CN102077092B - 质谱分析 - Google Patents

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Abstract

一种检验靶分析物的方法，该方法包括：(a)提供可包含靶分析物的多个样品，其中各样品用质量标签或质量标签的组合作差异性标记，所述质量标签来自质量标签的集合，各质量标签是包含质谱上不同的质量标记物基团的同量异序质量标签，从而可通过质谱法区分这些样品；(b)混合所述多个标记样品以产生分析混合物并将所述分析混合物引入质谱仪；(c)选择具有第一质荷比的离子，该第一质荷比等于用特定数量的质量标签标记的靶分析物的离子；(d)使具有该第一质荷比的离子断裂成多个片段离子，其中所述多个片段离子的一部分包含至少一个完整的质量标签；(e)选择具有第二质荷比的离子，该第二质荷比等于包含至少一个完整质量标签的靶分析物的片段的离子；(f)使具有该第二质荷比的离子断裂成多个其它片段离子，其中所述其它片段离子的一部分是所述质量标记物基团的离子；(g)产生在步骤(f)中产生的其它片段离子的质谱图；和(h)由所述质谱图测定各样品中靶分析物的含量。

Description

质谱分析
本发明涉及通过质谱法检验靶分析物，特别是生物分子，例如核酸和蛋白质的方法。具体地说，本发明涉及利用同量异序质量标签(isobaric mass labels)的多重串联质谱法。本发明还涉及检验一个或多个靶分析物的质谱装置。
本领域已知标记感兴趣分子的各种方法，包括放射性原子、荧光染料、发光试剂、电子捕获试剂和光吸收染料。这标记系统各自具有的特征使其适于某些应用，而不适于其它领域。最近，质谱法领域开发了检测可切割地连接于它们相关的感兴趣分子的标记物的方法。
对于诸如核酸分析等许多应用，可从间接标记测定分析物的结构。这对于应用质谱法尤其有利，因为复杂的生物分子，例如DNA具有复杂的质谱且检测灵敏度较低。间接检测意味着可利用相关标记分子鉴定原始分析物，其中为灵敏检测和简单质谱而设计标记物。简单质谱表示可利用多种标记物同时分析多个分析物。
PCT/GB98/00127描述了共价连接于可切割标记物的核酸探针阵列，而所述标记物可通过鉴定共价相连核酸探针的序列的质谱法来检测。该申请的标记探针具有结构Nu-L-M，其中Nu是共价连接于L(可切割接头)的核酸，而L共价连接于M(质量标签)。该申请中优选的可切割接头在质谱仪的离子源内切割。优选的质量标签是取代的多-芳基醚。该申请公开了各种电离方法和通过四极质量分析器、飞行时间(TOF)分析器和扇形磁场分析器作为通过质谱法分析质量标签的具体方法来分析。
PCT/GB94/01675公开了可切割地连接于质量标签分子的配体，特别是核酸。优选的可切割接头是光-可切割的。该申请公开了基体辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱法作为通过质谱法检验质量标签的具体方法。
PCT/US97/22639公开了可释放的不挥发质量标签分子。在优选的实施方式中，这些标记物包含聚合物，通常是可切割地连接于反应基团或配体，即探针的生物聚合物。优选的可切割接头看来是化学或酶学可切割的。该申请公开了MALDI TOF质谱法作为通过质谱法分析质量标签的具体方法。
PCT/US97/01070、PCT/US97/01046和PCT/US97/01304公开了可切割地连接于质量标签分子的配体，特别是核酸。优选的可切割接头看来是化学或光可切割的。该申请公开了各种电离方法和通过四极质量分析器、TOF分析器和扇形磁场分析器作为通过质谱法分析质量标签的具体方法来分析。
这些现有技术申请无一提及利用标记生物分子的串联或连续质量分析。
Gygi等(Nature Biotechnology 17：994-999，“利用同位素编码的亲和力标签定量分析复杂蛋白质混合物(Quantitative analysis of complex proteinmixtures using isotope-coded affinity tags)”1999)公开了利用“同位素编码的亲和力标签”从蛋白质中捕获肽以便作蛋白质表达分析。在该篇文章中，作者描述了利用与硫醇反应的生物素接头捕获其中含半胱氨酸的肽。一种来源的蛋白质样品与生物素接头反应并用内肽酶切割。然后利用亲和素化珠分离含生物素化半胱氨酸的肽以便通过质谱法作后续分析。可用生物素接头标记一种样品，而用氘化形式的生物素接头标记第二样品来定量比较两种样品。然后样品中的各肽在质谱图中表示为一对峰。质谱图中对应于各标签的诸峰的积分表明连接于标签的肽的相对表达水平。
选择反应监测(SRM)和多反应监测(MRM)提供了能有效滤出所需分析物外的所有分子和污染物的高度选择性串联质谱法。如果分析在确定分析窗内易具有几种同量异序物质的复杂样品，这是非常有利的。通常将在质谱仪第一阶段(本文称为Q1：四极1，但也等于非-四极质谱仪，例如离子阱等中的各阶段)的前体(亲代离子)选择与该前体离子断裂成许多片段组合起来，这些片段中的一个或数个特定片段在随后的MS-检测步骤中(通常在四极3，Q3)选择并在离子检测器处检测。该两步选择确保检测所需分析物并降低任何其它离子物质的强度。信噪比远优于常规MS/MS实验，该实验在Q1中选择一个质量窗，然后在离子检测器中检测所有产生的片段。原则上，依据MS的该方法可提供分析物的绝对结构特异性，与合适的稳定同位素标记内标(SIS)联用后，其可绝对定量分析物浓度。
在常规SRM/MRM型实验中，利用稳定同位素标记的参比产生用于相对参比定量测定分析物的分析物/参比配对。对于蛋白质分析，此类参比肽与待检测分析物的不同之处仅在于掺入了同位素，从而使其在质量上明显不同于Q1选择，但在化学组成和理化特性上相同。在典型的实验中，选择分析物/参比配对，即在Q1中在所述两种质量之间转变质量选择通道(massselection channel)。随后使所述两种离子断裂产生不同(特异性)的片段质量。然后选择一种或多种合适的片段质量，其中Q3滤器维持在所选片段离子的位置，因此确保该离子转移至质量分析器，并滤出其它离子种类。
设计改进的质量标签以便采用质谱法鉴定分析物的最近工作致力于在质谱图中更易鉴定(而非其它污染物)的质量标签。
WO 01/68664公开了两种或更多种质量标签的集合，该集合中的各标记物包含通过可切割接头连接于质量标准化部分的质量标记物部分，所述质量标记物部分耐受断裂。该集合中各标记物的合计质量(aggregate mass)可以相同或不同，该集合中各标记物的质量标记物部分的质量可以相同或不同。在具有共同质量的质量标记物部分的集合中的任何组标记物中，各标记物的合计质量不同于该组中的所有其它标记物，在具有共同合计质量的集合中的任何组标记物中，各标记物具有质量不同于该组中所有其它质量标记物基团的质量标记物部分，从而该集合中所有的质量标签可通过质谱法彼此区分。该申请还公开了分析方法，包括通过质谱法鉴定分析物特有的质量标签或质量标签组合来检测分析物。可采用串联质谱法。具体地说，用于检测质量标签的质谱仪可以是三重四极质量分析器，其包括第一分析器以选择特定质量或质量范围的离子、第二质量分析器以解离所选离子和第三质量分析器以检测得到的离子。
WO 03/025576公开了两种或更多种质量标签的集合，该集合中的各标记物包含通过至少一个酰胺键连接于质量标准化部分的质量标记物部分。该质量标记物部分包含氨基酸和含氨基酸的质量标准化部分。对于WO01/68664，该集合中各标记物的合计质量可以相同或不同，该集合中各标记物的质量标记物部分的质量可以相同或不同，从而该集合中所有质量标签可通过质谱法彼此区分。对于WO 01/68664，该申请还公开了可包括串联质谱法的分析方法。该申请尤其涉及分析肽和含质量标准化部分及质量标记物部分的质量标签，所述质量标记物部分含至少一个氨基酸。WO2007/012849公开了具有通用化学式的质量标签和反应性质量标签以便标记生物学分子并通过质谱法检测。该发明的质量标签和反应性质量标签在质谱图中清晰鉴定并易与分析物反应。对于WO 01/68664，该申请还公开了可包括串联质谱法的分析方法。
在二十世纪90年代后期，同量异序质量标签的开发使生物标志发现产生革命性变革。在一次LC-MS/MS流程中能分析多种样品(理论上无限数量)增加了处理量，同时降低分析差异。因此，需要通过质谱法定量检测和常规检测各种样品中的分析物的改进方法。
虽然WO 01/68664、WO 03/02557和WO 2007/012849提供的质量标签能显著改善通过质谱法分析分析物的方法，但仍需要提供通过质谱法鉴定此类质量标签来检测分析物的改进方法。具体地说，虽然这些新质量标签和分析方法能同时和定量分析多种样品而不显著增加质谱图的复杂性，但采用已知的串联质谱法分析同量异序质量标签提供的复杂样品的结果可能不精确。本领域仍需要提供能在质谱仪中简单鉴定质量标签并灵敏定量测定的改进分析方法。
因此，本发明的目的是解决本领域中现有技术的问题并提供通过质谱法检验靶分析物的方法。
在第一方面，本发明提供检验靶分析物的方法，该方法包括：
(a)提供可包含靶分析物的多个样品，其中各样品用质量标签或质量标签的组合作差异性标记，所述质量标签来自质量标签的集合，各质量标签是包含质谱上不同的质量标记物基团的同量异序质量标签，从而可通过质谱法区分这些样品；
(b)混合所述多个标记样品以产生分析混合物并将所述分析混合物引入质谱仪；
(c)选择具有该第一质荷比的离子，该第一质荷比等于用特定数量的质量标签标记的靶分析物的离子；
(d)使该具有第一质荷比的离子断裂成多个片段离子，其中所述多个片段离子的一部分包含至少一个完整的质量标签；
(e)选择具有第二质荷比的离子，该第二质荷比等于包含至少一个完整质量标签的靶分析物的片段的离子；
(f)使具有该第二质荷比的离子断裂成多个其它片段离子，其中所述其它片段离子的一部分是所述质量标记物基团的离子；
(g)产生在步骤(f)中产生的其它片段离子的质谱图；和
(h)由所述质谱图测定各样品中靶分析物的含量。
本发明方法利用同量异序标记的样品，通过定量测定感兴趣分子而克服了本领域的局限性，其中该方法包括选择预定质荷比的离子的两步骤，其后各自是断裂步骤。与常规串联质谱(MS/MS)实验相比，采用此类方法提供高度选择性，因此，最终步骤中产生的质谱图提供更精确的定量结果。
在利用同量异序质量标签的常规串联质谱(MS/MS)中，首先选择与标记靶分析物的质量相等的离子。选择后，使标记分析物的离子断裂，然后鉴定对应于质量标签的质量标记物基团的诸峰。然而，所得图谱常因具有与所选质荷比相同质荷比的污染物的共同洗脱片段而不能精确定量测定分析物。该问题在分析蛋白质的复杂混合物时产生。在复杂混合物中，不同肽或肽片段可具有与靶分析物相同的质量。这些污染肽不能通过MS/MS与靶分析物相区分，因为它们在选择步骤中作为母体离子质荷比而一起选择。因此，使母体离子断裂以释放质量标签的质量标记物基团会提供选择的所有肽的质量标记物基团的图谱，包括具有与靶分析物相同质量的污染性肽。
本发明因额外的选择(步骤e)和断裂(步骤f)步骤而克服了MS/MS的该局限性。在步骤e)中，选择与包含至少一个完整质量标签的靶分析物片段的所需离子相等的质荷比确保除去质谱图中在Q1中(步骤c)选择的大多数(即使不是全部)污染性分子。在步骤d)中断裂成多个片段并且无一具有与步骤e)中所选第二质荷比相等的质荷比的污染性肽会除去。因此，断裂步骤f)释放的质量标记物基团仅来自靶分析物，所得质谱图提供靶分析物的高度改进的精确定量测定结果。本发明方法尤其有利于分析复杂样品，因为额外的选择性程度提高了特异性。
本发明方法成功地在SRM(选择反应监测：一种分析物)或MRM(多反应监测：多种分析物)的高灵敏度和选择性之间产生组合，在用于定量测定目的的最终分析步骤中复用。
步骤(h)中测定的量可以是各样品中靶分析物的相对量或各样品中靶分析物的绝对量。
本发明的其它优点是能一起分析多个样品。所述多个样品可以是可包含靶分析物的测试样品。
术语“测试样品”指可能存在分析物的任何样本。测试样品可仅包含一种分析物。或者，测试样品可包含多种不同分析物。
在本发明的一个实施方式中，一个样品是测试样品，一个样品是校准样品，其中所述校准样品包含靶分析物的一个或多个不同试样，各试样具有已知量的该分析物，其中所述测试样品和所述校准样品的各试样作差异性标记。
当存在一种或多种校准样品时，本发明方法中的步骤h)最好包括根据校准样品中一个或多个试样中分析物的已知和测定量校准测试样品中分析物的含量。在优选的实施方式中，该方法包括将各试样中分析物的含量与通过质谱法测定的各试样中分析物的含量作图的步骤。该步骤可简单地包括计算和技术人员熟知的实施此类计算的数学程序或算法。然后通过质谱法检测样品中的含量，根据校准图计算样品中分析物的含量。就本发明而言，述及“通过质谱法检测的含量”通常是通过质谱法检测的涉及分析物含量的离子丰度、离子强度或其它信号。该实施方式提供独立于外部获得的校准值的更精确定量测定结果，因而提供更稳定而可靠的分析。
不同的试样各自具有不同的已知量的分析物。术语“已知量”表示校准样品的各试样中分析物的绝对量或定性量已知。
绝对量表示已知的数量。这考虑了待测定测试样品中分析物的绝对量。
本文中定性量表示数量并非绝对知晓，但可能是具有特定状态的对象，例如健康或患病状态对象中预计的数量范围，或取决于所研究的测试样品类型的一些其它预计范围。由于各试样含有不同量的分析物，其是“不同的”。一般通过从标准样品取得不同体积来实现这点，对于取得不同体积将确保各试样中以所需比例存在不同量而无需知晓绝对量的定性量尤其是这样。或者，各试样分别制备而不从同一样品中取得。在一个实施方式中，各不同试样具有相同体积，但包含不同量的分析物。
