CN102046814A - 浓度测定 - Google Patents

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Abstract

一种通过使每个样本顺序地经受分析循环来确定至少一个分析物在多个样本中的浓度的方法，其包括使该样本和样本来源溶液与承载能够特定地结合该分析物的物种或分析物结合物种的传感器表面接触，检测到该传感器表面的结合的量，并且再生该传感器表面以使它为下一个分析循环做准备，并且基于检测到的与该传感器表面的结合，使用虚拟校准数据确定分析物在每个样本中的浓度，该虚拟校准数据从通过使固相与含已知浓度的分析物的样本接触获得的真实校准数据对每个分析循环来计算。

Description

浓度测定
技术领域
本发明涉及用于确定分析物浓度的测定(assay)，其包括与配体承载传感器表面的结合(binding)的检测，特别地涉及其中用相同的配体承载传感器表面顺序分析多个样本的这样的测定，其中在每个分析循环之间再生传感器表面。
背景技术
可以实时监测分子相互作用的分析传感器系统正获得日益增加的兴趣。这些系统常常基于光学生物传感器并且通常称为相互作用分析传感器或生物特定相互作用分析传感器。代表性的这样的生物传感器系统是由GE Healthcare Biosciences AB(乌普萨拉，瑞典)销售的Biacore
Figure BPA00001271961900011
仪器，其使用表面等离体振子共振(SPR)用于检测样本中分子和固定在感测表面上的分子结构之间的相互作用。利用该Biacore
Figure BPA00001271961900012
系统，不仅实时确定样本中特定分子的存在和浓度而且实时确定例如分子相互作用的结合速率和分解速率常数等另外的相互作用参数而不使用标记(labeling)是可能的。
一般，在生物传感器测定中，当分析物或分析物结合配体(取决于测定形式)已经结合到传感器表面上的固定配体时，结合的物种通过用合适的流体处理释放以使表面准备与新样本接触，即称为再生的过程。通常，传感器表面可以经受相当大量的分析循环。然而，许多配体(例如病毒抗原等)常常具有差的稳定性，其使表面的分析物结合能力随循环数而减小，并且可妨碍配体对于定量目的的使用。尽管结合能力的极微减小常常可以通过频繁校准补偿，这显著减小处理能力并且还由于试剂消耗而增加成本。
本发明的目的是提供该问题的解决方案并且提供最小化在表面的结合能力漂移期间频繁校准的需要并且显著提高定量测量的质量的测定方法。
发明内容
上文提到的目的以及其他目的和优势用包括规格化步骤的方法获得，其中每个分析循环使用特定的虚拟校准曲线评价，即每个分析循环获得唯一的校准曲线或特定校准系数。由此，甚至在配体承载传感器表面的情况下(其结合能力显出随已经用传感器表面分析的样本数目的显著漂移)，必需的校准运行的数目可以最小化。
在一个方面，本发明因此提供通过使每个样本顺序经受分析循环来确定至少一个分析物在多个样本中的浓度的方法，该分析循环包括使样本或样本来源的溶液与传感器表面接触，该传感器表面承载能够特定地结合分析物的物种或分析物结合物种。检测与传感器表面的结合的量，并且传感器表面然后再生以使它为下一个分析循环做准备。基于检测的与传感器表面的结合，分析物在每个样本中的浓度使用虚拟校准数据确定，从通过使传感器表面与含已知浓度的分析物的样本接触所获得的真实校准数据来对每个分析循环计算该虚拟校准数据。
真实校准数据通过在分析序列期间的至少两个、优选地三个或更多不同时间(例如在多个样本的序列的开始、中间和最后)执行的校准循环获得。每个校准用至少两个、而优选地五个或更多不同的浓度(循环)执行。
在一个实施例中，虚拟校准数据包括每个循环的特定虚拟校准曲线。这样的特定校准曲线可从对每个循环由真实校准数据预测的虚拟浓度来计算，其优选地通过将真实校准数据或曲线的已知浓度拟合到传感器响应的模型方程(典型地使用循环次数作为x以及使用响应作为y)来进行。
在另一个实施例中，虚拟校准数据包括每个循环的校准系数。这样的校准系数可从真实校准数据计算的校准方程预测。
固定到传感器表面的配体可是分析物特定配体、分析物或分析物类似物、或捕获剂，其进而结合分析物特定配体。可使用各种测定形式，包括直接测定、抑制型测定、竞争型测定和夹心测定。
本发明的更完整理解以及其的另外的特征和优势将通过参考下列详细说明和图获得。
