CN102058875A

CN102058875A - 一种治疗人尖锐湿疣的多肽药物

Info

Publication number: CN102058875A
Application number: CN 201010616703
Authority: CN
Inventors: 吕凤林; 田菲菲; 杨力
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2011-05-18

Abstract

一种治疗人尖锐湿疣的多肽药物，其特征在于它基本的氨基酸序列为：氨基-YLQDNDSWV-羧基，利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，所形成的特殊连接方式。本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破带有人乳头瘤病毒11型相关标志的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。

Description

一种治疗人尖锐湿疣的多肽药物

(一)、所属技术领域

本发明涉及一种生物医学领域，特别是一种关于治疗人尖锐湿疣的多肽药物。

(二)、技术背景

目前治疗尖锐湿疣的只能采用综合治疗的方法，归纳起来有以下几种：

①手术疗法：尖锐湿疣一般不主张手术切除，因为手术治疗后，尖锐湿疣很容易复发，使治疗失败。

②冷冻疗法：利用-196℃低温的液体氮，采用压冻法治疗尖锐湿疣，促进疣组织坏死脱落，本法适用于数量少、面积小的湿疣，可行1～2次治疗，间隔时间为一周。

③激光治疗：通常用CO2激光，采用烧灼法治疗尖锐湿疣。

④电灼治疗：采用高频电针或电刀切除湿疣。

⑤β-射线治疗：应用β-射线治疗尖锐湿疣取得了较为满意的效果，该治疗效高，无痛苦、无损伤、副作用少，复发率低。

目前治疗尖锐湿疣的药物有：

①足叶草脂：适用湿润区域的湿疣，但有很多缺点，如对组织破坏性大，使用不当可引起局部溃疡。毒性大，主要表现为恶心、肠梗阻、白细胞及血小板减少，心动过速、尿闭或少尿，故使用时必须谨慎，发现上述反应时，应立即停药。本药有副作用，要注意保护周围皮肤粘膜，涂药2～4小时后洗去。有致畸作用，孕妇禁用。

②抗病毒药：可用5％酞丁胺霜剂，或用0.25％疱疹净软膏，每日2次，外涂。无环鸟苷口服，每日5次，每次200mg，或用其软膏外用。α-干扰素每日注射300万单位，每周用药五天。或干扰素300万单位注入疣体基部，每周2次，连用2～3周。主要副作用为流感综合症，局部用药副作用较少且轻微。

③腐蚀剂或消毒剂：常用有30％-50％三氯醋酸或饱和二氯醋酸，或18％过氧乙酸。用10％水杨酸冰醋酸或40％甲醛、2％液化酚、75％乙醇蒸馏水100ml混合溶液，点涂局部，用于龟头、肛周湿疣，每日或隔日一次，效果甚好。消毒剂可用20％碘酊外涂，或2.5-5％碘酊注射于疣体基部，每日0.1～1.5ml，或用新洁尔灭外涂或0.1～0.2％外敷，后者需配合全身疗法，这些腐蚀性极强的化合物，以消除疣体为目的。虽然见效快，价格低廉，但与物理治疗方法一样，均为治标不治本，极易复发。

④抗瘤药：5-氟脲嘧啶(5-Fu)；一般外用5％软膏或霜剂，每日2次，3周为一疗程。2.5％-5％氟脲嘧啶湿敷治疗阴茎、肛周尖锐湿疣，每次敷20分钟，每日一次，6次为一疗程。也可用聚乙二醇作基质，加入占其干质5％的5-Fu粉剂制成栓剂，治疗男女尿道内尖锐湿疣。也可用5-Fu基底注射，多者可分批注射。噻替派：主要用于5-Fu治疗失败的尿道内尖锐湿疣，每日用栓剂(每个含15mg)，连用8天。也可将本品60mg加入10～15ml消毒水中，每周向尿道内滴注，保持半小时，副作用有尿道炎。亦可用本品10mg加入10ml，浸泡患处，每日3次，每次半小时，治疗阴茎、龟头冠状沟湿疣。主要用于经其它方法治疗后，尚有残存疣体或复发者。也可将此溶液再稀释两倍浸泡局部，也预防复发。秋水仙硷：可用2-8％的生理盐水溶液外涂，涂两次，间隔72小时，治疗阴茎湿疣。涂后可出现表浅糜烂。争光霉素或平阳霉素：用0.1％的生理盐水溶液作皮损内注射，每次总量限制在1毫升(1mg)，大多一次可愈。

