并入本文。还参见，美国专利：5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429；美国专利5,545,807；PCT公开案：WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962以及PCT公开案WO01/14424。

在另一个方面，可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠)产生人抗IL-6抗体。此类小鼠，在本文中称为“KM mice^TM”，详细地描述于PCT公开案WO 02/43478中。

此外，表达人免疫球蛋白基因的可选择的转基因动物系统在本领域内是可获得的并且可用于产生IL-6抗体。例如，可使用称为Xenomouse^TM(Abgenix，Inc.)的可选择的转基因系统；此类小鼠描述于例如美国专利：5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中。

此外，表达人免疫球蛋白基因的可选择的转染色体动物系统在本领域内是可获得的并且可用于产生IL-6抗体。例如，可使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠(称为“TC小鼠”)；此类小鼠描述于Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727。此外，携带人重链和轻链转染色体的牛已描述于本领域中(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)并且可用于产生IL-6抗体。

还可使用已在其中重建了人免疫细胞(以便在免疫后可产生人抗体应答)的SCID小鼠制备人单克隆抗体。此类小鼠描述于例如美国专利：5,476,996和5,698,767。

人Ig小鼠的免疫

抗体和抗体产生性细胞系的产生

在用IL-6抗原免疫动物后，可从动物获得抗体和/或抗体产生性细胞。在一些情况下，通过采血或杀死动物从动物获得含有IL-6抗体的血清。可使用血清，因为其获自动物，可从血清获得免疫球蛋白级分，或可从血清纯化IL-6抗体。

在一些情况下，从分离自经免疫的动物的细胞制备产生抗体的永生化细胞系。在免疫后，杀死动物，然后通过本领域内已知的任何方法使淋巴结和/或脾B细胞永生化。永生化细胞的方法包括但不限于，用癌基因转染它们，用致癌病毒感染它们和在选择永生化细胞的条件下培养它们，将它们经历致癌或突变化合物，将它们与永生化细胞例如骨髓瘤细胞融合，以及使肿瘤抑制基因失活。如果使用与骨髓瘤细胞的融合，那么骨髓瘤细胞优选不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌型细胞系)。使用IL-6或其部分或表达IL-6的细胞筛选永生化细胞。在一些情况下，使用酶联免疫测定(ELISA)或放射性免疫测定来进行初步筛选。在PCT公开案WO 00/37504(通过引用合并入本文)中提供了ELISA筛选的实例。

选择、克隆产生IL-6抗体的细胞例如杂交瘤并且就期望的特征(包括旺盛的生长、高抗体产量和期望的抗体特征)对其进行进一步筛选。可在同基因动物(syngeneic animal)中，在缺乏免疫系统的动物例如裸小鼠中体内扩增或在细胞培养物中体外扩增杂交瘤。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。

在一个实例中，免疫的动物是表达人免疫球蛋白基因的非人动物，并且将脾B细胞融合至来自与该非人动物相同物种的骨髓瘤细胞系。一个这样的免疫的动物是Kirin TC Mouse^TM小鼠，并且骨髓瘤细胞系是非分泌型小鼠骨髓瘤。在另外的实例中，骨髓瘤细胞系是Sp2/0-Ag14(美国典型培养物保藏中心(ATCC)CRL-1581)。

还提供了用于制备产生抗IL-6的人单克隆抗体或其抗原结合部分的细胞系的方法，其包括：(a)用IL-6、IL-6的部分或表达IL-6的细胞或组织免疫本文中描述的非人转基因动物；(b)让转基因动物发起对IL-6的免疫应答；(c)从转基因动物分离抗体产生性细胞；(d)永生化抗体产生性细胞；(e)产生永生化的抗体产生性细胞的个体单克隆群体；和(f)筛选永生化的抗体产生性细胞以鉴定抗IL-6的抗体。

在另一个方面，提供了产生人IL-6抗体的杂交瘤。由杂交瘤产生的人IL-6抗体可以是IL-6的拮抗剂。可在非人、非小鼠物种例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生杂交瘤。

在一种情况下，分离抗体产生性细胞并且在宿主细胞例如骨髓瘤细胞中进行表达。在另一个实例中，用IL-6免疫转基因动物，从免疫的转基因动物分离原代细胞(例如，脾或外周血细胞)，鉴定产生特异于期望的抗原的抗体的个体细胞。从各个个体细胞分离多腺苷酸化的mRNA，使用与可变区序列退火的有义引物(例如，识别人重链和轻链可变区基因的大多数或所有FR1区的简并引物)以及与恒定区或连接区序列退火的反义引物进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。然后克隆重链和轻链可变结构域的cDNA，并在任何合适的宿主细胞例如骨髓瘤细胞中进行表达，对于嵌合抗体，使用各自的免疫球蛋白恒定区例如重链和κ或λ恒定结构域。参见Babcook，J.S.等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-48(通过引用合并入本文)。然后可鉴定和分离IL-6抗体。

产生抗体的重组方法

IL-6抗体或其抗原结合部分可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。例如，为了重组表达抗体，用一个或多个携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，以便轻链和重链在宿主细胞中表达并且，优选分泌入培养所述宿主细胞的培养基中，然后可从该培养基中回收抗体。可使用各种重组DNA方法来获得抗体重链和轻链基因，将此类基因整合入重组表达载体，和将载体引入宿主细胞，例如Sambrook，Fritsch和Maniatis(eds)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F.M.等人(eds.)Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates，(1989)和美国专利4,816,397(其公开内容通过引用合并入本文)中描述的方法。

突变和修饰

为了表达IL-6抗体，可首先使用本文中论述的任何方法获得编码V_H和V_L区的DNA片段。还可使用各种合适的方法来将各种突变、缺失和/或添加引入DNA序列。例如，可使用标准方法例如PCR介导的诱变来进行诱变，在所述PCR介导的诱变中，将突变的核苷酸整合入PCR引物以便PCR产物包含期望的突变或定点诱变。例如，可产生的一种类型的置换改变抗体中可与另一个残基例如但不限于丙氨酸或丝氨酸化学反应的一个或多个半胱氨酸。例如，可存在非典范或典范半胱氨酸的置换。可在抗体的可变结构域的CDR或构架区中或恒定结构域中产生置换。还可在重链和/或轻链的可变结构域中突变抗体，例如以改变抗体的结合性质。例如，可在一个或多个CDR区中产生突变以增加或减少抗体对IL-6的K_D，增加或减少k_off，或改变抗体的结合特异性。定点诱变中的技术包括例如Sambrook等人和Ausubel等人，其通过引用合并入本文。