附图说明
图1是在样本中具有不同的病毒浓度的三个情况(a-c)的在传感器表面上抑制型病毒测定的示意图示；
图2是与图1相似的示意图示，其中三个不同的病毒抗原固定到传感器表面上相应分开的点和对于每个抗原特定的三个不同的抗体用于定量化；
图3是示出在传感器表面上具有固定流感病毒抗原的抑制型测定中测量的相对响应/稳定性与不同流感病毒/抗血清混合物的浓度的关系的图。
图4是示出对于多个不同的流感病毒抗血清(influenza virus anti-sera)与具有固定流感病毒抗原的传感器表面的结合的所测量的相对响应与分析循环数的关系的图。
图5是示出在具有固定病毒抗原的传感器表面上运行的抑制型测定中对于在四个普通校准的病毒对照样本的七个浓度(0.156、0.31、0.625、1.25、2.5、5和10μg/ml)的基于作为x的循环数和作为y的测量响应的拟合规格化曲线的图。这些规格化曲线用于每个循环的虚拟浓度的预测。这些虚拟浓度然后用于使用虚拟浓度作为x和已知浓度作为y的循环特定校准曲线的构建。
图6是示出在具有固定病毒抗原的传感器表面上运行的抑制型测定中对于具有在不同循环数的四个普通校准的两个不同的对照样本浓度的所计算的浓度与分析循环数的关系的图。
图7是示出每个循环的虚拟校准曲线(根据图5)应用于如在图6中对于两个对照样本浓度的相同原始数据的图。
图8是与图7相似的图，示出对照样本的测量的结合数据和由虚拟校准曲线对每个循环规格化的对应数据。
图9A-C示出在用于同时检测三个不同病毒类型的测定中准备的校准曲线。
图10示出绘制的用虚拟校准估计的分析物浓度。
图11示出四参数方程的四个系数随循环数的变化。
图12示出形成典型的校准曲线的基础的病毒标准的许多传感图。
具体实施方式
简而言之，本发明涉及用于使用传感器技术、典型地生物传感器技术确定多个样本中分析物浓度的方法，其中来自校准运行的数据用于计算每个分析循环(即，每个样本)的虚拟校准数据，由此即使当传感器表面结合能力随执行的分析循环的数量存在相当大的降低时，避免频繁校准并且提高测量质量。
首先，关于生物传感器技术，生物传感器大体上限定为使用与固态物理化学换能器直接结合的用于分子识别的部件(例如具有固定抗体的层)，或具有与该换能器结合的可移动载体珠/颗粒的装置。尽管这样的传感器典型地基于检测固定层的质量、折射率或厚度的变化的无标记技术，也存在依赖于一些种类的标记的生物传感器。用于本发明的目的的典型传感器包括但不限于质量检测方法，例如光学方法和压电或声波方法，其包括例如表面声波(SAW)和石英晶体微天平(QCM)方法。代表性的光学检测方法包括检测质量表面浓度的那些方法，例如反射光学方法等，其包括外部和内部反射方法，其可以是角度、波长、偏振或相位分辨型的，例如隐失波椭圆光度法(evanescent wave ellipsometry)和隐失波光谱学(EWS，或内部反射光谱学)(其两个都可包括通过表面等离体振子共振(SPR)的隐失场增强)、布儒斯特角屈光计检查法(Brewster angle refractometry)、临界角屈光计检查法、受抑全反射(FTR)、散射全内反射(STIR)(其可包括散射增强标记)、光学波导传感器、外部反射成像、基于隐失波成像(例如临界角分辨成像、布儒斯特角分辨成像、SPR角分辨成像等)。此外，可能提到基于例如表面增强拉曼光谱学(SERS)、表面增强共振拉曼光谱学(SERRS)、隐失波荧光(TIRF)和磷光的光度测定和成像/显微术方法(“本身”或与反射方法结合)，以及波导干涉仪、波导泄漏模式光谱学、反射干涉光谱学(RIfS)、透射干涉量度法、全息光谱学和原子力显微术(AFR)。
基于SPR以及包括QCM的其他检测技术的生物传感器系统例如是商业上可获得的，两者例如具有一个或多个流动池(flow cell)的流通系统和如基于试管的系统。具有多个感测表面和流动系统的示范性SPR-生物传感器包括BiacoreTM系统(GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典)和ProteOnTM XPR36系统(Bio-Rad实验室)。这些系统准许实时监测结合的配体和感兴趣的分析物之间的表面结合相互作用。在该上下文中，“配体”是具有对给定分析物的已知或未知亲和力的分子并且包括固定在表面上的任何捕获或捕捉试剂，而“分析物”包括与其的任何特定结合搭配物。
