CN112051399A - 用于评估生物材料中的流感病毒类型的非缔合的病毒尺寸颗粒的流式细胞术方法 - Google Patents

用于评估生物材料中的流感病毒类型的非缔合的病毒尺寸颗粒的流式细胞术方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及用于评估生物材料中的具有特定表位的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法和流体样品，所述方法使用与表位特异性结合的荧光抗体染色剂，其中对具有病毒尺寸颗粒和荧光抗体染色剂的所述流体样品进行流式细胞术，以鉴定荧光发射检测事件，该事件指示有非缔合的标记的病毒尺寸颗粒通过流式细胞仪的流动池，该非缔合的标记的病毒尺寸颗粒包含所述病毒尺寸颗粒和荧光抗体染色剂。

Description

用于评估生物材料中的流感病毒类型的非缔合的病毒尺寸颗 粒的流式细胞术方法
本申请是中国发明申请(发明名称：用于评估生物材料中的流感病毒类 型的非缔合的病毒尺寸颗粒的流式细胞术方法，申请日：2016年3月23日； 申请号：201680029170.X；国际申请号：PCT/US2016/023737)的分案申请。
交叉引用
本申请要求以下美国临时专利申请的优先权且将它们每一个引入作为 参考：序列号62/280,079，名称为FLOW CYTOMETRY METHOD FOR EVALUATING BIOLOGICAL MATERIALFOR UNASSOCIATED PARTICLES OF VIRUS SIZE，2016年1月18日提交，且其代理机构案卷编号为50911-00035；序列号62/280,029，名称为EVALUATING BIOLOGICAL MATERIAL FORUNASSOCIATED VIRUS-SIZE PARTICLES OF BACULOVIRUS VIRAL TYPE，2016年1月18日提交，且其代理机构案卷 编号为50911-00036；序列号62/280,042，名称为EVALUATINGBIOLOGICAL MATERIAL FOR UNASSOCIATED VIRUS-SIZE PARTICLES OF ADENOVIRUS VIRALTYPE，2016年1月18日提交，且其代理机构案卷编 号为50911-00037；序列号62/280,048，名称为EVALUATING BIOLOGICAL MATERIAL FOR UNASSOCIATED VIRUS-SIZE PARTICLES OFADENO-ASSOCIATED VIRUS VIRAL TYPE，2016年1月18日提交，且其 代理机构案卷编号为50911-00041；序列号62/273,874，名称为FLOW CYTOMETRY METHOD FOR EVALUATINGBIOLOGICAL MATERIAL FOR UNASSOCIATED PARTICLES OF VIRUS SIZE，2015年12月31日提交，且其代理机构案卷编号为50911-00040；和序列号62/137,102，名称为 FLOW CYTOMETRYMETHOD FOR EVALUATING BIOLOGICAL MATERIAL FOR UNASSOCIATED PARTICLES OF VIRUSSIZE，2015年3 月23日提交，且其代理机构案卷编号为50911-00027。
技术领域
本发明涉及生物材料中的非缔合的病毒尺寸颗粒的流式细胞术评估，包 括评估具有指示流感病毒类型的表位的该病毒尺寸的非缔合的颗粒的存在。
背景技术
在许多情况下需要快速、可靠、准确和经济有效地定量游离、非缔合的 病毒颗粒(正式称为病毒体)。量或定量是指计数和确定各病毒颗粒的浓度。
一些重要的情况涉及流感病毒的领域。流感病毒是正粘病毒家族中的病 毒，包括三类：A型、B型和C型流感病毒(也称为甲型流感病毒、乙型流 感病毒和丙型流感病毒)。传染性流感在人类中主要由A型和B型流感病毒 引起。A型和B型流感病毒血清型容易因遗传漂变而持续演变，这需要持续 开发新疫苗。这种A型流感病毒的需求越来越高，该病毒的血清型也容易通 过遗传漂变偶尔快速转变，这可能造成大流行的情况，并且迫切需要研究和加快疫苗开发。相对于传统疫苗，例如在具有增强的疫苗免疫原性的病毒样 颗粒的领域中，重要的研究也涉及开发用作更普遍流感疫苗的病毒剂。在疫 苗生产操作和研究和监测目的中，快速和准确地评估流感病毒和相关病毒剂 是一个重要的挑战，部分原因是由于这种遗传漂变和遗传漂移。
此外，在过去十年中出现的显著挫折之后，基因治疗领域目前正在复苏， 无论是在使用这种方法所追求的不同应用的广度还是深度方面。然而，随着 这种持续的成功，认识到从早期研究与开发转向后期临床试验和产品发布所 固有的挑战。主要问题是在支持商业化所必需的水平下，连续且合规地生产 病毒载体。随着成功试验数量的增长和多项产品认证的可能性增加，认识到 当前制造技术未能保持步伐，这被视为迫切需要创新的领域。最有问题的步 骤之一是在生长、收获、纯化和释放期间对病毒载体定量。诸如定量PCR和在260nm和280nm处的吸光度读数的目前的方法是高度可变的，导致在 任何给定步骤都存在对颗粒过高或过低的评估。制造的后果是产品损失、延 误和成本超支，这是严重的，但仍比不上对患者施用过少(无治疗效果)或过 多(不良免疫反应)产品相关的风险。显然，对于用于载体介导的基因治疗的 病毒颗粒的快速、更精确的量化方法有非常关键的需求。
一些传统的病毒量化方法包括病毒斑块测试(斑块滴度测定)、透射电子 显微镜(TEM)和免疫单扩散(SRID)测定。这些传统方法往往具有以下一个或 多个限制：耗时、昂贵、高度技术性、结果的高可变性和主观性。推荐通常 用于病毒定量的一些较新的方法包括场流分级和多角度光散射 (FFF-MALS)，可调电阻脉冲感测(TRPS)和纳米粒子跟踪分析(NTS)。所有这 些较新的方法在一些情况下可能相对于传统的量化方法可以具有一些优点， 但也具有限制，包括通常提供有限的病毒数据。
使用蛋白质和核酸荧光染色剂的组合进行精心控制的流式细胞术也用 于定量各种病毒。流式细胞术是一种分析技术，其中随着颗粒在流体样品中 流过，通过通常称为流动池的研究试管时测量颗粒的物理和/或化学性质。虽 然可以通过使流体样品经受各种刺激来研究流体样品，但光是一种常见的刺 激技术。含有流动池和相关流体流、光输送和光检测组件的装置通常称为流 式细胞仪。
已经使用Virus
Figure BDA0002536843450000032
流式细胞仪(ViroCyt，Inc.)来检测多种病毒的游 离、非缔合的病毒颗粒(有时称为病毒体)的存在，这是通过非常低且被精确 控制的样品穿过流动池的流速且组合使用具有不同荧光发射特征的两种荧 光染色剂，其中一种染色剂对于标记核酸具有亲和性，另一种对标记蛋白质 具有亲和性。染色剂对于病毒类型是非特异性的，但是对于两种荧光染色剂 的两种不同荧光发射的同时检测事件的鉴定可以指示这种非缔合的病毒颗 粒穿过流动池。与仅测量颗粒、病毒体或其他颗粒的存在的场流分级和多角 度光散射(FFF-MALS)、可调电阻脉冲感测(TRPS)和纳米粒子跟踪分析(NTS) 这些技术不同，由于用于计数的染料的性质，Virus
Figure BDA0002536843450000031
流式细胞仪提 供更多的生物相关信息。
上述类型的非特异性蛋白质和核酸染料是荧光的。染料分子在游离、未 结合状态下仅具有非常弱的荧光响应，但当分子取向在与粒子结合而变得固 定时，荧光响应的大小显著增加。从游离、未结合状态到结合状态的荧光响 应的这种增加可以是增加一个数量级以上。这允许从未结合的染料分子的背 景荧光中鉴定出结合的染料分子的强荧光信号，因为来自未结合的染料分子 的荧光响应相对弱得多。
然而，在某些情况下，这种流式细胞术技术有局限性。例如，该技术对 于无包膜病毒如腺病毒或腺相关病毒的评估不是最佳的。在该无包膜病毒上 不存在容易获得的包膜蛋白可显著限制病毒定量技术的准确性。作为另一个 实例，在一些系统(例如杆状病毒蛋白表达系统)中，目标病毒颗粒(例如杆状 病毒颗粒)可以存在于包含高浓度血清蛋白的流体中，该血清蛋白通常来自 胎牛血清(FBS)。当使用BacMam表达载体系统时，可能就是这种情况。这 些高血清蛋白浓度的存在使对来自染色的病毒蛋白的荧光信号与高水平的 来自染色的血清蛋白的背景荧光信号的区分显著复杂化，这可显著不利地影 响病毒定量的精度。
关于流感病毒，在鸡蛋中产生流感病毒是很常见的。这是在疫苗行业和 /或在研究目的中生产流感病毒的主要技术。由于与收获的流感病毒一起收集 的鸡蛋的附属物质的存在，对收获的流感病毒颗粒的流式细胞术鉴别显著被 复杂化。这种附属物质可以包括例如细胞碎片、鸡胚碎片、细菌、蛋白质聚 集体、脂质、脂质组装体、脂质-蛋白质组装体、卵磷脂、脂质-蛋白聚集体、 脂质体、核糖体、囊泡、蛋白质-核酸复合物或其他材料。这些附属材料中 的许多可以包括与相应染色剂结合的蛋白质或核酸组分，其可以产生更高的 背景信号水平，这可以使靶向的流感颗粒与染色的碎片信号的区分复杂化。 可以纯化收获的流感病毒样品致一定程度以除去至少一些这样的干扰附属 材料，这可以改善流式细胞术操作，但是这种纯化处理可能是耗时的并且可 以增加大量费用，特别是如果需要以非常高的程度纯化收获的流感病毒样品 以准备流式细胞术评估的话，并且即使在显著程度的纯化中，仍然存在这种 干扰物质。一些特别困难的附属材料是叶黄素，其当以显著浓度存在时可不 利地干扰核酸染色剂与感兴趣的流感病毒颗粒的结合，这可导致流感病毒颗 粒的显著少计。