该校准样品或各校准样品优选包含靶分析物的两种或更多种不同试样。利用靶分析物的两种或更多种不同试样能构建各分析物的多点标准曲线而不会增加MS复杂性。利用步骤g)中产生的质谱图定量测定分析物，可同时定量测定和鉴定样品和校准样品中的分析物。或者，仅测定分析物的含量。该方法为在一次实验中检测最多10种、最多20种、最多50种或更多种分析物提供手段。
除一个或多个校准样品外，本发明方法可包括分析多个测试样品。在该实施方式中，优选检验所述多个测试样品各自的相同分析物。待检验的各测试样品优选利用相同的校准样品。通常向不同的各测试样品中加入包含分析物的一种或多种试样的已知体积的相同校准样品。该方法尤其可用于涉及患者的多种样品的临床研究。如果制备大量校准样品并取得各部分，多个实验室可利用相同的校准样品，从而促进交叉研究和交叉实验室比较。可利用一种或多种同量异序质量标签差异性标记各测试样品并在步骤b)中与一个或多个校准样品混合，在步骤h)中同时测定各样品中的分析物含量。或者，可用相同质量标签标记各测试样品，各不同测试样品重复步骤b)到h)。
在一个实施方式中，本发明方法可用于检验多个不同靶分析物。在一个实施方式中，该方法包括为各靶分析物重复步骤(c)到(h)的步骤。在其中一种样品是测试样品的该实施方式中，可为各不同分析物提供校准样品。各校准样品包含靶分析物的一个或多个不同试样，其中所述测试样品和各校准样品的各试样作差异性标记。在一个实施方式中，多种分析物是在步骤(a)之前通过化学或酶学加工蛋白质或多肽产生的蛋白质或多肽的肽片段。在具体实施方式中，所述多种分析物是相同蛋白质或多肽的肽。
现在，参考以下附图更详细地描述本发明：
图1a显示用两种质量标签的集合中的不同同量异序质量标签标记的肽VATVSLPR的MS/MS图谱，各标记物代表预定相对量的肽(质量为126∶127的质量标记物基团之比为2∶1)，图1b显示图1a的图谱的放大部分，其显示质量标记物基团的诸峰。
图2a显示图1所分析的标记肽VATVSLPR的b1-离子的MS/MS图谱；图2b显示图2a的图谱的放大部分，其显示质量标记物基团的诸峰。
图3显示用六种质量标签的集合中的不同同量异序质量标签标记的肽VAFSLR的MS图谱，各标记物代表预定相对量的肽(质量为126∶127∶128∶129∶130∶131的质量标记物基团之比为1∶3∶5∶5∶3∶1)。
图4显示图3所分析的标记VAFSLR肽的MS/MS图谱。
图5a显示图3所分析的标记VAFSLR肽的不同质量标记物基团的MS/MS图谱；图5b显示图3所分析的标记VAFSLR肽的不同质量标记物基团的MS/MS/MS图谱。
图6显示用六种质量标签的集合中的不同同量异序质量标签标记的肽AVFSLR的MS图谱，各标记物代表预定相对量的肽(质量为126∶127∶128∶129∶130∶131的质量标记物基团之比为1∶1∶1∶4∶4∶4)。
图7显示图6所分析的标记AVFSLR肽的MS/MS图谱。
图8a显示图6所分析的标记AVFSLR肽的不同质量标记物基团的MS/MS图谱；图8b显示图6所分析的标记AVFSLR肽的不同质量标记物基团的MS/MS/MS图谱。
图9显示用六种质量标签的集合中的不同同量异序质量标签标记的肽FAVSLR的MS图谱，各标记物代表预定相对量的肽(质量为126∶127∶128∶129∶130∶131的质量标记物基团之比为4∶4∶4∶1∶1∶1)。
图10显示图9所分析的标记FAVSLR肽的MS/MS图谱。
图11a显示图9所分析的标记FAVSLR肽的不同质量标记物基团的MS/MS图谱；图11b显示图9所分析的标记FAVSLR肽的不同质量标记物基团的MS/MS/MS图谱。
图12显示用六种质量标签的集合中的不同同量异序质量标签标记的肽LAFSVR的MS图谱，各标记物代表预定相对量的肽(质量为126∶127∶128∶129∶130∶131的质量标记物基团之比为5∶3∶1∶1∶3∶5)。
图13显示图12所分析的标记LAFSVR肽的MS/MS图谱。
图14a显示图12所分析的标记LAFSVR肽的不同质量标记物基团的MS/MS图谱；图14b显示图12所分析的标记LAFSVR肽的不同质量标记物基团的MS/MS/MS图谱。
图15显示用六种质量标签的集合中的不同同量异序质量标签各自标记的肽VAFSLR和LAFSVR的混合物的MS图谱，各标记物代表预定相对量的肽(肽VAFSLR：质量为126∶127∶128∶129∶130∶131的质量标记物基团之比为1∶3∶5∶5∶3∶1；和肽LAFSVR：质量为126∶127∶128∶129∶130∶131的质量标记物基团之比为5∶3∶1∶1∶3∶5)。
图16显示图15所分析的标记VAFSLR和LAFSVR肽的混合物的MS/MS图谱。
图17显示图15所分析的标记VAFSLR和LAFSVR肽的混合物的不同质量标记物基团的MS/MS图谱。
图18a显示图15所分析的标记VAFSLR的b1-离子的不同质量标记物基团的MS/MS/MS图谱；图18b显示图15所分析的标记LAFSVR的b1-离子的不同质量标记物基团的MS/MS/MS图谱。
图19显示用六种质量标签的集合中的不同同量异序质量标签各自标记的肽AVFSLR和FAVSLR和混合物的MS图谱，各标记物代表预定相对量的肽(肽AVFSLR：质量为126∶127∶128∶129∶130∶131的质量标记物基团之比为1∶1∶1∶4∶4∶4；和肽FAVSLR：质量为126∶127∶128∶129∶130∶131的质量标记物基团之比为4∶4∶4∶1∶1∶1)。
图20显示图19所分析的标记AVFSLR和FAVSLR肽的混合物的MS/MS图谱。
图21显示图19所分析的标记AVFSLR和FAVSLR肽的混合物的不同质量标记物基团的MS/MS图谱。
图22a显示图19所分析的标记AVFSLR的b1-离子的不同质量标记物基团的MS/MS/MS图谱；图22b显示图19所分析的标记FAVSLR的b1-离子的不同质量标记物基团的MS/MS/MS图谱。
图23显示标记肽AEFAEVSK的MS/MS图谱和用于标记该肽的质量标签(TMT0)的结构。该肽在N-末端和赖氨酸处标记。显示了该质量标签断裂产生的离子。
图24显示用两种质量标签的集合(包含TMT2-126和TMT2-127的TMT二聚体)标记的肽VLEPTLK的MS/MS图谱和用于标记该肽的质量标签的结构。该肽在N-末端和赖氨酸处标记。显示了该质量标签断裂产生的离子。
图25a显示用质量标签TMT-0标记的血清白蛋白LVNEVTEFAK的肽的MS/MS图谱，图25b显示用质量标签TMT六聚体(sixplex)标记的血清白蛋白LVNEVTEFAK的肽的MS/MS图谱。图25a和25b的肽在N-末端和赖氨酸处标记。图25a和25b的标记肽之间显示有10Da的质量差异。
图26a显示图25a的MS/MS图谱的放大部分，其显示y3离子片段，图26b显示图25b的MS/MS图谱的放大部分，其显示y3离子片段。y3离子片段保留赖氨酸残基上的一个完整质量标签，从而在图26a和26b的两种标记片段离子之间产生5汤姆森(Thomson)(Th，质荷比的单位)的m/z差异。
图27a显示图25a的MS/MS图谱的放大部分，其显示y5离子片段，图27b显示图25b的MS/MS图谱的放大部分，其显示y5离子片段。y5片段离子保留赖氨酸残基上的一个完整质量标签，从而在图27a和27b的两种标记片段离子之间产生5汤姆森(Th，质荷比的单位)的m/z差异。
图28a显示图25a的MS/MS图谱的放大部分，其显示b7离子片段，图28b显示图25b的MS/MS图谱的放大部分，其显示b7离子片段。b7片段离子保留N-末端上的一个完整质量标签，从而在图28a和28b的两种标记片段离子之间产生5汤姆森(Th，质荷比的单位)的m/z差异。
图29a显示用TMT 0(TMT zero)和TMT六聚体标记的肽LVTDLTK的MS图谱。该肽在N-末端和赖氨酸处作标记，从而在标记的肽TMT 0和TMT六聚体之间产生10Da的质量差异。在双荷电前体离子之间观察到5Th的质量差异。
图29b显示用TMT 0和TMT六聚体标记的肽HPDYSVVLLLR的MS图谱。该肽在N-末端作标记，从而在标记的肽TMT 0和TMT六聚体之间产生5Da的质量差异。在三荷电前体离子之间观察到1.67Th的质量差异。
图30显示用质量标签TMT-0和质量标签TMT六聚体(TMT6-127)标记的10种血浆肽的MRM离子色谱。
图31a-d显示用TMT-0和TMT六聚体(TMT6-127)标记的血浆肽K的MRM离子色谱。以不同比例混合TMT-标记的血浆样品。
图32显示肽K的TMT 0：TMT六聚体(如图31a-31d所示)的预计比例和观察比例的关系图。分析一式三份进行。
图33显示QitTofTM仪器的示意图。
图34a、34b和34c显示能进行MS/MS/MS的质谱仪的其它配置。
术语“分析物”不作特别限定，可采用本发明方法检验所提供的任何类型分子，该分子可用质谱法分析并能用含质谱学不同的质量标记物基团的同量异序质量标签标记。分析物包括氨基酸、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多核苷酸、寡核苷酸、DNA、RNA、肽-核酸、糖、淀粉和复杂的碳水化合物、脂肪和复杂的脂质、聚合物和有机小分子，例如药物和药物样分子或其片段。分析物优选肽、蛋白质、核苷酸或核酸。
对于本发明，术语分析物应与术语生物分子同义。
对于本发明，术语“蛋白质”应包括含有两个或更多个氨基酸的任何分子，包括二肽、三肽、肽、多肽和蛋白质。
对于本发明，术语“核酸”应包括含有两个或更多个核苷酸碱基的任何分子，包括二核苷酸、三核苷酸、寡核苷酸、脱氧核糖核酸、核糖核酸和肽核酸。
表述“六聚体串联质量标签(TMT)集合”指六个同量异序质量标签的集合，其中各标记物包含质谱学不同的质量标记物基团。六聚体串联质量标签的集合的例子是TMT6-128、TMT6-129、TMT6-130、TMT6-131，其中“6”代表该集合中标记物的数量，“TMT”后的数字128-131代表质量标记物基团的质量。二聚体串联质量标签的集合同样指两个同量异序质量标签的集合。二聚体串联质量标签的集合的例子是TMT2-126和TMT2-127，其中“2”代表该集合中标记物的数量，“TMT”后的数字126和127代表质量标记物基团的质量。五聚体串联质量标签的集合指五个同量异序质量标签的集合。
本发明的术语“MS”指质谱方法，包括产生样品的离子和产生这些离子的质谱图。
本发明的术语“MS/MS”指本发明方法，包括选择特定质荷比的离子，使所选离子断裂，例如通过碰撞诱导解离(CID)并产生片段离子的质谱图。
本发明的术语“MS/MS/MS”指本发明方法，包括步骤(a)-(h)。
对于本发明，术语“质谱法”应包括能进行断裂分析的任何类型的质谱法。适用于本发明的质谱仪包括能进行MS/MS/MS的含任何形式分析器的仪器。
在一个实施方式中，在质谱仪的不同四极中进行本发明方法的步骤(c)-(g)。在该实施方式中，选择具有第一质荷比的离子的步骤c)在串联仪器的第一质谱分析器(Q1)中进行。然后将选择的离子引入单独的碰撞室(Q2)，它们在其中与气体或固体表面碰撞从而在步骤d)中产生多个片段离子。然后将步骤d)的碰撞产物引入第三质量分析器(Q3)，其中在步骤e)中选择第二质荷比的离子(MS/MS离子)。然后将步骤e)的所选离子引入单独的碰撞室(Q4)，它们在其中与气体或固体表面碰撞从而在步骤f)中产生多个其它片段离子。将步骤f)的其它片段离子引入步骤g)中串联仪器的其它质量分析器(Q5)以检测碰撞产物。典型的串联仪器包括5个四极质谱仪、串联扇形仪器(tandem sector instrument)和四极飞行时间(TOF)质谱仪。
或者，本发明方法的步骤(c)-(g)在质谱仪的同一区域中顺序进行。例如，这可在离子阱和傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱仪中实现。
可联用常规3D离子阱，混合几何仪器，例如四极离子阱与TOF分析器以及较大的足迹四扇形仪器实施本发明的MS/MS/MS实验。
Wu Z.，Bordas-Nagy J.和Fenselau C.(1991)“三重质谱法(MS/MS/MS)与四-扇形串联质谱仪中的浮动碰撞室(Triple mass spectrometry(MS/MS/MS)with a floated collision cell in a four-sector tandem massspectrometer)”Organic Mass Spectrometry 26，10，908-911描述了用串联双聚焦质谱仪上的第三无场区中的电浮动碰撞室进行MS/MS/MS实验的方法。该实验利用JEOL JMS-HX110/HX110四-扇形质谱仪进行，虽然该方法包括校准所有加速电压(accelerating voltages)下的磁体校准(magnetcalibration)，但其通常适用于任何碰撞室电压值。
四极离子阱(QIT)是累积和储存离子的有效手段。联用QIT与TOF质谱仪提供单用QIT或TOF质谱仪所不具有的能力。早已将这些装置组合入称为QitTofTM的一种仪器，其是提供QIT MS的MSn优点与TOFMS的高速数据收集速度的首个市售可得仪器。QitTofTM仪器的构造示于图33。Shimadzu随后也开发了LCMS-QIT-TOF系统。图34所示示意图说明QitTofTM仪器的几何构造。
与其它仪器相比，QitTofTM几何构造尤其有优势。与正交-提取TOF MS相比，QitTofTM构造可能具有更高的离子传输效率并能进行有效的MSn操作。由于离子被脉冲出而非扫出QIT，QIT因较高的重复率而产生动态范围较高和离子阱性能较高的质量-选择性喷射(mass-selective ejection)。TOF提供多通道质量检测的优点，从而能有效收集所有离子。利用TOF分析器还实现了更好的离子质量精度。
