CN101411866A - 一种治疗高致病性禽流感病毒h5n1引发疾病的多肽药物 - Google Patents

Abstract

一种治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物，其特征在于它的氨基酸序列为：氨基端－FLNVEWSYI－羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破具有高致病性禽流感病毒H5N1之H5蛋白的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。

Description

一种治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物

(一)、技术领域

本发明涉及一种生物医学领域，特别是一种关于高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物。

(二)、背景技术

禽流行性感冒(Avian influenza)简称禽流感，是由A型流感病毒(AIV)引起的禽类广泛发生的传染病。据不完全统计，全球禽流感疫情已波及47个国家和地区，人发禽流感病例已达195起以上，其中死亡至少110人，死亡率高达56.4％。1997年在香港发生的禽流感引起了人的发病和死亡，从而引起了全世界的高度重视。AIV依据其血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原性的差异目前可分为16个H亚型(H1～H16)和10个N亚型(N1～N10)[Alexander DJ.A review of avian influenza in different birdspecies.Vet Microbiol，2000，74(1-2)：3-13]。根据禽流感病毒毒力和致病性的不同，可以将其分为高致病性、低致病性和无致病性三类。H7、H5亚型所致禽类疾病具有传播快、危害大、病情凶险等特征，除急性呼吸道炎症外，常伴有全身出血性改变，心、肺、肾等多脏器衰竭，死亡率达100％，故称为高致病性禽流感(highlypathogenic avian influenza)，目前将H5N1归为高致病性禽流感病毒。

对于人类而言，最大的威胁在于，如果同时感染人类流感病毒和禽流感病毒，就有可能在体内重组成可以在人类之间互相传播的新型病毒，而人们对此几乎没有免疫力，那势必将导致又一次的流感大流行。由于水禽和飞禽是AIV的天然宿主，这种病毒的长期存在，将为其与感染人或其他哺乳动物的流感病毒混合、产生新毒株提供条件。目前针对AIV的疫苗或者药物主要有以下几种：

1、质粒疫苗：Lalor PA等对比了分别构建的HA、NP(核蛋白)、M2基因的质粒疫苗的免疫效果。三种疫苗都对实验鼠和雪貂有明显的保护效果，而同时构建了NP和M2基因的疫苗效果最佳【Lalor PA，Webby RJ，Morrow J.Plasmid DNA-based vaccines protect mice andferrets against lethal challenge with A/Vietnam/1203/04(H5N1)influenza virus.J Infect Dis.2008；197(12)：1643-1652】。LiC等构建了优化后的质粒疫苗：H5N1/PR8-5B19。该疫苗包括H5N1病毒的HA和NA基因。并对HA和NA基因做了修饰-修改了HA切割位点使其和低致病性情流感相似、将NA的茎区用鼠肝炎病毒的S2糖蛋白的5B19表位代替，以降低其致病性和增强其免疫原性。最后该疫苗表现出较强的体液免疫应答，对实验鸡产生了较好的免疫保护【LiC，Ping J，Jing B.H5N1 influenza marker vaccine for serologicaldifferentiation between vaccinated and infected chickens.Biochem Biophys Res Commun.2008；372(2)：293-297.】。

2、重组体疫苗

Wei CJ等系统分析了几种不同形式的重组体HA蛋白应用为疫苗的潜力。单体、三聚体和低聚体的H5N1HA蛋白从细胞分理处分离出，采用中和抗体反应对其免疫原性进行评估。结果：高分子量的低聚体HA蛋白疫苗引发的抗体反应最强烈，三聚体次之，单体最弱【Wei CJ，Xu L，Kong WP.Comparative efficacy of neutralizing antibodieselicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1influenza virus.J Virol.2008 Jul；82(13)：6200-6208】。

Watanabe等研究发现，将H5N1病毒M2羟基端切除11个氨基酸后，该病毒与野生型相比有相似的生长能力，但在小鼠体内的复制效率大大降低。作者构建了重组体病毒-VN1203M2del11，该重组病毒HA的切割位点由切除11个氨基酸后的突变体代替。结果：该疫苗对小鼠产生了较好的保护性。M2胞质尾部突变体有发展成为H5N1病毒减毒活疫苗的潜力【Watanabe T，Watanabe S，KimJH.Novel approachto the development of effective H5N1 influenza A virusvaccines：use of M2 cytoplasmic tail mutants.J Virol.2008Mar；82(5)：2486-92】。