关于SPR生物传感器，SPR的现象是众所周知的。可以说当光在某些条件下在不同折射率的两个介质之间的界面处反射时SPR出现，并且该界面涂敷有金属膜，典型地银或金。在BiacoreTM系统中，介质是样本和传感器芯片的玻璃，其通过微流体流动系统与样本接触。金属膜是在芯片表面上的薄金层。SPR使反射光的强度在特定反射角处降低。该最小反射光强度的角度随反射光的相反侧(在BiacoreTM系统中的样本侧)上的表面附近的折射率而变化。来自该系统的输出是“传感图”，其是检测器响应作为时间的函数的图。
Biacore
Figure BPA00001271961900051
仪器和SPR现象的技术方面的详细论述可在美国专利号5,313,264中找到。关于生物传感器感测表面的基质涂层的更详细信息在例如美国专利号5,242,828和5,436,161中给出。另外，与Biacore
Figure BPA00001271961900061
仪器连同使用的生物传感器芯片的技术方面的详细论述可在美国专利号5,492,840中找到。上文提到的美国专利的全部内容通过引用结合于此。
尽管在接着的示例中，本发明在SPR光谱学(更具体地BiacoreTM系统)的上下文中说明，要理解本发明不限于该检测方法。相反，可采用任何基于亲和力的检测方法，其中例如分析物等结合物种结合到固定在感测表面上的配体，假如可以测量在感测表面处的变化，其是分析物与其上的固定配体的结合的定量指示。
本发明的方法可关于显出引起在传感器表面上的漂移的显著不稳定性的任何配体有利地使用。示范性的这样的配体包括病毒抗原，例如血凝素(HA)等，并且该方法因此可具有在病毒检测的上下文中的特定关联。
在下面并且仅为了说明并且没有任何对其的限制，本发明将关于用于病毒抗原的检测和定量化的测定更详细地描述，具体地关于用于确定至少一个流感病毒在样本中的浓度并且更特别地在三价流感疫苗中的三个不同病毒类型的血凝素(HA)的浓度的抑制型测定。
一般，在抑制型测定(也叫做溶液竞争)中，已知数量的检测分子(这里是抗体)与样本(这里是病毒)混合，并且测量自由检测分子在混合物中的数量。更具体地，在本生物传感器上下文中用于浓度测量的抑制型测定可典型地包括下列步骤：
1.配体附着到传感器表面。
2.恒定浓度(其可以是已知或未知的)的检测分子添加到不同浓度的校准物溶液(分析物)。
3.该混合物与传感器表面接触(在流动系统中在表面上注入)并且测量响应。
4.计算校准曲线。
5.然后通过将样本(分析物)与恒定浓度的检测分子混合进行测量，样本与传感器表面接触(在流动系统中在表面上注入)并且测量响应。
6.该校准曲线用于计算样本中的分析物浓度。自由检测分子的数量与分析物在样本中的浓度逆相关。
7.表面再生并且可以注入新样本。
在要描述的方法中，配体是病毒抗原，优选地表面抗原(或可选地整个病毒)，而分析物是该抗原(病毒颗粒、病毒颗粒的部分或疫苗)和检测分子(其典型地是对该抗原的抗体)的混合物。该抗体可是多克隆的(例如血清)或单克隆的。在该特定情况下使用抑制型测定形式的优势是避免大病毒颗粒(抗原)对表面的扩散效果。当该测定(典型地)用于从人工培养的病毒纯化疫苗时，抗原可以是来自纯化过程的任何部分并且包括整个病毒或最后的疫苗，其可仅由表面抗原构成。
现在参照在附图中的图1至12。
如在图1a中示意描绘的，由标号1标明的纯化病毒HA固定在生物传感器传感器表面2上。使病毒颗粒3和含抗血清的抗体4的混合物作为液流在传感器表面2上通过。如在图1a中图示的，抗体4可以结合到病毒颗粒或结合到固定的HA抗原或在溶液中是自由的。结合到传感器表面增加来自传感器表面的响应信号。
图1b图示当在样本中没有病毒存在时的情况。最大数量的抗体4然后结合到在传感器表面上的HA抗原1，导致高响应信号。
在图1c中，在另一方面，高浓度的病毒颗粒3导致低量自由抗体4，并且因此测量到低响应信号。从而，在样本中病毒的浓度越高，到表面HA的结合抗体的数量越低，导致较低的响应水平。
如果传感器表面具有或能够提供多个分离的感测区域或“点”，例如三个或更多等，例如如在图2中示意图示的可固定三个不同HA，其中对于病毒类型/亚型A/H1N1、A/H3N2和B(其典型地使用在当前流感疫苗中)特定的HA固定到在传感器表面上的相应点。
如将在下文证明的，不同病毒抗血清到HA的结合是选择性的，即在不同的病毒类型或亚型之间没有交叉反应性。由于该选择性，在样本中的两个或更多不同的病毒成分(例如多价疫苗)可同时确定。