几种其它仪器几何构造考虑可用于本发明的MS3实验，将来可能的选择示于图34。在本阶段难以评估各设计的性能，需要进一步研究。图34A描述了具有三个扫描四极和两个碰撞室的五-四极配置。离子倍增检测器通常与四极质量分析器联用。图34B描述了具有正交反射TOF(orthogonalreflectron TOF)作为终末期分析器的双重扫描四极。图34C描述了具有定时离子门的三重阶段TOF仪器，从而允许用户规定质量范围的离子进入第一(级)两个双线性TOF分析器。
本发明可采用基体辅助激光解吸/电离(MALDI)技术。MALDI需要生物分子溶液包埋在摩尔过量的光可激发的“基体”中。应用合适频率的激光导致基体激活，进而造成基体与其包埋的生物分子一起快速蒸发。质子从酸性基体向生物分子转移产生该生物分子的质子化形式，可通过正离子质谱法，特别是飞行时间(TOF)质谱法检测。通过MALDI TOF也可能进行负离子质谱法。该技术赋予离子显著量的平动能，但尽管如此其不倾向于诱导过度断裂。可采用激光能量和用于加速来源中离子的势差施加时间来控制该技术的断裂。该技术因其质量范围大、其图谱中主要是单电荷离子以及能同时分析多种肽而特别优选。本发明可采用TOF/TOF技术。
光可激发的基体包含“染料”，即，该化合物强烈吸收特定频率的光并优选不通过荧光或磷光放出能量而是经热，即，通过震动模式消散该能量。正是激光激发导致的基体震动使得染料的快速升华，同时将包埋的分析物带入气相。
虽然MALDI技术可用于本发明，但本发明不限于该类技术，如果需要，技术人员可将本领域常见的其它技术用于本发明。例如，可采用电喷雾或纳米电喷雾(nanoelectrospray)质谱法。
本发明方法可在步骤(a)之前包括用一个或多个同量异序质量标签差异性标记各样品和校准样品各试样(有一种或多种校准样品存在时)的其它步骤。在有一个或多个校准样品存在的实施方式中，该方法在步骤(a)之前还包括混合差异性标记的试样以产生校准样品的其它步骤。
可将靶分析物连接于一个质量标签、两个质量标签或多于两个质量标签。靶分析物或其片段优选连接于两个同量异序质量标签。靶分析物各端连接有至少一个质量标签也是优选的。这在靶分析物是蛋白质或核酸时尤其优选。
可在合适条件下标记样品以控制有多少标记物连接于靶分析物。例如，可将过量标记物加入样品以确保最大量的标记物连接于各分析物。当将质量标签连接于核酸或蛋白质分析物各端是有利之时最好这样。或者，可控制质量标签的反应活性基团和/或标记条件以将质量标签连接于分析物的优选端，例如蛋白质的C-末端或N-末端。
如果靶分析物是蛋白质或肽，优选用质量标签标记各靶分析物的N-末端和C-末端。各分析物的赖氨酸的氨基-末端胺基团和C-末端ε-胺基团优选各包含质量标签。图25a和图26b所示的肽(LVNEVTEFAK)连接于两个标记物，其中一个连接于N-末端亮氨酸，一个标记物连接于C-末端赖氨酸。
在本发明方法中，步骤c)中选择第一质荷比等于用特定数量质量标签标记的靶分析物离子的离子。各样品中该标记的靶分析物因具有相同的质量而在步骤c)中选择。
在一个实施方式中，所述第一质荷比等于用特定数量质量标签标记的靶分析物的未断裂母体离子的质荷比。或者，所述第一质荷比等于用特定数量质量标签标记的靶分析物的片段离子的质荷比。
步骤c)选择的具体质荷比取决于靶分析物和连接于该靶分析物的标记物数量。技术人员不难为步骤c)选择合适的第一质荷比。步骤c)中选择的离子优选具有2+或更高的电荷状态。
当对，例如包含组分，如蛋白质的混合物的样品实施本发明方法时，多个蛋白质或蛋白质片段可具有相同质量，因此在步骤c)中可选择具有相同质量的多个不同离子。
步骤c)后，具有第一质荷比的所选离子在步骤d)中断裂成多个片段离子，其中该多个片段离子的一部分包含至少一个完整的质量标签。
该多个片段离子的一部分包含至少一个完整的质量标签表示大于0％的片段离子包含至少一个完整的质量标签。步骤d)中提供的这些片段中的该部分足以使得质量报道基团在步骤g)产生的质谱图中检测。
本发明人发现用同量异序质量标签片段标记的分析物在步骤d)中断裂从而产生包含至少一个完整质量标签的片段离子。这是本发明的重要发现，因为能作进一步的选择步骤以先除去污染物，再切割标记的靶分析物的质量报道基团。这提供精确的定量结果。本发明人发现靶分析器最好连接于两个或更多各质量标签以确保步骤d)后至少一个质量标签是完整的。
当靶分析物是肽时，肽主要断裂成y-和b-离子系列，其中也可见其它形式，包括a-系列、c-系列、x-系列和z-系列。可在步骤d)中选择断裂条件以控制所产生的片段离子类型。断裂条件的选择最好能确保b-和y-离子是最主要的片段离子。宜选择很低的碰撞能量以防止连续断裂。例如，可利用离子阱以确保不发生连续断裂。
断裂通常由碰撞诱导解离(CID)、表面诱导解离(SID)、电子俘获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)或快速原子轰击。
电子俘获解离(ECD)是断裂多荷电(质子化)肽或蛋白质离子一个串联质谱分析(结构阐明)的方法。在该方法中，多质子化的肽或蛋白质局限于傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱仪的彭宁阱(Penning trap)中并接触具有近热能量(near-thermal energy)的电子。质子化肽俘获热电子(thermalelectron)是放热的(≈6eV；1eV＝1.602x10-19J)，并通过非遍历过程(即，不涉及分子内震动能量再分配的过程)导致肽骨架断裂。
[M+nH]n++e-→[[M+nH](n-1)+]*→片段
此外，可用低能电子中和一个或多个蛋白质阳离子以特异性切割键从而形成c、z产物，相比之下，b、y产物由例如碰撞激活解离(CAD；也称为碰撞诱导解离，CID)等其它技术形成。由于引入RF 3D四极离子阱(QIT)、四极飞行时间(TOF)或RF线性2D四极离子阱(QLT)仪器的RF场的热电子仅能在毫秒范围维持它们的热能且不为这些装置所捕获，因此ECD是仅单用于FTICR(最昂贵的一类MS仪器)的技术。
电子转移解离(ETD)是断裂多质子化肽或蛋白质离子以供串联质谱分析(结构阐明)的方法。与电子俘获解离(ECD)相似，ETD通过将电子转移给阳离子(例如，多荷电肽或蛋白质)以诱导它们断裂。与ECD相反，ETD不为此目的利用游离电子，而是利用自由基负离子(例如，具有显著低电子亲和力的蒽或偶氮苯阴离子以用作电子供体)。
[M+nH]n++A-→[[M+nH](n-1)+]*+A→片段
电子转移后，ETD导致与ECD相似的断裂模式，即，形成所谓的c和z离子。根据电子转移的不同方式，可利用不示于ECD的各种“低成本”质谱仪，例如四极离子阱(QIT)或RF线性2D四极离子阱(QLT)仪器来实施ETD。合适的参考文献参见John E.P.Syka，Joshua J.Coon，Melanie J.Schroeder，Jeffrey Shabanowitz和Donald F.Hunt，PNAS，101卷，26号，第9528-9533页。
虽然断裂方法不作特别限定，但最优选的实施方式是通过碰撞诱导解离进行断裂。
在一个实施方式中，本发明方法在步骤d)之后包括产生步骤(d)的多个片段离子的质谱图的其它步骤。可利用步骤d)后产生的质谱图，通过鉴定该质谱图中靶分析物的一个或多个特征性片段离子来鉴定该靶分析物。图谱中产生的片段离子可用于数据库检索，特别是用于肽分析物以测定该分析物的身份。
步骤(d)中的断裂可从质量标签上切割一部分质量标记物基团，如果产生，可在质谱图中观察到代表质量标记物基团的诸峰。然而，如果用该质谱图检测样品中靶分析物的含量，会因步骤(d)中存在标记的污染物而产生不精确的结果。
在步骤d)中断裂后，在步骤e)中选择第二质荷比等于捕获至少一个完整质量标签的靶分析物的片段离子的离子。
如上所述，当样品是复杂混合物时，步骤c)可选择大量离子，包括靶分析物和具有相同质量的其它污染性离子。因此，对与步骤c)中选择的离子相连的质量标签的质量标记物基团作分析提供的定量结果不能精确代表靶分析物的含量。为克服该局限性，步骤e)提供对有待进一步分析的靶分析物作进一步选择的步骤。质荷比等于包含至少一个完整质量标签的靶分析物的片段离子确保质谱图中除去了步骤c)中选择的污染性分子。
在步骤(e)中，第二质荷比优选等于包含至少一个完整质量标签的靶分析物的片段离子，该片段离子是该靶分析物独有的。
步骤(e)中选择的第二质荷比可以是步骤d)中产生的任何合适片段离子，所述片段离子包含至少一个完整质量标签。
第二质荷比可以等于a-系列离子、b-系列离子、c-系列离子、x-系列离子、y-系列离子或z-系列离子。可根据各离子的产生量选择在步骤e)中选择的离子类型。例如，可将肽主要断裂成b-系列离子，b1离子可以是最主要的离子。最主要的离子确保在步骤h)的质谱图中产生质量报道基团的良好信号。
还可根据所需的选择性程度选择步骤e)中所选的离子类型。步骤e)中所选的较大片段离子提供更好的靶分析物选择性。例如，选择b1离子可区分在N-末端具有不同氨基酸的肽。然而，如果需要更高的选择性来区分具有相同b1离子的肽，可选择较大的离子，例如b2或b3离子。如果步骤d)中的断裂产生具有相同质量的不同系列离子，也最好选择较大的离子。
可为本发明方法个别确定步骤e)中所选离子的最近类型以，例如利用MS-数据结果或计算机方法。
在本发明的一个实施方式中，在步骤e)中选择第二质荷比，例如b1离子或y1离子，对所选片段离子实施步骤f)到h)。然后可重复步骤e)到h)，在步骤e)中选择的第二质荷比确保选择较大的离子，例如b2或y2。然后可比较较大离子的结果与较小离子的结果作为检查手段以确保该结果精确反映样品中靶分析物的含量。
所述第二质荷比宜等于包含完整质量标签的y-系列离子。例如，y-系列离子可以是y1离子、y2离子、y3离子等，只要该离子包含至少一个完整的质量标签。
在其它优选的实施方式中，所述第二质荷比等于包含完整质量标签的b-系列离子。例如，所述b-系列离子可以是b1离子、b2离子、b3离子等，只要该离子包含至少一个完整的质量标签。
与在步骤(c)中选择的第一质荷比相比，诸如y-系列离子或b-系列离子等离子优选具有较高的质荷比。步骤e)中选择的离子的电荷状态比步骤(c)中选择的离子的电荷状态小一，但与在步骤(c)中选择的离子的电荷状态相比，具有较高的质荷比。这确保选择的离子出现在质谱图中非常干净的部分而没有任何污染离子，从而提供优秀的信噪比。
可根据步骤e)中优选的片段离子控制与靶分析物相连的质量标签的数量和定位。例如，当分析物是肽并且优选b-系列离子时，可控制标记以确保该肽在N-末端连接于质量标签。如果优选y-系列离子，可控制标记以确保该肽在C-末端连接于质量标签。
优选在步骤e)中选择b-系列离子并重复在步骤e)中选择y-系列离子的方法。在该实施方式中，可控制标记以确保该肽在C-末端和N-末端连接于质量标签。例如，如果靶分析物是肽并且赖氨酸的氨基-末端胺官能团和C-末端ε-胺官能团连接于质量标签，产生的y-离子在赖氨酸上具有一个完整的质量标签，或者产生的b-离子具有一个完整的N-末端质量标签。
断裂步骤d)可产生假y-离子，其代表失去一个质量标记物基团加上，例如邻近羰基的全长肽，电荷状态表现为-1。这些离子不可用于步骤e)中的选择，因为它们可含有m/z和电荷状态与也仅丧失一个质量报道基团的靶分析物相同的污染物，如果分析物仅连接于一个质量标签，则该离子不会产生包含完整质量标签的片段。
在步骤e)中选择具有第二质荷比的离子后，在步骤f)中将这些离子断裂成多个其它片段离子，其中所述其它片段离子的一部分是质量标记物基团的离子。
由于步骤e)中的选择使得靶分析物的离子通过进一步分析，从断裂步骤f)释放的质量标记物基团仅来自靶分析物，得到的质谱图提供靶分析物的精确定量结果。
所述其它离子的一部分是质量标记物基团的离子表示高于0％的片段离子是质量标记物基团的离子。所述其它片段离子的质谱图在步骤g)中产生，因此，质量标记物基团的离子部分足以从质谱图中测定各样品中靶分析物的含量。
可通过以上步骤d)所述的任何方法进行步骤f)中的断裂。与步骤d)中所用能量相比，断裂步骤f)中所用的能量最好较高以确保切割其余质量标签的质量标记物基团。步骤f)中优选利用碰撞室而非离子阱，因为该步骤中最好产生连续断裂。
在一个实施方式中，本发明方法在步骤(f)后包括选择质荷比范围等于质量报道基团的质荷比范围的离子的其它步骤。该第三选择步骤确保仅有质量报道基团的离子进入步骤g)中产生的质谱图，藉此除去任何污染物。
在步骤f)中断裂后，在步骤g)中产生所述其它片段离子的质谱图。
在步骤h)中，从步骤g)中产生的质谱图测定各样品中靶分析物的含量。该步骤优选包括鉴定对应于质谱图中质量标签的质量标记物基团的片段离子并根据该质谱图中它们的质量标记物基团的量来测定各样品中分析物的含量。在分析一个或多个校准样品的实施方式中，步骤h)包括根据相关质谱图中质量标记物基团的量，相对于同一质谱图中校准样品各试样的质量标记物基团的量来测定测试样品中分析物的量。如上所述，分析物的测定量可以是分析物的绝对量或定性量。
测试样品可来自天然来源或可合成产生。合成样品的例子是重组蛋白的混合物。在一个实施方式中，测试样品是复杂的混合物，例如来自植物或动物的样品。在优选的实施方式中，样品来自人。
本发明检验的测试样品的例子包括：哺乳动物组织、液体，例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑膜液、眼水(ocular fluid)、尿液、泪水和泪小管渗出液，肺抽吸物，包括支气管肺泡灌洗液，唾液、痰、母乳、乳头抽吸物、精液、灌洗液、细胞提取物、细胞系和亚细胞细胞器，组织，例如实体器官组织，衍生自哺乳动物、鱼、禽类、昆虫、环节动物、原生动物和细菌的细胞培养上清液或制品，组织培养提取物、植物组织、植物液体、植物细胞培养提取物、细菌、病毒、真菌、发酵肉汤培养液、食物、药物和任何中间产物。