3、病毒载体疫苗：Rmer等利用新城疫病毒作载体，表达HA免疫原作为疫苗。结果显示：这种疫苗(NDVNDVH5m)在一次免疫后就对鸡有了较好的效果。由新城疫病毒做载体的减毒疫苗对感染H5禽流感的保护水平由该疫苗与感染H5N1病毒的H5序列的同源性大小决定【Rmer-Oberd，rfer A，Veits J.Level of protection of chickensagainst highly pathogenic H5 avian influenza virus withNewcastle disease virus based live attenuated vector vaccinedepends on homology of H5 sequence between vaccine and challengevirus.Vaccine.2008；26(19)：2307-13】。

Mar等用HIV病毒颗粒作载体，包被H5N1的HA、NA、M2基因，构建成为H5N1HaNaM-pseudotyped HIV载体系统。该载体系统可以较精确的模拟禽流感病毒在体内的反应，可代替禽流感病毒，用来评估疫苗、药物。特别在是安全性较低的实验室应用该系统有实用意义【Mar Ao Z，Patel A，Tran K.Characterization of atrypsin-dependent avian influenza H5N1-pseudotyped HIV vectorsystem for high throughput screening of inhibitorymolecules.Antiviral Res.2008 Jul；79(1)：12-8】。

Singh等将牛腺病毒AD的一个亚型(BAd3)作为载体表达H5N1的HA基因，构建成BAd-H5NA疫苗，有较好的免疫效果【Singh N，Pandey A，Jayashankar L.Bovine adenoviral vector-based H5N1influenza vaccine overcomes exceptionally high levels ofpre-existing immunity against human adenovirus.Singh Mol Ther.2008；16(5)：965-71】。

(三)、发明内容

本发明的目的就是提供一种治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物，它可以专门针对高致病性禽流感病毒H5N1型感染的细胞进行有效地破坏，而且对人体无毒副作用。

本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，它的氨基酸序列为：氨基端-FLNVEWSYI-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。

正常人体的外周血单核细胞(简称PBMC)一般不具有特异性溶破受到高致病性禽流感病毒H5N1感染的细胞的功能，本发明提供的多肽在体外与HLA-A^*0201阳性人体的外周血单核细胞共同孵育，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量45％-80％，还可以诱导激活CTL溶破受高致病性禽流感病毒H5N1感染的阳性细胞，溶破率为60％-88％。

本发明的基本的氨基酸序列来源于GENBANK报道的高致病性禽流感病毒H5N1的H5蛋白的氨基酸序列，采用蛋白质表位分子设计的原理和方法，高致病性禽流感病毒H5N1的H5蛋白序列进行CTL表位分析，主要是基于量化基序法确定H5蛋白的CTL表位，具体做法是：从H5蛋白第1位氨基酸残基开始，逐个截取九肽段或十肽段，共获得13条九肽段。对于每一条肽段，在结合矩阵中查找各位点氨基酸残基的结合系数，这九肽结合系数相乘后再乘以标准系数，即为该九肽或十肽与HLA-A^*0201的结合系数。最后，选取结合系数最高的几条肽段作为候选CTL表位。以此方法找到了具有功能的本发明所述的氨基酸序列，即：氨基端-FLNVEWSYI-羧基端。

合成本发明所述的氨基酸序列方法均是现有的成熟技术，它是按照如下的方法制成的：

采用标准Fmoc方案，起始选用0.0125mmol，PSC树脂(ABI公司生产，批号A5F013)，分别按照权利要求1、2、3或4所述的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国ABI公司生产)的用量为0.1mmol。各种氨基酸保护基团是：各氨基酸的alpha氨基为Pmoc保护，其余侧链保护基团，Arg(Mtr)、tyr(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)、Asp(OtBu)。每步缩合都加入HoBt/Dcc活化保护氨基酸的羧基。每步缩合用含有20％六氢吡啶的NMP溶液去除Fmoc保护基，肽链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分：结晶苯酸0.75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)0.5ml、去离子水0.5ml、三氟乙酸10ml。在室温条件下持续搅拌，反应时间为4.5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至1～2ml，加乙醚50ml使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是肽产品。以上过程都是在ABI—431 A固相自动肽合成仪(美国生产)上完成。

本发明涉及的合成多肽药物或疫苗可以室温保存、运输，也可以自动化批量生产。

使用现有的成熟技术，制备表达高致病性禽流感病毒H5N1感染的靶细胞，叫HEK293细胞；

按照本领域公知的方法获得HLA-A^*0201阳性人体的外周血单核细胞(简称PBMC)；

培养上述PBMC细胞24小时后，取悬液(2×10⁶/ml)4瓶。加入本发明所述的氨基酸序列多肽(20μg/ml)，加入等量完全培养基作为对照组，37℃，5％ CO2环境下孵育。7天后重复该刺激过程，共反复刺激3次。最末一次刺激后第3天收集悬浮细胞，这些细胞具有针对高致病性禽流感病毒H5N1之H5蛋白的靶细胞的细胞毒性CTL细胞，计数检测发现：使用本发明涉及的合成多肽药物或疫苗可以使CTL细胞数量较对照组增加45％-88％。

