CN102056939A - 雌激素受体-α的活性的恢复 - Google Patents

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Abstract

所有乳癌中有三分之一是雌激素受体α(ERα)阴性的、具有不良总体预后并且对当前可供使用的内分泌疗法不能很好地响应。使用一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽如一种重组Wnt-5a蛋白或具有Wnt-5a信号特性的一种Wnt-5a衍生的六肽(Foxy-5)能够恢复Erα的表达并且使之有可能利用选择性雌激素受体调节剂如它莫西芬或芳香酶抑制剂来治疗此类乳癌。

Description

雌激素受体-α的活性的恢复
技术领域
本发明涉及建立或恢复雌激素受体-α的表达和活性以及由此在雌激素受体α阴性的乳癌细胞中建立或恢复对雌激素受体调节剂如它莫西芬的敏感性。
发明背景
在世界范围内，乳癌仍是女性中最常见的疾病之一。尽管在检测和治疗中有进展，在许多患者中该病发展至转移。对于细胞核激素受体，雌激素受体α(ERα)，为阴性的患者具有一种特别不良的预后(1)。对乳癌患者的临床列队分析显示出ERα表达缺失与Wnt-5a表达缺失之间的统计上显著的关联(2)。已经显示出，在乳癌中Wnt-5a表达的缺失发生在翻译水平而不是转录水平。所以，人们假设Wnt-5a也许能够调节ERα水平，而不是与此相反。在本工作中，已经建立了在乳癌中这两种关键蛋白之间的这样一种关系的调查。
Wnt-5a是Wnt分子大家族中的一个成员，并且它的改变的表达与包括乳癌、结肠癌、肝细胞癌以及黑色素瘤的癌症相关。在乳癌中，显示出Wnt-5a增加了上皮细胞的粘附并且降低了上皮细胞的迁移，说明了它与转移过程以及更好的患者的结果(2)的联系。以前已经研制了一种甲酰化的六肽，Foxy-5，能够模仿Wnt-5a对乳癌细胞的粘附和迁移的影响。虽然这种肽不太可能维持Wnt-5a信号的所有效果，诸位发明人相信这种肽具有明确的并且即时的治疗潜力。除其他之外，衍生自Wnt5-a的肽还已经更早地描述于WO 2006/130082以及WO01/32708中。
促成ERα阴性乳癌患者的预后不良的一个因素是，包括用它莫西芬(用于治疗乳癌的主要药物之一)治疗的内分泌疗法在ERα阴性患者中是无效的(1)。它莫西芬被称为一种选择性雌激素受体调节剂(SERM)，因为它在一些组织中充当一种激动剂而在其他组织中充当一种拮抗剂。人们认为，它莫西芬通过结合至Erα上来起作用，这种结合引起了一种构象变化，这种构象变化阻止了共活化剂的募集，从而导致雌激素调节基因的转录被改变以及细胞的增殖。因此，在缺乏ERα表达的患者中，它莫西芬大多是无效的。内分泌疗法还包括用芳香酶抑制剂如阿那曲唑、依西美坦或来曲唑进行治疗。然而，与以上论述的对于选择性雌激素受体调节剂的原因相同，用芳香酶抑制剂的治疗在缺乏ERα表达的患者中大多是无效的。
因此已经提出对于ERα阴性乳癌患者的一种新的治疗方法；取代发展全新疗法来治疗ERα阴性患者，如果能够使这些患者对当前有效的、认可的并且广泛可用的治疗方案(如它莫西芬)的响应敏感化，又会怎么样呢？这样一种思维的转变当前正在进行之中，已经表明如果这些患者某些基因的表达可以改进从而上调ERα，这些患者或许再次能得到有效治疗(3)。研究人员利用转染全长ERα质粒、或用DNA甲基转移酶(DNMT)和组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂如5-氮杂-dC以及曲古抑菌素A进行治疗，在ERα阴性乳癌患者中已经恢复了ERα表达(3-6)。然而，这些策略中没有一个对于直接临床使用是可行的。
发明概述
鉴于以下事实，即所有乳癌中有三分之一是雌激素受体α(ERα)阴性、具有不良的总体预后并且对当前可用的内分泌治疗不能很好地响应，需要新的治疗策略。因此，已经进行了以下调查，即：对ERα阴性乳癌细胞给予重组Wnt-5a或Wnt-5a衍生的六肽(Foxy-5)是否能将它们的ERα表达上调并且有可能使得它们响应于选择性雌激素受体调节剂或芳香酶抑制剂。已经发现通过使用一种天然的细胞表面受体配体或一种模仿这种配体的六肽来重建ERα表达，已经使得乳癌细胞响应于当前的用一种选择性雌激素受体调节剂(如它莫西芬)或一种芳香酶抑制剂(如阿那曲唑)的内分泌治疗，并且因此提示着一种乳癌的临床管理的重要进展。用一种模仿Wnt-5a的六肽与当前可用的ERα调节剂的协调治疗构成了一种对于具有ERα阴性肿瘤的乳癌患者的新颖的并且有益的治疗策略。
因此本发明的一个方面涉及一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽用于生产一种用于治疗乳癌亚型的药物组合物的用途，该乳癌亚型的特征为缺乏雌激素受体-α的活性。
本发明的另一个方面涉及用于治疗一种乳癌亚型的一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，该乳癌亚型的特征为缺乏雌激素受体-α的活性。
本发明的又一个方面涉及用于治疗乳癌一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽。
本发明的另一个方面涉及一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，用于治疗在一位雌激素受体-α阴性患者体内的乳癌。
