CN102070687A - 一种从土茯苓中提取落新妇苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从土茯苓中提取落新妇苷的方法，工艺以土茯苓为原料，热水超声提取，提取液浓缩至浸膏，加5％NaHCO3溶液搅拌，过滤，得澄清液，加酸沉淀，滤出沉淀，以氯仿-甲醇-正丁醇-水为两相溶剂系统，采用高速逆流色谱分离纯化，流出物脱溶后用热水溶解，放冷析晶，滤出结晶干燥即得产品。采用该法生产落新妇苷操作方便，成本低，无污染，工艺专属性强，收率高，纯度高。
Description
技术领域：
本发明属于天然植物提取领域，涉及一种从土茯苓中提取落新妇苷的方法，尤其涉及一种应用高逆流色谱法分离落新妇苷的方法。
背景技术：
土茯苓为百合科菝莫属植物光叶菝葜(Smilax glabra Roxb.)的干燥根茎，具有除湿、解毒、通利关节之功效，用于湿热淋浊，梅毒以及汞中毒所致的肢体拘挛，筋骨疼痛等症。土茯苓主要有效成分为皂苷和黄酮类化合物。据报道，土茯苓水提物有明显的抗炎作用，从土茯苓中提取分离的落新妇苷具有明显的利尿及镇痛作用。
落新妇苷，即花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，黄酮苷类，易溶于沸水，几乎不溶于乙醚。落新妇苷具有多种显著的生物学活性，包括抑制辅酶A还原酶，抑制醛糖还原酶，保护肝脏，镇痛，抗水肿等。近年又来有报道称落新妇苷有显著的选择性免疫抑制作用，且它的选择性作用与以往的免疫抑制剂相比具有明显优势，因此可以作为一种新的免疫抑制剂用于免疫相关疾病的治疗。张笑彦等“高效液相色谱法测定不同产地土茯苓药材中落新妇苷的含量”，研究显示，落新妇苷在土茯苓药材中含量在0.5-1.5％。
有关落新妇苷提取工艺的报道较少，多数为总苷提取工艺，专属性不强，如中国专利(申请号：200910043236)“土茯苓皂甙、黄酮类提取物及其制备方法”，采用醇提和有机溶剂萃取的方法，该方法得到的黄酮提取物中新落妇苷含量少，只适合粗提或总提取物的制备。
中国专利(申请号：200910194385.9)“测定土茯苓乙醇水溶液提取物中的总苷有效成分的方法”通过醇提、硅胶层析的方法得到了苷类物质，但落新妇苷含量较低；有些只研究了部分提纯方法，还不能构成完整的工艺，如王晋黄等“土茯苓中提取总黄酮的工艺研究”；还有许多来源于测定方法，无法用于生产，如陈幸等“HPLC法测定土茯苓中落新妇苷的含量”。
中国专利(申请号：200510040944.2)“一种落新妇苷的制备方法”，公开的方法是将药材粉碎，经过两种浓度乙醇水溶液分别渗漉提取，90％-95％重量的乙醇水提取液经石油醚脱脂后浓缩成浸膏，浸膏醇沉后，其母液与20％-80％重量乙醇水提取液合并，浓缩后用含乙醇的乙酸乙酯液萃取，萃取物经醇沉后与前述沉淀混合，溶解后过大孔吸附树脂或聚酰胺柱，20％-80％重量乙醇水溶液洗脱，洗脱液经重结晶后得落新妇苷，该方法有机溶剂使用量大，周期长，步骤繁复，不易于大规模生产。
发明内容：
发明人经工艺优化试验，发明了一种从土茯苓中提取落新妇苷的方法。该工艺简单易操作，生产时间短，产品收率高，生产成本低。
本发明是采用以下技术方案实现的：
一种从土茯苓中提取落新妇苷的方法，其特征在于包含以下步骤：
1)提取：将干燥土茯苓粉碎至20-30目，加5-8倍(V/W)热水超声提取，合并提取液，浓缩，得浸膏；
2)碱溶：上述浸膏加5％NaHCO3溶液至pH8-10，过滤，得澄清液；
3)酸沉：上述澄清液加酸至不再产生沉淀，过滤得到沉淀物；
4)高逆流色谱分离：上述沉淀物用下相溶解，通过高逆流色谱柱分离，收集落新妇苷流分；
5)结晶：上述流分脱溶后，加热水溶解，放冷结晶，重复2-3次，干燥即得产品。
所述步骤1)中超声提取频率为20-35KHz，提取2-3次，每次1-2小时。
所述步骤3)中酸为1mol/L盐酸或0.5mol/L硫酸溶液。
所述步骤4)中高逆流色谱以氯仿-甲醇-正丁醇-水为两相溶剂系统，体积比为6-10∶5-7∶2-5∶8-12，以下相为流动相，上相位固定相，色谱仪转速为750～1000r/min，流动相的流速为1.5～3.5ml/min。
综上所述，本发明存在以下优点：
1、加碱可以使游离的落新妇苷溶解，除去大量杂质。
2、本发明采用HSCCC，分离效果好，溶剂用量小，无需使用载体，减少了过程中的损失。
3、本工艺对落新妇苷的提纯专属性高。
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施方式：
实施例1：
取土茯苓2kg，粉碎至20目，加入16L水，超声提取1小时，提取3次，合并提取液，浓缩至浸膏，加5％NaHCO3溶液至pH8，过滤，得澄清液，加1mol/L盐酸至不再产生沉淀，过滤得到沉淀物，取氯仿-甲醇-正丁醇-水按体积比6∶5∶2∶8，超声波振荡混合，转移至分液漏斗，静置分层，分出上下相，以上相为固定相，下相为流动相。上述结晶物用350ml下相溶解，将上相用泵以10ml/min的流量灌满色谱柱，将柱的首端与进样阀相接，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为750r/min时，以流速为2.5ml/min泵入流动相，并通过进样阀进样，每次进样量为150mg，收集流出液，脱溶后溶于220ml热水，放冷结晶，养晶2小时，重复3次，滤出低温干燥，得产品4.7g，含量97.2％。