将转染了高致病性禽流感病毒H5N1之H5基因的HEK293细胞与上述CTL细胞共同孵育，发现该CTL细胞可以溶破转染了高致病性禽流感病毒H5N1之H5基因的HEK293细胞，溶破率得到60％-88％。

由于采用了上述技术方案，本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破具有高致病性禽流感病毒H5N1之H5基因的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。

(四)具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

本发明的氨基酸序列为：氨基端-FLNVEWSYI-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。

该多肽可以体外刺激HLA-A^*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高50％-80％，还可以激活CTL溶破高致病性禽流感病毒H5N1之H5基因的细胞，溶破率为60％-88％。

实施例1：它的氨基酸序列可以为：

该多肽可以体外刺激HLA-A^*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高60％，还可以激活CTL溶破对高致病性禽流感病毒H5N1之H5基因的细胞，溶破率为83.10％。

实施例2：它的氨基酸序列也可以为：

该多肽可以体外刺激HLA-A^*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高50％，还可以激活CTL溶破对高致病性禽流感病毒H5N1之H5基因的细胞，溶破率为79.0％。

实施例3：它的氨基酸序列还可以为：

该多肽可以体外刺激HLA-A^*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高55％，还可以激活CTL溶破对高致病性禽流感病毒H5N1之H5基因的细胞，溶破率为68.0％。

以上所述的氨基酸序列方法均是现有的成熟技术，它是按照如下的方法制成的：

采用标准Fmoc方案，起始选用0.0125mmol，PSC树脂(ABI公司生产，批号A5F013)，分别按照权利要求1、2、3或4所述的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国ABI公司生产)的用量为0.1mmol。各种氨基酸保护基团是：各氨基酸的alpha氨基为Pmoc保护，其余侧链保护基团，Arg(Mtr)、tyr(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)、Asp(OtBu)。每步缩合都加入HoBt/Dcc活化保护氨基酸的羧基。每步缩合用含有20％六氢吡啶的NMP溶液去除Fmoc保护基，肽链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分：结晶苯酸0.75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)0.5ml、去离子水0.5ml、三氟乙酸10ml。在室温条件下持续搅拌，反应时间为4.5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至1～2ml，加乙醚50ml使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是肽产品。以上过程都是在ABI-431A固相自动肽合成仪(美国生产)上完成。

下面结合实验例对本发明作如下说明：

实验例1：制备表达高致病性禽流感病毒H5N1之H5蛋白的靶细胞模型(HEK293细胞)

1、主要仪器：微量高速冷冻离心机；MJ.Research PCR扩增仪；凝胶成像分析系统；电泳系统；FX-302型暗箱式紫外检测仪；YJ-875 SA型超净工作台；THZ-C恒温振荡器；FA 1004电子天平；康乐电热恒温水浴箱；￠300型pH计。

2、主要材料：1)菌株：E.coli DH5α。2)质粒：HA/pIRES2-EGFP为含目的基因H5N1之H5的重组质粒；pIRES2-EGFP为含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体，含有Kana抗性基因。购自Clontech公司。

3、主要溶液配制：

1)LB培养液：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶于800mlddH2O中，用5M NaOH调整pH至7.4，定容至1000ml，分装成100ml后，高压蒸气灭菌，4℃保存。

2)LB固体培养基：100ml LB培养液中加入1.8g琼脂粉，高压蒸气灭菌后，铺板，4℃保存。

3)LB琼脂+Amp培养液：配制LB，高压消毒。冷却至50℃左右，加Amp使终浓度为100μg/ml，4℃保存。

4)LB琼脂+Amp固体培养基：配制LB固体培养基，高压消毒。冷却至50℃左右，加Amp使终浓度为100μg/ml，铺板，4℃保存。

5)LB琼脂+Kana培养液：配制LB，高压消毒。冷却至50℃左右，加Kana使终浓度为50μg/ml，4℃保存。

6)LB琼脂+Kana固体培养基：配制LB固体培养基，高压消毒。冷却至50℃左右，加Kana使终浓度为50μg/ml，铺板，4℃保存。

7)电泳缓冲液(50×TAE)：Tris碱24.2g，0.5M EDTA(pH8.0)10ml，冰乙酸5.71ml，加水至100ml。应用浓度为1×TAE。

8)溴化乙锭(EB)：在20mlH2O中溶解0.2gEB，混匀后于4℃避光保存。

9)0.1M CaCl2：CaCl2·2H2O 1.47g，溶解于100ml水中，高压消毒，4℃保存。

4、反应体系：

5、反应条件：

1cycle                 94℃    2min

30cycle                94℃    50sec

                       54℃    30sec

                       72℃    2min

1cycle                 72℃    10min

                       4℃     Hold

反应完毕后取4μl反应产物，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

6、HEK293细胞的培养：

1)细胞寄到后，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，在倒置显微镜下观察，待细胞贴壁至70-80％的时候，进行传代培养