还可在构架区或恒定结构域中产生突变以增加IL-6抗体的半衰期。参见，例如，PCT公开案WO 00/09560，通过引用合并入本文。还可在构架区或恒定结构域中产生突变以改变抗体的免疫原性，为与另一个分子的共价或非共价结合提供位点，或改变性质例如补体结合、FcR结合和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。单个抗体可在可变结构域的任何一个或多个CDR或构架区中或在恒定结构域中具有突变。

在称为“种系化(germlining)”的过程中，可突变V_H和V_L序列中的某些氨基酸以匹配在种系V_H和V_L序列中天然发现的氨基酸。特别地，可突变V_H和V_L序列中的构架区的氨基酸序列以匹配种系序列，从而在施用抗体时减少免疫原性的风险。人V_H和V_L基因的种系DNA序列在本领域内是已知的(参见例如，″Vbase″人种系序列数据库；也参见Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox等人Eur.J.Immunol.24：827-836(1994)；其各自的内容通过引用合并入本文)。

可产生的另一种类型的氨基酸置换是除去抗体中的潜在蛋白质水解位点。此类位点可存在于抗体的可变结构域的CDR或构架区中或恒定结构域中。半胱氨酸残基的置换和蛋白质水解位点的去除可减少抗体产物的异质性的风险，从而增加其同质性。另一种类型的氨基酸置换是通过改变天冬酰胺和甘氨酸中的一个或两者来消除形成潜在的脱酰胺位点的天冬酰胺-甘氨酸对。在另一个实例中，可切割IL-6抗体的重链的C末端赖氨酸。在各种实例中，IL-6抗体的重链和轻链可任选地包括信号序列。在一些情况下，可通过蛋白水解切割抗IL-6抗体的重链的C末端赖氨酸。

在获得编码V_H和V_L区段的DNA片段后，可利用标准重组DNA技术进一步操作此类DNA片段，例如以将可变区基因转换成全长抗体链基因，转换成Fab片段基因或转换成scFv基因。在此类操作中，将编码V_L或V_H的DNA片段有效地连接至编码另一种蛋白质(例如抗体恒定区或柔性连接体)的另一个DNA片段。术语“有效连接”，如本说明书中使用的，旨在表示连接两个DNA片段以便由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合读框。

可通过将编码V_H的DNA有效地连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一个DNA分子来将编码V_H区的分离的DNA转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域内是已知的(参见例如，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)并且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1或IgG2恒定区。IgG1恒定区序列可以是已知在不同个体中发生的任何等位基因或同种异型，例如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)和Gm(17)。此类同种异型代表了IgG1恒定区中天然发生的氨基酸置换。对于Fab片段重链基因，可将编码V_H的DNA有效地连接至只编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子。CH1重链恒定区可来源于任何重链基因。

可通过将编码V_L的DNA有效地连接至编码轻链恒定区C_L的另一个DNA分子来将编码V_L区的分离的DNA转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域内是已知的(参见例如，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)并且可通过标准PCR扩增来获得包含此类区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。κ恒定区可以是已知在不同个体中发生的任何等位基因例如Inv(1)、Inv(2)和Inv(3)。λ恒定区可来源于3个λ基因的任一个。

为了产生scFv基因，将编码V_H和编码V_L的DNA片段有效连接至编码柔性连接体(例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃)的另一个片段，以便V_H和V_L序列可表达为连续单链蛋白，且V_L和V_H区通过柔性连接体连接(参见例如，Bird等人Science 242：423-426(1988)；Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990))。如果只使用单个V_H和V_L，则单链抗体可以是单价的，如果使用两个V_H和V_L，则其可以是二价的，或如果使用2个以上的V_H和V_L，则其可以是多价的。可产生特异性结合IL-6和另一个分子的双特异性或多价抗体。

在另一种情况下，可制备包含连接至另一个多肽的IL-6抗体的全部或部分的融合抗体。在另一种情况下，只将IL-6抗体的可变结构域连接至多肽。在另一种情况下，将IL-6抗体的V_H结构域连接至第一多肽，同时将IL-6抗体的V_L结构域连接至第二多肽，所述第二多肽以使V_H和V_L结构域能够彼此相互作用以形成抗原结合部位的方式结合第一多肽。在另一种情况下，通过连接体将V_H结构域与V_L结构域分开，以便V_H和V_L结构域可彼此相互作用。然后将V_H-连接体-V_L抗体连接至目的多肽。此外，可产生其中两个(或更多个)单链抗体彼此连接的融合抗体。如果想要在单个多肽链上产生双价或多价抗体，或如果想要产生双特异性抗体，这是很有用的。

在其他情况下，可使用编码IL-6抗体的核酸分子制备其他修饰的抗体。例如，可按照本文中论述的教导使用合适的分子生物学技术制备“Kappa bodies”(Ill等人，Protein Eng.10：949-57(1997))、“微小抗体”(Martin等，EMBO J.13：5303-9(1994))、“双抗体”(Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))或“Janusins”(Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)和Traunecker等，Int.J.Cancer(Suppl.)7：51-52(1992))。

可利用许多方法(包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接)产生双特异性抗体或抗原结合片段。参见，例如，Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)，Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。此外，可将双特异性抗体形成为“双抗体”或“Janusins”。在一些情况下，双特异性抗体结合IL-6的两个不同表位。在一些情况下，使用来自人IL-6抗体的一个或多个可变结构域或CDR区来制备本文中描述的修饰的抗体。

载体和宿主细胞

为了表达IL-6抗体和其抗原结合部分，将如本文所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体，以便将基因有效地连接至转录和翻译控制序列。在本说明书中，术语“有效连接”旨在表示将抗体基因连接入载体以便载体内的转录和翻译控制序列能够发挥它们期望的调控抗体基因的转录和翻译的功能。选择表达载体和表达控制序列以与使用的表达宿主细胞相容。表达载体包括例如质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、植物病毒例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC和EBV衍生附加体。将抗体基因连接入载体以便载体内的转录和翻译控制序列能够发挥它们期望的调控抗体基因的转录和翻译的功能。选择表达载体和表达控制序列以与使用的表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体或将两个基因都插入相同的表达载体。利用各种方法(例如，抗体基因片段与载体上的互补限制性位点的连接，或者如果不存在限制性位点则平端连接)将抗体基因插入表达载体。