现在将描述应用于包含三个上文提到的病毒类型/亚型A/H1N1、A/H3N2和B的样本的本发明的示范性方法实施例。
来自三个不同病毒类型的HA固定在传感器表面上的三个不同点上。
然后执行校准过程。由每个病毒类型的固定浓度的标准抗血清构成的校准物与包含要测量的浓度范围的不同已知浓度的病毒(或病毒抗原)混合。该校准物然后注入(分别或所有三个类型一起)在传感器表面点上并且测量响应。然后从测量结果计算校准曲线。
为了说明，图12图示用Biacore
Figure BPA00001271961900081
系统对许多病毒标准获得的传感图(检测器响应与时间关系的曲线)的示例，其一起将提供典型的校准曲线。
病毒HA的样本含量的测量然后通过将每个样本与固定浓度的抗血清混合(一次一个，或优选地与所有三个抗血清)执行。该样本在传感器表面上注入并且测量自由抗血清浓度。校准曲线用于样本中病毒抗原浓度的计算。
然后再生表面(即，结合抗体通过使表面与合适的再生溶液接触从固定HA分离)，并且新的样本可以在表面上通过。
因为如上文提到的，固定抗原是不稳定的，这使传感器表面的能力减小。对照物测量/计算的浓度因此作为在新的校准运行执行前执行的分析循环的数目(或循环数)的函数增加，因为在抑制型测定形式中校准曲线将结合能力的降低解释为样本中HA浓度增加。该漂移随分析循环增加的数目增加，并且常常不是线性的，典型地指数的。如在本文中使用的术语“分析循环”包括在具有固定HA的传感器表面上通过病毒和检测抗体的混合物，然后使表面再生以使它为下一个分析循环准备的步骤。
因此，根据本发明，基于通常执行的多个校准(例如在分析序列的开始、中间和最后)，每个分析循环使用计算的对每个分析循环特定的“虚拟”校准数据评价。由此在漂移期间频繁校准的需要被有效地最小化并且使用例如上文提到的BiacoreTM系统等生物传感器系统的定量测量的质量相当大地提高。该新的校准例程可以采用不同的方式设计。
在一个变化形式中，来自校准运行的原始数据用于每个分析循环的虚拟浓度的预测，后跟循环特定校准曲线的计算和样本和对照物的浓度预测。
更具体地，对于用合适数目的不同浓度执行的每个校准，获得的响应拟合到模型函数，例如使用循环数作为x和响应作为y。该模型函数或方程可例如是指数函数，例如配体结合的双指数函数或标准型回归曲线模型，例如在下文的示例中描述的“四参数回归曲线”(下文也称为“四参数方程”)。产生的方程或曲线(每个浓度一个)然后用于计算每个分析循环的虚拟响应。这些虚拟响应数据然后用于计算每个循环的特定校准曲线，其可通过使用例如上文提到的四参数回归曲线完成。这些循环特定校准曲线然后用于样本和对照物的浓度预测。
在另一个变化形式中，校准方程对真实校准中的每个来计算，后跟每个分析循环的特定校准系数的预测。这些系数然后用于样本和对照物的浓度预测。
更具体地，使用在分析循环序列期间的不同时间获得的校准数据，对每个校准计算回归曲线模型的系数。该回归曲线模型可例如是配体结合的标准型回归曲线模型，例如上文提到的“四参数回归曲线”等，其中计算四个系数。对于每个系数，然后确定它的随循环数的变化，于是浓度可从使用的回归曲线模型计算。
上文提到的“四参数回归曲线”的四个系数(参数)中的每一个的变化的说明性示例在图11A(系数A＝Rhigh和D＝Rlow)和11B(系数B＝A2和logC＝logA1)中示出。对每个曲线指示的方程通过将相应系数作为循环数的函数来绘制而获得。
不同浓度和校准的必需的数目一般取决于使用的回归曲线模型。尽管至少针对相当小的浓度范围，以两个不同的分析循环数的校准和两个不同浓度可是足够的(线性回归曲线模型)，执行至少三个(例如三个或四个)校准并且使用至少5个(典型地6至8个)不同浓度是优选的(指数或“四参数回归曲线”)。
将在下文的示例4和5中更详细地描述的首先提到的方法变化形式典型地包括下列步骤：
在分析序列期间的不同时间用不同浓度执行校准以获得许多校准曲线；
对每个浓度使用循环作为x和检测响应作为y将校准曲线拟合到四参数方程或双指数函数以获得对应的响应与循环的关系曲线；
从不同的响应与循环的关系曲线对每个循环的相应浓度虚拟响应进行计算；
拟合到四参数方程以计算每个循环的特定校准曲线；以及
从该相应循环特定校准曲线确定在每个样本中的分析物浓度。