到目前为止，国内外治疗尖锐湿疣的生物制剂一般以免疫疗法为主：

①自体疫苗法：用病人自己的疣体组织匀浆(融冷灭活病毒)，并进行加热处理(56℃1小时)收集上清液注射，可用于顽固性肛周湿疣。

②干扰素诱导剂：可用聚肌胞及梯洛龙。聚肌胞每日注射2ml，连用10天，停药1～2月后，再继续用药。梯洛龙每日3次，每次300mg，停药4天，或隔日口服600mg。

③干扰素、白介素-2、灵杆菌素、利百多联合应用。

以上这些治疗方法和/或药物都不能彻底清除病毒在体内的复制，所以复发率高。

(三)、发明内容

本发明的目的就是提供一种便于运输保存和自动化批量生产的治疗人尖锐湿疣的多肽药物，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破带有人乳头瘤病毒11型相关标志的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，它基本的氨基酸序列为：YLQDNDSWV，利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，所形成的特殊连接方式。

本发明的基本的氨基酸序列来源于GENBANK报道的氨基酸序列，采用蛋白质表位分子设计的原理和方法，蛋白质序列进行二级结构、抗原性、B细胞表位、亲水性质、疏水性质的分析研究，找到了具有功能的本发明所指的基本的氨基酸序列。

使用现有的成熟技术，制备表达HPV11型E2蛋白的靶细胞，叫Caski细胞；

按照本领域公知的方法获得HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞(简称PBMC)；

培养上述PBMC细胞24小时后，取悬液(2×10⁶/ml)4瓶。加入本发明所述的氨基酸序列多肽(20μg/ml)，加入等量完全培养基作为对照组，37℃，5％CO2环境下孵育。7天后重复该刺激过程，共反复刺激3次。最末一次刺激后第3天收集悬浮细胞，这些细胞具有针对HPV11型E2蛋白的靶细胞的细胞毒性(CTL细胞)，计数检测发现：使用本发明涉及的合成多肽药物或疫苗可以使CTL细胞数量较对照组增加50％-80％。

将转染了HPV11之E2基因的Caski细胞与上述CTL细胞共同孵育，发现该CTL细胞可以溶破转染了HPV11之E2基因的Caski细胞，溶破率得到60％-90％。

由于采用了上述技术方案，本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破带有人乳头瘤病毒11型相关标志的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。

(四)具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

本发明的氨基酸序列为：KLPQLCTEL；利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。

该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高50％-80％，还可以激活CTL溶破带HPV11型E2标志的细胞，溶破率为60％-90％。

实施例1：它的氨基酸序列可以为：

上述多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高60％，还可以激活CTL溶破带HPV11型E2标志的细胞，溶破率为87.38％。

实施例2：它的氨基酸序列也可以为：

上述多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高50％，还可以激活CTL溶破带HPV11型E2标志的细胞，溶破率为77.83％。

实施例3：它的氨基酸序列也可以为：

上述多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高50％，还可以激活CTL溶破带HPV11型E2标志的细胞，溶破率为78.90％。