在优选的实施方式中，测试样品是血液的血浆。在特别优选的实施方式中，测试样品是贫化血浆(depleted plasma)。该血浆经纯化除去了大多数丰富的血浆蛋白质，例如白蛋白，从而降低样品中的蛋白质负载，从而减少样品中的分析物数量和总蛋白含量。
待检验样品的校准样品可以是天然样品，例如体液或组织提取物，或可以是合成的。校准样品可包含重组表达的蛋白质、合成制备的肽或寡核苷酸。此外，可通过重组蛋白表达以串联顺序产生许多不同的肽。欧洲专利申请EP 1736480公开的方法产生多种参比肽作为串联重组蛋白质从而类似于AQUA方法的方式用于多反应监测实验。按照本发明的任何方面，此类产生方法可与同量异序质量标签联用以提供校准样品。
校准样品可以是待检验样品的标准化形式。校准样品可包含待检验样品的所有组分，但其含量是特定的。例如，校准样品可包含以下物质的标准化制品：哺乳动物组织、液体，例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑膜液、眼水、尿液、泪水和泪小管渗出液，肺抽吸物，包括支气管肺泡灌洗液，唾液、痰、母乳、乳头抽吸物、精液、灌洗液、细胞提取物、细胞系和亚细胞细胞器，组织，例如实体器官组织，衍生自哺乳动物、鱼、禽类、昆虫、环节动物、原生动物和细菌的细胞培养上清液或制品，组织培养提取物、植物组织、植物液体、植物细胞培养提取物、细菌、病毒、真菌、发酵肉汤培养液、食物、药物和任何中间产物。如果感兴趣的分析物是蛋白质，由于校准样品中的所有蛋白质均作标记，可利用此类样品的完整蛋白质组作为研究样品的所有蛋白质的参比。
或者，校准样品可仅包含样品中待检验的分析物，而不含样品中的任何其它组分。可制备并外源性同量异序标记包含一种或多种分析物的校准样品，将其加入含有分析物的复杂混合物中。例如，如果样品是血浆样品，但仅要检验该血浆样品中特定的蛋白质，可制备包含重组形式蛋白质的不同试样的校准样品。
在其它方法中，校准样品的各试样中分析物的绝对量未知。在该实施方式中，校准样品的各试样中分析物的含量是已知的定性量。校准步骤包括根据校准样品的试样中分析物的定性量和测定量来校准测试样品中分析物的含量。在特定的实施方式中，定性量是具有特定状态，例如健康或患病状态的对象中分析物含量的预计范围。提供此类校准样品以便相对定量的试验的适用范围很广，包括生物标记发现、工业微生物、药物和食品制造以及人和兽医学疾病的诊断和控制。
分析复杂的生物学样品，例如血液血浆时，常可用相对定量实验。在具体的实施方式中，将大量的完整人血液血浆分成数份(即，四份)试样，各用不同的同量异序质量标签标记。例如，一种可利用TMT六聚体以产生血液血浆的四份标记试样。可利用TMT6-128、TMT6-129、TMT6-130、TMT6-131作标记。用该同量异序质量标签的另一种不同形式，即TMT6-126标记血液血浆研究的所有各份样品。现在可利用血液血浆的试样产生校准曲线，例如以0.5-1-2-5μL比例混合四份试样产生校准样品，然后加入1μL研究样品。通过混合样品与包含四种差异性标记的试样的校准样品，实际上，用此材料进行的所有实验会产生多组5标志-离子-4个来自校准样品，1个来自测试样品。因此，4-点校准曲线中可利用完整的蛋白质组。如果给该研究的所有测试样品掺加相同量的校准样品，可能相对定量所有研究样品。由于多个实验室可利用校准样品，交叉研究和交叉实验室比较是可能的。
虽然分析物的绝对量可能未知，但可从校准曲线计算含量的变化百分比。可根据应用调节校准曲线的比例和幅度。
在优选的实施方式中，选择校准样品的各不同试样中分析物的含量以反映测试样品中分析物的已知或怀疑的变化。在还要进一步的优选实施方式中，所提供试样包含的分析物量对应于健康或患病对象的测试样品中发现的分析物的已知或怀疑含量范围的上限和下限，及任选的中间点。
由于各分析物独立于样品中所有其它分析物定量，制备浓度彼此极为不同的多组校准样品的可能的，从而提高该实验的动态范围。还可能制备各分析物的多个参比生物分子，其中各生物分子的含量范围重叠以便延伸给定分析物的标准曲线的总范围。例如，根据在串联质谱仪中的性能，可选择靶蛋白的许多不同胰蛋白酶肽以便用作参比标准。可根据对应于质谱图中肽的离子的离子强度或根据对应于肽的离子在图谱中出现的区域的信噪比选择参比肽。或者，可选择参比肽以避免具有同量异序物质的肽。尤其宜选择蛋白型肽，即，仅在特定蛋白质中存在的肽。
如果用同量异序质量标签的六聚体集合的最多5个不同成员独立标记各标准肽，可将这些成员以不同比例混合以提供5-点标准曲线。可利用相同的同量异序质量标签来标记第二、第三、第四或更多的标准肽，各肽可以不同比例混合以涵盖与同一分析物的其它参比肽各自涵盖所不同的浓度范围。
产生衍生自靶蛋白的各肽的不同校准曲线，各校准曲线涵盖不同浓度范围。然后从其各自的校准曲线测定各肽的浓度，该浓度可向回与靶蛋白的浓度关联。对于一些校准曲线，测试样品中肽的含量可落在校准曲线的中部，从而精确测定其在样品中的实际含量。对于涵盖不同浓度范围的其它校准曲线，测试样品中肽的含量可落在校准曲线范围外。我们可利用各自衍生自单一感兴趣分析物的多种肽来产生与同一分析物相关的多条校准曲线，然后选择最精确的校准曲线以便从一种或多种肽的浓度测定测试样品中分析物的浓度。以此方式可涵盖较宽的动态范围而不损害试验灵敏度。
校准样品可包含常规量的分析物。校准样品中分析物的含量可表明植物、动物或优选人是健康的。或者，校准样品包含的分析物的含量可表明有特定疾病存在和/或其阶段。在进一步的实施方式中，校准样品包含的分析物的含量可表明治疗效力和/或毒性。制备具有特定性质，例如疾病的存在和/或阶段、对治疗的反应和/或毒性的已知标记的标准组。可从患有充分表征的疾病的患者制备包含同量异序质量标签标记的体液或组织提取物的校准样品，所述疾病包括但不限于：肿瘤、神经变性、心血管、肾脏、肝脏、呼吸、代谢、炎性和感染性疾病。将已知量的此类样品加入多份测试样品，该方式可根据共同校准样品的离子强度标准化质谱图中一系列分析离子强度，从而在不同分析之间作更精确的比较，降低研究的分析差异性。
以冠心病药物为例，合成产生从胰蛋白酶消化已知心脏病标记，例如肌红蛋白、肌钙蛋白-I、CK-MB、BNP、pro-BNP和NT-pro-BNP获得的一系列肽，分成三份试样。各参比肽的各试样用，例如此类同量异序质量标签的集合的三种同量异序质量标签之一标记，其中质谱法检测到该集合中的所有标签基本上具有相同的合计质量，在质谱仪中经碰撞诱导解离后该集合中各标签释放质量独特的质量标志离子。然后将已知浓度的各独特的参比肽-质量标签分子加入运载体溶液，例如质谱-相容缓冲液，从而同一参比肽的三种差异性标记试样的浓度不同，该不同横跨患有心脏病的患者中母体蛋白质的正常生物学浓度。将规定体积比的得到的参比肽组加入已用与标记参比肽相同的同量异序质量标签集合中的第四同量异序质量标签标记的测试样品。然后对掺加的样品进行串联质谱法，其中以直接模式进行全谱扫描从而仅鉴定具有各同量异序标记参比肽相关的特征性保留时间和质量的那些前体离子。对于各选择离子，质谱图将含有衍生自高、中和低浓度参比肽和测试样品的标志离子。
从参比肽标志离子强度不难构建简单的标准曲线，可根据校准曲线读数测试样品中同一肽的第四标志离子。这表示可在一次实验中测定多种生物学相关蛋白质的绝对浓度。技术人员可知道制备参比肽的不同蛋白质的数量无需具体限定，可以是1-100，最优选1-50的范围。类似地，代表性肽的数量可以是1-20、优选1-10、更优选1-5和最优选1-3的范围。技术人员会知晓上述例子是通用例子，其中描述的原理可适用于任何疾病的已知标志并适用于疾病诊断、监测疾病进展或监测患者对治疗的反应。
其它应用在于这些校准样品在时程实验中的应用。如果不同试样(四)来自四个不同时间点，例如零时、1小时、8小时和24小时，可在某实验(小鼠和人中的药物攻击，诱导大肠杆菌和酵母菌发酵)中，对于慢性疾病的产生或治疗反应还在数周和数月也可在较长时间尺度上建立关于时程的样品“状态”。
技术人员应知道同量异序质量标签的性质不作具体限制。本领域已知各种合适的同量异序治疗标记物，例如在WO 01/68664(通过引用纳入本文)和WO 03/025576(通过引用纳入本文)中公开的串联治疗标签(Thompson等，2003，Anal.Chem.75(8)：1895-1904(通过引用纳入本文))、在US6824981(通过引用纳入本文)中公开的iPROT标签和iTRAQ标签(Pappin等，2004，Methods in Clinical Proteomics Manuscript M400129-MCP200(通过引用纳入本文))。任何这些同量异序治疗标记物适于制备样品和校准样品及实施本发明方法。
虽然本发明所用质量标签的结构未作具体限定，只要它们是同量异序的并具有质谱学上不同的质量标记物基团(部分)，但在优选的实施方式中，质量标签包含以下结构：
X-L-M
其中X是质量标记物部分，L是可切割的接头，M是质量标准化部分。L可以是单键，或X的一部分或M的一部分。这些质量标签可以连接于测试或校准样品中分析物的任何点，例如通过M、L或X。它们优选通过M相连，例如标记物可包含以下结构：
(X-L-M)-。
这通常经由在质量标签中包含反应活性官能团使之能结合分析物得到实现，例如：
X-L-M-反应活性官能团。
当标记物包含反应活性官能团时，这些标记物称为反应活性质量标签。
将质量标签连接于分析物的反应活性官能团不作具体限定，可包含任何合适的反应活性基团。
本文所用的术语质量标签应指适于标记分析物以便测定的部分。术语标记物是术语标签的同义词。
本文所用的术语质量标记物部分应指有待通过质谱法检测的部分。术语质量标记物部分是术语质量标记物基团或术语报道基团的同义词。本发明质量标记物部分的各组分优选耐受断裂，从而可通过引入易于为以下方式打断的连接键来控制标志断裂的位点：碰撞诱导解离(CID)、表面诱导解离、电子俘获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)或快速原子轰击。在最优选的实施方式中，不难通过CID断裂所述连接键。
本文所用的术语质量标准化部分应指无需通过质谱法检测的部分，但其存在确保质量标签具有所需合计质量。质量标准化部分不作具体限定，仅用于改变质量标签的总质量。
在优选的实施方式中，质量标签的合计分子量是600道尔顿或低一些，更优选500道尔顿或低一些，还要优选400道尔顿或低一些，最优选300-400道尔顿。质量标签的特别优选的分子量是324、338、339和380道尔顿。这些优选的实施方式尤其有利，因为质量标签体积小意味着用质量标签标记时待检测肽的体积增加最少。
在优选的实施方式中，质量标记物部分的分子量是300道尔顿或低一些，优选250道尔顿或低一些，更优选100-250道尔顿，最优选100-200道尔顿。这些优选的实施方式尤其有利，因为质量标记物部分体积小意味着其在质谱图的沉默区产生峰，从而易在质谱图中鉴别质量标志，还能灵敏地定量。
质量标记物部分的特别优选的分子量是125、126、153和154道尔顿，或者其中一个或多个或所有的12C原子被13C原子取代的重量，例如未取代的质量标记物部分的重量是125，其用1、2、3、4、5和6个13C原子分别相应取代的质量是126、127、128、129、130和131道尔顿，和/或一个或多个或所有的14N原子被15N原子取代。
本文所用的术语质谱图的沉默区应指质谱图中与存在标记肽断裂产生的片段相关各峰造成的背景“噪声”低的区域。因此，术语沉默区应指质谱图中待检测肽相关各峰造成的“背景”低的区域。对于肽或蛋白质，质谱图的沉默区低于200道尔顿。
本发明人还发现上述反应活性质量标签易与蛋白质快速反应以形成标记的蛋白质。
本发明采用两种或更多种质量标签的集合。这些集合中标记物是具有不同质量的质量标志的同量异序质量标签。因此，该集合中各标记物如上所述，其中各质量标准化部分确保质量标签具有所需合计质量，其中该集合包含具有质量标记物部分的质量标签，各质量标记物部分具有不同于该集合中所有其它质量标记物基团的质量，该集合中各标记物具有共同的合计质量；其中质谱学显示该集合中所有质量标签彼此不同。
术语“同量异序”表示质谱法测定质量标签具有基本上相同的合计质量。同量异序质量标签的平均分子量通常落在彼此±0.5Da的范围内。术语“标记物”应是术语“标签”的同义词。就本发明而言，技术人员应知道术语“质量标记物部分”和术语“报道基团”可互换使用。
集合中标记物的数量不作特别限定，只要该集合包含多个标记物即可。然而，如果集合包括两个或多个、三个或更多个、四个或更多个或五个或更多个标记物是优选的，更优选六个或更多个标记物，最优选八个或更多个标记物。
本文的术语合计质量指质量标签的总质量，即，质量标记物部分、可切割接头、质量标准化部分和质量标签的任何其它组分的质量之和。
该集合中各质量标签的质量标准化部分的质量不同。各质量标签中质量标准化部分的质量等于共同的合计质量减去该质量标签中具体质量标记物部分的质量再减去可切割接头的质量。
质谱学显示集合中所有质量标签彼此不同。因此，质谱仪可区分质量标签，即，衍生自质量标签的各峰可以清楚地彼此分开。质量标记物基团之间的质量差异表示质谱仪可区分衍生自不同质量标签或质量标记物基团的离子。
本发明还可采用包含上述两个或更多个质量标签集合的质量标签阵列，其中该阵列中任一集合的各质量标签的合计质量不同于各其它集合中各质量标签的合计质量。
在优选的本发明实施方式中，质量标签的阵列优选在化学上均相同(在化学上基本相同)。术语“化学上基本相同”表示质量标签具有相同的化学结构，在该结构中可引入特定同位素取代或者可连接特定取代基。
在进一步优选的本发明实施方式中，质量标签可包含灵敏度增强基团。所述质量标签优选具有以下形式：
灵敏度增强基团-X-L-M-反应活性官能团。