本发明的另一个方面涉及一种用于恢复雌激素受体-α活性的方法，该方法通过向缺乏雌激素受体-α的人给予一个治疗有效量的一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，这种给予持续了一段时间，该段时间足以通过恢复此类受体诱导这种雌激素受体-α的活性。
本发明的另一个方面涉及一种用于在患有乳癌并且缺乏雌激素受体-α活性的人体内协助或增强内分泌后治疗的方法，其中一个治疗有效量的Wnt5-α蛋白或它的一种肽被给予一段时间，该段时间足以诱导雌激素受体-α的活性。
附图简要说明
图1：ERα、Frizzled 5、PR以及Wnt-5a在实验细胞系中的基础表达。
A：通过SDS-PAGE以及蛋白质印迹法对来自在培养中生长的细胞的蛋白溶解产物分析所感兴趣的蛋白。使用微管蛋白表达作为一种负载对照。B：对于我们所感兴趣的基因，将RNA从细胞系提取并且经受cDNA合成以及RT-PCR。由于已知T47D人乳癌细胞系表达了我们研究的所有感兴趣的基因，使用T47D人乳癌细胞系作为对于蛋白和mRNA两者的分析的一种阳性对照。使用β-肌动蛋白表达作为一种管家基因。阴性对照表示一种水对照。
图2：Wnt-5a信号恢复了ERα表达。
使乳癌细胞在6孔板中生长，并且用重组Wnt-5a蛋白(rW5a)、Wnt-5a衍生的Foxy-5肽(F5)、重组Wnt-3a蛋白(rW3a)、或一种甲酰化的随机六肽(Rdm)激励24或48小时。处理之后，将细胞溶解并且经受SDS-PAGE、转移到硝酸纤维素薄膜上并且对于ERα表达进行印迹。A：用重组Wnt-5a、Foxy-5、Wnt-3a、Rdm激励的MDA-MB-231细胞。B：用重组Wnt-5a或Foxy-5激励的MDA-MB-468细胞。C：用重组Wnt-5a或Foxy-5激励的4T1细胞。包括了阳性对照(Pos)，以便确定ERα的正确的带大小(band size)。使用两种不同的阳性对照：已知表达了ERα的T47D细胞溶解产物、以及用一种全长ERα质粒瞬间转染的导致非常高的ERα表达的MDA-MB-231细胞(首行，右组，第三行，右组)。
图3：Wnt-5a信号恢复了ERα转录。
在6孔板中生长乳癌细胞，并且用重组Wnt-5a蛋白(rW5a)或Wnt-5a衍生的Foxy-5肽(F5)进行激励，持续6、12、18或24小时。对于ERα以及管家基因，β-肌动蛋白，将RNA在最终时间点提取，合成cDNA并且经受RT-PCR。A：MDA-MB-231乳癌细胞，B：MDA-MB-468乳癌细胞。阳性对照(Pos)是从表达ERα的T47D细胞提取的RNA。阴性对照表示一个水对照。
图4：Wnt-5a信号Erα使启动子脱甲基化。
使MDA-MB-231细胞在常规培养基中生长并且或者不处理、或者用rWnt-5a蛋白(rWnt-5a，0.6μg/ml)或Wnt-5a衍生的Foxy-5肽(F5，100μM)进行激励，持续48小时。使MCF-7细胞生长等量的时间，并且不处理。从各个样品将DNA提取并且使之经受亚硫酸氢盐改性。使用具有用于ERα启动子区域的引物的巢式PCR使亚硫酸氢盐处理的DNA经受ERα启动子的亚硫酸氢盐基因组测序(BGS)。将PCR产物克隆并且测定10个随机克隆的序列。填充的(黑色)圆代表在一个给定胞嘧啶处的甲基化，空的(白色)圆代表未甲基化的胞嘧啶或者在rWnt-5a或Foxy-5处理之后脱甲基化的胞嘧啶。数字代表了CpG二核苷酸(dinculeotides)相对于转录起始位点(+1)的位置。TATA盒位于位置-17与+13之间。
图5：ERα是活化的并且能够下游转录。
在6孔板中生长MDA-MB-231细胞，并且用重组Wnt-5a蛋白(rW5a)或Wnt-5a衍生的Foxy-5肽(F5)激励24或48小时。A：处理之后，将细胞溶解并且经受SDS-PAGE、转移到硝酸纤维素薄膜上并且对于磷酸化ERα的表达进行印迹。阳性对照(Pos)代表来自表达ERα的T47D细胞的细胞溶解产物。B和C：也从激励的细胞中提取RNA，并且使用半巢式RT-PCR测试样品的孕酮受体(PR)(B)以及pS2(C)mRNA。阳性对照(Pos)是从表达ERα的T47D细胞提取的RNA。阴性对照表示一种水对照。PCR结果代表了三个单独的实验。
图6：ERα的上调致使先前无反应的乳癌细胞对它莫西芬治疗敏感。
在6孔板中生长MDA-MB-231细胞，并且用重组Wnt-5a蛋白(rW5a)或Wnt-5a衍生的Foxy-5肽(F5)激励24或48小时。将细胞用它莫西芬处理最终的20h，并且通过不同方法测定它们的凋亡反应。A：将处理的细胞用Hoechst进行染色以视觉上评价经处理而显示改变的核形态的凋亡细胞。箭头突出显示了凋亡细胞。条形代表10μM。B：用rW5a、F5以及它莫西芬，或它莫西芬单独处理之后，将细胞溶解并且使之经受SDS-PAGE、转移到硝酸纤维素薄膜上并且对于裂开的半胱天冬酶3进行印迹。C：使用荧光分光光度法将所处理的细胞对它们的半胱天冬酶3相对活性进行评定。该图表示6个单独的实验。*P＜0.01，**P＜0.001。D：在用rWnt-5a、F5以及它莫西芬处理的MDA-MB-231细胞或它莫西芬单独处理的MDA-MB-231和MCF-7细胞上还进行了MTT测定以评价细胞生长抑制。该图表示了6个单独实验的平均数，标准偏差由误差棒来表示。**P＜0.01，***P＜0.001。
图7：在它莫西芬处理之后由ERα直接调节的基因的表达被丢失。