方便的载体是这样的载体，其编码功能上完整的人C_H或C_L免疫球蛋白序列，具有适当的经工程改造的限制性位点以便任何V_H或V_L序列可容易地插入和表达，如上所述的。在此类载体中，剪接通常在插入的J区中的剪接供体位点与人C结构域之前的剪接受体位点之间发生，也可在存在于人C_H外显子中的剪接区域上发生。多腺苷酸化和转录终止在编码区下游的天然染色体位点上发生。重组表达载体还可编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆入载体以便信号肽符合读框地连接至免疫球蛋白链的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。

除了抗体链基因外，重组表达载体具有控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。表达载体的设计(包括调控序列的选择)可取决于因素例如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白质表达的病毒元件，例如来源于逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)，猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤和强哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子的启动子和/或增强子。关于病毒调控元件和其序列的进一步描述，参见例如，美国专利5,168,062、美国专利4,510,245和美国专利4,968,615，其通过引用合并入本文。用于在植物中表达抗体(包括启动子和载体的描述)以及植物的转化的方法，在本领域内是已知的。参见，例如，美国专利6,517,529，其通过引用合并入本文。

除了抗体链基因和调控序列外，重组表达载体可携带另外的序列，例如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因帮助选择已向其中引入了载体的宿主细胞(参见例如，美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017，其通过引用合并入本文)。例如，通常选择标记基因为向其中引入了载体的宿主细胞提供对药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于使用甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)、新霉素磷酸转移酶基因(用于G418选择)和谷氨酸合酶基因。

编码IL-6抗体的核酸分子和包含此类核酸分子的载体可用于转染适当的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。转化可以是将多核苷酸引入宿主细胞的任何适当的方法。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的封装和DNA至细胞核内的直接显微注射。此外，可利用病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞。转化细胞的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455，其通过引用合并入本文)。转化植物细胞的方法在本领域内是已知的，包括，例如农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、基因枪转化(biolistictransformation)、直接注射、电穿孔和病毒转化。用于转化细菌和酵母细胞的方法在本领域内也是熟知的。

可获得作为用于表达的宿主的哺乳动物细胞系在本领域内是熟知的，其包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化的细胞系。此类细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞和许多其他细胞系。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可使用的其他细胞系是昆虫细胞系例如Sf9或Sf21细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞并进行足以允许抗体在宿主细胞中表达或更优选，允许抗体分泌入培养宿主细胞的培养基中的时间来产生抗体。可使用各种蛋白质纯化方法来从培养基回收抗体。细胞宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)和链霉菌属(Streptomyces)的种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。

此外，可使用任何合适的技术来增强抗体从产生性细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶(GS系统)和DHFR基因表达系统是用于在某些条件下增强表达的常用方法。可使用常规技术例如有限稀释克隆和微滴(Microdrop)技术来鉴定高表达细胞克隆。在欧洲专利0 216 846、0 256 055、0 323 997和0 338 841中论述了GS系统。

由不同细胞系或在转基因动物中表达的抗体可能具有彼此不同的糖基化。然而，由本文中提供的核酸分子编码的或包含本文中提供的氨基酸序列的所有抗体都是本公开内容的部分，无论抗体的糖基化如何。

噬菌体展示文库

还提供了用于产生IL-6抗体或其抗原结合部分的方法，其包括步骤：在噬菌体上合成人抗体的文库，用IL-6或其部分筛选文库，分离结合IL-6的噬菌体，以及从噬菌体获得抗体。例如，用于制备抗体文库(其用于噬菌体展示技术)的一个方法包括步骤：用IL-6或其抗原性部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物以产生免疫应答，从免疫的动物提取抗体产生性细胞；从提取的细胞分离编码抗体的重链和轻链的RNA，逆转录RNA以产生cDNA，使用引物扩增cDNA，然后将cDNA插入噬菌体展示载体以便在噬菌体上表达抗体。可用该方法获得重组IL-6抗体。

可通过筛选重组组合抗体文库来分离重组IL-6人抗体。优选文库是使用从分离自B细胞的mRNA制备的人V_L和V_HcDNA产生的scFv噬菌体展示文库。用于制备和筛选此类文库的方法在本领域内是已知的。用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是可商购获得的(例如，PharmaciaRecombinant Phage Antibody System，catalog no.27-9400-01；和Stratagene SurfZAP^TM噬菌体展示试剂盒，catalog no.240612)。还存在可用于产生和筛选抗体展示文库的其他方法和试剂(参见，例如，美国专利5,223,409；PCT公开案WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；Fuchs等人，Bio/Technology 9：1370-1372(1991)；Hay等人，Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85(1992)；Huse等人，Science 246：1275-1281(1989)；McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)；Griffiths等人，EMBO J.12：725-734(1993)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3576-3580(1992)；Garrad等人，Bio/Technology 9：1373-1377(1991)；Hoogenboom等人，Nuc.Acid Res.19：4133-4137(1991)；和Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982(1991)，其全部通过引用合并入本文。

为了分离和产生具有期望的特征的人IL-6抗体，首先使用PCT公开案WO 93/06213(其通过引用合并入本文)中描述的表位印迹法将人IL-6抗体用于选择具有对IL-6的相似结合活性的人重链和轻链序列。用于该方法的抗体文库优选是如PCT公开案WO 92/01047，McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)；和Griffiths等人，EMBO J.12：725-734(1993)(其全部通过引用合并入本文)中所述制备和筛选的scFv文库。

在选择了初始的人V_L和V_H结构域后，进行“混合和匹配(mix andmatch)”实验，其中就IL-6结合筛选初始选择的V_L和V_H区段的不同配对以选择优选的V_L/V_H配对组合。此外，为了进一步提高抗体的质量，可在与体内体细胞突变过程(其在天然免疫应答过程中负责抗体的亲和力成熟)相似的过程中，随机突变优选的V_L/V_H对的V_L和V_H区段(优选在V_H和/或V_L的CDR3区域内)。可通过使用分别与V_HCDR3或V_LCDR3互补的PCR引物扩增V_H和V_L结构域来完成该体外亲和力成熟，所述引物已在某些位点上用4种核苷酸碱基的随机混合物进行“搀杂”以便所得的PCR产物编码已将随机突变引入V_H和/或V_LCDR3区域的V_H和V_L区段。可就对IL-6的结合再筛选这些随机突变的V_H和V_L区段。

