CN110305950A

CN110305950A - Dact2基因在制备房颤诊断和治疗产品中的应用

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Publication number: CN110305950A
Application number: CN201910430356.1A
Authority: CN
Inventors: 吴钟凯; 黄少杰; 侯健; 龙雁; 姚尖平; 陈光献; 梁孟亚; 岳媛
Original assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2039-05-22
Also published as: CN110305950B

Abstract

本发明公开了DACT2基因在制备房颤诊断和治疗产品中的应用。本发明首次发现了DACT2基因表达与房颤相关，通过检测受试者心肌组织中DACT2的表达，可以判断受试者是否患有房颤、或者判断受试者是否存在患有房颤的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。本发明发现了一种房颤的新的分子标记物‑DACT2基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现房颤的早期诊断，从而降低房颤的死亡率。

Description

DACT2基因在制备房颤诊断和治疗产品中的应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体地涉及DACT2基因在制备房颤诊断和治疗产品中的应用。

背景技术：

心房颤动(atrial fibrillation,AF,房颤)是最常见的心律失常之一，常导致心衰、中风以及其他栓塞症状的发生，增加住院患者的死亡率和并发疾病的发生率。房颤的症状可以表现为没有症状、心悸或者严重的并发症，包括频繁的住院、血流动力学不稳定、血栓栓塞等。房颤明显增加了人群中风的风险，是正常人的5倍左右，并且与年龄的增加呈正相关的关系。

临床上房颤一般按照发作时间分为阵发性房颤、持续性房颤、长期持续性房颤。永久性房颤指患者和医生联合决定放弃进一步的治疗措施以维持窦性心律。

对于合并其他继发性心脏疾病需要行开放心脏手术的患者，指南推荐术中同期行消融术治疗房颤是作为IIA类证据。外科手术治疗房颤经过许多外科医生的改良，发展为COX MAZE III手术，是房颤外科治疗的金标准。随着医疗技术的发展，也有医生使用射频消融或者冷冻消融等技术，替代外科的切开缝合技术，达到与COX MAZE III同样的治疗效果。然而目前对于房颤的治疗仍比较局限，术后也有一定的复发率，这源于目前仍没有完全明确房颤的发病机制。

早期预防、早期发现、早期治疗是提高人房颤根治率的关键。目前临床上对于房颤的诊断主要依赖于心电图的诊断，但当用上述方法确诊时，患者大多已是长期持续性房颤，对于早期阵发性房颤，仍缺乏一种特异和敏感的诊断方法。因此发现一种特异性的房颤标记物具有重要的意义。

发明内容：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供DACT2基因在制备房颤诊断和/或治疗产品中的应用。相比传统房颤的诊断方法，使用基因标志物来诊断房颤具有及时性、特异性和灵敏性，使患者在房颤早期就能知晓房颤风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供检测DACT2基因表达的产品在制备房颤诊断和/或治疗产品中的应用。

所述的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测DACT2基因及其表达产物的表达水平以诊断房颤的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断房颤的产品至少包括一对特异扩增DACT2基因的引物；所述用实时定量PCR诊断房颤的产品至少包括一对特异扩增DACT2基因的引物；所述用免疫检测诊断房颤的产品包括：与DACT2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断房颤的产品包括：与DACT2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断房颤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与DACT2蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与DACT2基因的核酸序列杂交的探针。

本发明的第二个目的是提供了一种诊断房颤的产品，所述的产品包括检测DACT2基因及其表达产物的表达水平的RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测试剂盒。

进一步，上面所述的产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测DACT2基因转录水平的针对DACT2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的DACT2蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测DACT2基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括DACT2蛋白的特异性抗体。

进一步，上面所述的试剂盒包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测DACT2基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对DACT2基因的引物和/或探针。

进一步，所述基因芯片可用于检测包括DACT2基因在内的多个基因(例如，与房颤相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括DACT2蛋白在内的多个蛋白质(例如与房颤相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与房颤的标志物同时检测，可大大提高房颤诊断的准确率。

本发明的第三个目的是提供DACT2基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗房颤的药物中的应用。