将在示例6中更详细地描述的第二方法变化形式典型地包括下列步骤：
在分析序列期间的不同时间用不同浓度执行校准以获得许多校准曲线；
将校准曲线拟合到“四参数方程”以确定每个校准曲线的四个系数的值；
对所有浓度相对于循环数来绘制系数值以获得每个循环的虚拟系数；以及
使用循环特定系数从四参数方程计算在每个样本中的分析物浓度。
在下列示例中，本发明的各种方面为了说明和非限制的目的更具体地公开。
示例
仪器
使用BiacoreTMT100(GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典)。该仪器(其基于在传感器芯片上的金表面处的表面等离体振子共振(SPR)检测)使用微流体系统(集成微流体控盒(cartridge)-IFC)用于使样本并且使缓冲液一个接一个或连续地通过四个分别检测的流动池(叫做Fc1至Fc4)。该IFC通过在BiacoreTMT100仪器内的对接机构被压入与传感器芯片接触。
Series CM5(GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典)用作传感器芯片，其具有涂敷金(大约50nm)表面，其具有羧甲基改性葡聚糖聚合物的共价联结的水凝胶基质(大约100nm)。
来自该仪器的输出是“传感图”，其是检测器响应(采用“共振单位”RU测量)作为时间的函数的图。1000RU的增加对应于在传感器表面上大约1ng/mm2的质量增加。
示例1：流感病毒A/H3N2/Wyoming(怀俄明州)、A/H3N2/New York 和B/Jilin的测定
材料
血凝素(HA)A/H3N2/，Wyoming/3/2003、Wisconsin和New York来自美国梅里登Protein Sciences公司。
HA A/H1N1，New Caledonia/20/99来自以色列ProsPec，Rehovot。
HB/Jilin来自美国圣地亚哥GenWay Biotech公司。
血清以及病毒菌株来自英国哈福德郡的波特斯巴NIBSC-国家生物学标准和管制所。
测定和样本缓冲液：HBS-EP+，GE Healthcare。
表面活性剂P20：GE Healthcare。
方法
HA(H3N2、H1N1和B)固定到在Biacore T100的三个相应流动池中的CM5传感器，其使用如下胺偶联(amine coupling)：
H3N2/Wyoming和Wisconsin：在10mM磷酸盐缓冲液中10μg/ml，pH7.0，0.05％表面活性剂P20，7分钟。
H3N2/New York：在10mM马来酸盐缓冲液中10μg/ml，pH6.5，0.05％表面活性剂P20，7分钟。
B/Jilin：在10mM马来酸盐缓冲液中5μg/ml，pH6.5，0.05％表面活性剂P20，20-30分钟。
固定水平是5000-10000RU。
对相应病毒菌株的血清被稀释以获得大约500-1500RU。
执行三到十次具有血清的启动循环。
校准曲线用病毒抗原(HA)准备，首先如由供应商推荐的在MQ中稀释(HA然后采用等分试样保持冷冻)，然后在血清中进一步稀释到典型地0.1-15μg/ml。
标准和样本具有400s注入时间。
采用后跟30s稳定化的50mM HCl，0.05％表面活性剂P20，30s来执行再生。
示例2：相同病毒亚型的不同菌株的检测的通用性
H3N2菌株Wyoming HA固定到CM5传感器芯片并且表面与不同的病毒/抗血清组合接触：来自Wyoming的病毒/抗血清(W/W)；来自New York的病毒/抗血清(N.Y./N.Y.)；Wyoming病毒和来自New York的血清(W/N.Y.)；New York病毒和来自Wyoming的血清(N.Y./W)。运行关于相应组合的校准曲线。结果在图3中示出。从图中，在不同病毒菌株之间存在交叉反应性是清楚的。Wyoming HA和病毒/抗血清因此可以用于New York菌株的定量化，并且反之亦然。
示例3：抗血清到不同流感病毒类型/亚型HA的结合中的选择性
对流感病毒A/H3N2、A H1N1和B的不同菌株的27个不同的抗血清在固定的H3N2 Wyoming HA上注入并且检测其结合。结果以及使用的菌株的列表在图4中指示。如从图明显的，所有H3N2抗血清结合具有高于100RU的信号，而所有H1N1和B抗血清具有低于50RU的信号。这指示若干病毒菌株可同时定量化并且H3N2的测量需要一个或仅少数HA。