鉴于涉及这些病毒和病毒剂的应用的重要性以及病毒试剂通常潜在的 毒性，将需要快速、便宜且可靠的定量技术。
发明内容
流式细胞术作为评估病毒颗粒的有用技术是相对较新的。生物材料的大 多数流式细胞术评估涉及到检测和研究尺寸大约为源自多细胞有机体或更 大有机体的细胞尺寸的颗粒的性质。这样的颗粒可以是单独的细胞或微球体 (通常由诸如胶乳或聚苯乙烯的材料制成)，其被官能化以具有结合较小的感 兴趣的生物单元的亲和力。这种微球也有时称为珠粒或微珠。通常在流式细 胞术中通过检测和分析从流动池发出的散射光来鉴定细胞或微球颗粒的存 在。还已经使用了各种荧光染色技术来提供关于这种颗粒的一些特定生物学 特性的附加信息，例如所检测到的细胞或与微球结合的生物材料的特定生物 学属性。通过还检测来自荧光染料的特定荧光发射来补充细胞或微球颗粒的 光散射检测。一些荧光染料包括结合于感兴趣的特定表位具有结合能力的抗 体的荧光分子以用于评估。然而，这些染料往往是荧光团，其无论是否结合 于颗粒都表现出高水平的荧光响应。通过流式细胞术有效定量流体样品中的 病毒-尺寸颗粒，需要计算病毒尺寸的各个非缔合的颗粒、测量样品流量、 并根据测量的颗粒数量和测量的样品流量计算病毒尺寸颗粒的浓度。与荧光 染色剂不同，来自未结合的荧光团染色剂的背景信号的存在是一个重大问 题。可以使用一些技术来确保检测到的荧光信号与感兴趣的细胞或微球相关 联，而不是来自染色的碎片或可能残留在溶液中的游离的未结合的荧光染色 剂分子。用所需的荧光染料染色颗粒后，颗粒可以从在溶液中含有残余荧光 染色剂分子的液体中分离，例如通过过滤或通过加速沉降，例如通过离心和 倾析分离。然后将分离的细胞或微球颗粒重新悬浮在不含未结合的荧光染色 剂的新鲜悬浮液中。此外，可以执行时间相关分析以识别指示存在细胞或微 球颗粒的光散射检测和指示存在荧光染色剂的荧光发射检测的同时事件的 发生，这有助于确保检测到的荧光信号实际上与细胞或微球的生物材料的性 质有关。
然而，已经发现，可以使用荧光抗体染色剂进行病毒颗粒的流式细胞术 定量，并且不进行通过光散射检测的颗粒鉴定，不在病毒颗粒染色后从具有 残留的未结合的染色剂的液体中分离染色的病毒颗粒，且不需要同时检测非 特异性蛋白质和核酸染色剂。这有助于实际使用荧光团抗体染色剂来检测病 毒以用于病毒治疗和其它应用，并且不会由于光散射检测或同时检测核酸和 蛋白质荧光染色剂而使病毒尺寸颗粒的鉴定复杂化，并且不在染色后从流体 样品中的残留未结合的抗体染色荧光团去除染色颗粒。由于该病毒颗粒尺寸 非常小，这是显著的。
本发明的一个方面是用于评估生物材料样品的具有特定表位(即特定抗 体结合能力)的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法。特定的抗体-结合活性可指示 颗粒类型，例如病毒或病毒样颗粒的病毒类型或外来体或其它纳米颗粒的类 型。该方法包括将包含至少一部分待评估的生物材料样品的流体样品进行流 式细胞术，其中流体样品包含能够直接或间接与特定表位结合的荧光抗体染 色剂。该流式细胞术可以包括使流体样品流过流式细胞仪的流动池；使流过 流动池的流体样品经受能够引起来自荧光抗体染色剂的荧光发射响应的激 发辐射；以及在所述荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射并评 估所述检测到的辐射，以鉴定指示有所述病毒尺寸的非缔合的标记的颗粒通 过所述流动池的检测事件，所述病毒尺寸的非缔合的标记的颗粒包括具有所 述表位的所述病毒尺寸颗粒和荧光抗体染色剂。每个这样的检测事件对应于 单个这样的非缔合的标记的颗粒。
许多特征改进和附加特征适用于本发明的该方面和其它方面。这些特征 改进和附加特征可以在本方面的主题中或本发明的任何其它方面中单独使 用或以任何组合使用。因此，以下特征中的每一个可以与本方面的任何其他 特征或特征的组合或本发明的任何其它方面一起使用，但不是必须。
该方面的方法的主要应用领域是流感病毒领域，包括，例如在疫苗行业 常见的，在待评估样品包含来自鸡蛋的干扰性附属物质(包括上述任何此类 附属物质)的情况。疫苗行业正在不断开发和制造新的疫苗产品，以解决流 感病毒株的快速演变和出现，并且对于快速、低成本和可靠的用于定量流感 病毒类型的病毒尺寸颗粒的存在的技术具有显著需求。这种需求例如延伸到 量化流感病毒颗粒和其它病毒颗粒，例如流感病毒类型的病毒样颗粒。然而， 该方面的方法的变化也适用于其他病毒和病毒试剂应用，包括如下面进一步 讨论的。
该方法可以包括制备流体样品，其包括待评估病毒尺寸的非缔合的颗粒 的存在的生物材料和能够通过表位直接或间接与非缔合的病毒尺寸颗粒结 合的至少一种荧光抗体染色剂，从而形成在流式细胞术期间可检测的病毒尺 寸的非缔合的标记的颗粒。制备流体样品可以包括将待评估的生物材料或其 一部分与荧光抗体染色剂混合。使流体样品进行流式细胞术可以包括在流动 条件下使流体样品流过流式细胞仪的流动池，以使病毒尺寸颗粒单独通过流 动池。
被靶向以用于检测的非缔合的病毒尺寸颗粒可以是包括感兴趣的表位 的任何病毒尺寸颗粒。该颗粒可以具有多个表位，其中至少一个对于颗粒评 估是感兴趣的。多个表位可以在相同的感兴趣的病毒尺寸颗粒上是感兴趣 的，并且可以使用相应数量的不同荧光抗体染色剂进行靶向。可以被靶向用 于检测的一些非缔合的病毒尺寸颗粒的实例包括病毒颗粒(包括病毒和具有 病毒属性的诸如病毒样颗粒的颗粒)和外来体。本发明提供的讨论主要通过 参考病毒颗粒来举例说明，但是所讨论的原理也适用于具有可以被靶向用于 检测的特定表位的其他病毒尺寸颗粒(例如，外来体和其它纳米颗粒)。
该方法的显著优点是，不需要在流式细胞术之前从流体样品中除去溶液 中残留的未结合的荧光抗体染色剂。从用于评估的荧光标记的感兴趣的病毒 尺寸颗粒分离剩余未结合的荧光抗体染色剂将需要麻烦且耗时的处理，例如 超速离心。这与在以前的应用中从较大的标记颗粒如细胞或免疫测定珠中分 离抗体染色剂显著不同，并且将荧光抗体染色剂从病毒尺寸颗粒中分离比在 这种较大粒子背景中的分离显著地更复杂、耗时和昂贵。在优选实施方案中， 制备流体样品包括，在混合后，在流式细胞术之前，不从流体样品中除去未 结合的荧光抗体染色剂，即未结合在非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体染色 剂(例如在溶液中游离)。换句话说，当对流体样品进行流式细胞术时，来自 混合步骤的残余未结合荧光抗体染色剂可以保持在流体样品中，从而保留在 流体样品中。这种未结合的荧光抗体染色剂可以代表在所述混合步骤期间与 生物材料混合的大多数荧光抗体染色剂。然而，流式细胞术性能的一个重要 考虑是控制该残留的未结合的荧光抗体染色剂分子在溶液中的浓度，使得来 自这种未结合的荧光抗体染色剂分子的荧光发射信号不会覆盖或影响来自 非缔合的标记的病毒尺寸颗粒的荧光发射信号，并防止非缔合的标记的颗粒 的发射信号变化。在一些优选的实施方案中，进料到流式细胞仪的流体样品 可以具有该未结合的荧光抗体染色剂(未结合在非缔合的标记的颗粒中)的浓 度为以下：其范围的下限为0.25微克/毫升、0.5微克/毫升、0.7微克/毫升、 1微克/毫升、2微克/毫升、3微克/毫升或5微克/毫升，且上限为10微克/ 毫升、8微克/毫升、7微克/毫升、6微克/毫升、5微克/毫升、4微克/毫升、 3微克/毫升、2.5微克/毫升或2微克/毫升，其中上限大于下限。当流体样品 包括多种不同类型的荧光抗体染色剂时，残留的未结合的荧光抗体染色剂的 这种浓度可以应用到每种单独的荧光抗体染色剂类型的浓度和/或一部分或 全部荧光抗体染色剂的组合浓度。约2、约2.5或约3微克/毫升或在相对较 窄的范围内(例如，在0.5微克/毫升以内)高于或低于2、2.5或3微克/毫升的 残留的未结合的荧光抗体染色剂的这种浓度可优选用于许多实施方案。在一 些优选的实施方案中，进料到流式细胞仪的流体样品可以具有的荧光抗体染色剂的总浓度(包括残留、未结合的荧光抗体染色剂和在非缔合的标记的颗 粒中结合的荧光抗体染色剂)为以下：其范围的下限为0.25微克/毫升、0.5 微克/毫升、0.7微克/毫升、1微克/毫升、2微克/毫升、3微克/毫升或5微克 /毫升且上限为10微克/毫升、8微克/毫升、7微克/毫升、6微克/毫升、5微 克/毫升、4微克/毫升、3微克/毫升、2.5微克/毫升或2微克/毫升，其中上 限大于下限。约2、约2.5或约3微克/毫升或在相对较窄的范围内(例如，在 0.5微克/毫升以内)高于或低于2、2.5或3微克/毫升的荧光抗体染色剂的这 种浓度可优选用于许多实施方案。当流体样品包括多种不同类型的荧光抗体 染色剂时，荧光抗体染色剂的这种总浓度可以应用到每种单独的荧光抗体类 型的总浓度和/或一部分或全部荧光抗体染色剂的组合浓度。约2、约2.5或 约3微克/毫升或在相对较窄的范围内(例如，在0.5微克/毫升以内)高于或低 于2、2.5或3微克/毫升的这种浓度可优选用于许多实施方案。如将理解的， 对于荧光抗体染色剂的这种总浓度或残留的非缔合的抗体染色剂的浓度来 说的最佳浓度在特定应用之间可以有所不同，但是规定范围通常可应用于许 多应用。特定应用的最佳浓度可以取决于如下变量：例如，靶向的非缔合的 病毒尺寸颗粒的浓度、这种非缔合的颗粒上的表位的量(针对荧光抗体染色 剂的结合位点的数量)以及荧光抗体染色剂与非缔合的颗粒上的表位结合的 亲和力。在一些优选的实施方案中，进料到流式细胞仪的流体样品可以具有 的非缔合的标记的颗粒的浓度为以下：其范围下限为1x 105、1x 106或1x107个颗粒/毫升，且上限为1x 109、1x 108或1x 107个颗粒/毫升，条件是上限 大于下限。当流体样品包括具有不同表位(被不同类型的荧光抗体染色剂检 测)的多种不同类型的颗粒时，可以将非缔合的标记的颗粒的这种浓度应用 于每种颗粒类型的非缔合的标记的颗粒的浓度和/或所有待检测的颗粒类型 的一些或全部非缔合的标记的颗粒的组合浓度。在一些优选的实施方案中， 当将流体样品送入流式细胞仪时，基本上所有待检测的颗粒类型都是非缔合 的标记的病毒尺寸颗粒。在一些优选的实施方案中，当在流式细胞术期间发 生指示流式细胞术中非缔合的标记的病毒尺寸颗粒的检测事件时，每分钟存 在许多这样的检测事件，其范围下限为每分钟300、1000或10,000次这样的 检测事件，并且上限为每分钟325,000或100,000次这样的检测事件。如将 理解的，样品流体需要以各种不同的稀释程度运行，以获得所需浓度的非缔 合的标记的颗粒和荧光染料(结合和不结合非缔合的标记的颗粒)和每分钟检 测事件的适当计数。