进一步，所述的DACT2基因和/或其表达产物的促进剂是指能够促进DACT2基因表达或增强DACT2表达功能的试剂。

进一步，所述试剂包括：含有能编码功能性DACT2蛋白的核酸的试剂、DACT2蛋白的激活剂、含有DACT2蛋白质的试剂。

其中，所述含有能编码功能性DACT2蛋白的核酸的试剂可以是在有利条件下翻译成活性形式的DACT2蛋白的单链核酸(如mRNA)或双链核酸(如DNA)，所述的核酸可以连接在表达载体上或重组到宿主细胞里，只要能编码成活性DACT2蛋白，任何一种DACT2基因的携带方式均可。所述的DACT2蛋白的激活剂是指刺激DACT2蛋白活性、增加DACT2蛋白活性、促进DACT2蛋白活性、增强DACT2蛋白激活、使DACT2蛋白活性敏感化或上调DACT2蛋白活性的试剂，如去甲基化试剂、DACT2启动子和/或增强子特异性的转录激活剂、DACT2蛋白的激动剂(如激活抗体)等。

本发明的第四个目的是提供一种治疗房颤的药物，包括能够促进DACT2基因表达或增强DACT2表达功能的试剂。

本发明的第五个目的是提供DACT2基因在制备抑制瓣膜病心肌细胞的纤维化水平药物中的应用。

本发明的药物可以用于补充内源性的DACT2蛋白的缺失或不足，通过提高DACT2蛋白的表达，从而治疗因DACT2蛋白减少导致的房颤。

本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

进一步，本发明中DACT2蛋白或编码DACT2蛋白的核酸可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂等。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。

进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。

本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有DACT2基因的药物或者含有DACT2蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有DACT2基因的药物或者含有DACT2蛋白质的药物注入体内组织中。

本发明的药物还可与其他治疗房颤的药物联用，多种药物联合使用可以大大提高治疗的成功率。

本发明中与DACT2基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明中所述DACT2蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述DACT2蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与DACT2蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的上下文中，“DACT2基因”包括人DACT2基因以及人DACT2基因的任何功能等同物的多核苷酸。DACT2基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中DACT2基因(NC_000006.12)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，DACT2基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述DACT2基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，DACT2基因表达产物包括人DACT2蛋白以及人DACT2蛋白的部分肽。所述DACT2蛋白的部分肽含有与房颤相关的功能域。

“DACT2蛋白”包括DACT2蛋白以及DACT2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括DACT2蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人DACT2的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，DACT2蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述DACT2蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是DACT2蛋白的融合蛋白。对于与DACT2蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留DACT2蛋白的生物学活性即可。

本发明的DACT2蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留DACT2蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断房颤”既包括判断受试者是否已经患有房颤、也包括判断受试者是否存在患有房颤的风险。

在本发明的上下文中，“治疗房颤”包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了DACT2基因表达与房颤相关，通过检测受试者心房组织中DACT2的表达，可以判断受试者是否患有房颤、或者判断受试者是否存在患有房颤的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的分子标记物-DACT2基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现房颤的早期诊断，从而降低房颤患者发生心脑血管事件的概率。

附图说明：

图1显示利用免疫组化染色检测DACT2基因在心脏瓣膜病心肌组织中的差异表达情况(A、B、F)，利用Masson染色检测心脏瓣膜病心肌组织窦性心律组和房颤组的纤维化程度(C、D、E)；

图2显示利用免疫荧光(B)及WB(A)检测DACT2基因在心房原代成纤维细胞中的过表达情况，其中图2-A中的横向的Control和DACT2分别代表转染Ad5-CON177-eGFP空病毒、转染Ad5-DACT2-eGFP病毒的心房原代成纤维细胞，纵向的DACT2和GAPDH代表检测DACT2和GAPDH基因；图2-B中的Control和DACT2分别代表转染Ad5-CON177-eGFP空病毒、转染Ad5-DACT2-eGFP病毒的心房原代成纤维细胞；

图3显示利用RT-PCR检测DACT2基因过表达对心房原代成纤维细胞中胶原蛋白I和胶原蛋白III表达水平的影响，其中Control代表空白对照组，DACT2代表Ad-DACT2-eGFP感染H9C2细胞。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、样本收集