使MDA-MB-231细胞在6孔板中生长，并且用重组Wnt-5a(rW5a)或Wnt-5a衍生的Foxy-5肽(F5)进行激励，持续24h或48小时。向样品的一个子集中，在最终的22h加入ERα配体雌二醇，并且在最终的20h加入它莫西芬。对于组织蛋白酶D(CATD)、ER-结合片段相关抗原9(EBAG9)以及管家基因、β-肌动蛋白，将RNA在最终时间点提取，合成cDNA并且经受RT-PCR。
图8：Foxy-5体内上调了ERα。
将2.5X 1044T1乳癌细胞接种到8周龄Balb/C小鼠的乳房脂肪垫中。将这些动物随后用单独的PBS，Rdm对照肽(20μg)或者Foxy-5(20μg)每第四天治疗，持续25天。对于鼠ERα，从来自每组中4个动物的原发乳房肿瘤中提取RNA，并且使之经受RT-PCR。所显示的是来自每治疗组两个动物的原发肿瘤样品。
发明详细描述
具体地，本发明涉及Wnt5-α蛋白(如一种重组Wnt5-a蛋白)或它的一种肽用于增强或恢复雌激素受体-α活性的用途。在乳癌的治疗中当患者是雌激素受体-α阴性时，这是特别有意义的。在增强或恢复雌激素受体-α活性后，有可能对于患者使用一种内分泌治疗，如用一种选择性雌激素受体调节剂(如它莫西芬)的治疗或用一种芳香酶抑制剂(如阿那曲唑)的治疗。当使用选择性雌激素受体调节剂(如它莫西芬)或芳香酶抑制剂治疗乳癌时，结果经常是在雌激素受体-α阴性患者中不成功，除非使用根据本发明的一种Wnt5-α蛋白(如一种重组Wnt5-a蛋白)或它的一种肽。
在它的一个优选实施方案中，Wnt5-α肽是具有以下序列之一的一种或多种：
MDGCEL SEQ.ID.NO.1
GMDGCEL                 SEQ.ID.NO.2
EGMDGCEL                SEQ.ID.NO.3
SEGMDGCEL               SEQ.ID.NO.4
TSEGMDGCEL              SEQ.ID.NO.5
KTSEGMDGCEL             SEQ.ID.NO.6
NKTSEGMDGCEL            SEQ.ID.NO.7
CNKTSEGMDGCEL           SEQ.ID.NO.8
LCNKTSEGMDGCEL          SEQ.ID.NO.9
RLCNKTSEGMDGCEL         SEQ.ID.NO.10
GRLCNKTSEGMDGCEL        SEQ.ID.NO.11
QGRLCNKTSEGMDGCEL       SEQ.ID.NO.12
TQGRLCNKTSEGMDGCEL      SEQ.ID.NO.13
GTQGRLCNKTSEGMDGCEL     SEQ.ID.NO.14
LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL    SEQ.ID.NO.15
或它的一种甲酰化衍生物。还可能使用两种或更多种这些肽的组合。
方法
细胞培养
在本研究中使用5个乳癌细胞系。所有MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、T47-D以及4T1细胞都从美国典型组织培养库(American Type Tissue Collection，ATCC)得到，并且根据ATTC的推荐使之生长。使4T1细胞在RPMI培养基(R8758)中生长，该培养基添加了10％胎牛血清(FCS)、1.5g/L碳酸氢钠、10mM HEPES、以及1mM丙酮酸钠。使MDA-MB-231、MDA-MB-468、以及MCF-7细胞系在具有10％FCS的DMEM中生长。所有细胞培养基含有加入的5U/ml青霉素、0.5U/ml链霉素以及2mM谷氨酰胺。如所指示的，对于一些实验，同样将细胞在缺少酚红并且添加了5％活性炭处理的FCS的“不含激素的培养基”中生长。将所有细胞在具有5％CO2的一个增湿的腔室内在37℃下孵育。
用重组Wnt-5a、重组Wnt-3a、Foxy-5或一种甲酰化的随机肽进行激励
细胞的激励是用重组Wnt-5a(0.6μg/ml)以及重组Wnt-3a(0.1μg/ml并且在一个对照实验中，0.6μg/ml)(R&D Systems Abington，UK)进行如所指示的时间。将在诸位发明人的实验室中设计的Wnt-5a衍生的甲酰化六肽(Foxy-5)(甲酰基-MDGCEL)(SEQ.ID.NO.1)以及一种甲酰化的随机六肽(甲酰基-MSADVG)(SEQ：ID：NO：16)由Pepscan Presto(Lelystad，The Netherlands)或Inbiolabs(Tallinn，Estonia)合成。将这些肽通过RP-HPLC以及质谱法进行纯化，并且将＞95％的纯的肽合成3次。将细胞用Foxy-5或随机肽以100μM的浓度处理如所指示的时间。除非另外指明，所有其他化学品购买自SigmaChemicals(St.Louis，MO)。
已知具有Wnt5-α活性的肽是
MDGCEL               SEQ.ID.NO.1
GMDGCEL              SEQ.ID.NO.2
EGMDGCEL             SEQ.ID.NO.3
SEGMDGCEL            SEQ.ID.NO.4
TSEGMDGCEL           SEQ.ID.NO.5
KTSEGMDGCEL          SEQ.ID.NO.6
NKTSEGMDGCEL         SEQ.ID.NO.7
CNKTSEGMDGCEL        SEQ.ID.NO.8