示例4：虚拟校准过程
许多测定循环(大约100个)在Biacore T100和CM5传感器芯片上运行，在此期间四个普通校准用对照样本的七个不同浓度执行(0.156、0.31、0.625、1.25、2.5、5和10μg/ml)。函数y(x)＝a*exp(-b*x)+c*exp(-d*x)+e(使用循环数作为x，响应作为y和a、b、c、d以及e作为拟合参数)对七个不同浓度中的每个来拟合。该结果在图5中示出，其中顶部曲线代表对照物的最低浓度(0.156μg/ml)(即，最高响应-抑制测定)并且底部曲线代表最高(10μg/ml)(即最低响应)。方程然后用于每个循环的虚拟响应的计算。这些响应然后用于每个循环的校准曲线的计算，其中使用在下文的示例6中描述的标准类型“四参数回归曲线”。从这些循环特定校准曲线，做出在确切该循环运行的样本和对照物的预测，如下文参照图6和7描述的。
图6图示在2个对照物(1.0μg/ml和0.5μg/ml)的计算浓度上的漂移。运行很多测定循环并且四个中间校准在由双虚线箭头指示的循环数处执行。在每个校准后的3(2)个对照物的浓度针对前面最靠近的校准曲线计算。如由虚线箭头指示的，随到校准的距离增加，在计算的浓度方面存在系统性增加。该计算浓度的增加是由于来自对照样本的减小的信号。这进而由于表面的结合能力作为循环数的函数的减小引起，校准曲线将其解释为增加的浓度。该结合能力的减小在图3和图4中也是可见的。
上文描述的虚拟校准方法到图6中的原始数据的应用给出在图7中示出的0.5和1.0μg/ml对照物的浓度估计，这在对照样本浓度预测方面具有可重复性的相当大的提高。
示例5：通过虚拟校准程序使结合数据规格化
HA重组蛋白质HB/Jilin、H1N1/New Caledonia和H3N2/Wyoming被固定。获得校准曲线。稀释样本并且测量和重新计算在0.5-15μg/ml之间的浓度。为了避免响应漂移，结果使用在上文的示例4中概述的规格化程序规格化，每个循环获得唯一的校准曲线。图8示出在对照样本(5μg/ml的B/Jiangsu/10/2003)规格化之前和之后的结果，给出250RU的响应，CV＝1.2％。
示例6：三个不同病毒类型的同时检测
三个流动池固定有三个不同的重组流感病毒HA蛋白质：H1N1/New Caledonia、H3N2/Wisconsin和B/Jilin。
来自三个流感菌株(H1N1/New Caledonia、H3N2/Wisconsin和B/Malaysia)的病毒标准被稀释并且混合在一起，使得每个标准的最终浓度是16μg/ml。校准曲线然后做成是从16μg/ml到0.5μg/ml的2倍连续稀释(2-fold serial dilution)。
要分析的三个疫苗(H1N1、H3N2和B)被稀释8、16、32和64倍。
三个血清(来自NIBSC的H1N1/New Caledonia、H3N2/Wisconsin和B/Malaysia)被稀释到给出500-700RU响应的浓度并且混合在一起。
要分析疫苗，标准和疫苗的复制品使用在“方法建立器(Method Builder)”中创建的方法首先与血清溶液混合并且然后允许流过所有流动池。
来自“方法建立器”的一般方法：
启动(7个循环，仅血清，接着再生)
校准曲线1(14个循环)
样本(12个循环)
校准曲线2(14个循环)
样本(12个循环)
校准曲线3(14个循环)。
每个菌株的校准曲线1-3在图9A-C中示出，其中在每个图中校准曲线1是顶部曲线，校准曲线2是中部曲线并且校准曲线3是底部曲线。
结果然后关于三个校准曲线规格化。这通过执行校准曲线到四参数回归曲线(方程1)(其常规与Biacore系统一起用于确定浓度)的四参数拟合来进行以确定四个系数：
Response = R high - ( R high - R low ) 1 + ( X A 1 ) A 2 - - - ( 1 )
其中Rhigh是在低病毒浓度的响应，Rlow是在低病毒浓度的响应，A1(EC50)和A2(Hill slope)是拟合参数并且X是病毒的浓度。
然后四个系数中的每一个在不同浓度获得的值针对分析循环数来绘制，由此获得每个系数的方程。使用用上文的方程1获得的系数，计算规格化的浓度。
结果
Figure BPA00001271961900153