选取因瓣膜性心脏病行瓣膜置换手术的患者28名，其中房颤患者(AF)18名，窦性心律(SR)患者10名，所有患者均在术中获取右心耳组织标本。以上所有标本的获取均通过组织伦理委员会的同意。

2、Masson染色和免疫组化染色具体操作步骤如下所示：

(1)将新鲜组织标本固定于4％多聚甲醛中，进行石蜡包埋切片，保存备用。

(2)Masson染色

A.石蜡切片脱至水：将标本切片依次放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。

B.苏木素染细胞核：置于Masson染色试剂盒内用Weigert氏铁苏木素染5min，自来水冲洗，用1％的盐酸酒精分化数秒后，自来水冲洗，流水冲洗数分钟返蓝。

C.丽春红染色：置于Masson染色试剂盒内用丽春红酸性品红液染5-10min，蒸馏水快速漂洗。

D.磷钼酸处理：置于Masson染色试剂盒内用磷钼酸水溶液处理约3-5min。

E.苯胺蓝染色：不用水洗，直接置于Masson染色试剂盒内用苯胺蓝液复染5min。

F.分化：用1％冰醋酸处理1min。

G.脱水封片：将标本切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，稍晾干后，用中性树胶封片。

H.显微镜下镜检，采集图像分析。

I.染色结果：胶原纤维、粘液软骨呈蓝色；肌素和红细胞呈红色；细胞核呈蓝黑。

J.Masson染色纤维化程度评价：应用Image Pro Plus 6.0对组织纤维化程度进行评价，随机选取心肌组织切片中的至少3个区域，计算其纤维化面积与各选定部分总面积的比值，以评估其纤维化程度，随后确定该心肌组织切片纤维化程度的平均比值。我们定义：当平均比值<0.1时，该组织纤维化程度为弱，当平均比值≥0.1且<0.3时，纤维化程度为强，当平均比值≥0.3时，纤维化程度为非常强。

(3)免疫组化染色：

A.石蜡切片脱蜡至水：将切片依次置于二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。

B.抗原修复：将组织切片置于盛满0.01mmol/L柠檬酸钠盐酸缓冲液(PH 6.0)的修复盒中后，于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切忌干片。待自然冷却后将玻片置于PBS(PH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

C.阻断内源性过氧化物酶：将标本切片置于3％过氧化氢溶液(双氧水：纯水＝1：9)中，室温避光孵育25min后，将玻片放入PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每5min。

D.血清封闭：将标本切片稍甩干后，用组化笔在标本组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内滴加10％正常山羊血清，均匀覆盖组织表面，室温封闭30min。

E.加一抗：轻轻甩掉封闭液后，在标本玻片上滴加用PBS按一定比例配好的DACT2一抗(Abcam，货号：ab42099，兔多克隆抗体，1：100)，然后将切片平放于湿盒中4℃孵育过夜。(于湿盒内加少量水防止抗体蒸发)。

F.加二抗：将标本玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50min。

G.DAB显色：将标本玻片置于PBS(PH7.4)中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。将切片稍甩干后，在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，于显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，于自来水下冲洗切片终止显色。

H.复染细胞核：用Harris苏木素复染3min左右，自来水冲洗，用1％的盐酸酒精分化数秒后，自来水下冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

I.脱水封片：将标本玻片依次放入75％酒精6min-85％酒精6min-无水乙醇Ⅰ6min-无水乙醇Ⅱ6min-二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将玻片从二甲苯中拿出稍晾干后，用中性树胶封片。

J.显微镜下镜检，采集图像分析。

K.石蜡切片的免疫组化结果判读：DAB下阳性表达显色为棕黄色，苏木素染细胞核为蓝色。

L.免疫组化结果评价：应用Image Pro Plus 6.0软件进行免疫组化表达的评价，随机选取心肌组织切片中至少3个阳性表达区，然后应用Image Pro Plus 6.0软件对阳性区域进行分析，随后计算其平均光密度，代表该切片中DACT2的表达强度。我们定义：当平均光密度<0.004时，DACT2为弱表达，当平均光密度≥0.004时，DACT2为强表达。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS19.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用卡方检验，采用非参数秩和检验评价DACT2表达水平和纤维化程度的相关性，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图1(A、B、F)所示，免疫组化提示在房颤心律组DACT2弱染色比例明显高于窦性心律组，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示DACT2基因在房颤组织中的表达量显著低于窦性心律组心肌组织中的表达量。