以上所述的氨基酸序列的制备方法均是现有的成熟技术，它是按照如下的方法制成的：

采用标准Fmoc方案，起始选用0.0125mmol，PSC树脂(ABI公司生产，批号A5F013)，分别按照权利要求1、2、3或4所述的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国ABI公司生产)的用量为0.1mmol。各种氨基酸保护基团是：各氨基酸的alpha氨基为Fmoc保护，其余侧链保护基团，Arg(Mtr)、Tyr(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)、Asp(OtBu)。每步缩合都加入HoBt/Dcc活化保护氨基酸的羧基。每步缩合用含有20％六氢吡啶的NMP溶液去除Fmoc保护基，肽链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，

将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分：结晶苯酸0.75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)0.5ml、去离子水0.5ml、三氟乙酸10ml。在室温条件下持续搅拌，反应时间为4.5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤，

以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至1～2ml，加乙醚50ml使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是肽产品。以上过程都是在ABI-431A固相自动肽合成仪(美国生产)上完成。

下面结合实验例对本发明作如下说明：

实验例1制备表达HPV11E2蛋白的靶细胞模型(Caski细胞)

1、主要仪器：微量高速冷冻离心机；MJ.Research PCR扩增仪；凝胶成像分析系统；电泳系统；FX-302型暗箱式紫外检测仪；YJ-875 SA型超净工作台；THZ-C恒温振荡器；FA 1004电子天平；康乐电热恒温水浴箱；￠300型pH计。

2、主要材料：1)菌株：E.coli DH5α。2)质粒：pBR322/HPV16为含目的基因HPV16E2的重组质粒；pIRES2-EGFP为含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体，含有Kana抗性基因。购自Clontech公司。

3、主要溶液配制：

1)LB培养液：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶于800ml ddH2O中，用5M NaOH调整pH至7.4，定容至1000ml，分装成100ml后，高压蒸气灭菌，4℃保存。

2)LB固体培养基：100ml LB培养液中加入1.8g琼脂粉，高压蒸气灭菌后，铺板，4℃保存。

3)LB琼脂+Amp培养液：配制LB，高压消毒。冷却至50℃左右，加Amp使终浓度为100μg/ml，4℃保存。

4)LB琼脂+Amp固体培养基：配制LB固体培养基，高压消毒。冷却至50℃左右，加Amp使终浓度为100μg/ml，铺板，4℃保存。

5)LB琼脂+Kana培养液：配制LB，高压消毒。冷却至50℃左右，加Kana使终浓度为50μg/ml，4℃保存。

6)LB琼脂+Kana固体培养基：配制LB固体培养基，高压消毒。冷却至50℃左右，加Kana使终浓度为50μg/ml，铺板，4℃保存。

7)电泳缓冲液(50×TAE)：Tris碱24.2g，0.5M EDTA(pH8.0)10ml，冰乙酸5.71ml，加水至100ml。应用浓度为1×TAE。

8)溴化乙锭(EB)：在20mlH2O中溶解0.2gEB，混匀后于4℃避光保存。

9)0.1M CaCl2：CaCl2·2H2O 1.47g，溶解于100ml水中，高压消毒，4℃保存。

4、反应体系：

P1(10μmol/L) 1μl

P2(10μmol/L) 1μl

dNTP(2.5mM) 1μl

10×Buffer 5μl

MgCl₂(25mM) 3μl

pBR322/HPV16 1μl

pfu Taq(5u/ul) 1μl

ddH₂O up to 50μl

5、反应条件：

1cycle 94℃ 2min

30cycle 94℃ 50sec

54℃ 30sec

72℃ 2min

1cycle 72℃ 10min

4℃ Hold

反应完毕后取4μl反应产物，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

6、Caski细胞的培养：

1)细胞寄到后，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，在倒置显微镜下观察，待细胞贴壁至80-90％的时候，进行传代培养

2)弃去细胞培养液，PBS洗涤2～3遍

3)用0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化至悬浮状态迅速加入含血清的1640培养基终止消化