根据制造商，在疫苗中的每个菌株的HA浓度应该是30μg/ml，用SRID分析。
示例7：CHO-HCP的确定
对BiacoreTMT100仪器设置方法以确定具有5000ng/ml浓度的CHO-HCP(中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白质)的二十个样本的浓度。三个标准曲线使用每个标准曲线的6-8个浓度在开始、中间和最后运行。该二十个样本在固定有抗CHO HCP的传感器芯片表面上注入300s。再生用10mM甘氨酸-HCl、pH1.5执行60s。浓度的评价通过虚拟校准执行，并且为了比较分别使用平均曲线和前面最靠近的校准曲线。结果在下文的表格中和在图10中示出。如可以在其中看见的，用虚拟校准评价的浓度具有4798ng/ml的平均浓度，其具有1.45的CV(％)。使用平均曲线评价浓度给出具有9.87的CV(％)的4795ng/ml的平均浓度，对于样本的评价使用前面的校准曲线给出具有4.76的CV(％)的4408的平均浓度，
虚拟校准
Figure BPA00001271961900161
浓度分析(用平均曲线计算)
Figure BPA00001271961900172
浓度分析(用最接近曲线计算)
Figure BPA00001271961900173
Figure BPA00001271961900181

Claims (14)

1.一种通过使每个样本顺序地经受分析循环来确定至少一个分析物在多个样本中的浓度的方法，其包括：
使样本或样本来源溶液与传感器表面接触，所述传感器表面承载能够特定地结合所述分析物的物种或分析物结合物种，
检测与所述传感器表面的结合的量，以及
再生所述传感器表面以使它为下一个分析循环做准备，以及
基于所检测到的与所述传感器表面的结合，使用虚拟校准数据确定分析物在每个样本中的浓度，所述虚拟校准数据从通过使固相与含已知浓度的分析物的样本接触而获得的真实校准数据来对每个分析循环来计算。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述虚拟校准数据包括每个循环的特定校准曲线。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述循环特定校准曲线从由所述真实校准数据对每个循环预测的虚拟浓度来计算。
4.如权利要求3所述的方法，其中预测所述虚拟浓度包括将所述已知校准数据拟合到模型函数以确定每个校准浓度的传感器响应-循环数关系。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述模型函数是配体结合的标准型回归曲线。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述模型函数是指数函数。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述虚拟校准数据包括每个循环的特定校准系数。
8.如权利要求7所述的方法，其中校准方程从所述真实校准数据计算，并且每个循环的虚拟校准系数由此预测。
9.如权利要求8所述的方法，其中预测所述虚拟校准系数包括将所述校准数据拟合到模型函数以确定每个循环的模型函数的系数的值。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述真实校准数据包括来自在所述多个样本的分析期间的至少两个、优选地至少三个不同时间执行的校准的数据。
11.如权利要求9所述的方法，其中每个校准用至少两个、优选地至少五至八个不同浓度执行。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述分析循环基于从直接测定、抑制测定、竞争测定和夹心测定选择的测定形式。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述分析循环基于直接型测定，并且分析物特定配体固定在所述传感器表面上。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述分析循环基于抑制型测定，其中所述样本与恒定量的检测分子混合，并且分析物或分析物类似物固定在所述传感器表面上。
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