CN102058874A

CN102058874A - 一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽疫苗

Info

Publication number: CN102058874A
Application number: CN 201010616674
Authority: CN
Inventors: 吕凤林; 田菲菲; 杨力
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2011-05-18

Abstract

一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物，涉及一种生物医学领域，特别是一种关于人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽疫苗。其特征在于它的氨基酸序列为：KLPQLCTEL；利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，将多个氨基酸序列所形成的特殊连接方式。本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破带有人乳头瘤病毒16型相关肿瘤标志的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。

Description

一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽疫苗

(一)、技术领域

本发明涉及一种生物医学领域，特别是一种关于人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽疫苗。

(二)、背景技术

人乳头瘤病毒的英文全称是human papilloma virus，简称HPV。

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，全球范围内，宫颈癌是女性癌症死因的第二杀手，每年新增约50万病例，其中有20％发生在中国。好发年龄呈双峰状，35～39岁和60～64岁。近年已明确，几乎所有的宫颈癌都由人乳头瘤病毒引起。其中，超过2/3的宫颈癌病例可归咎于两种类型的HPV：16型和18型。

发生宫颈癌的病因至今尚未完全明了，可能与性生活紊乱，过早性生活，早年分娩，多产，地理环境等因素有关。分子生物学研究结果显示90％以上的宫颈癌伴有HPV感染。宫颈癌以鳞状细胞癌最为多见，其次为腺癌和腺鳞癌等。高危型人乳头瘤病毒的感染是诱发宫颈癌的必要条件，几乎所有的宫颈鳞癌中都可以检测到HPV-DNA的存在。

目前治疗宫颈癌的只能采用手术、放疗，或两者联合使用。近年来，在上述方法基础上加免疫治疗受到重视并取得较好的效果。单独应用一种治疗方法的并发症发生率为3～11％，联合应用两种治疗方法的并发症发生率达到30％或以上。手术和放疗各有优缺点。目前的趋势是强调综合治疗，把手术、放疗和化疗进行有机的结合，以达到提高治疗效果、改善生活质量、减低并发症、尽可能保留生育功能和卵巢功能的目的。

综合治疗宫颈癌的方法，归纳起来有以下几种：

1)手术治疗法：切除标本的正常组织边缘距离肿瘤病灶最少达1cm以上。其缺点是损伤大，不能凭肉眼发现受HPV病毒感染的细胞，因此，被感染的细胞清除不彻底。

2)放射治疗法：放疗包括外照射和腔内放疗。适用于各期患者，常和手术、化疗配合使用。该方法主要缺点是：虽然能够杀死受HPV病毒感染的细胞，但是，射线对正常组织细胞损伤较大。

3)化学治疗法：化疗可用于术前、术后，或放疗前后，也常与放疗同时进行，以提高放疗的疗效。迄今为止，已报道有54种细胞毒药物用于进展或复发宫颈癌的化疗，单药化疗以顺铂的研究最广泛，疗效也最肯定。该方法主要缺点是：虽然能够杀死受HPV病毒感染的细胞，但是，化疗药物对正常组织细胞的毒性较大，出现诸如过敏性休克、呕吐、白细胞减少、抵抗力下降等副作用。

(三)、发明内容

本发明的目的就是提供一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽疫苗，它可以专门针对受HPV16型病毒感染的细胞进行有效地破坏，而且对人体无毒副作用。

本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，它的氨基酸序列为：KLPQLCTEL；利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。

正常人体的外周血单核细胞(简称PBMC)一般不具有特异性溶破受到HPV16型病毒感染的细胞的功能，本发明提供的多肽在体外与HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞共同孵育，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量50％-80％，还可以诱导激活CTL溶破HPV16型阳性的肿瘤细胞，溶破率为60％-90％。

本发明的基本的氨基酸序列来源于GENBANK报道的氨基酸序列，采用蛋白质表位分子设计的原理和方法，对HPV16型的E6蛋白序列进行CTL表位分析，主要是基于量化基序法确定E6蛋白的CTL表位，具体做法是：从E6蛋白第1位氨基酸残基开始，逐个截取九肽段或十肽段，共获得300条九肽段和350条十肽段。对于每一条肽段，在结合矩阵中查找各位点氨基酸残基的结合系数，这九肽或十肽结合系数相乘后再乘以标准系数，即为该九肽或十肽与HLA-A*0201的结合系数。最后，选取结合系数最高的几条肽段作为候选CTL表位。以此方法找到了具有功能的本发明所述的氨基酸序列，即：KLPQLCTEL。

合成本发明所述的氨基酸序列的方法均是现有的成熟技术，它是按照如下的方法制成的：

采用标准Fmoc方案，起始选用0.0125mmol，PSC树脂(ABI公司生产，批号A5F013)，分别按照权利要求1、2、3或4所述的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国ABI公司生产)的用量为0.1mmol。各种氨基酸保护基团是：各氨基酸的alpha氨基为Fmoc保护，其余侧链保护基团，Arg(Mtr)、Tyr(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)、Asp(OtBu)。每步缩合都加入HoBt/Dcc活化保护氨基酸的羧基。每步缩合用含有20％六氢吡啶的NMP溶液去除Fmoc保护基，肽链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分：结晶苯酸0.75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)0.5ml、去离子水0.5ml、三氟乙酸10ml。