在该例子中，灵敏度增强基团通常连接于质量标记物部分，因为打算增加该部分在质谱仪中的检测灵敏度。显示有反应活性官能团存在并连接于与灵敏度增强基团不同的部分。然而，无需以此方式限定质量标签，在一些情况中，灵敏度增强基团可连接于与反应活性官能团相同的部分。
现在更详细地描述本发明中用于标记分析物的质量标签的优选结构。
在优选的实施方式中，X是包含以下基团的质量标记物部分：
其中环状单元是芳族或脂族，在任两个毗邻原子之间独立包含0-3个双键；各Z独立为N、N(R1)、C(R1)、CO、CO(R1)(即，-O-C(R1)-或-C(R1)-O-)、C(R1)2、O或S；X是N、C或C(R1)；各R1独立为H、取代或未取代的直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的脂族环状基团、取代或未取代的芳族基团或取代或未取代的杂环基团；和y是0-10的整数。
在上述通式中，当Z是C(R1)2时，碳原子上的各R1可以相同或不同(即，各R1是独立的)。因此，C(R1)2基团包括诸如CH(R1)等基团，其中一个R1是H，另一个R1是选自以上R1定义的另一基团。
在上述通式中，X和非环状Z之间的键根据该位置的所选X和Z基团可以是单键或双键。例如，当X是N或C(R1)时，X到非环状Z的键必须是单键。当X是C时，X到非环状Z的键根据所选的非环状Z基团和环状Z基团可以是单键或双键。当非环状Z基团是N或C(R1)时，非环状Z到X的键是单键，或者如果y是0，可以是双键，根据所选X基团和非环状Z所连接的基团。当非环状Z是N(R1)、CO(R1)、CO、C(R1)2、O或S时，到X的键必须是单键。本领域技术人员不难根据上式选择合适的X、Z和(CR1 2)y基团与正确的化合价(单键或双键连接)。
质量标记物部分的取代基不作特别限定，可包含任何有机基团和/或元素周期表IIIA、IVA、VA、VIA或VIIA任一族的一个或多个原子，例如B、Si、N、P、O或S原子或卤素原子(例如，F、Cl、Br或I)。
当取代基包含有机基团时，有机基团优选包含烃基团。烃基团可包含直链、支链或环状基团。烃基团可独立包含脂族或芳族基团。烃基团还可独立包含饱和或不饱和的基团。
当烃包含不饱和基团时，其可包含一个或多个烯官能团和/或一个或多个炔官能团。当烃包含直链或支链基团时，其可包含一个或多个伯烷基、仲烷基和/或叔烷基。当烃包含环状基团时，其可包含芳环、脂环、杂环和/或这些基团的稠环衍生物。因此，环状基团可包含苯、萘、蒽、茚、芴、吡啶、喹啉、噻吩、苯并噻吩、呋喃、苯并呋喃、吡咯、吲哚、咪唑、噻唑和/或唑基以及以上基团的区域异构体(regioisomer)。
烃基团中的碳原子数不作具体限定，但优选烃基团包含1-40个C原子。因此，烃基团可以是低级烃(1-6个C原子)或高级烃(7个或更多个C原子，例如7-40个C原子)。环状基团的环中的原子数不作具体限定，但优选环状基团的环中包含3-10个原子，例如3、4、5、6或7个原子。
上述包含杂原子的基团以及以上定义的任何其它基团可包含元素周期表IIIA、IVA、VA、VIA或VIIA任一族的一个或多个杂原子，例如B、Si、N、P、O或S原子或卤素原子(例如，F、Cl、Br或I)。因此，取代基可包含有机化学中的一个或多个普通官能团，例如羟基、羧酸基团、酯基、醚基、醛基、酮基、胺基、酰氨基、亚氨基、硫醇基、硫醚基、硫酸酯基、磺酸基团和磷酸酯基等。取代基还可包含这些基团的衍生物，例如羧酸酐(carboxylic acid anhydryde)和羧酸卤化物。
此外，任何取代基可包含两个或更多个以上定义的取代基和/或官能团的组合。
本发明所用质量标签的可切割接头不作具体限定。所述可切割接头优选可通过以下方式切割的接头：碰撞诱导解离、表面诱导解离、电子俘获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)或快速原子轰击。在最优选的实施方式中，连接键可由CID切割。接头可包含酰氨键。
上下文中述及可用于连接感兴趣分子与本发明所用质量标记化合物的接头基团。本领域已知各种接头，其可引入本发明质量标签和它们的共价相连生物学分子之间。一些这样的接头是可切割的。寡聚或聚乙二醇或它们的衍生物可用作接头，例如Maskos，U.和Southern，E.M.Nucleic AcidsResearch 20：1679-1684，1992所述那些。还广泛使用基于琥珀酸的接头，但这些接头不适宜涉及标记寡核苷酸的领域，因为它们通常对碱不稳定，因此与许多寡核苷酸合成中所用的碱介导脱保护步骤不相容。
炔丙醇是提供在寡核苷酸合成条件下稳定的连接键的双功能接头，是本发明用于相关寡核苷酸应用的优选接头。类似地，6-氨基己醇是连接适当功能化分子的有用双功能试剂，其也是有用的接头。
各种已知的可切割接头基团可与本发明所用的化合物联用，例如光可切割的接头。邻-硝基苄基是在苄胺键处切割的已知光可切割接头，特别是2-硝基苄基酯和2-硝基苄胺。可切割接头的综述参见Lloyd-Williams等，Tetrahedron 49，11065-11133，1993，其涵盖了各种光可切割和化学可切割的接头。
WO 00/02895公开了乙烯基砜化合物作为可切割接头，这些接头也适用于本发明，特别是涉及标记多肽、肽和氨基酸的领域。该申请的内容通过引用纳入本文。
WO 00/02895公开了硅化合物作为可通过碱在气相中切割的接头的应用。这些接头也适用于本发明，特别是涉及标记寡核苷酸的领域。该申请的内容通过引用纳入本文。
本发明所用的质量标签的质量标准化部分的结构不作具体限定，只要其适合确保质量标签具有所需合计质量。然而，质量标准化部分优选包含直链或支链C1-C20取代或未取代的脂族基团和/或一个或多个取代或未取代的氨基酸。
质量标准化部分优选包含C1-C6取代或未取代的脂族基团，更优选C1、C2、C3、C4、C5取代或未取代的脂族基团，还要更优选C1、C2或C5取代或未取代的脂族基团或C1甲基取代的基团。
所述一个或多个取代或未取代的氨基酸可以是任何必需或非必需天然氨基酸或非天然氨基酸。优选的氨基酸是丙氨酸、β-丙氨酸和甘氨酸。
质量标准化部分的取代基不作特别限定，可包含任何有机基团和/或元素周期表IIIA、IVA、VA、VIA或VIIA任一族的一个或多个原子，例如B、Si、N、P、O或S原子或卤素原子(例如，F、Cl、Br或I)。
当取代基包含有机基团时，有机基团优选包含烃基团。烃基团可包含直链、支链或环状基团。烃基团可独立包含脂族或芳族基团。烃基团还可独立包含饱和或不饱和的基团。
当烃包含不饱和基团时，其可包含一个或多个烯官能团和/或一个或多个炔官能团。当烃包含直链或支链基团时，其可包含一个或多个伯烷基、仲烷基和/或叔烷基。当烃包含环状基团时，其可包含芳环、脂环、杂环和/或这些基团的稠环衍生物。因此，环状基团可包含苯、萘、蒽、茚、芴、吡啶、喹啉、噻吩、苯并噻吩、呋喃、苯并呋喃、吡咯、吲哚、咪唑、噻唑和/或唑基以及以上基团的区域异构体。
烃基团中的碳原子数不作具体限定，但优选烃基团包含1-40个C原子。因此，烃基团可以是低级烃(1-6个C原子)或高级烃(7个或更多个C原子，例如7-40个C原子)。环状基团的环中的原子数不作具体限定，但优选环状基团的环中包含3-10个原子，例如3、4、5、6或7个原子。
上述包含杂原子的基团以及以上定义的任何其它基团可包含元素周期表IIIA、IVA、VA、VIA或VIIA任一族的一个或多个杂原子，例如B、Si、N、P、O或S原子或卤素原子(例如，F、Cl、Br或I)。因此，取代基可包含有机化学中的一个或多个普通官能团，例如羟基、羧酸基团、酯基、醚基、醛基、酮基、胺基、酰氨基、亚氨基、硫醇基、硫醚基、硫酸酯基、磺酸基团和磷酸酯基等。取代基还可包含这些基团的衍生物，例如羧酸酐(carboxylic acid anhydryde)和羧酸卤化物。
此外，任何取代基可包含两个或更多个以上定义的取代基和/或官能团的组合。
在其中所述方法包括标记样品的步骤的一个本发明实施方式中，所述标记步骤包括将分析物与反应活性质量标签反应的步骤，其中所述反应活性质量标签包含质量标签和反应活性官能团。
本发明通常用于标记和通过质谱法检测生物学分子的反应活性质量标签包含促进质量标签与生物学分子连接或用于这种连接的反应活性官能团和质量标签，如上文定义的。在本发明的优选实施方式中，反应活性官能团使得质量标签与分析物，优选氨基酸、肽或多肽共价反应。反应活性官能团可经可切割或不可切割的接头连接于质量标签。反应活性官能团可连接于质量标签的质量标记物部分或质量标签的质量标准化部分。
可将各种反应活性官能团引入本发明所用的质量标签。所述反应活性官能团的结构不作具体限定，只要其能与待标记生物学分子上的一个或多个反应活性位点反应即可。反应活性官能团优选亲核试剂或亲电试剂。
在最简单的实施方式中，其可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯。N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的质量标签还能与肼反应得到可用于标记，例如高碘酸盐氧化糖部分的酰肼反应活性官能团。一些应用中可利用氨基或硫醇作为反应活性官能团。可利用碳二亚胺作为偶联试剂，用赖氨酸偶联质量标签与游离羧基官能团。赖氨酸还可用作将其它反应活性官能团引入本发明质量标签的起点。可通过赖氨酸ε氨基与马来酸酐反应引入硫醇-反应活性马来酰亚胺官能团。半胱氨酸硫醇基团可用作合成各种烯基砜化合物的起点，这些化合物是与硫醇和胺反应的有用蛋白质标记试剂。可利用例如氨基己酸等化合物在质量修饰的质量标记物部分或质量标准化部分与反应活性官能团之间提供间隔基团。
下表1列出了可与在生物分子中发现的亲核官能团反应的一些反应活性官能团，从而在两个实体之间产生共价连接。可将以下所列任何官能团引入本发明化合物以使质量标志连接于感兴趣的生物学分子。可利用反应活性官能团引入含其它反应活性官能团的其它接头基团，如果需要的话。表1部分穷尽的，本发明不限于仅利用所列官能团。
表1
在本发明的优选实施方式中，反应活性官能团包含以下基团：
其中各R2独立为H、取代或未取代的直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的脂族环状基团、取代或未取代的芳族基团或取代或未取代的杂环基团。
反应活性官能团的取代基不作特别限定，可包含任何有机基团和/或元素周期表IIIA、IVA、VA、VIA或VIIA族的一个或多个原子，例如B、Si、N、P、O或S原子或卤素原子(例如，F、Cl、Br或I)。
当取代基包含有机基团时，有机基团优选包含烃基团。烃基团可包含直链、支链或环状基团。烃基团可独立包含脂族或芳族基团。烃基团还可独立包含饱和或不饱和的基团。
当烃包含不饱和基团时，其可包含一个或多个烯官能团和/或一个或多个炔官能团。当烃包含直链或支链基团时，其可包含一个或多个伯烷基、仲烷基和/或叔烷基。当烃包含环状基团时，其可包含芳环、脂环、杂环和/或这些基团的稠环衍生物。因此，环状基团可包含苯、萘、蒽、茚、芴、吡啶、喹啉、噻吩、苯并噻吩、呋喃、苯并呋喃、吡咯、吲哚、咪唑、噻唑和/或唑基以及以上基团的区域异构体。
烃基团中的碳原子数不作具体限定，但优选烃基团包含1-40个C原子。因此，烃基团可以是低级烃(1-6个C原子)或高级烃(7个或更多个C原子，例如7-40个C原子)。环状基团的环中的原子数不作具体限定，但优选环状基团的环中包含3-10个原子，例如3、4、5、6或7个原子。
含有上述杂原子的基团以及上述任何其它基团可包含周期表中IIIA、IVA、VA、VIA或VIIA任一族的一个或多个杂原子，例如B、Si、N、P、O或S原子或卤素原子(例如，F、Cl、Br或I)。因此，取代基可包含一个或多个有机化学共同官能团，例如羟基、羧酸基、酯基、醚基、醛基、酮基、氨基、酰氨基、亚胺基、巯基、硫醚基、硫酸酯基、磺酸基和磷酸酯基等。取代基还可包含这些基团的衍生物，例如羧酸酐和羧酸卤化物。
此外，任何取代基可含有两个或更多个以上定义的取代基和/或官能团的组合。
在更优选的实施方式中，反应活性官能团包含以下基团：
在本发明的优选实施方式中，反应活性质量标签具有以下结构之一：
3-[2-(2，6-二甲基-哌啶-1-基)-乙酰氨基]-丙酸-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)-酯(DMPip-βAla-OSu)
3-[2-(嘧啶-2-基硫烷基)-乙酰氨基]-丙酸-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)-酯(Pyrm-βAla-OSu)
6-[(嘧啶-2-基硫烷基)-乙酰氨基]-己酸-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)-酯(Pyrm-C6-OSu)
2-[2-(2，6-二甲基-哌啶-1-基)-乙酰氨基]-丙酸-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)-酯(DMPip-Ala-OSu)
[2-(2，6-二甲基-哌啶-1-基)-乙酰氨基]-乙酸-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)-酯(Pyrm-Gly-OSu)。
在本发明的方法中，集合中各标记物具有共同的合计质量，集合中各标记物具有质量独特的质量标记物部分。
集合中各质量标记物部分优选具有共同的基础结构，集合中各质量标准化部分优选具有共同的基础结构，集合中各质量标签包含一个或多个质量调节部分，所述质量调节部分与质量标记物部分的基础结构和/或质量标准化部分的基础结构相连或位于其中。在该实施方式中，集合中各质量标记物部分包含不同数量的质量调节部分，而集合中各质量标签具有相同数量的质量调节部分。