2)弃去细胞培养液，PBS洗涤2～3遍

3)用0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化至悬浮状态迅速加入含血清的1640培养基终止消化

4)500rpm/min离心5min

5)弃上清，加入新鲜培养基4mL，吹打重悬细胞

6)分装至3个培养瓶内，每个培养瓶内再加入2mL培养基

7、质粒DNA转染HEK293细胞：

细胞准备收获处于指数生长期细胞约1×10⁵个细胞接种于6孔细胞培养板中，使细胞达到40-60％融合，置于37℃、5％CO2培养箱中，无血清培养24小时。转染48小时后，将6孔培养板直接置于荧光显微镜下，在479nm的激发波长下激发绿色荧光，观察绿色荧光蛋白EGEP以及H5N1之H5蛋白在细胞中的定位和表达情况。

实验例2：体外诱导特异性性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)

1、试剂和材料

1)含10％胎牛血清的RPMI1640培养基。

2)PBS洗涤液。

3)重组人白介素(recombinant human IL-2)。

4)规格为1毫升和10毫升的刻度吸管。

5)75％酒精，无菌棉球，镊子。

6)显微镜、水平式离心机。

7)HLA-A^*0201阳性人体血液20mL(4×5mL)。按照本领域公知的方法获得外周血单核细胞(PBMC)。

2、方法：

培养PBMC细胞24小时后，取悬液(2×10⁶/ml)4瓶。加入本发明所述的基本的氨基酸序列多肽(20μg/ml)和等量完全培养基，同时培养瓶内加入rhIL-2使终浓度为50U/mL、37℃、5％CO2下孵育。7天后重复该刺激过程，共刺激3次。每次刺激之间，视情况加入新鲜RPMI1640培养基，每一次刺激时均需吹打贴壁细胞至悬浮状态，洗涤，换培养瓶。按照该方法便可以得到细胞毒性CTL细胞。

实验例3：【⁵¹Cr】释放试验检测CTL细胞溶破HEK293细胞的能力

1、主要仪器：YJ-875SA型超净工作台；水平式离心机；康乐电热恒温水浴箱；恒温孵箱；γ-计数仪

2、主要实验材料：靶细胞为转染了H5N1之H5基因的HEK293细胞；效应细胞为本发明所述的基本的氨基酸序列多肽与重组人IL-2协同刺激人外周血单个核细胞后得到的T淋巴细胞。放射性同位素Na2⁵¹Cr O₄；RPMI1640培养基；盐酸(HCl)；规格为6孔、96孔培养瓶。

3、靶细胞准备：收获处于对数生长期的靶细胞(转染了pIRES2-EGFP-H5N1之H5质粒的HEK293细胞)，洗涤后调整细胞浓度为2×10⁶/ml。取1×10⁶细胞(0.5ml)，加Na₂ ⁵¹Cr O₄100μci，37℃孵育2～3h，每15min轻轻振摇一次。用含有10％FCS的RPMI-1640洗涤3次，每次800rpm离心，5min，弃上清，重悬细胞至浓度为1×10⁵/ml。96孔培养板中，每孔加100μl(1×10⁴细胞)，每份3个复孔，共42孔。

4、CTL细胞的加入：每孔加入100μl不同细胞浓度的CTL细胞，最大释放组加入100μl的1％mol/L HCL，以此溶破靶细胞效率为100％；自然释放组加100μl完全培养基，以此为阴性对照组。每孔取出100μl上清，按照本领域公知的方法在γ计数仪上测定cpm值。

结果表明：该多肽可以体外刺激HLA-A^*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高45％-88％，还可以激活CTL溶破对H5N1之H5蛋白的细胞，溶破率为60％-88％。

H5N1之H5氨基酸系列表的计算机可读形式

<110>吕凤林

<120>一种治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物

<130>无

<140>申请号

<141>2008-10-8

<160>3

<170>Patent In Version 2.1

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Phe₁Leu Asn Val Glu Trp Ser Tyr Ile₉

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Asn₁ Leu Tyr Asp Val Arg Leu Gln Leu₉

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Thr₁ Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val₉

Claims (4)

1.一种治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物，其特征在于它的氨基酸序列为：氨基端-FLNVEWSYI-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。

2.如权利要求1所述的治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物，其特征在于它的氨基酸序列为：

3.如权利要求1所述的治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物，其特征在于它的氨基酸序列为：

4.如权利要求1所述的治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物，其特征在于它的氨基酸序列为：