Masson染色提示(图1中的C、D、E)，与窦性心律组相比，房颤心律组的心肌细胞间有明显纤维化，差异具有统计学意义(P<0.05)。

这些数据表明DACT2在房颤中扮演一个保护性的角色，通过负性调控房颤心房纤维化从而起保护作用。

实施例2 DACT2基因过表达

1、从成年SD大鼠获取原代心房成纤维细胞，以含抗生素(100U/ml青霉素和100mg/L链霉素)和10％胎牛血清的DMEM(高糖)培养基在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％胰蛋白酶常规消化传代。

2、DACT2基因的过表达

(1)DACT2基因过表达载体的构建

过表达DACT2基因的Ad5-DACT2-eGFP病毒和Ad5-CON177-eGFP空病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司采用Ad-CMV-eGFP载体构建获得。

(2)转染

将细胞种于6孔板，培养24h后换含有每个细胞所需病毒multiplicityofinfection(MOI)(Ad5-DACT2-eGFP病毒或Ad5-CON177-eGFP空病毒)的新鲜培养基进行感染，18h后，吸去含有病毒的培养基，换新鲜培养基。

(3)免疫荧光检测

感染48h用荧光显微镜观察细胞的GFP荧光强度。

(4)Western blot检测

Ad-DACT2-eGFP感染细胞48h后将培养液吸弃，用预冷的PBS清洗3次，每孔加入100ul含有cocktail的裂解液用细胞刮将细胞刮下，吸至新的EP管，在冰面上裂解细胞30min，4℃离心，13000G 10min，吸取上清。BCA法进行蛋白定量。取一定量的蛋白样品，加入6×的Loading Buffer，100℃加热5min使蛋白变性。取等量蛋白(20μg)进行SDS-PAGE电泳，先以60V的电压至条带出浓缩胶，后以90V恒压跑至溴酚蓝至胶的底沿。用湿转方法将SDS-PAGE胶中蛋白电转移至PVDF膜上，60V恒压的条件下转膜2h。室温下用含5％脱脂奶粉的TBS-T孵育lh以封闭膜上非特异性结合位点，分别加入相应的一抗(用5％脱脂奶粉的TBS-T稀释)，4℃过夜。次日TBS-T洗膜3次，每次10min。加入相应的辣根过氧化物酶标记的抗鼠或兔IgG二抗(均为1︰5000稀释)，室温孵育1.5h，TBS-T洗膜3次，每次10min。ECL发光液显色，用化学发光成像仪(ChemiDoc Touch)曝光。以GAPDH为内参。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS19.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

如图2所示，免疫荧光检测及Western Blot检测显示，与空载组(Control)相比，Ad-DACT2-eGFP感染组(DACT2)的DACT2的蛋白表达水平明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示腺病毒Ad-DACT2-eGFP成功感染SD大鼠心房原代成纤维细胞，并且过表达DACT2。

实施例3 DACT2基因过表达对SD大鼠心房原代成纤维细胞的影响

1、采用RT-PCR法检测DACT2基因对SD大鼠心房原代成纤维细胞中胶原蛋白I和II表达水平的影响。

2、RT-PCR具体步骤如下所示：

Ad-DACT2-eGFP感染H9C2细胞48h后使用Trizol法提取RNA，cDNA合成使用PrimeScript^TM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒，条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃保存。Real-time PCR使用的是TB Green^TM Premix Ex Taq II(TliRNAseH Plus)试剂盒，检测仪器为LightCycler480荧光定量PCR仪，反应条件为：预变性：95℃，30s；PCR反应：95℃，5s；60℃20s；40个循环；熔解曲线设置：95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。

内参基因选择β-actin，空白对照以超纯水代替模板DNA，目标基因的相对表达量采用2^－△△CT方法。所使用的相关基因引物序列如下：Collagen I上游引物：5’-GTACATCAGCCCAAACCCCA-3’(SEQ ID NO.3)，下游引物：5’-CAGGATCGGAACCTTCGCTT-3’(SEQID NO.4)；Collagen III上游引物：5’-AGGGCAGGGAACAACTGATG-3’(SEQ ID NO.5)，下游引物：5’-GGTCCCACATTGCACAAAGC-3’(SEQ ID NO.6)；β-actin上游引物：5’-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3’(SEQ ID NO.7)，下游引物：5’-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3’(SEQ ID NO.8)；上述实验重复3次。