在从重组免疫球蛋白展示文库筛选和分离IL-6抗体后，可从展示包装(例如，从噬菌体基因组)回收编码所选择的抗体的核酸，然后通过标准重组DNA技术将其亚克隆入其他表达载体。需要时，还可操纵核酸以产生其他抗体形式，如本文中所描述的。为了表达通过筛选组合文库而分离的重组人抗体，如上所述，将编码抗体的DNA克隆入重组表达载体并且引入哺乳动物宿主细胞。

去免疫化的抗体

在另一个方面，可使用例如PCT公开案：WO98/52976和WO00/34317(其通过引用合并入本文)中描述的技术将IL-6抗体或其抗原结合部分去免疫化以减小它们的免疫原性。

衍生的和标记的抗体

可衍生IL-6抗体或抗原结合部分或将其连接至另一个分子(例如，另一个肽或蛋白质)。一般地，衍生抗体或其抗原结合部分以使IL-6结合不受衍生或标记不利地影响。因此，抗体和抗原结合部分旨在包括本文中描述的人IL-6抗体的原封不动(intact)的形式和修饰的形式。例如，可将抗体或抗原结合部分功能性地连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合等)至一个或多个其他分子实体，例如另一个抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、检测试剂、标记、细胞毒性剂、药剂和/或可介导抗体或抗原结合部分与另一个分子的结合的蛋白质或肽(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)。

通过交联两种或更多种抗体(相同类型或不同类型的，例如，以产生双特异性抗体)来产生一种类型的衍生抗体。合适的交联剂包括具有被适当的间隔子分隔的两个不同的反应性基团的异双功能的(例如，m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的(例如，二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)交联剂。此类交联剂可从Pierce ChemicalCompany，Rockford，IL获得。

另一种类型的衍生抗体是标记抗体。可用其衍生抗体或抗原结合部分的有用的检测试剂包括荧光化合物，包括例如，荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺基-1-萘-磺酰氯、藻红蛋白、镧系元素磷光体。抗体还可用用于检测的酶标记，所述酶例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶或葡糖氧化酶。当用可检测的酶标记抗体时，通过加入另外的试剂(酶可用其产生可辨别的反应产物)来检测酶。例如，当提供试剂辣根过氧化物酶时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入导致可检测的有色反应产物。还可用生物素标记抗体，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的结合来对其进行检测。还可用预先确定的被第二报道分子识别的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，二抗的结合部位，金属结合结构域、表位标签)标记抗体。在一些情况下，通过不同长度的间隔臂连接标记以减小潜在的空间位阻。还可用化学基团例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基团衍生IL-6抗体。此类基团可用于改进抗体的生物学特征，例如，增加血清半衰期。

本文中所示的特定实施例旨在举例说明本公开内容的特定方面并且无意限定权利要求的范围。

实施例1

产生抗IL-6抗体的杂交瘤的产生

如下制备、选择和测定根据本公开内容的示例性抗体：

小鼠品系

使用人Ig转基因小鼠品系HCo7和HCo12以及人转染色体/转基因品系KM(Medarex，Inc.)制备抗人IL-6的完全人单克隆抗体。这些品系都表达不能与从人分离的抗体相区分的完全人抗体。

在所有3个品系中，分别如Chen等人(1993)EMBO J.12：811-820和PCT公开案WO 01/09187的实施例1中所述，纯合地破坏内源小鼠κ轻链基因和内源小鼠重链基因。此外，所有3个品系都具有人κ轻链转基因KCo5，如Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中描述的。相反地，在它们的人重链基因方面，3个品系是不同的。HCo7品系具有如美国专利：5,545,806、5,625,825和5,545,807中描述的HCo7人重链转基因；HCo12品系具有如PCT公开案WO01/09187的实施例2中描述的HCo12人重链转基因；以及KM品系具有如Ishida等人，(2002)，Cloning and Stem Cells，4：91-102中描述的人微型染色体。

使用IL-6抗原的免疫和产生抗IL-6单克隆抗体的HuMab小鼠的 选择

用于HuMab小鼠的一般免疫方案描述于Lonberg等(1994)Nature368(6474)：856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology14：845-851和PCT公开案WO 98/24884中。在本发明中，用5-25μg的在Ribi佐剂中的纯化的人IL-6在6-16周龄时开始免疫HCo7、HCo12和KM品系的总共81只HuMab小鼠。从人骨髓衍生的基质细胞HS-5(ATCC CRL-11882，Roecklein B.A.&Torok-Storb B.，Blood 85：997-1005，1995)(其将IL-6内源地分泌入培养基)分离人IL-6。从表达IL-6的HS-5培养基纯化人IL-6，其通过超滤，然后通过QSepharose阴离子交换层析步骤和使用小鼠抗hIL-6MAb(R&DSystems，Catalog number MAB2061，克隆1936)的亲和层析步骤来进行浓缩。纯化的人IL-6具有大约90％的纯度(通过SDS-PAGE测定的)。从SDS-PAGE凝胶上切取主条带，用胰蛋白酶降解，并在4700TOF/TOFProteomics Analyzer上通过MALDI/MS分析提取的、凝胶纯化的胰蛋白酶降解的肽，确认其为人IL-6。可选择地，可使用商业来源的重组人IL-6(例如，重组人IL-6，产品目录号206-IL-6/CF.R&D SystemInc.614Mckinley Place NE，Minneapolis，MN 55413)。以3至14天的间隔通过腹膜内、皮下或至足垫(footpad)内的注射进行施用，直至总共8次免疫。如下所述，通过ELISA筛选来监控免疫应答。

产生抗IL-6抗体的HuMab小鼠的选择

通过眶后采血获得来自上述转基因小鼠的血，并且就对纯化的人IL-6重组蛋白的特异性结合通过ELISA对其进行分析，如由Fishwild等人(1996)，Nature Biotechnology 14：845-851所描述的。