在本说明书中，共同的基础结构表示两个或多个部分共有结构骨架、主链或核心基本上相同的某结构。骨架包含以上结构式所示的质量标记物部分或上述质量标准化部分。骨架还可包含经酰胺键相连的许多氨基酸。还可存在其它单元，例如芳基醚单元。骨架或主链可含有垂下的取代基，或在其中含有原子或同位素取代而不改变共同的基础结构。
在优选实施方式中，本发明的质量标签或反应活性质量标签的集合包含具有以下结构的质量标签：
M(A)y-L-X(A)z
其中M是质量标准化部分，X是质量标记物部分，A是质量调节部分，L是可切割接头，y和z是0或更大的整数，y+z是1或更大的整数。M优选断裂耐受的基团，L是经与另一分子或原子碰撞后易于断裂的接头，X优选预电离的断裂耐受基团。
该集合中所有成员的M和X的质量总和相同。M和X优选具有相同的基础结构或核心结构，该结构由质量调节部分修饰。质量调节部分确保该集合中所有质量标签的M和X质量总和相同，还确保各X具有不同的(独特的)质量。
质量调节部分(A)宜选自：
(a)位于质量标记物部分和/或质量标准化部分内的同位素取代基，和
(b)与质量标记物部分和/或质量标准化部分相连的取代基原子或基团。
质量调节部分优选卤素原子取代基、甲基取代基和2H、15N、18O或13C同位素取代基。
在本发明的一个优选实施方式中，上述质量标签集合中各质量标签具有以下结构：
X(*)n-L-M(*)m
其中X是质量标记物部分，L是可切割接头，M是质量标准化部分，*是同位素质量调节部分，n和m是0或更大的整数，从而使得该集合中各标记物包含具有独特质量的质量标记物部分，该集合中各标记物具有共同的合计质量。
X优选包含以下基团：
其中R1、Z、X和y如上所述，该集合中各标记物包含0、1或更多个*，从而使得该集合中各标记物包含具有独特质量的质量标记物部分，该集合中各标记物具有共同的合计质量。
在进一步优选的实施方式中，本发明的反应活性质量标签包含以下反应活性官能团：
其中R2如上所述，该集合包含0、1或更多个*，从而使得该集合中各标记物包含具有独特质量的质量标记物部分，该集合中各标记物具有共同的合计质量。
在所有上述优选的结构式中，特别优选同位素原子*位于质量标记物部分和/或接头和/或质量调节部分内，而不是在促进标记物与分析物相连的任何反应活性部分上。同位素取代基的数量不作具体限定，可以根据集合中标记物的数量来确定。*原子的数量通常是0-20，更优选0-15，最优选1-10，例如1、2、3、4、5、6、7或8。在两个标记物的集合中，*原子的数量优选1，在5个标记物的集合中，该数量优选4，而在6个标记物的集合中，该数量优选5。然而，该数量可根据标记物的化学结构而有所不同。
如果标记物含有一个或多个硫原子，则需要时，还可将S的同位素变体用作质量调节部分。
在质量调节部分是15N或13C的特别优选实施方式中，反应活性质量标签的集合包含具有以下结构的两种质量标签：
以上质量标签构成二聚体串联质量标签集合的例子。
在质量调节部分是15N或13C的特别优选实施方式中，反应活性质量标签集合包含具有以下结构的五种质量标签的集合：
以上质量标签构成五聚体串联质量标签集合的例子。
在质量调节部分是15N或13C的另一特别优选实施方式中，反应活性质量标签集合包含具有以下结构或这些结构的立体异构体的六种质量标签I-IV：
以上质量标签构成六聚体串联质量标签集合的例子。
本发明的方法可包括分离靶分析物或其片段与样品中其它组分的其它步骤。该分离步骤可在步骤(a)之前，步骤(a)之后但步骤(b)之前或在步骤(b)期间进行。
该方法还标记用至少一种酶消化各样品以消化样品中诸组分的步骤。该消化步骤可在步骤(a)之前，步骤(a)之后但步骤(b)之前或在步骤(b)期间进行。在一个实施方式中，在消化前用同量异序质量标签标记样品。在另一实施方式中，在消化后标记样品。
在进一步的实施方式中，该方法所用的质量标签还包含亲和力捕捉配体。质量标签的亲和力捕捉配体结合反配体，从而在步骤(a)之前，步骤(a)之后但步骤(b)之前或在步骤(b)期间分离同量异序标记的分析物与未标记的分析物。
亲和力捕捉配体是具有高度特异性结合伴侣的配体。这些结合伴侣使得用配体标记的分子能为结合伴侣所选择性地捕捉。优选用结合伴侣衍生固体支持物，因此可在固相支持物上选择性捕捉亲和力配体标记的分子。优选的亲和力捕捉配体是可通过本领域已知的标准方法引入本发明质量标签的生物素。具体地说，可在质量标记物部分或质量标准化部分后掺入赖氨酸残基，从而能将胺反应活性生物素连接于质量标签(参见例如，Geahlen R.L.等，Anal Biochem202(1)：68-67，“制备在羧基端生物素化的肽的通用方法”(A general method forpreparation of peptides biotinylated at the carboxy terminus.)，1992；Sawutz D.G.等，Peptides 12(5)：1019-1012，“[Lys]缓激肽的生物素化类似物的合成和分子表征”(Synthesis and molecular characterization of a biotinylated analogue of[Lys]bradykinin.)，1991；Natarajan S.等，Int J Pept Protein Res 40(6)：567-567，“位点特异性生物素化，一种新方法及其对于内皮素-1类似物和PTH-类似物的应用”(Site-specific biotinylation.A novel approach and its application toendothelin-1 analogues and PTH-analogue.)，1992)。还可使用亚胺生物素(iminobiotin)。可使用生物素的各种亲和素反配体，包括单体和四聚体的亲和素及链霉亲和素，这些均可用于许多固体支持物上。
其它亲和力捕捉配体包括洋地黄毒苷、荧光素、硝基苯基部分和许多肽表位，例如c-myc表位，其选择性单克隆抗体以反配体存在。或者，可通过本领域技术人员已知的方法产生对质量标签结构具有特异性的抗体或其它结合试剂。然后可将此类结合试剂连接于固体支持物，例如珠、孔或侧流装置(lateralflow device)的平坦表面上来构建亲和力基质。然后在质量标记的分析物与结合试剂结合并保留，而除去所有未标记的材料(例如，通过洗涤)的条件下，通过将标记的分析物与亲和力基质接触来纯化它们。最后，可通过将条件调节至促进所捕捉的质量标记分析物释放的那些条件，例如低pH或高盐下来回收捕捉的分析物。优选采用低pH的条件以免需要随后除去可能干扰MS的盐离子。还可利用金属离子结合配体，例如易于结合Ni2+离子的六组氨酸。例如，可市售购得提供亚氨基二乙酸螯合Ni2+离子的层析树脂。可利用这些固定化镍柱捕捉质量标签。此外，亲和力捕捉官能团可与适当衍生的固相支持物选择性反应。例如，已知硼酸能与邻位顺式二醇和化学上相似的配体，例如水杨基羟肟酸选择性反应。
本发明方法还可包括在步骤(a)之前，步骤(a)之后但步骤(b)之前或在步骤(b)期间电泳或色谱分离同量异序标记的分析物的步骤。在优选的实施方式中，采用强阳离子交换层析。
在本发明其它方面，样品之一包含含有触发分析物的触发试样。触发分析物优选用非同量异序质量标签标记，该方法在步骤(b)之后和步骤(c)之前包括检测质荷比等于触发分析物质荷比的离子的其它步骤，其中检测到质荷比等于触发分析物质荷比的离子时，步骤(c)以第一质荷比的m/z启动。触发试样中触发分析物的含量足以在检测步骤期间用作触发物。优选校准样品的试样之一是触发试样。
检测质荷比等于触发分析物的质荷比的离子的步骤可包括前体离子扫描。这通常包括使得所有离子经第一质量分析器进入碰撞室，样品中所有分析物在该处发生CID，而非常规MS/MS那样是特别选择的离子。将最终质量分析器设置为仅检测触发物的报道离子，其可用作感兴趣分析物在任何特定时间点进入质谱仪的标志。检测触发物的报道离子时，将质谱仪设置成对感兴趣靶分析物实施本发明方法，包括获取存在的质量标记物基团的全m/z范围。
在优选的实施方式中，存在触发物的报道离子表明感兴趣分析物从LC柱上洗脱。这会“触发”执行本发明的预定MS/MS/MS实验。
可用同量异序质量标签标记触发试样。或者，所述触发物可以不是用同量异序质量标签标记的分析物。所述触发物可以是与感兴趣的标记分析物在LC期间共同洗脱或基本上共同洗脱的任何标记分析物。触发分析物的标记物有的质量可不同于校准样品的同量异序质量标签。例如，在一个实施方式中，校准样品包含用同量异序质量标签作差异性标记的分析物的试样，还包含用化学上相同但同位素不同，优选质量与同量异序质量标签差5Da的质量标签标记的分析物的试样。然后同位素不同的质量标签可用作“触发物”。分析的MS期间，携带同位素不同的同量异序标记物的校准样品中存在的各分析物显示为因同量异序和同位素不同的标记物之间的质量差异而分开的一对峰，其中携带同位素不同标记物的分析物的存在量不难检测。将质谱仪编程为对此类峰中同量异序标记的分析物进行专门的MS/MS/MS实验，从而触发感兴趣分析物的定量分析。
在优选的实施方式中，同位素不同的质量标签触发物不包含同位素取代基，同量异序质量标签包含多个同位素取代基，优选2H、15N、18O或13C同位素取代基。这在用同量异序质量标签标记的校准样品的分析物与用触发标记物标记的分析物之间产生质量差异。由于触发标记物不含同位素取代基，如果需要，该标记物可大量使用而无需高成本的同位素标记。
触发试样中分析物的含量最好多于其它样品，包括测试样品和校准样品中存在的分析物含量。与其它样品中的分析物相比，较大量的触发分析物确保首先检测该触发分析物，从而在本发明方法的步骤(c)中触发扫描具有第一质荷比的所选离子。与其它样品中分析物的含量相比，触发试样中分析物的含量比例优选2∶1或更高，更优选3∶1或更高，更优选9∶1或更高，最优选27∶1或更高。与其它样品中分析物的含量相比，触发试样中分析物的含量较高是有利的，因为促进触发分析物的检测。例如，如图31a-31d所示，与TMT6标记的血浆相比，触发分析物(TMT0)的比例越高，触发物的检测和色谱图中所示各峰的后续前沿之间的时间越长。
本发明还提供质谱装置以供检验一种或多种靶分析物，其中所述装置包括：
(i)引入可包含一种或多种靶分析物的两个或更多个样品的器件，其中各样品用质量标签或质量标签的组合作差异性标记，其中各质量标签是包含质谱上不同质量标记物基团的同量异序质量标签；
(ii)选择具有第一质荷比的离子的器件，所述第一质荷比等于用特定数量的所述质量标签标记的靶分析物；
(iii)将具有所述第一质荷比的离子断裂成多个片段离子的器件，其中所述多个片段离子的一部分包含至少一个完整的质量标签；
(iv)选择具有第二质荷比的离子的器件，所述第二质荷比等于包含至少一个完整质量标签的靶分析物的片段；
(v)将具有所述第二质荷比的离子断裂成多个其它片段离子的器件，其中所述其它片段离子的一部分是所述质量标签的质量标记物基团的离子；
(vi)适于选择质荷比范围等于所述质量标记物基团的质荷比范围的离子并适于产生所述质量标记物基团的质谱图的器件。
本发明装置是有利的，因为仅要求选择离子的器件(ii)、(iv)和(vi)选择特定质荷比或小范围的质荷比。这使得所述装置简单、便于制造并具有较小的体积。可制造所述装置以便分析特定靶分析物，因此，在步骤(ii)和(iv)中选择离子的器件仅需能选择特定靶分析物的第一质荷比和第二质荷比。因此，所述装置可适合，例如用于看护时或为诊断目的，且无需将样品运离实验室从而减少诊断耗时。
本发明装置适于实施本发明方法，其中所述方法包括选择等于质量标记物基团的范围的离子的第三步骤。因此，关于本发明方法，包括样品、分析物、质量标签、选择步骤、断裂步骤、产生质谱图和定量测定靶分析物的以上讨论也适用于本发明装置。
适于选择质量标记物基团的离子的器件选择的质荷比范围取决于用于标记所述一种或多种靶分析物的质量标签中质量标记物基团的质量范围。因此，该范围不作特别限定。适于选择质量标记物基团的离子的器件可选择，例如15Th范围的质荷比、8Th范围的质荷比、5Th范围的质荷比或2Th范围的质荷比。
在适于选择质量标记物基团的离子的器件选择8Th范围的优选实施方式中，该范围是124-131。
在适于选择质量标记物基团的离子的器件选择6Th范围的优选实施方式中，该范围是126-131Th，其对应于上述质量标签的TMT六聚体集合的质量标记物基团的质量。
在适于选择质量标记物基团的离子的器件选择5Th范围的优选实施方式中，该范围是126-130Th，其对应于上述质量标签的五聚体集合的质量标记物基团的质量。
在适于选择质量标记物基团的离子的器件选择2Th范围的优选实施方式中，该范围是126-127Th，其对应于上述质量标签的TMT二聚体集合的质量标记物基团的质量。
将选择具有第一质荷比的离子的器件设置为选择(质荷比)等于用特定数量的以上本发明方法所述的质量标签标记的靶分析物的离子。所述第一质荷比取决于靶分析物与相连的质量标签或质量标签的组合的质量。如以上本发明方法所述，所述第一质荷比可等于用特定数量的质量标签标记的靶分析物的未断裂母体离子的质荷比。或者，在一个实施方式中，所述第一质荷比等于用特定数量的质量标签标记的靶分析物的片段离子的质荷比。
选择具有第一质荷比的离子的器件最好能选择低于或等于1500m/z的离子。所得离子束的宽度优选在一定程度上可调节(可调谐)，从而选择的离子束能横跨所选的质量范围，例如50道尔顿范围、20道尔顿范围或5道尔顿范围。选择的离子束更优选具有单位分辨率(unit resolution)，仅横跨1道尔顿。最优选将所选离子的宽度调谐至低于0.1道尔顿。