2、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS19.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3、结果

如图3所示，RT-PCR检测显示DACT2过表达组collagen I和collagen III的表达水平显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明DACT2可抑制瓣膜病心肌细胞的纤维化水平。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中山大学附属第一医院

<120> DACT2基因在制备房颤诊断和治疗产品中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2325

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atgtggacgc cgggcggacc cccggggtcc gcgggctggg accgccgtag gttgggcgcg 60

aggttgcgcg cggcgttcgc ggggctgcag gagctgcagg ggctgcgagc cacgcagcag 120

gagcgggtac ggggcgccct ggccctgcag cccccgcccg cgcccgccgc gccctgcggc 180

ccccacggcc tccacggccc cgagcagcag ctggaggcgg cgctggccgc gctgcaggag 240

cagctgtccc ggctgagaca acaggacatc ggcctgaaga cccacctgga ccagctggac 300

ctgcagatta gcaagctgca gctggatgtg ggcacagcct caggggaggc cctggacagc 360

gacagcaggc ccagctcagg cttttacgag atgagcgacg gtggatcctg ctccctgtcc 420

acgtcctgtg cctccgtctg cagtgaccac atctctccct cgctgggcag tttgttgcct 480

gtggcccagg cccacaaggc caggcccagc atgggggact ggaggccccg gtcggttgat 540

gagactactg tgccagcgtg gagaccccag gctaccgagg agggcgccag gcccccaggg 600

agcgtggagg atgcaggcca gccgtggggc acattctggc ccaggcctgt gtctacaggt 660

gatcttgaca gagccctgcc ggcggacacg gggctccaga aagccagcgc ggacgccgag 720

ctcctcgggc tcctctgcca gggggtggat atcccgctgc acgtgccgga ccccaagtat 780

cggcaggacc tggtgtccca gggcggcagg gaggtgtacc cgtaccccag ccccctgcac 840

gccgtggctc tacagagccc cctgtttgtc ctgactaagg aaaccccaca gagaggtggc 900

ccctcgttcc ctagggagag ccccaggggc cccgcaggtc tgaacaccat ccagactggg 960

ccggtcctcg aggctggccc ggccagggcc agagcttata tcgacaggtt gctgcatctg 1020

tggggccggg agaccccagc aaagggtagc gagggagaac agggacctct aaggcatgca 1080

gcgtccccat ctccacagag gcagggtggc tggagtacag acggtggagg gcgactgctg 1140

gtcttcgccc cagggaggga ggacgaggga gggccagctc agagcagggg tgccggcagg 1200

ggcgggcccc agcagcaggg atacatgccc cttgagggtc cccagcagtc tggcagcctt 1260

ccagaggagg gctccaagcc ctcaaacagc tgtgtcctca gggagaccat ggtgcaggct 1320

tctcccagct caaaggccca gcagacaccc tcagctcagg actatggacg aggcaacatc 1380

atatccccat ccaggatgct ggacaagagc ccctcaccgg cctctgggca ctttgcccac 1440

ccatcctttg ctgccagcct gaaaatgggt ccccccaaga gcaaggctga aaaaatcaag 1500

agaagtccca tggacaaggt gctgaggttt gcaaggcagc cgctgcttct actggacagg 1560