简而言之，使用50μl/孔的在PBS中的纯化的重组IL-6溶液(1μg/ml)包被微量滴定板，然后在4℃下温育过夜。然后使用200μl/孔的在PBS/Tween(0.05％)中的5％鸡血清封闭孔。向各孔中加入来自IL-6免疫的小鼠的血浆的稀释物，然后在环境温度下温育1小时。用PBS/Tween清洗板，然后将其与缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG Fc多克隆抗体一起在室温下温育1小时。在清洗后，用ABTS底物对板进行显色(Moss Inc，product#：ABTS-1000mg/ml)，然后在OD 415-495处用分光光度计进行分析。将产生最高滴度的抗IL-6抗体的小鼠(总共22只动物)用于融合。

产生抗IL-6的人单克隆抗体的杂交瘤的产生：

在杀死和取出脾和/或淋巴结之前3天用IL-6静脉内加强上述选择的小鼠，并在其之前2天再次进行加强。进行总共17个融合。

按照标准的或制造商推荐的方案，使用电融合(E-fusion，CytoPulse^TM technology，Cyto Pulse^TM Sciences，Inc.，Glen Burnie，MD)将从免疫的HuMab或KM小鼠分离的小鼠脾细胞和/或淋巴结淋巴细胞融合至SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL-1581，ATCC美国典型培养物保藏中心，1080University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209USA)。

简而言之，制备来自免疫的小鼠的脾细胞和/或淋巴结淋巴细胞的单细胞悬浮液，然后将其与等数量的Sp2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞组合；然后进行E-fusion。

然后将细胞以2x10⁴个细胞/孔涂板在平底微量滴定板中，并在含有10％胎牛血清，10％P388D1(ATCC，CRL-TIB-63)条件培养基，3-5％的在DMEM(Mediatech，Herndon，VA，Cat.No.CRL 10013，具有高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)中的(IGEN)、5mM HEPES、0.055mM2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素和1x HAT(Sigma，Cat.No.CRL-P-7185)的选择性培养基中温育10至14天。

1至2周后，将细胞培养在其中用HT替代了HAT的培养基中。在细胞涂板后大约10至14天，就人γ、κ抗体的存在筛选来自单个孔的上清液。就人抗IL-6单克隆IgG抗体通过ELISA(使用上述方案)筛选对于人γ、κ评分为阳性的上清液。将分泌抗体的杂交瘤转移至24孔板，再次进行筛选，并且如果确认对于人抗IL-6IgG单克隆抗体为阳性，则通过有限稀释将其亚克隆至少2次。然后体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用于进一步表征。

实施例2

IL-6抗体的测序

如下从杂交瘤克隆全长抗IL-6抗体并进行序列验证：使用RNeasyMini Kit(Qiagen)分离Poly(A)⁺mRNA，然后用Advantage RT-for-PCR试剂盒(BD Biosciences)，利用寡聚(dT)引物从mRNA合成cDNA。分别使用表1中所列的简并引物扩增克隆9C8的寡聚(dT)引发的cDNA。

表1：用于9C8的简并引物(5′至3′)

VH4_5UTR_F	CTTTCTGAGASTCMTGGAKCTCMTG SEQ ID NO：49
		G_3UTR_R	TACGTGCCAAGCATCCTCGC SEQ ID NO：50
VK1a_5UTR_F	GSARTCAGWCYCWVYCAGGACACAGC SEQ ID NO：51
		κ_3UTR_F	AGGCTGGAACTGAGGAGCAGGTG SEQ ID NO：52

使用High Fidelity Polymerase(Roche)和PTC-200DNA Engine(MJ Research)，利用如下循环：2′95℃；25x(20”95℃，30”52℃，2′72℃)；10′72℃进行扩增。使用标准方案将PCR扩增子克隆入pCR2.1TOPO，然后转化入TOP10化学感受态细胞(Invitrogen)。使用Grills 16^thBDTv3.1/dGTP化学试剂(AppliedBiosystems Inc)和3730x1DNA分析仪(Applied Biosystems Inc)序列验证克隆。通过与‘V BASE序列目录’(Tomlinson，等人，J.Mol.Biol.，227，776-798(1992)；Hum.Mol.Genet.，3，853-860(1994)；EMBO J.，14，4628-4638(1995)比对来分析所有序列。示例性抗IL-6抗体的种系基因区段使用列于表2中。

表2：

来源于杂交瘤的抗IL-6抗体的全长序列

9C8

来自杂交瘤细胞的9C8重链的DNA序列(可变结构域以大写字母标示)

CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTATCTATGGTGGGTCCTTCAGGGAGTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCAACATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGACCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGAATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa SEQ ID NO：1

来自杂交瘤细胞的9C8重链的衍生蛋白序列(通过翻译)(可变结构域以大写字母标示)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAIYGGSFREYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIFHSGSTNYNPSLKSRVNISVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCAREELDDFDIWGQGTMVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk SEQ ID NO：3

来自杂交瘤细胞的9C8轻链的DNA序列(可变结构域以大写字母标示)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAAAAGTTACCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt SEQ ID NO：12

来自杂交瘤细胞的9C8轻链的衍生蛋白序列(通过翻译)(可变结构域以大写字母标示)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYKSYPRTFGQGTKVEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec SEQ ID NO：14

如下将抗IL-6抗体可变结构域克隆入表达载体：

使用表3中所列的引物从克隆了cDNA的pCR2.1扩增可变结构域。使用Pfx Platinum聚合酶(Invitrogen)和PTC-200DNA Engine(MJResearch)，利用如下循环：2′94℃；20x(30”94℃，45”55℃，1′68℃)；5′68℃进行扩增。然后将可变结构域克隆入含有适当的同种型的恒定结构域的表达载体。使用Grills 16^thBDTv 3.1/dGTP化学药品(Applied Biosystems Inc)和3730x1DNA分析仪(AppliedBiosystems Inc)序列验证这些克隆。

表3：用于9C8的可变结构域引物(5′至3′)

重组抗IL-6抗体的全长序列

9C8

重组9C8IgG2重链的DNA序列(可变结构域以大写字母标示)

CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTATCTATGGTGGGTCCTTCAGGGAGTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCAACATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGACCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGAATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa SEQ ID NO：23

重组9C8IgG2重链的衍生蛋白序列(通过翻译)(可变结构域以大写字母标示)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAIYGGSFREYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIFHSGSTNYNPSLKSRVNISVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCAREELDDFDIWGQGTMVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk SEQ ID NO：24