将选择具有第二质荷比的离子的器件设置为选择(质荷比)等于包含至少一个完整质量标签的靶分析物的片段的离子。所述第二质荷比取决于靶分析物与包含至少一个完整质量标签的所选片段离子的质量。所述第二质荷比最好等于包含靶分析物特有的至少一个完整质量标签的靶分析物的片段(的质荷比)。如以上本发明方法所述，所述第二质荷比可等于a-系列离子、b-系列离子、c-系列离子、x-系列离子、y-系列离子或z-系列离子。与第一质荷比相比，第二质荷比优选具有较高质荷比的y-离子或b-离子。
选择具有第二质荷比的离子的器件最好仅能选择小于或等于1500道尔顿的离子。选择具有第二质荷比的离子的器件优选仅适于选择50道尔顿范围、更优选20道尔顿范围的离子，离子最优选具有一种质量。
在一个实施方式中，本发明装置包括产生第一质荷比离子的多个片段离子的质谱图的其它器件。如以上本发明方法所述，
在本发明的一个实施方式中，器件(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)在质谱仪中是不同的四极。在其它实施方式中，器件(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)在质谱仪的单区域或多个区域中。
本发明装置可包括离子阱，包括线性离子阱，例如克拉托斯公司(Kratos)的ABI 4000 QTRAP，Orbitraps，QIT-Tof(四极-离子阱-Tof)。可用于实施本发明方法的上述各类装置还可用于本发明装置中。
以下非限制性例子描述了本发明。
实施例1-标记肽VATVSLPR的MS/MS和MS/MS/MS分析
为证明本发明原理，包括MS/MS和MS/MS/MS期间质量标签的质量报道基团的产生，制备了肽VATVSLPR的两个样品。一个样品用TMT2-126标记，另一个样品用TMT2-127标记。
然后将两个样品以TMT2-126∶TMT2-127为2∶1的比例混合在一起。
利用膳摩公司(Thermo)的LCQ deca，通过MS/MS分析样品混合物。图1a显示MS/MS分布图，其中b 1离子(325)代表连接于完整质量标签的肽(V)的b1离子，b2离子(396)代表连接于完整质量标签的肽(VA)的b2离子。图1b显示从其余质量标签上切割的质量标记物基团(126和127)的放大部分。图1b中质量标记物基团的各峰显示各样品量的正确比例，2∶1。
随后，利用膳摩公司的LCQ deca选择b1-离子并进行断裂(MS/MS/MS)。图2a显示断裂的b1-离子的MS/MS/MS图谱，其中226处的峰是完整的质量标签的，297处的峰是a1-离子。图2b显示从MS/MS/MS图谱的质量标记物基团(126和127)的放大图，其显示保留了2∶1的正确比例。该图显示MS/MS中产生的一部分片段离子包含完整的质量标签，然后可在MS/MS/MS中选择以便进一步断裂从而释放质量标记物基团。
实施例2-标记的同量异序肽的混合物的MS/MS和MS/MS/MS分析
为证明本发明原理，包括MS/MS和MS/MS/MS期间质量标签的质量报道基团的产生和利用同量异序质量标签的MS/MS/MS如何精确定量复杂混合物中的分析物，制备了以下肽溶液：
表2
  肽   序列   126   127   128   129   130   131
  1   VAFSLR   1   3   5   5   3   1
  2   AVFSLR   1   1   1   4   4   4
  3   FAV5LR   4   4   4   1   1   1
  6   LAFSVR   5   3   1   1   3   5
制备各肽1、2、3和6的不同样品，各自分成6个试样。各试样包含预定量的肽，各试样中肽的相对比例示于上表。例如，肽1分成肽的相对比例为1∶3∶5∶5∶3∶1的6个试样。用不同的TMT六聚体标记物标记各肽的各六个试样。用于标记肽试样的质量标签的结构如下所示：TMT6-126(I)、TMT6-127(II)、TMT6-128(III)、TMT6-129(IV)、TMT6-130(V)和TMT6-131(VI)。
将各肽在N-末端和各赖氨酸残基处连接于质量标签。
然后将肽1的6个试样混合在一起(下文称为肽1混合物)，首先通过MS分析，再通过MS/MS分析，然后选择b1-离子作MS/MS/MS。对各肽混合物重复进行。各肽混合物的MS、MS/MS和MS/MS/MS图谱如下所述：
肽1
图3显示肽1混合物的MS图谱，其中m/z 461处的前体2+离子和m/z 921处的前体1+离子是连接于质量标签的肽1。m/z 461和m/z 921处的各峰显示两种不同荷电状态的肽。
图4显示肽1混合物的MS/MS图谱，其中m/z 239处的b1-离子是连接于完整质量标签的TMT6-130(V)。
图5a显示图4的MS/MS图谱的放大图，其显示6个不同质量标记物基团的各峰。峰高度显示了1∶3∶5∶5∶3∶1的正确比例。
图5b显示选择连接于完整质量标签的b-1离子并进一步断裂后的MS/MS/MS图谱的放大图。MS/MS/MS中质量标记物基团的峰高度也显示了1∶3∶5∶5∶3∶1的正确比例。
肽2
图6显示肽2混合物的MS图谱，其中m/z 461处的前体2+离子和m/z 921处的前体1+离子是连接于质量标签的肽2。
图7显示肽2混合物的MS/MS图谱，其中m/z 301处的b1-离子是连接于完整质量标签的A。
图8a显示图7的MS/MS图谱的放大图，其显示6个不同质量标记物基团的各峰。峰高度显示了1∶1∶1∶4∶4∶4的正确比例。
图8b显示选择连接于完整质量标签的b-1离子并进一步断裂后的MS/MS/MS图谱的放大图。MS/MS/MS中质量标记物基团的峰高度也显示了1∶1∶1∶4∶4∶4的正确比例。
肽3
图9显示肽3混合物的MS图谱，其中m/z 461处的前体2+离子和m/z 921处的前体1+离子是连接于质量标签的肽3。
图10显示肽3混合物的MS/MS图谱，其中m/z 377处的b1-离子是连接于完整质量标签的F。
图11a显示图10的MS/MS图谱的放大图，其显示6个不同质量标记物基团的各峰。峰高度显示了4∶4∶4∶1∶1∶1的正确比例。
图11b显示选择连接于完整质量标签的b-1离子并进一步断裂后的MS/MS/MS图谱的放大图。MS/MS/MS中质量标记物基团的峰高度也显示了4∶4∶4∶1∶1∶1的正确比例。
肽6
图12显示肽6混合物的MS图谱，其中m/z 461处的前体2+离子和m/z 921处的前体1+离子是连接于质量标签的肽3。
图13显示肽6混合物的MS/MS图谱，其中m/z 343处的b1-离子是连接于完整质量标签的L。
图14a显示图13的MS/MS图谱的放大图，其显示6个不同质量标记物基团的各峰。峰高度显示了5∶3∶1∶1∶3∶5的正确比例。
图14b显示选择连接于完整质量标签的b-1离子并进一步断裂后的MS/MS/MS图谱的放大图。MS/MS/MS中质量标记物基团的峰高度也显示了5∶3∶1∶1∶3∶5的正确比例。
肽混合物1、2、3和6的以上MS、MS/MS和MS/MS/MS分析显示在MS中，显示了共同前体离子，因为肽本身和质量标签均是同量异序的。在MS/MS中，一个断裂步骤后产生了不同b1-离子片段，其中所述b1-离子连接于完整的质量标签。各肽产生不同的b1-离子。在MS/MS/MS中，选择连接于完整质量标签的b1-离子的质荷比，然后断裂产生对应于质量标记物基团的峰，其中6个不同质量标记物基团的峰对应于上表2所示标记肽混合物的正确比例。
然后对以下肽混合物进行MS、MS/MS和MS/MS/MS：
肽1和肽6
将肽1的6试样混合物与肽6的6试样混合物混合并如上所述分析。
图15显示肽1和肽6混合物的MS图谱，其中两种肽在m/z 461处具有相同的前体2+离子，而m/z 921处的前体1+离子表示是连接于质量标签的各肽。
图16显示肽1和肽6混合物的MS/MS图谱，其中m/z 329处的b1-离子来自肽1，而m/z 343处的b1-离子来自肽6。
图17显示图16的MS/MS图谱的放大图，其显示肽1和肽6的6个不同质量标记物基团的各峰。各质量标记物基团的6个峰的高度不对应于肽1或肽6的正确比例。这是因为在MS/MS中选择了两种同量异序肽，因此，质量报道基团是来自两种标记的肽。
图18a显示选择肽1的b-1离子并进一步断裂后的MS/MS/MS图谱的放大图。质量标记物基团的峰高度显示1∶3∶5∶5∶3∶1的正确比例，因为仅有肽1具有质量为329的b1-离子，因此，该质量标记物基团仅来自肽1。
图18b显示选择肽6的b-1离子并进一步断裂后的MS/MS/MS图谱的放大图。质量标记物基团的峰高度显示5∶3∶1∶1∶3∶5的正确比例，因为仅有肽6具有质量为343的b1-离子，因此，该质量标记物基团仅来自肽6。
肽2和肽3
将肽2的6试样混合物与肽3的6试样混合物混合并如上所述分析。
图19显示肽2和肽3混合物的MS图谱，其中两种肽在m/z 461处具有相同的前体2+离子，而m/z 921处的前体1+离子表示是连接于质量标签的各肽。
图20显示肽2和肽3混合物的MS/MS图谱，其中m/z 301处的b1-离子来自肽2，而m/z 377处的b1-离子来自肽3。
图21显示图20的MS/MS图谱的放大图，其显示肽2和肽3的6个不同质量标记物基团的各峰。各质量标记物基团的6个峰的高度不对应于肽2或肽3的正确比例。这是因为在MS/MS中选择了两种同量异序肽，因此，质量报道基团是来自两种标记的肽。
图22a显示选择肽2的b-1离子并进一步断裂后的MS/MS/MS图谱的放大图。质量标记物基团的峰高度显示1∶1∶1∶4∶4∶4的正确比例，因为仅有肽2具有质量为301的b1-离子，因此，该质量标记物基团仅来自肽2。
图22b显示选择肽3的b-1离子并进一步断裂后的MS/MS/MS图谱的放大图。质量标记物基团的峰高度显示4∶4∶4∶1∶1∶1的正确比例，因为仅有肽3具有质量为377的b1-离子，因此，该质量标记物基团仅来自肽3。
肽混合物1和6及肽混合物2和3的以上MS、MS/MS和MS/MS/MS分析显示分析包含同量异序肽的复杂肽混合物时，通过MS/MS定量不精确。然而，通过选择一种肽的b1-离子并使该b1-离子断裂以释放质量标记物基团而克服了该问题，其中所述b1-离子包含完整的质量标签。MS/MS/MS后，质量标记物基团的各峰高度显示代表肽的各试样的各标记物正确比例。然后对混合物中各肽重复选择b1-离子和断裂的步骤。
实施例3-标记肽AEFAEVSK的MS/MS分析
用质量标签TMT 0(该标记物的结构示于图23)标记肽AEFAEVSK，通过MS/MS分析。用两个标记物标记肽，一个在N-末端，一个在C-末端赖氨酸处。图23显示标记肽的完全MS/MS图谱。标为A的峰(126)代表质量标记物基团的m/z。标为B的峰(225)代表完整质量标签的m/z。标为C的峰(1175.7和电荷状态1)是伪-y-离子，其代表肽和质量标签的一部分的m/z，因一个质量标记物基团和毗邻羰基的丧失而导致电荷丧失1和质量丧失153Da。这种丧失通常已发生在氨基末端标签以及赖氨酸标签上。由于肽在N-末端具有一个质量标签，在C-末端赖氨酸上具有一个质量标签，MS/MS后一个完整的质量标签仍存在于伪y-离子上。
实施例4-标记肽VLEPTLK的MS/MS分析
用TMT二聚体(TMT2-126和TMT2-127，如图24所示)标记肽VLEPTLK，通过MS/MS分析。用两个标记物标记肽，一个在N-末端，一个在C-末端赖氨酸处。图24显示标记肽的完全MS/MS图谱。标为A的峰(126和127)代表质量标记物基团的m/z。标为B的峰(226)代表完整质量标签的m/z。标为C的峰(1096.7)和标为D的峰(1095.7)代表各不同标记肽的伪-y-离子，如图24所示，丧失153Da(TMT2-126)和丧失154Da(TMT2-127)。这种丧失通常已发生在氨基末端标签以及赖氨酸标签上。由于肽在N-末端具有一个质量标签，在C-末端赖氨酸上具有一个质量标签，MS/MS后一个完整的质量标签仍存在于肽上。
实施例5-标记肽LVNEVTEFAK的MS/MS分析
用两个质量标签标记肽LVNEVTEFAK。一个试样用TMT 0(126Da的质量报道基团，结构示于图23)标记，一个试样用TMT六聚体(TMT6-131)标记。在各试样中，用两个标记物标记肽，一个在N-末端，一个在C-末端赖氨酸。
图25a显示用TMT 0标记的肽的MS/MS图谱，图25b显示用TMT六聚体(TMT6-131)标记的肽的MS/MS图谱。由于各肽连接了两个质量标签，质量差异为10Th。
图26显示图25a的y3-离子的放大图，图26b显示图25b的y3-离子的放大图。各y3-离子包含一个完整的质量标签，如图26a和图26b中y3-离子之间5Th的差异所示。
图27显示图25a的y5-离子的放大图，图27b显示图25b的y5-离子的放大图。各y5-离子包含一个完整的质量标签，如图27a和图27b中y5-离子之间5Th的差异所示。
图28显示图25a的b7-离子的放大图，图28b显示图25b的b7-离子的放大图。各b7-离子包含一个完整的质量标签，如图28a中b7-离子和图28b中b7-离子之间5Th的差异所示。
图26-28显示MS/MS之后，肽的许多不同片段离子仍包含一个完整的质量标签，因此，任何这些离子可在MS/MS/MS中选择并断裂以提供适于精确定量肽的质量报道基团。
实施例6-标记肽LVTDLTK的MS/MS分析
用两个质量标签标记肽LVTDLTK。一个肽试样用质量标签TMT 0(总质量224Da)标记，一个试样用TMT六聚体(TMT6-128；总质量229Da)标记。TMT 0和TMT6-128标记肽连接有两个质量标签，一个在N-末端，一个在赖氨酸处，从而在两个标记的肽之间产生10Da的质量差异。
然后可将差异性标记的试样混合在一起，通过MS分析。图29a显示m/z619.4(TMT 0标记的肽)和m/z 624.4(TMT6-128标记的肽)的双重荷电前体离子的质谱图。两种标记的肽之间10Da的质量差异在该双重荷电前体之间产生的m/z差异是5Th。