本发明公开的方法的另一个优点是可以使用流式细胞术鉴定特定类型 的病毒尺寸颗粒(例如，如具有的特定抗原结合能力所示)，而不检测光散射， 以鉴定颗粒的存在，例如在鉴定宿主细胞中的病毒类型或附着于微球的病毒 类型时的情况。在优选的实施方案中，流式细胞术不包括(不存在)检测光散 射，并且可以仅包括检测荧光染色剂的荧光发射或仅检测一种或多种荧光抗 体染色剂的荧光发射。
荧光抗体染色剂可以包括连接到抗体分子上的一种或多种荧光组分，该 抗体分子特异性结合到病毒类型的靶标颗粒的表位。这些荧光组分可以是具 有荧光活性任何组分，以作用为附着于抗体分子的荧光标记。荧光组分与抗 体分子的连接可以是直接或间接的。连接可以通过化学键或其它附着机制。 可以包含在荧光抗体染色剂中的荧光组分的一些实例包括荧光团(荧光化合 物)、荧光导电纳米晶体(量子点)、荧光聚合物、荧光藻胆色素和重组荧光蛋 白。这里的描述主要参考荧光团的用途进行示例，但是该描述也适用于可附 着于抗体分子的其它荧光组分。在荧光团的情况下，该荧光抗体染色剂的每 个荧光抗体染色剂的抗体分子可优选包含的附着的荧光团基团(染料分子)的 平均数量(F/P比)的范围下限为3、4或5且上限为10、9、8或7，其中5至 7的范围对许多应用是优选的。荧光抗体染色剂的抗体分子可以是单克隆或 多克隆的。在许多情况下，单克隆抗体可优选用于靶向检测许多病毒类型。 然而，由于一些病毒的快速演变，多克隆抗体对于针对各种病毒血清型的评 估的一些应用可以是优选的。以下就是这种情况，例如流感病毒(特别是A 型流感病毒)和可能易于快速演变的其它病毒，例如易于快速遗传漂变、遗 传漂变和重组的病毒，例如RNA病毒。靶向用于评估的病毒类型可与任何 类型的病毒相关。除了流感病毒，一些示例的病毒类型，包括杆状病毒、腺 病毒、肠病毒、腺相关病毒(AAV)或诺如病毒以及它们具体的血清型。病毒 类型是指针对检测和鉴别的病毒属性的特定类别，并且其可以是家族、亚家 族、种或血清型水平或前述的任何可鉴别的子集。作为一些实例，靶标病毒 类型可以包括单一特异性血清型，或者可以包括多种血清型，它们共享共同 的抗原属性以与荧光抗体染色剂相互作用(例如，包括与相同的单克隆荧光 抗体染色剂结合的共同表位多种血清型)。在涉及在流体样品中评估两种不 同靶标病毒类型的存在的应用中，不同的病毒类型可以代表例如不同家族、 亚家族、属、种或血清型。一个这样的例子可以是评估流感病毒的两种不同 血清型(作为不同病毒类型)的存在。另一个这样的例子可以是评估作为两种 不同病毒类型的不同病毒种类。另一个这样的例子可以是评估两种不同病毒 家族，例如杆状病毒和不同病毒家族(例如，流感病毒、腺病毒、腺相关病 毒)的病毒样颗粒。应当理解，具有多克隆抗体的荧光抗体染色剂将包含多 种不同的染色抗体分子，其各自与靶标病毒类型的不同表位结合，例如与不 同血清型(例如，流感病毒的不同类型、亚型和/或株)上的不同表位结合。使 用多克隆抗体的一个优选实例是评估跨越多种血清型的流感病毒类型(例如，具有与A型和B型流感病毒二者的表位结合的抗体分子的多克隆抗体， 或与A型流感病毒的不同亚型和菌株和/或B型流感病毒不同菌株的表位结 合的多克隆抗体分子)。
如将理解的，流感病毒包括三种类型：A型、B型和C型，它们都具有 通常在约80纳米至120纳米范围内的病毒颗粒尺寸。靶标流感病毒的病毒 类型可以包括这三种类型中的任何一种或多于一种。A型流感病毒包括许多 不同的血清型，并且易于遗传漂变和偶尔的快速遗传漂变。因此，当靶标流 感病毒的病毒类型包括A型流感病毒时，多克隆荧光抗体染色剂通常是有益 的。同样地，当对A型和B型流感病毒血清型进行靶向分析时，多克隆荧 光抗体的使用通常可是有益的。然而，在分析是针对特定A型血清型或特定 针对B型流感病毒(其具有单一特异性靶标表位)的情况下，则可以优选使用 单克隆荧光抗体染色剂。C型流感病毒也可被靶向以用于评估，例如用于研 究目的。
在一些应用中，杆状病毒类型的病毒尺寸颗粒可被靶向用于评估，其作 为唯一的靶标病毒类型，或在也涉及靶向另一种病毒类型的应用中，例如同 时靶向评估其他病毒类型的病毒样颗粒。
杆状病毒是长达300nm的杆形状的病毒家族(杆状病毒科)，其特别可用 于产生重组蛋白质。杆状病毒通常在昆虫细胞中感染和复制，并且使用基因 修饰的杆状病毒表达载体在昆虫细胞系统中表达重组蛋白质是众所周知的 技术。杆状病毒也可以被基因修饰以包括哺乳动物启动子以驱动哺乳动物细 胞中的重组蛋白表达。包括可用于通过转导到哺乳动物细胞而将插入的遗传 物质转移的哺乳动物启动子的修饰的杆状病毒系统通常称为“BacMam”系 统，以用于将杆状病毒基因转移到哺乳动物细胞中。
杆状病毒也可用于生产病毒样颗粒，其可以包括多种病毒蛋白质。可以 在这种病毒样颗粒中表达的示例性病毒类型包括流感病毒、腺病毒和腺相关 病毒。取决于具体过程或过程中的处理阶段，杆状病毒可以是期望的产物或 不期望的污染物。在任一情况下，在生产操作中的各个点处对杆状病毒的准 确监测和定量对于过程和产品控制都是重要的。如上所述，当使用利用非特 异性的荧光蛋白和核酸染色的组合的现有技术时，在一些杆状病毒蛋白表达 系统(例如，BacMam系统)中胎牛血清(FBS)的存在可使来自感兴趣的病毒颗粒中的染色蛋白的荧光信号与来自染色的血清蛋白的高水平的背景荧光信 号的区分被显著复杂化。
荧光抗体染色剂可以通过表位直接或间接地与病毒颗粒结合。通过表位 直接结合，是指荧光抗体染色剂的抗体部分上的位点与表位结合。通过表位 间接结合，是指在表位和荧光抗体染色剂之间存在中间结合单元。例如，中 间结合单元可以是与表位直接结合的不同抗体(不同于荧光抗体染色剂的抗 体)，并且该荧光抗体染色剂与该抗体结合，从而使荧光抗体染色剂结合至 非缔合的标记的颗粒中。
荧光抗体染色剂可以包括荧光成分，例如荧光团，其通过任何方便的激 发辐射激发，且在激发辐射的吸收光谱和荧光发射的发射光谱之间具有适当 的斯托克斯位移。荧光团可以通过与其中染料处于固定的高度荧光状态的形 式的另一分子连接或缀合的荧光染料分子提供。荧光染料可以直接与抗体缀 合，或者可以与另外的组分缀合，然后该另外的组分与抗体连接(例如下面 讨论的生物素化的荧光抗体染色剂)。
荧光抗体染色剂或者其它也可以使用的荧光染色剂的激发辐射可以在 所用的一种或多种荧光染色剂的任何合适的一个或多个波长范围内。当使用 多种荧光染料时，优选不同荧光染色剂的发射光谱不重叠或仅最小程度地重 叠，从而便于单独检测。激发辐射通常可以在可见或近可见的光谱内(例如， 紫外至近红外)。激发辐射的一些示例光源包括提供窄光谱的LED和激光器。 各种小型激光器可用作激发辐射源。一些示例性激光器是绿光激光器，例如 绿色He-Ne或Nd:YAG激光器。提供激发辐射的其他可能的激光器在以下讨论，例如：Methods in Molecular Biology,Vol.263,Flow Cytometry Protocols, 第2版,Hawley、Teresa S.和Haley Robert G.编辑,Humana Press,2004,第23 章"Small Lasersin Flow Cytometry",Telford,William G.,399-418页；Methods in Cell Biology,Vol.102,Recent Advances in Cytometry,Part A:Instrumentation, Methods,Darzynkiewicz,Zbigniew等人编辑,Elsevier,2011,第15章"Lasers in FlowCytometry",Telford,William G.,375-407页；和Telford,William G.等人,Supercontinuum white light lasers for flow cytometry,Cytometry A.2009May, 75(5):450-459.doi:10.1002/cyto.a.20687。
在一些优选的实施方案中，当将两种或更多种不同的荧光染色剂用于单 一流体样品时，例如评估不同的生物材料组分(其可以是不同的病毒类型)时， 多个荧光染色剂可以优选地被相同的窄谱激发辐射激发，尽管在其它实施方 式中，可使用多个激发辐射源或提供多个激发辐射光谱的单个光源(例如， 可调白光源)，只要不同荧光染色剂的荧光发射响应可通过该不同的激发辐 射光谱区分。许多应用的一些示例性激发辐射可以是包括以下波长之一的窄 光谱：350纳米、405纳米、488纳米、532纳米、543纳米、561纳米和635 纳米。荧光发射光谱可以包括任何窄的光谱，通常在可见光和近可见光谱内。 通常优选荧光染色剂(包括荧光抗体染色剂)的荧光发射光谱相对于该荧光染 色剂的激发光谱峰值波长具有显著的峰值波长的斯托克斯位移。波长的斯托 克斯位移可以是至少5纳米，至少10纳米，至少20纳米或更多。许多荧光 染色剂具有10至50纳米范围内的斯托克斯位移，尽管有些可具有更大的斯 托克斯位移。