在室温条件下持续搅拌，反应时间为4.5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至1～2ml，加乙醚50ml使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是肽产品。以上过程都是在ABI-431A固相自动肽合成仪(美国生产)上完成。

本发明涉及的合成多肽药物或疫苗可以室温保存、运输，也可以自动化批量生产。

使用现有的成熟技术，制备表达HPV16型E6蛋白的靶细胞，叫Caski细胞；

按照本领域公知的方法获得HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞(简

称PBMC)；

培养上述PBMC细胞24小时后，取悬液(2×10⁶/ml)4瓶。加入本发明所述的氨基酸序列多肽(20μg/ml)，加入等量完全培养基作为对照组，37℃，5％CO2环境下孵育。7天后重复该刺激过程，共反复刺激3次。最末一次刺激后第3天收集悬浮细胞，这些细胞具有针对HPV16型E6蛋白的靶细胞的细胞毒性(CTL细胞)，计数检测发现：使用本发明涉及的合成多肽药物或疫苗可以使CTL细胞数量较对照组增加50％-80％。

将转染了HPV16之E6基因的Caski细胞与上述CTL细胞共同孵育，发现该CTL细胞可以溶破转染了HPV16之E6基因的Caski细胞，溶破率得到60％-90％。

由于采用了上述技术方案，本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破具有人乳头瘤病毒16型相关肿瘤标志的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。

(四)具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

本发明的氨基酸序列为：KLPQLCTEL；利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。

该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高50％-80％，还可以激活CTL溶破带HPV16E6标志的细胞，溶破率为60％-90％。

实施例1：它的氨基酸序列可以为：

上述多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高60％，还可以激活CTL溶破带HPV16E6标志的细胞，溶破率为87.38％。

实施例2：它的氨基酸序列也可以为：

上述多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高50％，还可以激活CTL溶破带HPV16E6标志的细胞，溶破率为77.83％。

实施例3：它的氨基酸序列也可以为：

上述多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高50％，还可以激活CTL溶破带HPV16E6标志的细胞，溶破率为78.90％。

以上所述的氨基酸序列的制备方法均是现有的成熟技术，它是按照如下的方法制成的：

采用标准Fmoc方案，起始选用0.0125mmol，PSC树脂(ABI公司生产，批号A5F013)，分别按照权利要求1、2、3或4所述的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国ABI公司生产)的用量为0.1mmol。

各种氨基酸保护基团是：各氨基酸的alpha氨基为Fmoc保护，其余侧链保护基团，Arg(Mtr)、Tyr(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)、Asp(OtBu)。每步缩合都加入HoBt/Dcc活化保护氨基酸的羧基。每步缩合用含有20％六氢吡啶的NMP溶液去除Fmoc保护基，肽链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分：结晶苯酸0.75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)0.5ml、去离子水0.5ml、三氟乙酸10ml。在室温条件下持续搅拌，反应时间为4.5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至1～2ml，加乙醚50ml使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是肽产品。以上过程都是在ABI-431A固相自动肽合成仪(美国生产)上完成。

下面结合实验例对本发明作如下说明：

实验例1制备表达HPV16E2蛋白的靶细胞模型(Caski细胞)

1、主要仪器：微量高速冷冻离心机；MJ.Research PCR扩增仪；凝胶成像分析系统；电泳系统；FX-302型暗箱式紫外检测仪；YJ-875SA型超净工作台；THZ-C恒温振荡器；FA 1004电子天平；康乐电热恒温水浴箱；￠300型pH计。

2、主要材料：1)菌株：E.coli DH5α。2)质粒：pBR322/HPV16为含目的基因HPV16E2的重组质粒；pIRES2-EGFP为含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体，含有Kana抗性基因。购自Clontech公司。

3、主要溶液配制：

1)LB培养液：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶于800ml ddH2O中，用5M NaOH调整pH至7.4，定容至1000ml，分装成100ml后，高压蒸气灭菌，4℃保存。