LCNKTSEGMDGCEL       SEQ.ID.NO.9
RLCNKTSEGMDGCEL      SEQ.ID.NO.10
GRLCNKTSEGMDGCEL     SEQ.ID.NO.11
QGRLCNKTSEGMDGCEL    SEQ.ID.NO.12
TQGRLCNKTSEGMDGCEL      SEQ.ID.NO.13
GTQGRLCNKTSEGMDGCEL     SEQ.ID.NO.14
LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL    SEQ.ID.NO.15
或它的一种甲酰化衍生物。这些肽可以单独地或以两种或更多种的混合物使用。
细胞溶解以及蛋白质印迹分析
将细胞溶解在曲通溶解缓冲液(50mM Tris(pH 7.5)，1％曲通x-100，140mM NaCl，0.5mM EDTA，0.5MgCl2，10mM NaF)中，加入了新鲜亮抑酶肽(1μg/ml)、Pefabloc(2mM)、抑肽酶(20μg/ml)以及Na3VO4(4mM)。将溶解产物在冰上孵育15分钟，然后以8000g通过离心10分钟进行预澄清。将细胞溶解产物根据大小在8％-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离并且随后电转移至PVDF或硝酸纤维素薄膜上。将薄膜在室温下在具有5％乳的TBS-吐温(0.01％)中封闭1小时。将薄膜与第一抗体在4℃下在具有3％乳的TBS-吐温(0.01％)中孵育过夜，然后在TBS-吐温(0.01％)中洗涤3次持续10分钟。蛋白的可视化是通过向薄膜加入偶联至辣根过氧化物酶上的一种第二抗体然后将该薄膜在室温下在具有3％乳的TBS-吐温(0.01％)中孵育1小时来进行的。然后将薄膜在TBS-吐温(0.01％)中洗涤3次持续10分钟，并且然后在ECL中孵育并且用超薄膜显影。使用一台Bio-Rad(Hercules CA)GS-800光密度计用Quantity One软件进行了扫描以及光密度测定。
抗体
使用以下稀释度的抗体：雌激素受体a：HC-20(Santa Cruz Biotechnology)1∶1000、Wnt-5a(在我们实验室中研制的一种抗人与鼠之间具有100％同源性的Wnt-5a序列的抗体)1∶1000(2)、孕酮受体：6A1，检测A和B同种型两者(Cell Signaling Technology)，Frizzled 5：(Upstate)1∶1000、裂开的半胱天冬酶3：Asp175(Cell Signaling Technology)1∶1000、磷酸化ERα(Ser 118)：16J4(Cell Signaling Technology)1∶1000、微管蛋白：DM1A(Santa CruzBiotechnology)1∶10000。所有第二抗体来自Dako Chemicals并且使用以下稀释度：羊抗兔1∶10000，羊抗鼠1∶7500，兔抗羊1∶7500。
RNA提取
RNA提取是在一个指定的干净RNA区域中向每个样品加入500μl TRIzol来进行的。然后加入100μl氯仿，并且将样品在4℃在250g下离心10分钟。将250μl异丙醇加入到清澈的上相中并且将样品在4℃在16000g下离心15分钟。将上清液去除并且将片状沉淀物在75％乙醇中洗涤并且在DEPC处理的水中再悬浮。将RNA用DNase 1(Sigma)在37℃下处理。使用一个Nanodrop分光光度计ND-1000(Bio-Rad(Hercules CA))测量RNA浓度。
cDNA合成&逆转录酶PCR(RT-PCR)
从1μg总RNA使用M-MuLV逆转录酶(Fermentas)在一台MJ Mini Personal循环变温加热器(Bio-Rad(Hercules CA))中合成cDNA。在一个指定的干净的PCR罩中进行所有的RT-PCR。使用每种样品含有5μl的10x缓冲液、5μl的25mM MgCl2、1μl10mM dNTP、1μl正向引物、1μl反向引物以及0.2μl的Taq聚合酶(Fermentas(Ontario，Canada))的一种预混合液进行RT-PCR。为了检测孕酮受体(PR)，进行半巢式RT-PCR以增加敏感性，从而向具有一个第二内反向引物的一个第二PCR反应中加入10μl的初始PCR反应产物。用这些引物扩增A和B同种型两者。
引物序列如下。
ERα正向：5’CAC CCT GAA GTC TCT GGAAG 3’(SEQ.ID.NO.17)，
ERα反向：5’GGC TAAAGT GGT GCA TGA TG 3’(SEQ.ID.NO.18)，
组织蛋白酶D正向：5’GTA CAT GAT CCC CTG TGA GAA GGT 3’(SEQ.ID.NO.19)，
组织蛋白酶D反向：5’GGG ACA GCT TGT AGC CTT TC 3’(SEQ.ID.NO.20)，
EBAG9正向：5’GAT GCA CCC ACC AGT GTA AAG A 3’(SEQ.ID.NO.21)
EBAG9反向：5’AAT CAG GTT CCA TTG TTC CAA AG 3’(SEQ.ID.NO.22)，
β肌动蛋白正向：5’TTC AAC ACC CCA GCC ATG TA 3’(SEQ.ID.NO.23)
β肌动蛋白反向：5’TTG CCA ATG GTG ATG ACC TG 3’(SEQ.ID.NO.24)
Wnt-5a正向：5’GGA TTG TTA AAC TCA ACT CTC 3’(SEQ.ID.NO.25)，