用于一些病毒类型的荧光抗体染色剂的一些示例性抗体示于表1。
Figure BDA0002536843450000121
Figure BDA0002536843450000131
荧光抗体染色剂的抗体可以是泛血清型抗体(与多种血清型结合)。来自 Takara的多克隆M149产品是抗人A、B型流感的兔多克隆抗体，其为跨越 多种流感病毒血清型(包括B型流感病毒和A型流感病毒的多种血清型)的泛 血清型。荧光抗体染色剂的单克隆抗体可以是血清型特异性的，或可以在一 定程度上是泛血清型。例如，表1中列出的ADK8/9是AAV-8和AAV-9血 清型的泛血清型。作为另一个实例，对于腺病毒，荧光抗体染色剂中的抗体 例如与存在于多种血清型间的衣壳蛋白结合。例如表1中列出的8C4即为这 种情况，其与存在于多种腺病毒血清型间的六邻体蛋白质结合。
可以在荧光抗体染色剂中使用多种荧光团。荧光团可以直接连接到抗体 上或通过连接基团连接。这样的连接基团可以是生物素化的抗体上的生物素 衍生的连接基团，荧光团缀合的抗生蛋白链菌素可以通过该连接基团与抗体 结合。为了便于参考，具有连接到生物素化抗体的荧光团的这种荧光抗体染 色剂在本发明中可被称为生物素化的荧光抗体染色剂。表2显示了Alexa Fluor产品系列(Life Technologies，Thermo FisherScientific)中可以以缀合形式 用作荧光团的一些示例荧光染料产品，以及染料分子缀合物的峰值激发(吸 收)波长和发射波长。缀合物的斯托克斯位移是这些波长之间的差异：
Figure BDA0002536843450000141
以缀合物形式被用作荧光团并与绿色激光激发光源一起使用的一些示 例染料(用于多种抗体以产生荧光抗体染色)，被示于表3中。
Figure BDA0002536843450000142
表2和3中列举的任何示例染料或其它染料可与表1中列举的任何示例 抗体一起用于荧光抗体染色剂中。
流体样品可以仅包含单一荧光染色剂，其将是荧光抗体染色剂。在替代 实施方案中，流体样品可以包含多种荧光染色剂(即，两种或多于两种不同 的荧光染色剂)，其中至少一种是荧光抗体染色剂。当使用多种荧光染色剂 时，两种或多于两种的荧光染色剂可以是荧光抗体染色剂和/或一种或多于一 种可以是荧光抗体染色剂以外的荧光染色剂，例如非特异性荧光染色剂。这 种非特异性荧光染色剂的一个实例是用于标记核酸的染色剂。非特异性荧光 染色剂，是指对病毒型不具有特异性的荧光染色剂。可由绿色激光光源激发的一种核酸非特异性荧光染色剂的实例是来自Life Technologies(Thermo FisherScientific)的POPO-3。当使用多种不同的荧光抗体染色剂时，不同的 荧光抗体染色剂可以被指向鉴定不同病毒类型的病毒颗粒，在这种情况下， 每种不同的荧光抗体染色剂都能够与不同病毒类型的不同病毒颗粒结合形 成不同的非缔合的标记的颗粒。流式细胞术可以包括在不同荧光抗体染色剂 的不同波长范围内检测来自流动池的辐射，以鉴定指示有不同非缔合的标记 的颗粒类型(其指示不同病毒类型的存在)穿过流动池的检测事件。
可以在液体介质中混合荧光抗体染色剂和用于评估的生物材料，例如在 缓冲的含水液体中进行。在混合期间，荧光抗体染色剂可以以荧光团已经连 接到抗体的形式提供，或者荧光抗体染色剂可以在混合期间由向混合所提供 的前体成分原位形成。荧光抗体染色剂可以在混合期间从这些前体的溶液中 形成，然后附着于非缔合的颗粒，和/或可在非缔合的颗粒上形成，以形成非 缔合的标记的颗粒。例如，在生物素化的荧光抗体染色剂的情况下，生物素 化的抗体染色剂可以预先制备并以预先制备的状态提供至混合物，例如分散 在缓冲溶液中的状态，或者生物素化的抗体染色剂的前体可被分别提供至混 合，并且可以在混合期间才第一次接触以便原位形成生物素化的抗体。作为 一个实例，预先制备的生物素化抗体和预先制备的荧光团:抗生蛋白链菌素缀 合物可以单独向混合步骤提供，例如在独立的缓冲溶液制剂中。预先制备的 生物素化抗体和预先制备的荧光团:抗生蛋白链菌素缀合物然后可以反应以 形成生物素化的荧光抗体染色剂。这种反应可在抗体与非缔合的颗粒结合之 前发生，和/或这种反应可在生物素化的荧光抗体已经结合到非缔合的颗粒之 后发生，在这种情况下，生物素化的荧光抗体染色剂可以直接在未缔合的颗 粒上形成，从而形成非缔合的标记的颗粒，同时形成生物素化的荧光抗体染 色剂。当将这些前体单独提供至混合时，可以以适当比例加入前体以提供所 需浓度的所得荧光抗体染色剂，优选不含大量的残留非缔合的荧光团:抗生蛋 白链菌素缀合物，其将显著增加额外的背景荧光。
被靶向用于检测的病毒尺寸颗粒可以是病毒颗粒。病毒颗粒是指病毒的 各个颗粒(例如病毒体)或病毒样颗粒，病毒类型是指与该类型病毒相关的病 毒或病毒样颗粒的特定类型。如将理解的，病毒样颗粒是与病毒相似但是由 于缺乏完整的病毒构成(例如病毒遗传物质)而不具有感染性的颗粒。被靶向 用于检测的病毒尺寸颗粒可以是具有用于与抗体结合的表位的外来体或其 他纳米粒子。
病毒尺寸颗粒或病毒尺寸的颗粒是指尺寸为单个、游离的病毒颗粒或病 毒体的数量级的颗粒，通常在几十纳米到几百纳米的范围内。在一些实施方 案中，病毒尺寸颗粒可以具有的尺寸范围下限为10纳米、20纳米、40纳米、 60纳米或80纳米，且上限为2微米、1微米、600纳米、300纳米或200纳 米。在一些实施方案中，病毒尺寸颗粒可以具有在该范围内的长度尺寸、直 径尺寸或最大截面尺寸中的任何一个或多个。所谓颗粒是非缔合的，是指颗 粒不是大于病毒尺寸的较大颗粒结构的一部分，例如非缔合的颗粒不在宿主 细胞内，或不与微球体结合，或不为大于病毒尺寸的聚集体的一部分。相对 于未标记的病毒尺寸颗粒(例如未标记的病毒体、外来体或病毒样颗粒)，非 缔合的标记的颗粒将会具有稍大尺寸。即使具有结合的荧光抗体染色剂，所 述非缔合的标记的颗粒也为病毒尺寸，并且其最大截面尺寸通常可以大于未 标记的病毒尺寸颗粒的最大截面尺寸，该未标记病毒尺寸颗粒的最大截面尺 寸的范围下限为10纳米、20纳米或30纳米，上限为200纳米、150纳米、100纳米、50纳米或25纳米，其中上限大于下限。例如，相对于未标记的 病毒尺寸颗粒，尺寸约为5至10纳米数量级的单个抗体分子通常可将标记 的颗粒的最大截面尺寸增加两倍，或增加约10至20纳米。如将理解的，间 接结合的抗体染色剂可以由于中间结合基团而使最大截面尺寸增加更大的 量。
待评估的生物材料可以从任何来源获得。一些示例来源包括：培养病毒 的制造操作(例如，疫苗生产)；制备基因修饰的病毒颗粒(例如，病毒样颗粒) 例如用于替代形式的疫苗，其中制备基因修饰的病毒以用于表达重组蛋白 质，或用于递送用于病毒治疗的遗传物质；或者制备纯化的病毒尺寸颗粒的 批次以测试生物流体制造中的排阻限(exclusionlimit)。该方法可以与这样的 制造操作相关联或作为其一部分而进行。生物材料可以是对初始生物材料的 先前处理的结果，该初始生物材料可以是已经纯化或以其它方式处理的粗物 质，以制备对流式细胞术评价的更合适的样品。可以提供生物材料用于以任 何方便的形式与荧光抗体染色剂混合，包括在缓冲水溶液中，例如磷酸盐缓 冲溶液中，其可以包含一种或多种添加剂或可用于加工的其它试剂。类似地， 荧光抗体染色可以以任何方便的形式提供，包括在缓冲溶液中，例如磷酸盐 缓冲溶液或其它缓冲溶液中。生物材料可以以纯化形式提供，例如可以由纯 化处理产生。这种纯化处理可以如国际专利公开WO2014/210370A1中所公 开的，其全部内容通过引用并入本文。可以提供生物材料以在Tris-HCl缓冲 溶液中与荧光抗体染色剂混合(如WO2014/210370A1中所公开用于流式细胞 术的)，或可使用不同的缓冲溶液。流式细胞仪可以例如是Virus
Figure BDA0002536843450000173
2100流式细胞仪，或优选为Virus
Figure BDA0002536843450000172
3100流式细胞仪(ViroCyt，Inc.)。 这样的流式细胞仪被特别设计为以非常低的样品流速操作以评估流体样品 中病毒尺寸颗粒的存在。尽管不太优选，也可以使用其它流式细胞仪，其使 得病毒尺寸颗粒充分集中在流体样品流的中心以在流动池中进行研究。配备 有用于激发辐射的绿光激光源的其它流式细胞仪的一些实例是
Figure BDA0002536843450000171
NxT (Thermo Fisher Scientific)、
Figure BDA0002536843450000174
Space(Sysmex)和S1000EXi(Stradedigm)。可以包括绿光激光以外的激发辐射源的其它流式细胞仪的一些 实例是ACSCaliburTM(Becton Dickinson)、BD LSRFortessaTM(Becton Dickinson)、BDFACSCantoTM(Becton Dickinson)、FACSVerse(Becton Dickinson)、GalliosTM(BeckmanCoulter)、CyAnTM ADP(Beckman Coulter)、 SE520EXi(Stratedigm)和SP6800(SONY)。如上所述，流体样品中的生物材 料可以是用于增强流式细胞术评估的纯化形式，并且其可以是根据 WO2014/210370A1中公开的方法纯化生物材料的粗样品的结果。