2)LB固体培养基：100ml LB培养液中加入1.8g琼脂粉，高压蒸气灭菌后，铺板，4℃保存。

3)LB琼脂+Amp培养液：配制LB，高压消毒。冷却至50℃左右，加Amp使终浓度为100μg/ml，4℃保存。

4)LB琼脂+Amp固体培养基：配制LB固体培养基，高压消毒。冷却至50℃左右，加Amp使终浓度为100μg/ml，铺板，4℃保存。

5)LB琼脂+Kana培养液：配制LB，高压消毒。冷却至50℃左右，加Kana使终浓度为50μg/ml，4℃保存。

6)LB琼脂+Kana固体培养基：配制LB固体培养基，高压消毒。冷却至50℃左右，加Kana使终浓度为50μg/ml，铺板，4℃保存。

7)电泳缓冲液(50×TAE)：Tris碱24.2g，0.5M EDTA(pH8.0)10ml，冰乙酸5.71ml，加水至100ml。应用浓度为1×TAE。

8)溴化乙锭(EB)：在20mlH2O中溶解0.2gEB，混匀后于4℃避光保存。

9)0.1M CaCl2：CaCl2·2H2O 1.47g，溶解于100ml水中，高压消毒，4℃保存。

4、反应体系：

P1(10μmol/L) 1μl

P2(10μmol/L) 1μl

dNTP(2.5mM) 1μl

10×Buffer 5μl

MgCl₂(25mM) 3μl

pBR322/HPV16 1μl

pfu Taq(5u/μl) 1μl

ddH₂O up to 50μl

5、反应条件：

1cycle 94℃ 2min

30cycle 94℃ 50sec

54℃ 30sec

72℃ 2min

1cycle 72℃ 10min

4℃ Hold

反应完毕后取4μl反应产物，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

6、Caski细胞的培养：

1)细胞寄到后，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，在倒置显微镜下观察，待细胞贴壁至80-90％的时候，进行传代培养。

2)弃去细胞培养液，PBS洗涤2～3遍。

3)用0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化至悬浮状态迅速加入含血清的1640培养基终止消化。

4)500rpm/min离心5min。

5)弃上清，加入新鲜培养基4mL，吹打重悬细胞。

6)分装至3个培养瓶内，每个培养瓶内再加入2mL培养基。

7、质粒DNA转染Caski细胞：

细胞准备收获处于指数生长期细胞约1×10⁵个细胞接种于6孔细胞培养板中，使细胞达到40-60％融合，置于37℃、5％CO2培养箱中，无血清培养24小时。转染48小时后，将6孔培养板直接置于荧光显微镜下，在479nm的激发波长下激发绿色荧光，观察绿色荧光蛋白EGEP以及HPV16E6在细胞中的定位和表达情况。

实验例2体外诱导特异性性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)

1、试剂和材料

1)含10％胎牛血清的RPMI1640培养基。

2)PBS洗涤液。

3)重组人白介素(recombinant human IL-2)。

4)规格为1毫升和10毫升的刻度吸管。

5)75％酒精，无菌棉球，镊子。

6)显微镜、水平式离心机。

7)HLA-A*0201阳性人体血液20mL(4×5mL)。按照本领域公知的方法获得外周血单核细胞(PBMC)。

2、方法：

培养PBMC细胞24小时后，取悬液(2×10⁶/ml)4瓶。加入本发明所述的基本的氨基酸序列多肽(20μg/ml)和等量完全培养基，同时培养瓶内加入rhIL-2使终浓度为50U/mL、37℃、5％CO2下孵育。7天后重复该刺激过程，共刺激3次。每次刺激之间，视情况加入新鲜RPMI1640培养基，每一次刺激时均需吹打贴壁细胞至悬浮状态，洗涤，换培养瓶。按照该方法便可以得到细胞毒性CTL细胞。

实验例3 ⁵¹Cr释放试验检测CTL细胞溶破Caski细胞的能力

1、主要仪器：YJ-875SA型超净工作台；水平式离心机；康乐电热恒温水浴箱；恒温孵箱；γ-计数仪

2、主要实验材料：靶细胞为转染了HPV16之E6基因的Caski细胞；效应细胞为本发明所述的基本的氨基酸序列多肽与重组人IL-2协同刺激

人外周血单个核细胞()后得到的T淋巴细胞。放射性同位素Na₂ ⁵¹Cr O₄；RPMI1640培养基；盐酸(HCl)；规格为6孔、96孔培养瓶。

3、靶细胞准备：收获处于对数生长期的靶细胞(转染了pIRES2-EGFP-HPV16E6质粒的Caski细胞)，洗涤后调整细胞浓度为2×10⁶/ml。取1×10⁶细胞(0.5ml)，加Na₂ ⁵¹Cr O₄100μci，37℃孵育2～3h，每15min轻轻振摇一次。用含有10％FCS的RPMI1640洗涤3次，每次800rpm离心，5min，弃上清，重悬细胞至浓度为1×10⁵/ml。96孔培养板中，每孔加100μl(1×10⁴细胞)，每份3个复孔，共42孔。

4、CTL细胞的加入：每孔加入100μl不同细胞浓度的CTL细胞，最大释放组加入100μl的1％mol/L HCL，以此溶破靶细胞效率为100％；自然释放组加100μl完全培养基，以此为阴性对照组。每孔取出100μl上清，按照本领域公知的方法在γ计数仪上测定cpm值。

结果表明：该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高50％-80％，还可以激活CTL溶破对HPV16型肿瘤细胞，溶破率为60％-90％。

Claims

1.一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽疫苗，其特征在于它的氨基酸序列为：氨基-KLPQLCTEL-羧基。

2.如权利要求1所述的治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽疫苗，利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，所形成的特殊连接方式，其特征在于它的氨基酸序列的连接形式为：

3.如权利要求1所述的治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽疫苗，利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，所形成的特殊连接方式，其特征在于它的氨基酸序列的连接形式为：

4.如权利要求1所述的治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽疫苗，利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，所形成的特殊连接方式，其特征在于它的氨基酸序列的连接形式为：

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