Wnt-5a反向：5’ACA CCT CTT TCC AAA CAG GCC 3’(SEQ.ID.NO.26)
PR正向：5’TCA TTA CCT CAG AAG ATT TAT TTA ATC 3’(SEQ.ID.NO.27)，
PR反向1：5’ATT GAA CTT TTT AAA TTT TCG ACC TC 3’(SEQ.ID.NO.28)，
PR反向2：5’ATT TTA TCA ACG ATG CAG TCA TTT C 3’(SEQ.ID.NO.29)。
所有RT-PCR进行至少3次，并且常规地包括缺少逆转录酶的对照以排除DNA污染。
核染色法用于凋亡细胞的分析
将MDA-MB-231细胞在盖玻片上铺板并且允许粘附。加入Wnt-5a(0.6μg/ml)或Foxy-5(100μM)24或48小时。然后将细胞用它莫西芬(5μM)处理最后的20小时。使用MCF-7细胞作为阳性对照。将细胞在冰冷多聚甲醛(4％)中固定15分钟、洗涤并且在黑暗中用10μg/ml Hoechst 33342染色剂(Invitrogen)孵育10分钟。将细胞用PBS洗涤并且用Dako Cytomation荧光封固剂(fluorescent mounting medium)进行封固。用具有60x物镜的Nikon E800Eclipse显微镜分析形态。
DNA提取&亚硫酸氢盐基因组测序(BGS)
根据标准程序，将DNA从细胞提取。然后使用EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)将1μg DNA进行亚硫酸氢盐处理并且通过巢式PCR用对于ERα启动子区域的引物进行扩增。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物克隆。使用一台ABI3730DNA分析器(Applied Biosystems)将10个随机克隆进行测序。
半胱天冬酶3活性测定
通过荧光光谱法测定半胱天冬酶3活性。使用荧光肽DEVD-amc(Upstate Biotech)作为一种底物。使MDA-MB-231细胞在6孔板中生长，并且用重组Wnt-5a蛋白(0.6μg/ml)或Foxy-5肽(100μM)激励24或48小时。然后将细胞用它莫西芬(Sigma)以1μM的浓度处理20小时。将浮游和粘附的细胞溶解在半胱天冬酶溶解缓冲液(10mM Tris-HCl、10mM NaH2PO4/Na2HPO4、130mMNaCl、1％曲通-X-100、10mM NaPPi)中，并且向具有200μl HEPES缓冲液以及3μDEVD-amc的反应孔中加入50μl三份。将反应在37℃下孵育1小时并且在一台FLUOstar酶标仪(BMG Lab technologies)上进行分析。使用Coomassie Plus Protein Assay测定各个溶解产物的总蛋白含量并且相应地读出平均值以及校正值。将实验进行6次，并且将结果平均。
MTT增殖测定
遵循制造厂家的说明，通过MTT测定(Vybrant)测量了细胞增殖。简言之，使MDA-MB-231和MCF-7细胞在96孔板中生长，然后不激励或者用rWnt-5a(0.6μg/ml)或Foxy-5肽(100μM)激励24或48小时。然后将细胞用5μM它莫西芬(Sigma)处理最终的20小时。然后将所有细胞用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯四唑鎓溴化物)进行标记，在37℃下孵育4小时然后在一台Biorad 680酶标仪(Biorad)上测量吸光度。将原始的吸光度在570nm下重复测量9次，相应地读出平均值以及校正值。将实验进行6次，并且将结果平均。
体内研究
将2.5X 1044T1乳癌细胞接种到8周龄Balb/C小鼠的乳房脂肪垫中，将这些小鼠随后用PBS单独地，Rdm对照肽(20μg)或者Foxy-5(20μg)每第四天处理25天，如诸位发明人在先前公开物中所述(9)。对于鼠ERα，从来自每组中4个动物的闪冻的原发乳房肿瘤中提取RNA，并且使之经受RT-PCR。
统计分析
用双侧非配对t检验使用Graph Pad软件确定半胱天冬酶-3活性测定的显著性。使用以下符号以表示统计学显著性：*p＜0.01，**p＜0.001。
结果
在一个临床乳癌队列上进行的先前研究显示出，缺乏ERα表达的乳癌患者同样缺乏Wnt-5a表达(2)。因此，通过在三个人和一个鼠细胞系中测定关键蛋白的内源表达而开始了该实验方法(图1a)。使用人T47D乳癌细胞系作为一种阳性对照，因为已知它在mRNA和蛋白水平二者表达ERα、Wnt-5a、Frizzled 5以及PR(A和B同种型二者)。MDA-MB-231、MDA-MB-468以及4T1细胞缺乏ERα、Wnt-5a以及PR的表达，然而它们确实表达了Wnt-5a受体、Frizzled 5，表明了在这些细胞系中Wnt-5a信号的诱导是可能的。MCF7细胞表达了所有测试的蛋白。其次，在人乳癌细胞中这些基因的表达的特征在mRNA水平(表1b)。在MCF7和T47D细胞中检测到了ERα以及PR mRNA。在所有细胞系中检测到了Wnt-5a mRNA，证实了来自本发明诸位发明人实验室以及其他人的先前数据，这些数据意味着Wnt-5a表达在转录后水平修饰的。这还与来自其他人的临床数据一致，这些临床数据表明乳癌肿瘤表达了高水平的Wnt-5a mRNA(7)。然后，寻求确定Wnt-5a信号的恢复是否影响乳癌细胞系中的ERα表达水平。将MDA-MB-231乳癌细胞种到6孔板上的正常培养基中，并且用重组Wnt-5a蛋白激励24和48小时。在这组实验中，使用ERα阳性乳癌细胞系作为阳性对照，主要用来确定在蛋白质印迹上的代表ERα的正确的带，而不是作为一种被比较的标准表达。在24小时后观察到了ERα蛋白水平的增加(图2a，顶部左组)。然后，研究在实验室中研制的Wnt-5a衍生的肽，Foxy-5，是否也能够上调ERα表达。