cctgagggag cccatgcagc cccccagcca tccctggagt gggaccctgc ccactggccc 1620

acagggaggg gcgggctcca gcggaggcca gccctggcct gggaggcacc cgggcgctcc 1680

tgttctgagt ccaccctcta ccccatgcct gtcctcgtcc ccttggcagt ggccccgcag 1740

gagagccacc ggacctcagc ccaagccctg ttcccctttg aggcgtcact gctcacctca 1800

gtggccagga ggaagcatcg ccgctggcag tccaccgtgg agatctcggc ccgggcccgc 1860

ctggccagct gtcctgagtc taacctgggg ccccccaggc ccgtggccag gagagcaggt 1920

ggcccactgg cccggggccg tccctcactg gtccgccagg acgcctacac caggagcgac 1980

tcagagccct ccaagcactc ggccgagtgt gacccgcggt tcccgtcagt catcccggag 2040

accagcgagg gagagtccag tgaccacacc accaaccgat tcggagaccg tgagtccagc 2100

agcagcgacg aggagggcgg cgcccagagc agggactgtg acctggcact gggctatgtg 2160

gcggccgggc atgcggagct ggcctggacc caggaggccc cggtcagctc ggggccactc 2220

ctgtcccccg tgcccaagct gtgccgtatt aaggcctcca aggccctgaa gaagaagatc 2280

cgcaggttcc agccgacggc cctgaaggtc atgaccatgg tgtga 2325

<210> 2

<211> 774

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Trp Thr Pro Gly Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Trp Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Leu Gly Ala Arg Leu Arg Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gln Glu Leu

20 25 30

Gln Gly Leu Arg Ala Thr Gln Gln Glu Arg Val Arg Gly Ala Leu Ala

35 40 45

Leu Gln Pro Pro Pro Ala Pro Ala Ala Pro Cys Gly Pro His Gly Leu

50 55 60

His Gly Pro Glu Gln Gln Leu Glu Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gln Glu

65 70 75 80

Gln Leu Ser Arg Leu Arg Gln Gln Asp Ile Gly Leu Lys Thr His Leu

85 90 95

Asp Gln Leu Asp Leu Gln Ile Ser Lys Leu Gln Leu Asp Val Gly Thr

100 105 110

Ala Ser Gly Glu Ala Leu Asp Ser Asp Ser Arg Pro Ser Ser Gly Phe

115 120 125

Tyr Glu Met Ser Asp Gly Gly Ser Cys Ser Leu Ser Thr Ser Cys Ala

130 135 140

Ser Val Cys Ser Asp His Ile Ser Pro Ser Leu Gly Ser Leu Leu Pro

145 150 155 160

Val Ala Gln Ala His Lys Ala Arg Pro Ser Met Gly Asp Trp Arg Pro

165 170 175

Arg Ser Val Asp Glu Thr Thr Val Pro Ala Trp Arg Pro Gln Ala Thr

180 185 190

Glu Glu Gly Ala Arg Pro Pro Gly Ser Val Glu Asp Ala Gly Gln Pro

195 200 205

Trp Gly Thr Phe Trp Pro Arg Pro Val Ser Thr Gly Asp Leu Asp Arg

210 215 220

Ala Leu Pro Ala Asp Thr Gly Leu Gln Lys Ala Ser Ala Asp Ala Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gln Gly Val Asp Ile Pro Leu His Val Pro