制备流体样品可以包括在将用于评估的生物材料与荧光抗体染色剂混 合之前纯化生物材料的粗样品，以制备用于进行流式细胞术的流体样品的生 物材料。纯化可以包括过滤出粗样品中较大尺寸杂质的颗粒。这种较大尺寸 的杂质可以包括大于病毒尺寸的颗粒。这种较大尺寸的杂质可包括例如细胞 碎片、细菌、分枝杆菌蛋白质聚集体、脂质、脂质组装体、脂质-蛋白质组 装体、卵磷脂、脂质-蛋白聚集体、脂质体、核糖体、囊泡、蛋白质-核酸复 合物或其它材料。过滤可以包括以下列过滤器分离尺寸或过滤尺寸的过滤： 不大于2微米，不大于1.5微米，不大于1.3微米，不大于1微米，不大于 0.9微米，不大于0.8微米或不大于0.75微米的过滤。分离尺寸通常可以是 至少0.05微米、至少0.1微米、至少0.3微米、至少0.4微米、至少0.5微米、 至少0.6微米或至少0.7微米。纯化可以包括层析去除至少一部分较小尺寸 的杂质(其可以小于病毒尺寸)。这种较小尺寸的杂质可包括例如蛋白质和/或核酸，以及衍生自病毒的物质，例如来自病毒的片段或碎片。层析去除可 包括离心机中的旋转层析。旋转层析可以包括在捕获较小尺寸杂质的色谱介 质的存在下离心要纯化的样品，其可以在缓冲溶液中。可以进一步处理包含 残留生物材料的上清液，例如通过过滤，或被直接提供以与荧光抗体染色剂 混合。
在其它实施方式中，流体样品可以包括未被纯化或未被纯化到显著程度 的粗制形式的生物材料样品。即使使用该生物材料的粗样品，标记的病毒尺 寸颗粒的荧光抗体染色剂峰值信号的特异性也可以与背景读数区分开。
在一些优选的实施方案中，流式细胞术可以包括以非常低的流体样品流 速使流体样品流过流式细胞仪流动池。这样的样品流体流速可以在每分钟 250-3000纳升的范围内。如上所述，也可以使用具有较大流速的流式细胞仪， 其能够将病毒大小的颗粒集中在流体样品流的中心以用于在流动池中研究。 这种流式细胞仪可以例如具有高达1毫升/分钟的流体样品流速。在优选的实 施方案中，流式细胞术可以包括用鞘液将流体样品流通过流体动力集中，并 使流体样品和鞘液流过流动池。此外，在一些更优选的实施方式中，流式细 胞术或该流式细胞术使用的流式细胞仪(例如，Virus
Figure BDA0002536843450000181
3100流式细胞 仪)可以采用对如下所述的荧光发射信号的颗粒属性进行评估：国际专利申 请号PCT/US2015/033907(公开号WO2015/187783)，标题为FLOW CYTOMTER PEAK SIGNALIDENTIFICATIONEMPLOYING DYNAMIC THRESHOLDING，其全部内容通过引用并入本文。这样，评估使用动态阈 值测定以鉴定颗粒计数的峰值信号阈值，并且其特别有利地用于与本公开的 方法一起使用以定量评估标记的非缔合的病毒尺寸颗粒。已经发现Virus
Figure BDA0002536843450000182
3100流式细胞仪具有以下有利能力：将来自非缔合的标记的病毒 尺寸颗粒的荧光响应信号与残留的未结合的荧光抗体染色剂的背景信号区 分开来；鉴定指示非缔合的标记的病毒尺寸颗粒通过流式细胞仪流动池的荧 光响应检测事件；根据这些检测事件对流体样品中的这种非缔合的标记的颗 粒进行计数；并相对于通过流动池的流体样品实时地计算并显示流动样品中 非缔合的标记的颗粒的浓度。Virus
Figure BDA0002536843450000192
3100流式细胞仪监测、测量并 小心控制流向流动池的流体样品流速，并且与其他流式细胞仪不同，其随着 时间的推移使用积分的流速测量数据，以确定通过流动池的样品流体体积， 从而用于浓度计算的目的。附加信息在WO2010/132053中提供，其内容通 过引用并入本文。
在一些实施方案中该流式细胞术可包括将检测事件计数为出现了通过 流动池的非缔合的标记的每一个颗粒，以确定通过流动池的流体样品体积中 非缔合的标记的颗粒的计数；确定与计数相对应的通过流动池的流体样品的 体积；和使用非缔合的标记的颗粒的计数确定通过流动池的流体样品体积中 非缔合的标记的颗粒的浓度。这样的计数可以相对于对应于检测事件的辐射 的检测而实时进行，并且浓度的确定也可以相对于流体样品通过流动池的体 积而实时进行。确定通过流动池的流体样品的体积可以包括用流量传感器实 时测量流体样品流向流动池的流速，并随时间对所得到的流速测量数据进行 积分。可以在不与光散射检测信息关联的情况下鉴定指示有非缔合的标记的 颗粒通过流动池的检测事件。流式细胞术操作控制和数据采集和分析(例如， 鉴定检测事件、计数、确定体积、确定浓度、流速测量数据、积分测量的流 速数据)可以由电子控制器执行，例如使用Virus
Figure BDA0002536843450000191
3100流式细胞仪。
流体样品可以包括多种荧光染色剂(两种或更多种荧光染色剂)，其中至 少一种是荧光抗体染色剂。在一些实施方案中，荧光染色剂可以是具有第一 荧光发射的第一荧光染色剂，并且流体样品可以包含具有不同的第二荧光发 射的不同的第二荧光染色剂(以及还可以有不同的第三或甚至更多不同的荧 光染色剂)。可以单独检测第一和第二荧光发射。用于第一荧光发射的第一 检测事件可以指示第一颗粒性质(例如，表位的存在)，并且用于第二荧光发 射的第二检测事件可指示第二颗粒性质(例如，存在不同表位或一些其他性 质)。第一和第二检测事件的不同性质可以与存在于单个病毒尺寸颗粒上的 两种性质有关(在这种情况下，第一和第二检测事件将与单个颗粒通过流动 池的时间重合)，或者可以与存在于不同颗粒上的每种性质有关(在这种情况 下，第一和第二检测事件不会在时间上重合)。这样的第一和第二荧光染色 剂可以被相同波长的激发辐射激发，也可不被激发，尽管为了简化操作，方 便地使两种荧光染色剂都被相同窄谱的激发辐射激发。
在一些实施方案中，第一荧光染色剂可以是荧光抗体染色剂，第二荧光 染色剂可以是核酸染色剂，其可以是非特异性荧光染色剂。用于第二荧光发 射的检测事件可以指示含有用荧光核酸染色剂染色的核酸的病毒尺寸颗粒 的通过。可以对第一和第二荧光染色剂的单独检测的结果进行比较，以鉴定 与所述第二检测事件在时间上重合的所述第一检测事件的出现，这可以进一 步指示同时包含表位和核酸性质的非缔合的标记的颗粒通过流动池，例如其 可以指示完整的病毒颗粒。第一和第二检测事件的比较可选地或附加地可以 包括鉴定不与第二检测事件在时间上重合的第一检测事件的发生，由于没有 遗传物质，这可以例如指示具有表位性质而不具有核酸性质的病毒样颗粒或 外来体(或其它纳米颗粒)。第一和第二检测事件的比较可以可选地或另外包 括鉴定不与第一检测事件在时间上重合的第二检测事件的出现，这例如可以 指示包含核酸性质但不包含表位性质的外来体(或其他纳米颗粒)。
当使用多种荧光染色剂时，会有多种荧光抗体染色剂。例如，具有第一 荧光发射的第一荧光抗体染色剂能够与第一表位结合，并且具有第二荧光发 射的不同的第二荧光抗体染色剂能够与不同的第二表位结合。也可以使用第 三种或更多种额外的荧光抗体染色剂和/或一种或多种非特异性染色剂(例 如，非特异性核酸染色剂)，尽管所用的流式细胞仪将需要具有区分所有不 同的荧光发射光谱的能力。可以分别检测第一和第二荧光发射。对第一荧光 发射的辐射的第一检测事件可以指示包括含第一表位的病毒尺寸颗粒的非 缔合的标记的病毒尺寸颗粒的通过，并且对第二荧光发射的辐射的第二检测 事件可以指示包括含第二表位的病毒尺寸颗粒的非缔合的标记的病毒尺寸 颗粒的通过。在病毒尺寸颗粒同时具有第一和第二表位的情况下，第一和第 二检测事件将在时间上重合，而当存在两种不同种类的病毒尺寸颗粒、一种 具有第一表位而另一种具有第二表位时，第一和第二检测事件不会在时间上 重合。例如，第一表位可以指示第一病毒类型的颗粒，第二表位可以指示不 同的第二病毒类型的颗粒。或者，第一和第二表位都可以指示相同的病毒类型，例如当病毒颗粒同时包含第一和第二表位时。在第一和第二表位都可指 示相同的病毒类型的情况下，该病毒类型可例如为这些示例病毒类型的任一 种。
为了获得关于待评价的生物材料样品的内容的更多的细节，可以通过流 式细胞术分别评估样品的不同部分，其中用于在每一个被不同的流式细胞术 评估的不同的流体样品中使用不同的荧光抗体染色剂。以这种方式，可以处 理生物材料样品的多个部分以制备不同流体样品的基质以用于流式细胞术， 使用不同的荧光染色剂组合以测试生物材料样品中颗粒性质的不同组合。每 种不同的流体样品可以例如包含荧光抗体染色剂与非特异性荧光染色剂(例 如，核酸染色剂)和/或与多种荧光抗体染色剂的不同组合。这样的矩阵型评 估可以例如用于制备并通过流式细胞术测试一种或多于一种不同标记的流 体样品，以评估所需病毒尺寸的产物颗粒的存在和/或评估是否存在不需要的 病毒尺寸的污染物颗粒。
包括流式细胞术在内的评估方法可以是包含病毒尺寸颗粒的产品的制 造方法的一部分，也可以与其关联进行。这种制造可以包括：在生物生产操 作中生成病毒尺寸颗粒；从该生物生产操作收获包含病毒尺寸颗粒的粗产 物；和纯化至少一部分该粗产物材料以制备包含病毒尺寸颗粒的纯化产物。 这样的纯化产物可以是最终产物，或者可以是可被进一步加工的中间产物。 作为制造的一部分或与制造关联而进行的流式细胞术评估可以包括从生产 处理的阶段收集生物材料样品(在该阶段病毒颗粒预期将存在于生物材料 中)，和评估所述样品是否存在具有特定表位的病毒尺寸颗粒，包括使至少 一部分样品进行流式细胞术。包括流式细胞术的这种评估可以例如包括所述 特征的任一种或以上所述特征的任何组合。这种制造可以包括进行多次收集 以从制造的多个不同阶段收集待评估的不同的所述生物材料样品，且对每个 这样收集的待评估的生物材料样品进行评估,包括流式细胞术。以这种方式， 可以通过制造处理的各个阶段来验证产品产量和质量，并且处理问题可以被 快速鉴定、分析并采取矫正行动。例如，可以在生成或收获期间的第一阶段 和在纯化期间或之后的第二阶段进行收集。
包括流式细胞术在内的评估方法可以在不是该制造的一部分或不是与 其关联的环境中进行。例如，可以结合研究或诊断活动来执行该方法。