这证明是事实(图2a，顶部右组)。然后，通过用重组Wnt-3a蛋白以及一种甲酰化的随机六肽激励细胞，研究了这种效应的特异性。这些激励都没有导致增加的水平的ERα(图2a，底组)。然后在两个其他ERα阴性乳癌细胞系中重复了重组Wnt-5a以及Foxy-5激励。在用重组Wnt-5a或Foxy-5激励24和48小时之后，在MDA-MB-468(图2b)和4T1(图2c)乳癌细胞系二者中ERα水平是上调了。
为了确定这种ERα上调是否发生在一个转录水平或翻译水平，研究了ERαmRNA上调是否发生在比当最初检测到ERα蛋白时更早24小时的时间点。将人乳癌细胞系(MDA-MB-231以及MDA-MB-468)用重组Wnt-5a或Foxy-5激励6、12、18以及24小时，从而确定ERαmRNA在什么时间点是可检出的。在重组Wnt-5a激励12小时后和Foxy-5激励6小时后在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中检测到了ERαmRNA(图3)。
然后我们使用亚硫酸氢盐(bisufite)基因组测序(BGS)彻底分析了跨过ERαCpG岛的甲基化模式(图4)。这种分析允许我们清楚地证明在用rWnt-5a或Foxy 5激励的MDA-MB-231细胞中CpG岛的特异区域被脱甲基化了(图4)。将一种ERα阳性乳癌细胞系与未处理的MCF-7细胞的相同的区域进行了比较。在Wnt-5a信号启动之后，存在两个主要的脱甲基化区域，它们中的一个接近TATA盒以及转录起始位点(10)。具体地，在相对于转录起始位点的+42、+65、+165、+192、+195、+375处，存在显著的脱甲基化，与在使用HDAC以及DNMT抑制剂(3，4)的研究中所看到的类似。
然后，寻求确定上调的ERα是否是功能上活性的。对于这些实验使用MDA-MB-231细胞系，并且这是以许多方式来研究的。首先，测试重组Wnt-5a和Foxy-5激励的溶解产物的磷酸化ERα的存在。ERα在多个位点被磷酸化。选择研究丝氨酸118处的位点，因为在此位点处的磷酸化最常用作ERα活性的指示。在用重组Wnt-5a或Foxy-5激励的细胞中检测到了磷酸化的ERα(图45)。孕酮受体是一种活性ERα的下游转录目标指示。因此，在用重组Wnt-5a和Foxy-5激励一直到96小时后研究了它的转录。在用重组Wnt-5a或Foxy-5激励96小时后检测了PR mRNA(图5b)。
一旦确定重组Wnt-5a和Foxy-5上调了ERα并且它确实是活性的并且能够下游发信号，探讨了ERα阴性乳癌细胞中数据的临床相关性，这些细胞对于选择性雌激素受体调节剂(使用它莫西芬)通常是无反应的(1，4)。将细胞不激励或用重组Wnt-5a和Foxy-5激励24和48小时，然后在实验的最后20小时加入它莫西芬。还没有完全阐明它莫西芬的作用方式，然而已知ERα阳性乳房上皮细胞的处理导致了细胞凋亡，这可以在视觉上或通过凋亡途径中的关键蛋白的分析来评定(3)。首先，进行Hoechst染色并且随后直接观察到在用重组Wnt-5a或Foxy-5激励24和48小时后响应于它莫西芬的显示改变的核形态的凋亡细胞(观察为染色质凝聚以及碎裂)。多数凋亡细胞分离的事实使得这种测定是次优的，因为它低估了它莫西芬对凋亡的真实效应。为了改进测定的敏感性并且确定是否这种凋亡是通过半胱天冬酶途径来发生的，诸位发明人然后研究了来自用载体单独地、或重组Wnt-5a或Foxy-5以及它莫西芬激励的细胞的溶解产物的裂开的半胱天冬酶3的表达。诸位发明人在Wnt-5a信号细胞中检测到比在仅仅用它莫西芬处理的细胞中更高水平的裂开的半胱天冬酶-3(图6b)。为了将这些效应量化，诸位发明人然后通过一种荧光测定研究了半胱天冬酶-3的活性(图6c)。当与未处理的细胞或单独用它莫西芬处理的细胞相比时，用重组Wnt-5a以及它莫西芬的细胞的激励使凋亡程度增加了两倍，用Foxy-5以及它莫西芬的激励是凋亡程度增加了几乎三倍。在半胱天冬酶实验中，我们没有包括MCF-7细胞，因为它们被报道不能表达半胱天冬酶-3。在诱导Wnt-5a信号并且用它莫西芬处理后，这个试验允许我们清楚地观察到驱向凋亡途径的细胞的可再现的增加。由于还已知成功的它莫西芬处理会导致细胞生长抑制，我们使用一种MTT增殖测定进一步分析了我们的细胞(图6D)。当与用它莫西芬单独处理的细胞相比时，用rWnt-5a或Foxy-5激励然后用它莫西芬处理的细胞显示出统计上显著的生长抑制(图6D)。单独的rWnt-5a或Foxy-5都不具有对乳癌细胞增殖的影响。它莫西芬对用rWnt-5a或Foxy-5处理的MDA-MB-231细胞的影响是非常类似于在ERα阳性MCF-7细胞系中看到的它莫西芬诱导的影响(图6D)。