重组9C8κ轻链的DNA序列(可变结构域以大写字母标示)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAAAAGTTACCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt SEQ ID NO：25

重组9C8κ轻链的衍生蛋白序列(通过翻译)(可变结构域以大写字母标示)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYKSYPRTFGQGTKVEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec SEQ ID NO：26

实施例3

抗IL-6抗体的诱变：

在IgG1或IgG2形式的背景中，单个地或组合地在位点24(I24V)、30(R30S)、31(E31G)、52(F52N)、68(N68T)、83(T83S)上于重链可变结构域中产生抗IL-6抗体9C8的氨基酸置换变体。在IgG1或IgG2形式中，在92(K92N)上于轻链可变结构域中产生抗IL-6抗体9C8的氨基酸置换变体。产生具有重链可变结构域和轻链可变结构域变体的抗体。一些突变组合示于表6a和6b中。按照制造商的说明书，使用表4中所列的引物(显示有义链；靶向的残基以粗体显示)和QuickChange试剂盒(Stratagene)在克隆9C8的V_H(I24V)、V_H(E31G)、V_H(N68T)和V_H(T83S)区域中进行诱变。利用标准技术对突变的变体进行序列验证，然后将其克隆入表达载体。

表4：用于9C8的诱变引物(5′至3′)

重组9C8IgG2重链(N68T，T83S)重链的DNA序列

CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTATCTATGGTGGGTCCTTCAGGGAGTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGAATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa SEQ ID NO：27

重组9C8IgG2重链(N68T，T83S)重链的衍生蛋白序列(通过翻译)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAIYGGSFREYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIFHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREELDDFDIWGQGTMVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk SEQ ID NO：28

重组9C8IgG1重链(N68T，T83S)重链的DNA序列

CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTATCTATGGTGGGTCCTTCAGGGAGTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACIACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGAATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa SEQ ID NO：31

重组9C8IgG1重链(N68T，T83S)重链的蛋白质序列

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAIYGGSFREYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIFHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVIAADIAVYYCAREELDDFDIWGQGTMVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqqrepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk SEQ ID NO：32

重组9C8(E 31G，N68T，T83S)重链的可变结构域DNA序列

CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTATCTATGGTGGGTCCTTCAGGGGGTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGAATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA SEQID NO：33

重组9C8(E 31G，N68T，T83S)重链的可变结构域的翻译的蛋白序列

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAIYGGSFRGYYWSWIRQpPGKGLEWIGEIFHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREELDDFDIWGQGTMVTVSS SEQ IDNO：34

重组9C8(I24V，N68T，T83S)重链的可变结构域DNA序列

CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGGGAGTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGAATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO：36

重组9C8(I24V，N68T，T83S)重链的可变结构域的翻译的蛋白质序列

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFREYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIFHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREELDDFDIWGQGTMVTVSS SEQ IDNO：37

按照提供商的方案，将含有CMV启动子的表达载体转染入293Freestyle(Invitrogen)细胞。通过离心收集来自这些细胞的上清液，然后利用标准蛋白A亲和层析进行纯化以分离重组免疫球蛋白。然后通过SDS-PAGE、光散射和分光光度计测量表征这些蛋白质。

根据布达佩斯条约的条款，将示于表5中的抗IL-6抗体的重链和轻链保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manassas，VA 20110-2209。重链和轻链已被赋予下列登录号：

表5

实施例4

TF-1增殖

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas，Va.)获得人细胞TF-1细胞，将其维持在含有10％热灭活的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，Carlsbad，Ca.)和2ng/ml重组人GM-CSF的RPMI-1640培养基中。将TF-1细胞分成1-2x10⁵以在第二天使用。在涂板之前，用RPMI-1640清洗细胞3次，计数，然后用测定培养基调整体积以产生2x10⁵个细胞/ml。向各孔中加入50μl的已清洗的细胞，并在37℃和5％CO₂中温育过夜。在96孔组织培养处理板(Corning，Corning，NY)中以一式三份进行所有条件。向各孔中加入25μl体积的25ng/ml或2.5ng/ml的IL-6和25μl体积的在磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠和150mM氯化钠，pH 7.4)中的不同浓度的测试或对照抗体(至100μl的终体积)。单独和用人IL-6测试抗体。将板在37℃和5％CO₂下温育48小时(hr)。48小时后，加入10μl/孔的0.5μCi ³H-胸苷(Amersham Biosciences，Piscataway，N.J.)并且脉冲细胞3小时。为了检测整合的胸苷的量，将细胞收获至预润湿的unifilter GF/C滤板(Packard，Meriden，Ct.)，用水清洗10次。让板干燥过夜。给滤板加上底部密封。然后，每孔加入45μl Microscint 20(Packard，Meriden，Ct.)。在加上顶部密封后，在Trilux microbeta计数器(Wallac，Norton，Oh.)中对板进行计数，数据报告为CPM(计数/分钟)。表6a和6b显示9C8抗体和具有氨基酸置换的各种抗体在TF-1增殖测定中的IC50。表6a和表6b中显示的结果来自在两个分开的场合进行的测定。

表6a

Hc	Lc	平均IC50(μg/ml)	倍数差异
				9C8	9C8	0.0022	1.0
9C8I24V	9C8	0.0071	3.3
				9C8R30S	9C8	0.0260	12.1
9C8N68T	9C8	0.0028	1.3
				9C8T83S	9C8	0.0026	1.2
9C8I24V，N68T，T83S	9C8	0.0145	6.7
				9C8I24V，R30S，N68T，T83S	9C8	0.2040	94.9
9C8E31G	9C8	0.0051	2.4
				9C8F52N	9C8	1.3850	644.2
9C8	9C8K92N	0.0120	5.6