本发明公开的方法的一个应用是当生物材料样品被怀疑包含病毒样颗 粒时评估生物材料样品的病毒样颗粒。以下就可以是这种情况，例如在制造 病毒样颗粒或包含病毒样颗粒的产品例如以用于疫苗或作为载体(载体)的操 作期间或与制造操作有关的期间。
本发明公开的方法的另一个重要应用是评估生物材料样品的流感病毒。 以下就可以是这种情况，例如在制备流感病毒以用于制备疫苗的制造操作期 间或与制造操作有关的期间。
本发明公开的方法的另一个重要应用是评估生物材料样品的杆状病毒 颗粒。以下就可以是这种情况，例如在使用杆状病毒产生重组蛋白或产生病 毒样颗粒的制造操作期间或与其有关的期间。
本发明公开的方法的另一个重要应用是评估生物材料的完整病毒颗粒。 这种病毒检测可以是评估病毒污染物和/或评估所需病毒产物的存在。在一个 变体中，病毒可以是被编辑用于病毒治疗的病毒。这样的病毒可以是例如抗 癌溶瘤病毒，其为用于基因治疗或免疫治疗的病毒载体。
本发明公开的方法的另一个重要应用是评估生物材料样品的外来体或 其他纳米颗粒。这样的外来体或其他纳米颗粒的检测可以例如有助于鉴定外 来体或其它纳米颗粒的污染物、或所需的外来体或其他纳米颗粒产物的存 在。外来体已经成为使用荧光蛋白和核酸染料的组合的病毒颗粒流式细胞术 中的假阳性指示的来源，因为这样的外来体有时包含可以被染色并错误鉴定 为病毒颗粒的蛋白质和核酸。此外，外来体或其他纳米颗粒可以独立地作为 研究对象。
本发明的另一方面是流体制剂形式的组合物，例如用于流式细胞术评估 的制剂中的流体样品。该流体制剂包含：
水性液体介质；
水性液体介质中的非缔合的标记的病毒尺寸颗粒，其浓度为1x 105至 15x 109个非缔合的标记的颗粒/毫升，其中所述非缔合的标记的颗粒各自包 含具有特定表位的病毒尺寸颗粒和对与所述表位直接或间接的结合有特异 性的荧光抗体染色剂；和
水性液体介质中非缔合状态的荧光抗体染色剂(不结合在非缔合的标记 的颗粒)的浓度范围为0.25(或更多)微克/毫升至10(或更少)微克/毫升。
许多特征改进和附加特征适用于本发明的该方面和其它方面。这些特征 改进和附加特征可以在本方面的主题或本发明的任何其它方面中单独使用 或以任何组合使用。因此，以下特征中的每一个可以但不是必须与本方面的 任何其他特征或特征的组合或本发明的任何其它方面一起使用。
这样的流体制剂可以是或具有关于该方法方面的流体样品所描述的任 何一个或多个特征。水性液体介质、非缔合的标记的颗粒及其浓度和组分、 病毒尺寸颗粒、表位、荧光抗体染色剂和非缔合浓度的荧光抗体染色剂的浓 度可以是或具有关于该方法方面的流体样品描述的任何一个或多个特征。
参照附图以及下面提供的讨论、参照下面描述的实施方式和权利要求书 将进一步理解本方面和其它方面的其它特征。
附图简述
图1显示了本发明的流式细胞术方法的一些实施方案的一般流程框图。
图2示出了图1的一般流程中的一些更具体的流程实施方案的流程框 图。
图3示出了可以在流式细胞术中与图2所示的流程一起进行的流程的实 例。
图4示出了图1的一般流程中的一些其他更具体的流程实施方案的流程 框图。
图5示出了可以在流式细胞术中与图4所示的流程一起进行的流程的实 例。
图6示出了图1的一般流程中的一些其他更具体的流程实施方案的流程 框图。
图7示出了可以在流式细胞术中与图6所示的流程一起进行的流程的实 例。
图8示出了图1的一般流程中的一些其他更具体的流程实施方案的流程 框图。
图9示出了图8的流程的纯化粗样品步骤中的一些更具体的流程实施方 案的流程框图。
图10-11是总结下面给出的实施例1的结果的图。
图12是总结下面给出的实施例2的结果的图。
图13-14是总结下面给出的实施例3的结果的图。
图15-16是总结下面给出的实施例4的结果的图。
图17是总结下面给出的实施例5的结果的图。
图18是总结下面给出的实施例6的结果的图。
图19是总结下面给出的实施例7的结果的图。
图20是总结下面给出的实施例8的结果的图。
图21是总结下面给出的实施例9的结果的图。
图22-23是总结下面给出的实施例10的结果的图。
图24-25是总结下面给出的实施例11的结果的图。
图26是总结下面给出的实施例12的结果的图。
图27-30是总结下面给出的实施例13的结果的图。
发明详述
图1显示了用于评估生物材料是否存在特定的目标病毒类型的非缔合的 病毒颗粒的流式细胞术方法的一般流程框图。图1所示的方法包括制备流体 样品102以制备流体样品104，然后对流体样品104进行流式细胞术106。 由制备流体样品102步骤得到的流体样品104包含能够与目标病毒类型的非 缔合的病毒颗粒直接或间接结合以形成非缔合的标记的颗粒的荧光抗体染 色剂，该非缔合的标记的颗粒可以在流式细胞术106期间检测。制备流体样 品102可以包括将待测试的生物材料与至少一种荧光抗体染色剂混合。图2 示出了图1所示的一般流程的更具体的示例性实施方案的流程框图，其中制 备流体样品102包括混合108步骤，在该步骤期间，待评估的生物材料110 与荧光抗体染色剂112混合，该荧光抗体染色剂112能够与指示生物材料110 所被评估的目标病毒类型的表位直接或间接结合。随着被引入混合108中， 生物材料110可以以适于处理的浓度存在于缓冲溶液中，并且可以是来自生 物材料的初始粗样品的先前处理的结果。可以将生物材料110进料到混合108中的这种溶液也可以包含在处理期间有用的其它添加剂或试剂。同样， 可以将荧光抗体染色剂在适当缓冲的溶液中与一种或多种添加剂或其它试 剂一起提供至混合108步骤。例如，在混合108之前，荧光抗体染色剂112 可以在缓冲溶液中提供，该溶液还包含用于稳定、有助于保护或分散荧光抗 体染色剂112的试剂。例如，荧光抗体染色剂112可以在含有抗凝聚剂(例如 牛白蛋白)和/或抗微生物剂(例如叠氮化钠)的缓冲溶液中提供。缓冲溶液可以 是磷酸盐缓冲溶液或在适当的PH下的其它缓冲溶液。
图3示出了可以在图2的示例性实施方式的流式细胞术106期间进行的 流程的实例。如图3所示，通过流式细胞仪的流动池114的流体样品104流 在流动池114中经受激发辐射116，例如来自激光、LED或其他光源的激发 辐射。在图3所示的示例中，通过流动池114的流体样品104的流沿着流动 箭头118的方向。检测器系统120包括用于在荧光抗体染色剂112的荧光发 射的波长范围内检测来自流动池的辐射的光学组件。图3中示出了非缔合的标记的病毒尺寸颗粒122的通过，该非缔合的标记的颗粒122包括具有与其 结合的荧光抗体染色剂的病毒颗粒。图3还示出了光电检测器的输出(C1)的 示例时间图124，其检测荧光发射并且在时间t1显示与该非缔合的标记的颗 粒122通过流动池114对应的峰值电压。另外为了说明的目的，图3示出了 流体样品104中的残留的、未结合的荧光抗体染色剂112，这会造成时间图 124中的一些更大的背景峰值。
进行流式细胞术106的图1的流体样品104可以使用两种或更多种不同 的荧光染色剂制成，其中至少一种是荧光抗体染色剂。图4示出了与图2所 示相同的示例流程，除了在混合108期间将第二荧光染色剂126提供给混合 108步骤以使其包含在进行流式细胞术106的流体样品104中。在图4所示 的实例中，第二荧光染色剂126是对于病毒型没有选择性的核酸的染色剂。 第二荧光染色剂126可以是荧光染色剂，并且可以在具有荧光抗体染色剂 112的单一制剂中提供，或者可以以独立的制剂提供。在优选的流程情况下， 可将荧光抗体染色剂112和第二荧光染色剂126提供在单一制剂中，例如具 有所需比例的单一缓冲溶液中，以被包含在流体样品104中。图5示出了图 4的流式细胞术106的流程的示例。如图5所示，通过流动池114的流体样 品104的流在流动池114中经受激发辐射116。在图5所示的图示中，检测 系统120包括用于检测来自荧光抗体染色剂112的荧光发射的第一光电检测器和用于检测来自第二荧光染色剂的不同荧光发射的第二光电检测器。图5 显示了包含其上附着有荧光抗体染色剂112和第二荧光染色剂126的非缔合 的标记的病毒颗粒128的实例。图5显示第一时间图130和第二时间图132， 第一时间图130具有检测来自荧光抗体染色剂112的荧光发射的第一光电检 测器的示例性输出(C1)，第二时间图132显示检测来自第二荧光染色剂126 的荧光发射的第二光电检测器的示例性输出(C2)。在第一时间图130和第二 时间图132中的时间t2处的电压峰的时间重合指示非缔合的标记的颗粒128 通过流动池114。在第二时间图132中显示的时间t1和t3处的电压峰值指示 含有第二荧光染色剂但不含有荧光抗体染色剂112的颗粒通过流动池114。 可包含第二荧光染色剂126而不是荧光抗体染色剂112的这种颗粒可以是例 如与非缔合的标记的颗粒128的病毒颗粒的病毒类型不同的病毒类型的病毒 颗粒。时间图130中显示的更大背景幅度和更大背景峰可以指示未结合的荧 光抗体染色剂112通过流动池114。为了说明的目的，图5显示在穿过流动 池114的流体样品104中存在的该未结合的荧光抗体染色剂112。第二时间 图132包括具有较小背景峰的背景图案，其指示第二荧光染色剂，该第二荧 光染色剂是在不附着在颗粒的核酸时提供非常少的背景荧光发射的荧光材 料。