实施例2：
取土茯苓2kg，粉碎至20目，加入12L水，超声提取2小时，提取2次，合并提取液，浓缩至浸膏，加5％NaHCO3溶液至pH10，过滤，得澄清液，加0.5mol/L硫酸至不再产生沉淀，过滤得到沉淀物，取氯仿-甲醇-正丁醇-水按体积比10∶7∶5∶12，超声波振荡混合，转移至分液漏斗，静置分层，分出上下相，以上相为固定相，下相为流动相。上述结晶物用300ml下相溶解，将上相用泵以10ml/min的流量灌满色谱柱，将柱的首端与进样阀相接，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为1000r/min时，以流速为3.5ml/min泵入流动相，并通过进样阀进样，每次进样量为200mg，收集流出液，脱溶后溶于ml热水，放冷结晶，养晶2.5小时，重复2次，滤出低温干燥，得产品3.9g，含量96.5％。
实施例3：
取土茯苓2kg，粉碎至30目，加入15L水，超声提取1小时，提取3次，合并提取液，浓缩至浸膏，加5％NaHCO3溶液至pH9，过滤，得澄清液，加1mol/L盐酸至不再产生沉淀，过滤得到沉淀物，取氯仿-甲醇-正丁醇-水按体积比8∶5∶2∶8，超声波振荡混合，转移至分液漏斗，静置分层，分出上下相，以上相为固定相，下相为流动相。上述结晶物用400ml下相溶解，将上相用泵以10ml/min的流量灌满色谱柱，将柱的首端与进样阀相接，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为950r/min时，以流速为2ml/min泵入流动相，并通过进样阀进样，每次进样量为200mg，收集流出液，脱溶后溶于200ml热水，放冷结晶，养晶3小时，重复3次，滤出低温干燥，得产品4.8g，含量97.4％。
实施例4：
取土茯苓2kg，粉碎至30目，加入10L水，超声提取2小时，提取2次，合并提取液，浓缩至浸膏，加5％NaHCO3溶液至pH8.5，过滤，得澄清液，加1mol/L盐酸至不再产生沉淀，过滤得到沉淀物，取氯仿-甲醇-正丁醇-水按体积比8∶7∶3∶10，超声波振荡混合，转移至分液漏斗，静置分层，分出上下相，以上相为固定相，下相为流动相。上述结晶物用300ml下相溶解，将上相用泵以10ml/min的流量灌满色谱柱，将柱的首端与进样阀相接，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为800r/min时，以流速为1.5ml/min泵入流动相，并通过进样阀进样，每次进样量为250mg，收集流出液，脱溶后溶于280ml热水，放冷结晶，养晶3小时，重复2次，滤出低温干燥，得产品4.2g，含量98.8％。
实施例5：
取土茯苓2kg，粉碎至30目，加入10L水，超声提取2小时，提取2次，合并提取液，浓缩至浸膏，加5％NaHCO3溶液至pH10，过滤，得澄清液，加0.5mol/L硫酸至不再产生沉淀，过滤得到沉淀物，取氯仿-甲醇-正丁醇-水按体积比9∶6∶3∶10，超声波振荡混合，转移至分液漏斗，静置分层，分出上下相，以上相为固定相，下相为流动相。上述结晶物用350ml下相溶解，将上相用泵以10ml/min的流量灌满色谱柱，将柱的首端与进样阀相接，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为850r/min时，以流速为3ml/min泵入流动相，并通过进样阀进样，每次进样量为200mg，收集流出液，脱溶后溶于200ml热水，放冷结晶，养晶3小时，重复3次，滤出低温干燥，得产品5.2g，含量98.0％。
Claims (4)
1.一种从土茯苓中提取落新妇苷的方法，其特征在于包含以下步骤：
1)提取：将干燥土茯苓粉碎至20-30目，加5-8倍(V/W)热水超声提取，合并提取液，浓缩，得浸膏；
2)碱溶：上述浸膏加5％NaHCO3溶液至pH8-10，过滤，得澄清液；
3)酸沉：上述澄清液加酸至不再产生沉淀，过滤得到沉淀物；
4)高逆流色谱分离：上述沉淀物用下相溶解，通过高逆流色谱柱分离，收集落新妇苷流分；
5)结晶：上述流分脱溶后，加热水溶解，放冷结晶，重复2-3次，干燥即得产品。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)中超声提取频率为20-35KHz，提取2-3次，每次1-2小时。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中酸为1mol/L盐酸或0.5mol/L硫酸溶液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)中高逆流色谱以氯仿-甲醇-正丁醇-水为两相溶剂系统，体积比为6-10∶5-7∶2-5∶8-12，以下相为流动相，上相位固定相，色谱仪转速为750～1000r/min，流动相的流速为1.5～3.5ml/min。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110525 |