表6b

Hc＝重链，Lc＝轻链

实施例5

来自LPS-猴研究的C反应性蛋白

由Charles River Laboratories Preclinical Services在它们的Worcester，MA Test Facility进行本研究的体内部分。简而言之，本研究由15只雄性食蟹猴(5组；3只猴子/组)组成。在第1天，第1组中的动物接受媒介物；第2和3组中的动物分别接受剂量为0.5和5mg/kg的抗体9C8N68T T83S IgG₁；以及第4和5组中的动物分别接受剂量为0.5和5mg/kg的9C8N68T T83S IgG₂。以各自1mL/kg的剂量体积通过IV团注来施用所有处理。处理后大约2小时，用10μg/kg细菌脂多糖(LPS)以1mL/kg的体积通过缓慢IV团注来攻击所有动物。在第1天，在基线(处理之前)、紧在处理后、处理后2小时(紧在LPS施用之前)以及在LPS攻击后30分钟和1、2、3、4、6、8和22小时从外周血管收集血液。还在第3、4、5、6和7天收集血液样品。处理全血样品以获得血清，然后将血清样品冷冻贮藏。使用来自Meso Scale DiscoveryGaithersburg，MD的人VascularInjury Panel II Multi-Assay试剂盒测量C反应性蛋白(CRP)。如来自MSD的公开的试剂盒说明书中概述的，进行测定。图2显示9C8N68T T83S IgG₂抗体的总血清CRP。

实施例6

利用流式细胞术进行的pSTAT3测定

在用重组人IL-6(rhIL-6)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)和人全血中进行体外测定以测量在抗IL-6抗体存在的情况下磷酸化的STAT3(pSTAT3)的水平。

全血测定

将新收集的肝素化的人全血与抗IL-6抗体或媒介物对照(终体积300μL，于15mL聚丙烯管中)一起在37℃下温育15分钟。用重组人(rh)IL-6(终浓度25ng/mL)刺激样品，在37℃下温育10分钟。然后用4mL RBC裂解缓冲液(Sigma)裂解红细胞(RBC)，将样品在37℃下轻轻地混合10分钟。以400×g离心样品5分钟以沉淀细胞。除去上清液。向各管中加入2毫升清洗缓冲液(4％BSA于PBS中，Gibco)，然后以400×g离心样品5分钟以沉淀细胞。除去上清液，将细胞沉淀重悬浮于200μL预热的(37℃)透化缓冲液(2％甲醛，于PBS中，Polysciences，Inc.)中并且在37℃下温育10分钟。向各样品中加入3毫升冰冷的MeOH以固定细胞。将样品混合并且置于冰上至少30分钟。将样品离心(400×g进行5分钟)，并除去上清液。用清洗缓冲液清洗沉淀1次。然后用在清洗缓冲液(终体积100μL)中稀释的缀合至Alexa Fluor 488的抗磷酸化的STAT3(Y705)抗体(BD Pharmingen)对细胞沉淀进行染色。在冰上温育样品30分钟，然后在清洗缓冲液中清洗2次。将终细胞沉淀重悬浮于400μL IF缓冲液(Hank′s缓冲盐溶液，2％胎牛血清，10mM Hepes，0.2％叠氮化钠，Gibco)中。将使用CellQuest软件的FACSCalibur仪(BD Biosciences)用于收集和分析数据。表7显示在抗IL-6抗体存在的情况下在人全血中测量的pSTAT3的水平。

表7

PBMC测定

按照制造商的方案(Sigma-Aldrich A7054)，使用AccuspinSystem-Histopaque 1077柱子从新收集的肝素化的人全血分离外周血单核细胞(PBMC)，将其置于(0.1％青霉素链霉素于Macrophage SFM培养基中，Gibco)中。将大约2X10⁶个PBMC与抗IL-6抗体或媒介物对照(终体积300μL)一起在37℃下温育15分钟。用rhIL-6(终浓度25ng/mL)刺激PBMC，在37℃下温育10分钟。将样品以400×g离心5分钟以沉淀细胞。除去上清液。向各样品中加入2mL清洗缓冲液(4％BSA于PBS中)。将样品以400x g离心5分钟以沉淀细胞。除去上清液，将细胞沉淀重悬浮于200uL预热的(37℃)透化缓冲液(2％甲醛于PBS中，Polysciences，Inc.)中并且在37℃下温育10分钟。向各样品中加入3毫升冰冷MeOH以固定细胞。混合样品，并将其保持在冰上至少30分钟。以400x g离心样品5分钟，然后除去上清液。用清洗缓冲液清洗细胞沉淀1次，然后如全血测定中所述，进行染色和分析。表8显示在抗IL-6抗体存在的情况下在人外周血单核细胞中测量的pSTAT3的水平。

表8

实施例7

结合亲和力

BIAcore芯片的制备

如由&Johnsson(J.Chem.Soc.Chem.Commun.(1990)；21：pp1526-1528)所述，通过胺偶联至与芯片的葡聚糖基质连接的羧甲基纤维素(CM)将抗IL-6抗体9C8N68T T83S IgG2固定至BIAcore CM5芯片(GE Biosciences-之前的BIAcore Inc，Piscataway，NJ)上。在偶联之前用1M NaCl和50mM NaOH预处理芯片。通过组合EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)并且使其通过芯片以活化CM基团来完成胺偶联。使10mM醋酸盐缓冲液pH 5中的配体通过芯片表面并且共价结合至活化的CM基团。通过使1M乙醇胺pH 8.5通过芯片来淬灭芯片表面上剩余的活性CM基团。EDC、NHS和乙醇胺作为从GE Biosciences获得的Amine Coupling试剂盒的部分而获得。使用包括在BiaControl Software V3.2中的自动化的Surface Preparation Wizard进行偶联。

结合亲和力的测定

在BIAcore 3000仪(GE Biosciences，Piscataway，NJ)上进行所有SPR测量。将BIAcore Software-BIAcore 3000Control SoftwareV3.2用于BIAcore 3000仪的操作和控制。BiaEvaluation SoftwareV4.1用于分析来自BIAcore 3000仪的SPR数据，并使用Graph PadPrism Software Version 5对数据作图。在HBS-EP缓冲液(10mMHEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％P20)中于25℃下测量IL-6对单克隆抗体(mAb)的结合亲和力。用于亲和力研究的流速是40uL/分钟，以最小化质量运输效应(mass transport effect)(Myszka，D.G.，等人，Biophysical chemistry.64，127-137，1997)。将人IgG_κ用作用于构建芯片的参照通道的配体。以一式二份测量分析物(rhIL-6；R&D Systems，Minneapolis，MN，206-IL)对固定的配体(9C8N68T T83S IgG₂)的结合，IL-6的浓度在0至25nM的范围之内。IL-6的注射时间是6分钟，解离时间是25分钟。以30uL/分钟的流速利用10mM甘氨酸pH 1.7进行30秒，以在循环之间再生表面。在再生研究后确定最佳的再生条件(数据未显示)。通过使用Kinetics Wizard和手动拟合程序(两者都包括在BiaEvaluation Software V4.1中)，使用1∶1Langmuir模型来分析数据(Karlson R &A.，J.Immunol.Methods.200：pp121-133，1997)。抗IL-6抗体9C8N68T T83S IgG₂经显示具有k_a＝9.95E+05(Ms)^-1，k_d＝1.34E-04s^-1和K_D＝1.35E-10M或135pM。