图6示出了与图4所示相同的示例流程，不同之处在于提供给混合步骤 108的第二荧光染色剂是第二荧光抗体染色剂134，其特异结合至与荧光抗 体染色剂112不同的病毒类型的病毒颗粒的表位(例如不同病毒或相同病毒 的不同血清型)。可以使用如图6所示的流程来区分存在于生物材料110中的 不同病毒类型的病毒颗粒并定量流体样品中两种不同类型中每一种的病毒 颗粒的存在。图7示出了可以在图6所示的流程实例的流式细胞术106期间 发生的流程的实例。图7与图5相同，除了显示了流体样品104，其包含示 例性的第一类型的非缔合的标记的颗粒136和第二类型的非缔合的标记的颗 粒138，该第一类型的非缔合的标记的颗粒136包含具有与其连接的荧光抗 体染色剂112的第一病毒类型的病毒颗粒，该第二类型的非缔合的标记的颗 粒138包含附着有第二抗体染色剂134的第二病毒类型的病毒颗粒。图7示 出了第一时间图140和第二时间图142，第一时间图140示出了检测荧光抗 体染色剂112的荧光发射的第一光电检测器的示例性输出(C1)，第二时间图 142示出检测来自第二抗体染色剂134的荧光发射的第二光电检测器的示例 性输出(C2)。为了说明的目的，图7中的流体样品104显示为包含非缔合的 第一荧光抗体染色剂112和非缔合的第二荧光抗体染色剂134。如图7所示， 在时间t1的第一时间图140上的电压峰指示第一类型的非缔合的标记的颗粒 136通过流动池114，并且在第二时间图142中显示的t2处的电压峰指示第 二类型非缔合的标记的颗粒138通过流动池114。
图8示出了根据图1所示的一般流程的流程示例，其中制备流体样品102 包括在混合108之前纯化粗样品的步骤144。在纯化粗样品144期间，对生 物材料的粗样品146进行纯化处理以去除可能干扰流式细胞术106的至少一 部分杂质，以制备更纯形式的生物材料110，从而在混合108期间与荧光抗 体染色剂112混合，以制备流体样品104。为了说明的目的，图8中的流程 包括向混合108提供第二荧光染色剂148以使其包含在流体样品中。第二荧 光染色剂148可以是不同于荧光抗体染色剂112的第二荧光抗体染色剂，或 可以是非特异性荧光染色剂，例如核酸染色剂。生物材料146的粗样品可以 用缓冲溶液或其它试剂以稀释形式提供，也可以不以稀释形式提供，并且在 引入纯化粗样品144步骤之前可以经过处理或可以不经过处理。
图9显示了可以在图8所示的一般流程的纯化粗样品144步骤期间进行 的流程的实例。在图9所示的实例流程中，纯化粗样品144包括层析去除步 骤150，然后是过滤步骤152。在层析去除150期间，通过色谱法从生物材 料146的粗样品中除去较小尺寸的杂质154，其中较小尺寸的杂质154被保 留在色谱介质中。较小尺寸的杂质可以是小于病毒尺寸的杂质。然后对来自 层析去除150的经处理的液体156进行过滤152，以过滤出较大尺寸的杂质 158。较大尺寸的杂质158可以作为过滤器保留物被去除，并且提供给混合 108的生物材料110可以是或包含来自过滤152的滤液或其部分，其有或没 有进一步的处理。
实施例
在下面的实施例中，在Virus Counter3100流式细胞仪(ViroCyt，Inc.) 上进行流式细胞术测试。在这些实施例中提及的图中绘制病毒颗粒浓度相对 稀释因子的图是对数图。在染色后不洗涤染色的病毒样品、且不检测光散射 以辅助颗粒检测的情况下进行使用荧光抗体染色剂的流式细胞术测试。除了 下面另有说明，这些实施例中的荧光抗体染色剂通常包含的附着的染料分子 (荧光团)相对于荧光抗体染色剂中的每个抗体分子的平均数量(F/P比例)为3 至7。这些实施例中提供的荧光抗体染色剂浓度是样品中的总浓度。应当理 解，一些这种荧光抗体染色剂附着并染色样品中的病毒颗粒，但当对样品进 行流式细胞术时，样品中的大多数荧光抗体染色剂通常将处于未结合状态。 这些实施例中的所有样品流体用缓冲溶液制备为pH在pH7至pH8的范围 内。
实施例1-6
在下面的实施例1-6中，荧光抗体染色剂包括对于杆状病毒的gp64包 膜糖蛋白具有特异性的AcV1单克隆抗体，其与Alexa Fluor 532的染料(在 以下和图中鉴定为AFAcV1抗体染色剂)缀合或与CF532(在以下鉴定为 CFAcV1抗体染色剂)缀合。
实施例1
以约5x 106个非缔合的杆状病毒颗粒/毫升的浓度和不同浓度的荧光抗 体染色剂制备包含杆状病毒和杆状病毒-特异性的荧光抗体染色剂AFAcV1 的测试制剂。对不同的测试制剂进行流式细胞术。图10总结了检测AFAcV1 染色剂的荧光发射(包括由溶液中残存的未结合的AFAcV1染色产生的基线 组分)的光电检测器(光电倍增管)的测量基线电压响应，其作为AFAcV1浓度 (微克/毫升)的函数。图11总结了鉴定的检测事件的特异性荧光发射响应的 平均峰高电压，该检测事件指示用AFAcV1染色剂染色的杆状病毒，其为相 同的AFAcV1浓度(微克/毫升)的函数。显示的AFAcV1浓度是测试制剂中的 总浓度，因此包括与杆状病毒结合的AFAcV1和未结合的AFAcV1，然而测 试制剂中大部分AFAcV1将处于未结合状态，即使在如图11所示的最低总 浓度下。
如图10所示，测试制剂中的非特异性信号背景随着AFAcV1染色剂浓 度的增加而增加。如图11所示，来自染色的杆状病毒的电压信号的峰高度 在较低浓度下增加，但随着杆状病毒颗粒随着AFAcV1染色剂与颗粒结合而 变得饱和从而达到平衡。如图10和11的比较所示，存在低于约8微克/毫升 的窄范围的荧光抗体染色剂浓度，其中非特异性电压基线足够低并且染色的 杆状病毒的特异性电压峰值高度足够高，从而使被荧光抗体染色剂染色的杆 状病毒能够被辨别。
实施例2：
对杆状病毒测试制剂进行对比流式细胞术测试，其中相对于用非特异性 蛋白质染色剂和非特异性核酸染色剂(荧光染色剂)的组合染色的常规病毒， 使用了荧光抗体染色剂AFAcV1。使用Combo Dye染色试剂(ViroCyt，Inc.) 进行常规染色试验，其用适当比例的非特异性蛋白质染色剂和非特异性核酸 染色剂进行预配制。对测试溶液进行流式细胞术评估。对于Combo Dye的 运行，仅当对于来自核酸染色剂和蛋白质染色剂的荧光发射存在独立且同时 的检测事件时才计数杆状病毒颗粒的检测。对于荧光抗体染色剂，根据仅来自AFAcV1的荧光发射的检测事件来计数杆状病毒颗粒的检测。对于 AFAcV1测试，测试溶液中AFAcV1染色剂(结合和未结合至杆状病毒)的总 浓度为约3微克/毫升。对于Combo Dye和荧光抗体染色剂试验的每一个， 以杆状病毒储液的不同稀释度制备四种测试溶液，以提供四种不同的杆状病 毒浓度，对于每种染色剂组合，缓冲溶液中浓度通常在106至107个病毒颗 粒/毫升的范围内。对于特异性对照，针对不相干病毒慢病毒以及不存在任何 类型的病毒的缓冲溶液测试荧光抗体染色剂。
结果总结在图12中，其显示了通过流式细胞术测定的杆状病毒浓度作 为ComboDye试验中AFAcV1染色试验的稀释因子的函数的图。纵轴和横 轴均为对数尺度。如图12所示，针对AFAcV1检测指示的杆状病毒浓度接 近于Combo Dye测试所指示的浓度。图12还总结了相对于每毫升约为log 5.5 颗粒(约1x 105.5个颗粒/毫升)的流式细胞仪的近似检测下限，慢病毒和空白 培养基测试的数据。结果证实，来自抗体染色剂处理的样品的数据与使用 Combo Dye生成的数据类似。此外，抗体不能结合慢病毒，这证实了荧光抗 体染色的特异性。此外，当加入到空白培养基中时，抗体不会将背景增加到 不可接受的水平。
实施例3:
针对包含约1x 105至1x 108个杆状病毒颗粒/毫升的杆状病毒溶液的滴 定，使用各种抗体染色浓度进行流式细胞术稀释系列。每个稀释系列包括对 以杆状病毒储液的不同稀释度制备的200微升样品进行流式细胞术，其中每 个稀释系列中的所有样品含有相同浓度的荧光抗体染色剂。四种稀释系列以 每毫升样品约1.2、2.5、5和7.5微克CFAcV1抗体染色剂的抗体染色剂浓度 进行。进行流式细胞术测试以检测和评估来自染色的杆状病毒的荧光发射。 每个稀释系列的流式细胞术测试的结果总结在图13和14中。图13显示了 通过流式细胞术测试对样品测定的未校正的杆状病毒浓度(病毒颗粒/毫升) 的图，而图14显示了相同数据的图，但修正了稀释因子。两个图都是对数 图。图13和14对于中间稀释因子都显示出良好的结果(接近线性拟合)，其 中针对图14所示的稀释度校正的流式细胞术结果接近于中间稀释因子的杆 状病毒储液的实际杆状病毒浓度。较低的稀释因子(样品中更高的杆状病毒 浓度)和较高的稀释因子(样品中较低的杆状病毒浓度)的结果趋于不佳，这可 表示由于一些杆状病毒颗粒在较低的稀释因子时的聚集，和由于在较高稀释 因子时由未结合的抗体染色剂的背景信号的干扰引起的更高的计数。
实施例4:
类似于实施例1，使用荧光抗体染色剂CFAcV1相对于Combo Dye(非 特异性蛋白质和核酸荧光染色剂)进行对比流式细胞术测试。样品中荧光抗 体染色剂的浓度为约2.5微克/毫升。图15和16中总结了结果，图15绘制 了流式细胞术确定的每毫升的病毒颗粒浓度相对于稀释因子的关系，图16 绘制了通过稀释因子校正的相同数据，类似于上文对图13和14的描述。在 该实施例中，使用荧光抗体染色产生的病毒浓度结果始终低于使用ComboDye产生的病毒浓度结果，并且如图16所示，使用荧光抗体染色剂的流式 细胞术测定的稀释度-校正的病毒浓度结果与基于杆状病毒储液中的杆状病 毒浓度的预期更接近。
实施例5:
在胎牛血清(FBS)存在下，使用荧光抗体染色剂FCAcV1进行流式细胞 术检测来评估杆状病毒检测。制备杆状病毒的滴定液，其含有约1x 107至1 x 108个杆状病毒颗粒/毫升和约3体积％FBS(恒定FBS)，或稀释约2.5个log 的FBS(降低的FBS)。进行流式细胞术稀释系列，其中每个样品含有约2.5 微克/毫升的荧光抗体染色剂。在一个稀释系列中，向稀释的样品中加入额外 的FBS，使得稀释系列中所有流式细胞术样品中FBS的浓度与储液(约3体 积％FBS)大致相同。在第二稀释系列中，不添加额外的FBS，因此FBS的 浓度与杆状病毒浓度一起稀释。两个稀释系列的结果如图17所总结。如图 17所示，两个稀释系列的结果非常相似，表明样品中FBS的存在对使用荧 光抗体染色剂的杆状病毒鉴定没有不利影响。