实施例7-标记肽HPDYSVVLLLR的MS/MS分析
如实施例6所述，用两个质量标签TMT 0和TMT6-128标记肽HPDYSVVLLLR。TMT 0和TMT6-128标记的肽在N-末端连接有一个标签，从而在两个标记肽的之间产生5Da的质量差异。
图29b显示m/z 512.62(TMT 0标记肽)和m/z 514.30(TMT6-128标记肽)的三重荷电前体离子的MS图谱。两种标记的肽之间5Da的质量差异在该三重荷电前体之间产生的m/z差异是1.66Th。
实施例8-通过色谱和MRM分析标记的血浆肽
用质量标签TMT 0和TMT6-127标记下表3所示的血浆肽A-M将标记的肽样品以1∶1的比例混合，在第一中情况中，利用4000QTRAP通过独立数据获取(ida)进行分析以获得MS/MS片段离子信息。这是为测定TMT 0和TMT6-127标记所选肽的最佳Q1(在本发明方法的步骤c)中选择的前体离子)和Q3(在步骤e)中选择的MS/MS片段离子)转变以便在步骤f)-h)中进行后续分析(MS/MS/MS)。还测定了使肽断裂以便最佳检测Q3转变的碰撞能量。
通过质谱法作分析前，通过与质谱仪连接的反相色谱拆分标记的肽样品。从ida分析测定色谱特性(保留时间)。
表3列出了TMT 0和TMT6-127标记肽集合的不同Q1和Q3转变，还给出了标记的前体离子的电荷状态和各肽的保留时间。TMT 0和TMT6-127标记的肽之间Q1和Q3转变不同；这取决于连接于前体离子的标签数量及其电荷状态(Q1转变)和连接于片段离子的标签数量(Q3转变)。在所有情况中，Q3转变是单荷电的。表3所列信息是通过本发明方法检测选择的多肽所需。
图30显示表3的TMT 0和TMT6-127标记肽的MRM离子色谱，其中所述标记肽运行30分钟梯度，1μg蛋白质载荷o/c(标记肽的各500ng试样)。从图30可见以1∶1比例混合的标记肽共同洗脱。
表3
实施例9-
为证明联用TMT 0和TMT六聚体(TMT6-127)标记肽和MRM作定量测定的精确性和重现性，以不同比例混合TMT 0和TMT6-127标记的血浆肽并评估标记肽转变A-M(表3)的MRM转变。以1∶1、3∶1、9∶1和27∶1的比例混合TMT 0：TMT6-127标记样品；各比例一式三份分析。图31a到d显示所选肽K在检测的不同比例下的MRM离子色谱。
利用自动峰积分工具，通过提取各TMT 0和TMT6-127MRM转变的峰面积来比较所有肽转变A-M(表3)的比例。表4显示所有选择的肽的观察平均值(三次检测的平均值)和各自的变异系数。列出各肽在反相柱上的保留时间(括号中1-13编号)。可以看到观察平均比例与预期比例极其良好地相关。此外，82％的观察比例具有低于5％的变异系数(一式三份检测)。与预期比例显示最大偏差并具有较高变异系数的观察比例可解释为这些检测值是来自疏水性更高的肽(最高保留时间)。由于这些肽与反相树脂结合较强以及乙腈浓度较高，观察到这些肽的峰形衰退，乙腈是洗脱这些肽所需的洗脱溶剂，导致电喷雾不稳定。因此，保留时间较早的肽对于该方法是最佳的。
如图32所示，以肽K为例，观察比例与观察比例极其良好地相关。峰面积上2x10e4-8x10e5的范围显示线性关系(R2＝0.9998)。重复分析之间也观察到低变异系数(表4)。
表4
表4续

Claims (41)

1.一种检验靶分析物的方法，该方法包括：
(a)提供多个样品，其中各样品用质量标签或质量标签的组合作差异性标记从而形成多个标记样品，所述质量标签来自质量标签的集合，各质量标签是包含质谱上不同的质量标记物基团的同量异序质量标签，从而能通过质谱法区分这些样品；
(b)混合所述多个标记样品以产生分析混合物并将所述分析混合物引入质谱仪；
(c)选择具有第一质荷比的离子，该第一质荷比等于用特定数量的质量标签标记的靶分析物的离子；
(d)使具有该第一质荷比的离子断裂成多个片段离子，其中所述多个片段离子的一部分包含至少一个完整的质量标签；
(e)选择具有第二质荷比的离子，该第二质荷比等于包含至少一个完整质量标签的靶分析物的片段的离子；
(f)使具有该第二质荷比的离子断裂成多个其它片段离子，其中所述其它片段离子的一部分是所述质量标记物基团的离子；
(g)产生在步骤(f)中产生的其它片段离子的质谱图；和
(h)由所述质谱图测定各样品中靶分析物的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，一个样品是测试样品，一个样品是校准样品，其中所述校准样品包含靶分析物的一个或多个不同试样，各试样具有已知量的该分析物，其中所述测试样品和所述校准样品的各试样作差异性标记。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括为各靶分析物重复步骤(c)到(h)的步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，一个样品是测试样品并提供各不同分析物的校准样品，其中各校准样品包含靶分析物的一个或多个不同试样，其中所述测试样品和各校准样品的各试样作差异性标记。
5.如权利要求2或权利要求4所述的方法，其特征在于，所述校准样品或各校准样品包含所述靶分析物的两个或更多个不同试样。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，为分析物检验多个测试样品。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，为同一分析物检验所述多个测试样品的每一个。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，用一个或多个所述同量异序质量标签差异性标记各测试样品。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤(a)之前用一个或多个同量异序质量标签差异性标记各测试样品和校准样品各试样的其它步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(a)之前还包括混合差异性标记的试样以产生校准样品的其它步骤。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个样品是测试样品。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(h)中测定的量是各样品中靶分析物的相对量。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(h)中测定的量是各样品中靶分析物的绝对量。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(d)之后还包括产生步骤(d)的多个片段离子的质谱图的其它步骤。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，通过鉴定步骤(d)所得多个片段离子的质谱图中靶分析物的一个或多个特征性片段离子来测定该靶分析物的身份。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(f)后还包括选择质荷比范围等于质量标记物基团的质荷比范围的离子的其它步骤。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述第一质荷比等于用特定数量质量标签标记的靶分析物的未断裂母体离子的质荷比。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述第一质荷比等于用特定数量质量标签标记的靶分析物的片段离子的质荷比。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，所述第二质荷比等于包含至少一个完整质量标签的靶分析物的片段离子，该片段离子是该靶分析物独有的。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，所述第二质荷比是包含完整质量标签的一个y-系列离子的质荷比。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，所述第二质荷比是包含完整质量标签的一个b-系列离子的质荷比。
22.如权利要求20或权利要求21所述的方法，其特征在于，与在步骤(c)中选择的第一质荷比相比，所述y-系列离子或b-系列离子具有较高的质荷比。
23.如权利要求1的方法，其特征在于，所述靶分析物选自蛋白质、肽、氨基酸或核酸、或它们的片段。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶分析物是多肽。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在质谱仪的不同四极中进行步骤(c)-(g)。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在质谱仪的同一区域中顺序进行步骤(c)-(g)。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品之一包含含有触发分析物的触发试样，所述方法在步骤(b)之后和步骤(c)之前还包括检测质荷比等于所述触发分析物质荷比的离子的其它步骤，其中检测到质荷比等于所述触发分析物质荷比的离子时，步骤(c)启动。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，用同量异序质量标签标记所述触发试样中的触发分析物。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，用化学上相同但同位素不同并且质量与所述样品中其它分析物的同量异序质量标签不同的质量标签标记所述触发试样中的触发分析物。
30.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质量标签包含以下结构：
X-L-M
式中，X是包含以下基团的质量标记物部分：
式中，环状单元是芳族或脂族，在任两个毗邻原子之间独立包含0-3个双键；各Z独立为N、N(R1)、C(R1)、CO、CO(R1)、C(R1)2、O或S；X是N、C或C(R1)；各R1独立为H、取代或未取代的直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的脂族环状基团、取代或未取代的芳族基团或取代或未取代的杂环基团；和y是0-10的整数，L是可切割接头，M是质量标准化部分。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，将所述质量标记物部分连接于所述质量标准化部分的所述可切割接头是通过碰撞切割的接头。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述接头利用质谱法通过CID、ETD、ECD或SID切割。
33.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述标记步骤包括将所述分析物与反应活性质量标签反应的步骤，其中所述反应活性质量标签包含质量标签和反应活性官能团。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述反应活性官能团能是能够与多肽上的任何氨基反应的亲核官能团或亲电官能团。
35.如权利要求33或权利要求34所述的方法，其特征在于，所述质量标签是标记和通过质谱法检测多肽的反应活性质量标签，其中所述质量标签包含将所述质量标签连接于多肽的反应活性官能团，所述反应活性官能团包含以下基团：
式中，各R2独立为H、取代或未取代的直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的脂族环状基团、取代或未取代的芳族基团或取代或未取代的杂环基团。
36.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述质量标签是来自两种或更多种质量标签的集合的质量标签，其中各质量标准化部分确保所述质量标签具有所需合计质量，其中该集合包含具有质量标记物部分的质量标签，各质量标记物部分具有不同于该集合中所有其它质量标记物基团的质量，该集合中各标记物具有共同的合计质量；其中质谱学显示该集合中所有质量标签彼此不同。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述集合中的各质量标签具有选自以下的质量调节部分：
(a)位于质量标记物部分内和/或质量标准化部分内的同位素取代基，和
(b)与质量标记物部分和/或质量标准化部分相连的取代基原子或基团。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述质量调节部分选自：卤素原子取代基、甲基取代基和2H、15N、18O或13C同位素取代基。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述质量调节部分是15N或13C，该集合包含具有以下结构的两种质量标签：
40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述质量调节部分是15N和13C，该集合包含具有以下结构的五种质量标签：
41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述质量调节部分是15N和13C，该集合包含具有以下结构的六种质量标签：
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