序列表的概述(除了由‘n.a.’指示的序列(其表示核酸)外，序列都是氨基酸序列)

Claims (14)

1.包含重链可变(V_H)结构域和轻链可变(V_L)结构域的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中V_H的CDR1、CDR2和CDR3以及V_L的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列：

a)分别为：如SEQ ID NO：5所示的V_HCDR1，如SEQ ID NO：6所示的V_HCDR2，如SEQ ID NO：7所示的V_H CDR3，如SEQ ID NO：16所示的V_LCDR1，如SEQ ID NO：17所示的V_L CDR2，和如SEQ ID NO：18所示的V_LCDR3；

b)分别为：如SEQ ID NO：35所示的V_H CDR1，如SEQ ID NO：6所示的V_HCDR2，如SEQ ID NO：7所示的V_H CDR3，如SEQ ID NO：16所示的V_LCDR1，如SEQ ID NO：17所示的V_LCDR2，和如SEQ ID NO：18所示的V_LCDR3；

c)分别为：在ATCC登录号PTA-8013和PTA-8014下保藏的大肠杆菌克隆所编码的V_H和V_L的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；

d)分别为：在ATCC登录号PTA-8019和PTA-8014下保藏的大肠杆菌克隆所编码的V_H和V_L的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或

e)分别为：在ATCC登录号PTA-8015和PTA-8016下保藏的大肠杆菌克隆所编码的V_H和V_L的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；

并且，其中所述抗体特异性结合人IL-6。

2.权利要求1的单克隆抗体或抗原结合部分，其中V_H的FR1、FR2、FR3和FR4以及V_L的FR1、FR2、FR3和FR4：

a)分别为：如SEQ ID NO：8所示的V_H FR1，如SEQ ID NO：9所示的V_HFR2，如SEQ ID NO：10所示的V_HFR3，如SEQ ID NO：11所示的V_HFR4，如SEQ ID NO：19所示的V_LFR1，如SEQ ID NO：20所示的V_LFR2，如SEQ ID NO：21所示的V_LFR3，和如SEQ ID NO：22所示的V_L FR4；

b)分别为：如SEQ ID NO：8所示的V_HFR1，如SEQ ID NO：9所示的V_H FR2，如SEQ ID NO：30所示的V_HFR3，如SEQ ID NO：11所示的V_H FR4，如SEQ ID NO：19所示的V_LFR1，如SEQ ID NO：20所示的V_LFR2，如SEQ ID NO：21所示的V_L FR3，和如SEQ ID NO：22所示的V_LFR4；或

c)分别为：如SEQ ID NO：38所示的V_HFR1，如SEQ ID NO：9所示的V_H FR2，如SEQ ID NO：30所示的V_HFR3，如SEQ ID NO：11所示的V_H FR4，如SEQ ID NO：19所示的V_LFR1，如SEQ ID NO：20所示的V_LFR2，如SEQ ID NO：21所示的V_LFR3，和如SEQ ID NO：22所示的V_L FR4。

3.权利要求1的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体的V_H和V_L结构域：

a)分别为SEQ ID NO：4和15；

b)分别为SEQ ID NO：29和15；

c)分别为SEQ ID NO：34和15；

d)分别为SEQ ID NO：37和15；

e)分别为在ATCC登录号PTA-8013下保藏的大肠杆菌克隆所编码的V_H结构域氨基酸序列，以及在ATCC登录号PTA-8014下保藏的大肠杆菌克隆所编码的V_L结构域氨基酸序列；

f)分别为在ATCC登录号PTA-8019下保藏的大肠杆菌克隆所编码的V_H结构域氨基酸序列，以及在ATCC登录号PTA-8014下保藏的大肠杆菌克隆所编码的V_L结构域氨基酸序列；或

g)分别为在ATCC登录号PTA-8015下保藏的大肠杆菌克隆所编码的V_H结构域氨基酸序列，以及在ATCC登录号PTA-8016下保藏的大肠杆菌克隆所编码的V_L结构域氨基酸序列；

并且，其中所述抗体特异性结合人IL-6。

4.权利要求1的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别为下列序列：

a)SEQ ID NO：3和14；

b)SEQ ID NO：24和26；

c)SEQ ID NO：28和26；或

d)SEQ ID NO：32和14。

5.单克隆抗体，其包含SEQ ID NO：28的重链氨基酸序列以及SEQID NO：26的轻链氨基酸序列。

6.包含权利要求1至5的任一项的抗体或抗原结合部分以及药学可接受的载体的药物组合物。

7.分离的细胞系，其产生权利要求1至5的任一项的抗体或抗原结合部分。

8.宿主细胞，其包含：编码权利要求1至5的任一项的抗体或抗原结合部分的重链的核苷酸序列，以及编码所述抗体或抗原结合部分的轻链的核苷酸序列。

9.载体，其包含：编码权利要求1至5的任一项的抗体或抗原结合部分的重链的核苷酸序列，以及编码所述抗体或抗原结合部分的轻链的核苷酸序列，其中所述载体任选地包含与所述核苷酸序列有效连接的表达控制序列。

10.权利要求1至5的任一项的抗体或抗原结合部分或权利要求6的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防或缓解有此需要的受试者中IL-6介导的病症的症状。

11.权利要求10的用途，其中所述IL-6介导的病症选自：炎性病症、变应性病症、自身免疫病症、移植排斥病症、动脉粥样硬化、骨质疏松症、神经性疼痛、2型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、多发性硬化、脓毒症、癌症、卡斯尔曼病和纤维化状况。

12.权利要求11的用途，其中所述炎性病症选自类风湿性关节炎，青少年特发性关节炎、骨关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、银屑病、克罗恩病和成人斯蒂尔病。

13.权利要求11的用途，其中所述纤维化状况选自肝纤维化、肾纤维化和肺纤维化。

14.权利要求11的用途，其中所述癌症是多发性骨髓瘤或肾细胞癌。