然后，分析了ER-结合片段相关抗原9(EBAG9)以及组织蛋白酶D(CATD)基因的mRNA水平。这些基因二者都被称为人雌激素应答基因，这是由于它们是通过直接的ERα结合来调节的，并且它们的mRNA表达指示了一种活性雌激素受体。以前的实验表明，在用重组Wnt-5a或Foxy-5激励24至48小时后，ERα蛋白上调了。因此，使MDA-MB-231细胞在不含激素的培养基中生长并且用配体雌二醇进行激励，在对于有待上调的ERα的足够时间过去后，允许了下游目标，EBAG9以及组织蛋白酶D的转录。在生长的最后20小时的它莫西芬的加入干扰了配体至受体的结合，以及随后的复合体至下游目标的ERE(雌激素应答元件)的结合，因此在48小时时间点不再观察到这些基因的表达。在用重组Wnt-5a或Foxy-5预处理后在48小时当用它莫西芬同时处理样品时，一致性地失去了雌二醇诱导的CATD以及EBAG9的表达(图7)。在一些情况下，组织蛋白酶D(CATD)的表达在24小时时间点也失去了，然而这在重复的实验中不同。这个结果表明了，在ERα阴性乳癌细胞中，Wnt-5a信号的恢复不仅上调了ERα表达和活性，而且还有ERα靶基因的它莫西芬依赖性抑制。
鉴于Foxy-5对于乳癌患者的潜在益处，诸位发明人进行了一项体内研究，研究了在一种鼠转移乳癌模型中Wnt-5a信号的Foxy-5介导的重建效应(9)。他们研究了来自那个研究的一系列动物实验的原发乳房肿瘤以测定Foxy-5是否可以体内上调ERα。将迅速转移性(metastic)ERα阴性4T1细胞接种到Balb/C小鼠的乳房脂肪垫中，将Balb/C小鼠用PBS单独地，随机对照肽(Rdm)，或者Foxy-5每第四天处理25天。与来自用PBS单独或Rdm控制肽处理的动物的肿瘤相反，来自用Foxy-5处理的动物的肿瘤显示出强的ERα表达(图8)。这个实验清楚地显示Foxy-5在ERα阴性乳癌中可以体内上调ERα。
讨论
用于治疗乳癌的主要药物，它莫西芬，主要通过ERα介导它的效应。ERα的表达与对内分泌治疗的临床应答强烈相关。ERα阴性乳癌不仅对它莫西芬不敏感，并且更有侵袭性并且具有不良的总体预后。因此，靶向这组患者的新疗法是至关重要的。在此文中，诸位发明人首次报道了在ERα阴性乳癌细胞中在乳房上皮细胞上的一种天然细胞表面受体的接合恢复了ERα的表达。对于ERα阴性乳癌患者的未来的治疗，这具有高的临床重要性。
来自我们实验室的以前的研究确认了在一个临床乳癌队列中ERα的状态与Wnt-5a的表达之间的关联性。Wnt-5a表达的丢失已被证明与更高组织学级别的并且缺乏ERα的乳房肿瘤是显著地相关的。在此，诸位发明人报道如下，即：用重组Wnt-5a蛋白或Wnt-5a衍生的Foxy-5肽对三种不同的ERα阴性乳癌细胞系的激励导致了增加的ERα表达。
当前所理解的情况是：在人乳癌中ERα的表达的缺乏大多是由于ERα启动子的甲基化(8)。在本研究中使用了缺乏ERα以及Wnt-5a表达的MDA-MB-231细胞系，这种细胞系已经被描述为具有一种沉默的ERα，这是由于在启动子区域中的CpG岛的这种甲基化的缘故。其他人已经试图通过加入HDAC和DNMT抑制剂来重建在这些细胞中的ERα信号，并且产生了与诸位发明人通过触发Wnt-5a信号所观察到的类似的结果(3)。我们的发现与以下想法一致，即：Wnt-5a信号作用于将ERα阴性细胞中的ER启动子脱甲基化，虽然在这种Wnt-5a诱导的ERα上调之后的后生机制依然有待研究。
上调的ERα在Ser-118残基上也是磷酸化的并且能够诱导孕酮受体的转录，表明了一种活性的并且发信号的ERα。重组Wnt-5a以及Foxy-5二者都能恢复功能性ERα的新发现引导我们通过使用选择性雌激素受体调节剂(它莫西芬)进行功能测定来研究是否这是临床相关的。将ERα阴性乳癌细胞用重组Wnt-5a、Foxy-5进行激励或不激励，然后加入ERα配体雌二醇并且最后加入它莫西芬，以便测定Wnt-5a信号是否会致使先前无反应的细胞对它莫西芬处理敏感。这是以四种方式来评定的。第一，通过Hoechst染色直接观察凋亡细胞。第二，通过蛋白质印迹观察凋亡的蛋白半胱天冬酶-3的增加的表达，该酶在凋亡诱导后裂开。这是使用一种荧光半胱天冬酶3活性测定来定量地证实的。最后，观察它莫西芬诱导的ERα的下游靶基因的抑制。所有的功能测定报道了相同的趋势，即：在用重组Wnt-5a或Foxy-5以及它莫西芬激励之后增加的凋亡；然而半胱天冬酶-3(capsase-3)活性测定显示出最显著的增加。这可能是由于这种测定的设计，它测量了上清液中的濒死细胞连同粘附细胞。
在我们实验室中研制的Wnt-5a衍生的Foxy-5甲酰化六肽能够将ERα表达调整到与实验中重组Wnt-5a相同的程度。这种肽具有明确的临床潜力，因为对于患者使用它具有多种优于重组Wnt-5a蛋白的优点。向乳癌患者直接给予Wnt-5a是不太可能成功的，因为Wnt-5a具有结合到细胞表面硫酸乙酰肝素上的一个特异域，这显著地限制了Wnt-5a在体内的分布。同样，Wnt-5a是一种相对大的蛋白质(43kDa)，并且因此更有吸引力的是使用一种小分子，如Foxy-5，它缺乏硫酸乙酰肝素结合区域，仍然可以模仿Wnt-5a对ERα表达的功能效果。
这种通过活化一种天然细胞表面受体(为了使得肿瘤响应于当前的内分泌治疗)来重建ERα表达的新颖方法对于这种常见疾病的临床管理是具有显著重要性的。用一种模仿Wnt-5a的六肽与当前可用的ERα调节剂的协调治疗可以代表对于具有ERα阴性肿瘤的乳癌患者的一种新颖的并且有益的治疗策略。
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9.
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Claims (25)