4)500rpm/min离心5min

5)弃上清，加入新鲜培养基4mL，吹打重悬细胞

6)分装至3个培养瓶内，每个培养瓶内再加入2mL培养基

7、质粒DNA转染Caski细胞：

细胞准备收获处于指数生长期细胞约1×10⁵个细胞接种于6孔细胞培养板中，使细胞达到40-60％融合，置于37℃、5％CO2培养箱中，无血清培养24小时。转染48小时后，将6孔培养板直接置于荧光显微镜下，在479nm的激发

波长下激发绿色荧光，观察绿色荧光蛋白EGEP以及HPV11E2在细胞中的定位和表达情况。

实验例2体外诱导特异性性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)

1、试剂和材料

1)含10％胎牛血清的RPMI1640培养基。

2)PBS洗涤液。

3)重组人白介素(recombinant human IL-2)。

4)规格为1毫升和10毫升的刻度吸管。

5)75％酒精，无菌棉球，镊子。

6)显微镜、水平式离心机。

7)HLA-A*0201阳性人体血液20mL(4×5mL)。按照本领域公知的方法获得外周血单核细胞(PBMC)。

2、方法：

培养PBMC细胞24小时后，取悬液(2×10⁶/ml)4瓶。加入本发明所述的基本的氨基酸序列多肽(20μg/ml)和等量完全培养基，同时培养瓶内加入rhIL-2使终浓度为50U/mL、37℃、5％CO2下孵育。7天后重复该刺激过程，共刺激3次。每次刺激之间，视情况加入新鲜RPMI1640培养基，每一次刺激时均需吹打贴壁细胞至悬浮状态，洗涤，换培养瓶。按照该方法便可以得到细胞毒性CTL细胞。

实验例3 ⁵¹Cr释放试验检测CTL细胞溶破Caski细胞的能力

1、主要仪器：YJ-875SA型超净工作台；水平式离心机；康乐电热恒温水浴箱；恒温孵箱；γ-计数仪

2、主要实验材料：靶细胞为转染了HPV11之E2基因的Caski细胞；效应细胞为本发明所述的基本的氨基酸序列多肽与重组人IL-2协同刺激

人外周血单个核细胞()后得到的T淋巴细胞。放射性同位素Na₂ ⁵¹Cr O₄；RPMI1640培养基；盐酸(HCl)；规格为6孔、96孔培养瓶。

3、靶细胞准备：收获处于对数生长期的靶细胞(转染了pIRES2-EGFP-HPV16E6质粒的Caski细胞)，洗涤后调整细胞浓度为2×10⁶/ml。取1×10⁶细胞(0.5ml)，加Na₂ ⁵¹Cr O₄100μci，37℃孵育2～3h，每15min轻轻振摇一次。用含有10％FCS的RPMI1640洗涤3次，每次800rpm离心，5min，

弃上清，重悬细胞至浓度为1×10⁵/ml。96孔培养板中，每孔加100μl(1×10⁴细胞)，每份3个复孔，共42孔。

4、CTL细胞的加入：每孔加入100μl不同细胞浓度的CTL细胞，最大释放组加入100μl的1％mol/L HCL，以此溶破靶细胞效率为100％；自然释放组加100μl完全培养基，以此为阴性对照组。每孔取出100μl上清，按照本领域公知的方法在γ计数仪上测定cpm值。

结果表明：该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高50％-80％，还可以激活CTL溶破带HPV11型E2标志的细胞，溶破率为60％-90％。

Claims

1.一种能治疗人尖锐湿疣的多肽药物，其特征在于它基本的氨基酸序列为：氨基-YLQDNDSWV-羧基。

2.如权利要求1所述的一种能有效治疗人尖锐湿疣的多肽药物，利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，所形成的特殊连接方式，其特征在于它基本的氨基酸序列为：

3.如权利要求1所述的一种能有效治疗人尖锐湿疣的多肽药物，利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，所形成的特殊连接方式，其特征在于它的氨基酸序列的连接形式为：

4.如权利要求1所述的一种能有效治疗人尖锐湿疣的多肽药物，利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，所形成的特殊连接方式，其特征在于它的氨基酸序列的连接形式为：

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