245 250 255

Asp Pro Lys Tyr Arg Gln Asp Leu Val Ser Gln Gly Gly Arg Glu Val

260 265 270

Tyr Pro Tyr Pro Ser Pro Leu His Ala Val Ala Leu Gln Ser Pro Leu

275 280 285

Phe Val Leu Thr Lys Glu Thr Pro Gln Arg Gly Gly Pro Ser Phe Pro

290 295 300

Arg Glu Ser Pro Arg Gly Pro Ala Gly Leu Asn Thr Ile Gln Thr Gly

305 310 315 320

Pro Val Leu Glu Ala Gly Pro Ala Arg Ala Arg Ala Tyr Ile Asp Arg

325 330 335

Leu Leu His Leu Trp Gly Arg Glu Thr Pro Ala Lys Gly Ser Glu Gly

340 345 350

Glu Gln Gly Pro Leu Arg His Ala Ala Ser Pro Ser Pro Gln Arg Gln

355 360 365

Gly Gly Trp Ser Thr Asp Gly Gly Gly Arg Leu Leu Val Phe Ala Pro

370 375 380

Gly Arg Glu Asp Glu Gly Gly Pro Ala Gln Ser Arg Gly Ala Gly Arg

385 390 395 400

Gly Gly Pro Gln Gln Gln Gly Tyr Met Pro Leu Glu Gly Pro Gln Gln

405 410 415

Ser Gly Ser Leu Pro Glu Glu Gly Ser Lys Pro Ser Asn Ser Cys Val

420 425 430

Leu Arg Glu Thr Met Val Gln Ala Ser Pro Ser Ser Lys Ala Gln Gln

435 440 445

Thr Pro Ser Ala Gln Asp Tyr Gly Arg Gly Asn Ile Ile Ser Pro Ser

450 455 460

Arg Met Leu Asp Lys Ser Pro Ser Pro Ala Ser Gly His Phe Ala His

465 470 475 480

Pro Ser Phe Ala Ala Ser Leu Lys Met Gly Pro Pro Lys Ser Lys Ala

485 490 495

Glu Lys Ile Lys Arg Ser Pro Met Asp Lys Val Leu Arg Phe Ala Arg

500 505 510

Gln Pro Leu Leu Leu Leu Asp Arg Pro Glu Gly Ala His Ala Ala Pro

515 520 525

Gln Pro Ser Leu Glu Trp Asp Pro Ala His Trp Pro Thr Gly Arg Gly

530 535 540

Gly Leu Gln Arg Arg Pro Ala Leu Ala Trp Glu Ala Pro Gly Arg Ser

545 550 555 560

Cys Ser Glu Ser Thr Leu Tyr Pro Met Pro Val Leu Val Pro Leu Ala

565 570 575

Val Ala Pro Gln Glu Ser His Arg Thr Ser Ala Gln Ala Leu Phe Pro

580 585 590

Phe Glu Ala Ser Leu Leu Thr Ser Val Ala Arg Arg Lys His Arg Arg

595 600 605

Trp Gln Ser Thr Val Glu Ile Ser Ala Arg Ala Arg Leu Ala Ser Cys

610 615 620

Pro Glu Ser Asn Leu Gly Pro Pro Arg Pro Val Ala Arg Arg Ala Gly

625 630 635 640

Gly Pro Leu Ala Arg Gly Arg Pro Ser Leu Val Arg Gln Asp Ala Tyr

645 650 655

Thr Arg Ser Asp Ser Glu Pro Ser Lys His Ser Ala Glu Cys Asp Pro

660 665 670

Arg Phe Pro Ser Val Ile Pro Glu Thr Ser Glu Gly Glu Ser Ser Asp

675 680 685

His Thr Thr Asn Arg Phe Gly Asp Arg Glu Ser Ser Ser Ser Asp Glu

690 695 700

Glu Gly Gly Ala Gln Ser Arg Asp Cys Asp Leu Ala Leu Gly Tyr Val

705 710 715 720

Ala Ala Gly His Ala Glu Leu Ala Trp Thr Gln Glu Ala Pro Val Ser

725 730 735

Ser Gly Pro Leu Leu Ser Pro Val Pro Lys Leu Cys Arg Ile Lys Ala

740 745 750

Ser Lys Ala Leu Lys Lys Lys Ile Arg Arg Phe Gln Pro Thr Ala Leu

755 760 765

Lys Val Met Thr Met Val

770

Claims

1.检测DACT2基因表达的产品在制备房颤诊断和/或治疗产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测DACT2基因及其表达产物的表达水平以诊断房颤的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断房颤的产品至少包括一对特异扩增DACT2基因的引物；所述用实时定量PCR诊断房颤的产品至少包括一对特异扩增DACT2基因的引物；所述用免疫检测诊断房颤的产品包括：与DACT2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断房颤的产品包括：与DACT2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断房颤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与DACT2蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与DACT2基因的核酸序列杂交的探针。

4.一种诊断房颤的产品，其特征在于，所述的产品包括检测DACT2基因及其表达产物的表达水平的RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测试剂盒。

5.根据要求4所述的产品，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测DACT2基因转录水平的针对DACT2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的DACT2蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测DACT2基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括DACT2蛋白的特异性抗体。

6.根据要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括针对DACT2基因的引物和/或探针。

7.DACT2基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗房颤的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的DACT2基因和/或其表达产物的促进剂是指能够促进DACT2基因表达或增强DACT2表达功能的试剂。

9.一种治疗房颤的药物，其特征在于，包括能够促进DACT2基因表达或增强DACT2表达功能的试剂。

10.DACT2基因在制备抑制瓣膜病心肌细胞的纤维化水平药物中的应用。