1.一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽用于生产用于治疗一种乳癌亚型的药物组合物的用途，该乳癌亚型的特征为缺乏雌激素受体-α的活性。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述乳癌是一种在雌激素受体-α阴性患者体内的乳癌。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中该治疗还包括一种内分泌治疗。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中该治疗还包括用一种选择性雌激素受体调节剂进行的治疗。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述选择性雌激素受体调节剂是它莫西芬。
6.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中该治疗还包括用一种芳香酶抑制剂进行的治疗。
7.如权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述Wnt5-α蛋白是一种重组蛋白。
8.如权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述Wnt5-α肽具有以下序列之一
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9.如权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述Wnt5-α肽具有以下序列之一
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并且是作为它的一种甲酰化衍生物而存在的。
10.用于治疗一种乳癌亚型的一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，该乳癌亚型的特征为缺乏雌激素受体-α的活性。
11.一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，用于治疗在雌激素受体-α阴性患者体内的乳癌。
12.如权利要求10或11中所述的一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，其中该治疗还包括一种内分泌治疗。
13.如权利要求10-12中任一项所述的一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，其中该治疗还包括用一种选择性雌激素受体调节剂进行的治疗。
14.如权利要求13所述的一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，其中所述选择性雌激素受体调节剂是它莫西芬。
15.如权利要求10-12中任一项所述的一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，其中该治疗还包括用一种芳香酶抑制剂进行的治疗。
16.如权利要求10-15中任一项所述的一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，其中所述Wnt5-α蛋白是一种重组蛋白。
17.如权利要求10-16中任一项所述的一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，其中所述Wnt5-α肽具有以下序列之一
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18.如权利要求10-16中任一项所述的一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，其中所述Wnt5-α肽具有以下序列之一
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并且是作为它的一种甲酰化衍生物而存在的。
19.一种用于恢复雌激素受体-α活性的方法，该方法是通过向缺乏雌激素受体-α的人给予一个治疗有效量的一种Wnt5-α蛋白或它的一种肽，这种给予持续一段时间，该段时间足以通过恢复此类受体来诱导这种雌激素受体-α的活性。
20.一种用于在患有乳癌并且缺乏雌激素受体-α活性的人体内协助或增强内分泌后治疗的方法，其中一个治疗有效量的Wnt5-α蛋白或它的一种肽被给予一段时间，该段时间足以诱导雌激素受体-α的活性。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述内分泌后治疗是用一种选择性雌激素受体调节剂进行的治疗。
22.如权利要求21所述的方法，其中该选择性雌激素受体调节剂是它莫西芬。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述内分泌后治疗是用一种芳香酶抑制剂进行的治疗。
24.如权利要求20或22所述的方法，其中该Wnt5-α肽是具有以下序列的组中的一个或多个
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并且是作为它的一种甲酰化衍生物而存在的。
25.如权利要求20或22所述的方法，其中该Wnt5-α肽是具有以下序列的组中的一个或多个
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