实施例6:
对含有BacMam病毒(修饰的杆状病毒)的溶液进行流式细胞术稀释系 列。制备含有约1x 107至1x 108个BacMam病毒颗粒/毫升和约3％FBS的 储液。以荧光抗体染色剂CFAcV1的浓度为约2.5微克/毫升制备流式细胞术 样品。流式细胞术稀释系列的结果如图18所示，其绘制了不同稀释因子下 通过流式细胞术测定的每毫升的BacMam病毒的浓度，并证明了数据的良好 的线性拟合。
实施例7-8
腺病毒是尺寸大约90至100纳米的非包膜病毒家族(腺病毒科)，其具有 含有尺寸为26至48kbp的双链DNA基因组的二十面体核衣壳。腺病毒对 许多脊椎动物宿主具有感染性，其包括感染人的许多不同的血清型。腺病毒 是用于许多病毒治疗应用的重要病毒，包括用于溶瘤、基因治疗和免疫治疗 应用。腺病毒是将遗传负载物递送到特定细胞类型(特别是肿瘤细胞)的主要 手段之一。腺病毒具有很高的潜在毒性，对腺病毒进行严格且准确的监测和 定量在各个制造阶段以及对于在病毒治疗制剂中的精确给药都是非常重要 的。例如，已知腺病毒在人类中，主要在儿童中，引起呼吸系统疾病，并且 关键的病毒基因被所需的一种或多种治疗基因所替代是至关重要的。为了避 免这个问题，以及避免宿主对载体的免疫应答的可能性，也正在研究非人类 的腺病毒毒株。产生腺病毒病毒载体的最有问题的方面之一是在生长、收获、 纯化和释放期间对腺病毒病毒载体的定量。
在下面的实施例7和8中，荧光抗体染色剂是8C4单克隆抗体-CF 532 缀合物(下文称为CF-8C4)。8C4抗体对腺病毒的六邻体蛋白是特异性的，并 且对于不同的腺病毒血清型(至少针对血清型2至6进行测试)是有效的。
实施例7:
使用荧光抗体染色剂CF-8C4在含有不同腺病毒血清型的两种不同的测 试制剂上对腺病毒测试制剂进行对比流式细胞术检测。一个测试制剂包含腺 病毒血清型4，另一个测试制剂包含腺病毒血清型5。对于所有测试，测试 溶液中CF-8C4抗体染色剂(结合和未结合到腺病毒)的总浓度为约2.5微克/ 毫升。对于每个测试制剂，对于每个稀释系列，以病毒储液的不同稀释度制 备4种测试溶液，以提供四种不同的病毒浓度以用于在缓冲溶液中对每种测 试制剂测试。
结果总结在图19中，其显示了通过流式细胞术测定的每种不同血清型 的稀释系列中每种稀释度的腺病毒浓度为稀释因子的函数。纵轴和横轴均为 对数标度。如图19所示，每个稀释系列的浓度几乎落在指示CF-8C4与两种 血清型结合的线上，但数据倾向于在浓度处于或低于流式细胞仪检测限(约 105.5个颗粒/毫升)的高稀释因子时偏离。
实施例8：
相对于对8C4抗体无抗原性的流感病毒和慢病毒的对照，使用与实施例 1(CF-8C4)中使用的相同的荧光抗体染色剂，在腺病毒测试制剂上进行对比 流式细胞术测试。测试制剂中使用的腺病毒是血清型4。对于所有测试，测 试溶液中CF-8C4抗体染色剂(结合和未结合到腺病毒)的总浓度为约2.5微克 /毫升。对于每个稀释系列，以腺病毒储液的不同稀释度制备6种测试溶液， 以提供6种不同的病毒浓度，从而用于在缓冲溶液中测试。对于特异性对照， 针对流感和慢病毒类型的无关病毒测试荧光抗体染色剂。
结果总结在图20中，其显示了通过流式细胞术测定的每种稀释度的腺 病毒浓度为不同测试制剂的稀释因子的函数。纵轴和横轴均为对数标度。如 图20所示，对于腺病毒，稀释系列的浓度曲线显示出良好的线性。图20还 总结了对照制剂相对于流式细胞仪的近似检测下限(约105.5个颗粒/毫升)的 数据，表明荧光抗体染色剂未能结合流感病毒和慢病毒对照，证实了荧光抗 体染色剂的特异性。
实施例9-10
腺相关病毒(AAV)是一种小型、无包膜病毒家族，具有约20纳米尺寸和 4.7kb单链DNA基因组。AAV具有许多能够感染人宿主中的分裂和静止细 胞的血清型。腺相关病毒是用于许多病毒疗法应用的重要病毒，包括作为基 因治疗载体。由于极小的体积，腺相关病毒难以检测和准确量化，例如在用 于制备重组腺相关病毒和用于给药控制的制造操作中。
腺相关病毒(AAV)通常是非复制型的，复制通常需要存在另外的因子。 例如，可以使用一些腺病毒基因的蛋白质在腺病毒存在下复制AAV。使用 AAV作为病毒载体的一些优点是不存在致病性、低宿主免疫应答和长期表 达。在制造和配制操作过程中精确定量AAV对监测制造建构物的性能和跟 踪产品产量以及提供准确的剂量是重要的。即使不是致病性的，感染性病毒 剂如腺相关病毒的过量给药也可对患者造成严重问题。
最有问题的步骤之一是在生长、收获、纯化和释放期间定量AAV病毒 载体。诸如定量PCR和在260nm和280nm处的吸光度读数的方法是高度可 变的，导致在任何给定步骤存在对颗粒过高或过低的评估。制造的后果是产 品损失、延误和成本超支，这是严重的，但仍比不上给药过少(无治疗效果) 或过多(不良免疫反应)的产品相关的风险。显然，对于用于载体介导的基因 治疗的AAV病毒颗粒的快速、更精确的量化方法有非常关键的需求。
在以下实施例9-10中，使用荧光抗体染色剂对腺相关病毒血清型2 (AAV-2)进行流式细胞术测试，该荧光抗体染色剂包含与Alexa Fluor 532染 料缀合的抗AAV-2单克隆抗体A20(PROGEN Biotechnik)(在以下称为 CF-A20抗体染色剂)。A20是AAV-2和AAV-3的组装衣壳的构象表位的抗 体。
实施例9:
相对于对A20抗体无抗原性的AAV-5和AAV-9的对照，使用荧光抗体 染色剂CF-A20对AAV-2测试制剂进行对比流式细胞术测试。使用从不同商 业来源获得的AAV-2制备两种不同的AAV-2测试制剂。对于所有测试，测 试溶液中的CF-A20抗体染色剂(结合和未结合至AAV-2)的总浓度为约2.5 微克/毫升。对于每个稀释系列，以病毒储液的不同稀释度制备五种测试溶液， 以提供五种不同的病毒浓度，从而用于在缓冲溶液中测试。对于特异性对照，针对AAV-5和AAV-9血清型以及包含CF-A20但无任何类型的病毒的缓冲 溶液测试荧光抗体染色剂。
结果总结在图21中，其显示，对于CF-A20染色试验和对照，通过流式 细胞术测定的每个AAV-2样品的AAV-2浓度为稀释因子的函数。纵轴和横 轴均为对数刻度。如图21所示，CF-A20测试指示的AAV-2浓度对于两种 AAV-2测试制剂中的每一种是接近的。图21还总结了对照制剂相对于流式 细胞仪的近似检测下限(约105.5个颗粒/毫升)的数据。结果表明，来自抗体染 色剂处理的AAV-2样品的数据在AAV-2的不同来源之间是相当一致的。此外，抗体未能结合AAV-5或AAV-9，证实了相对于其他血清型，荧光抗体 染色剂对AAV-2的特异性。此外，当添加到空白介质中时，荧光抗体染色剂 不会将背景增加到不可接受的水平。
实施例10:
针对包含约1x 105至1x 108个AAV-2颗粒/毫升的AAV-2溶液的滴定使 用多种抗体染色剂浓度进行流式细胞术稀释系列。每个稀释系列包括对以不 同稀释度的AAV-2储液制备的200微升样品进行流式细胞术，每个稀释系列 中的所有样品含有相同浓度的荧光抗体染色剂。三种稀释系列以抗体染色剂 浓度为约0.91、1.82和2.73微克CF-A20抗体染色剂/毫升样品运行。进行 流式细胞术测试以检测和评估染色的AAV-2的荧光发射。每个稀释系列的流 式细胞术测试结果总结在图22和23中。图22显示了通过流式细胞术确定 的样品的未校正AAV-2浓度(病毒颗粒/毫升)的图，而图23显示相同数据的 图，但校正了稀释因子。两个图都是log-log图。图22和23在中间稀释因 子处都显示出一般良好的结果(接近线性拟合)，图23所示的针对稀释进行校 正的流式细胞术结果接近中间稀释因子的AAV-2储液的实际AAV-2浓度。 在较低的稀释因子(样品中更高的AAV-2浓度)和更高的稀释因子(样品中较 低的AAV-2浓度)结果趋于不佳，这表明，由于一些AAV-2颗粒在较低的稀 释因子下聚集而导致计数更低，和由于在较高稀释因子处来自未结合的抗体 染色剂的背景信号的可能干扰导致计数更高。
实施例11-13
在下面的实施例11-13中，使用荧光抗体染色剂对各种流感病毒类型进 行流式细胞术测试，该荧光抗体染色剂包含与CF532染料缀合的M149多克 隆抗体(针对人A、B型流感的兔多克隆抗体–Clontech/Takara)(在以下称为 M140-532抗体染色剂)。
实施例11
以F/P比为3、5和7制备实施例M149-532荧光抗体染色剂制剂。用于 流式细胞术测试的测试制剂被制备为包括A型流感病毒颗粒/毫升(而不是非 缔合的流感病毒的滴定液)，并用M149-532荧光抗体染色剂的三种制剂的每 一种对其进行流式细胞术检测。流式细胞术稀释系列如下运行：对于每次流 式细胞术运行，使用不同M149-532制剂中的每一种且各M149-532荧光抗 体染色剂的总浓度为约2.5微克/毫升。不同稀释系列的流式细胞术测试结果 总结在图24和25中。图24显示每毫升未经校正的病毒颗粒计数(未针对背 景信号校正)，图25显示每毫升校正的病毒颗粒计数(针对背景信号校正)。 如图24和图25所示，使用F/P比为5和7的测试在所有稀释系列间显示了 良好结果(接近线性)和一致的流式细胞术结果，而使用F/P比为3的测试对 测试的最高病毒颗粒浓度(稀释因子10x)显示出一致的结果，但在较低浓度 点(稀释因子为1000x和10,000x)则不是(其中每毫升测量的病毒颗粒显著下 降)。值得注意的是，即使在对背景校正后，在使用F/P比为5和7的测试中， 在整个稀释系列中获得了良好和一致的结果，但是对于使用F/P比为3的 10,000x稀释测试，标记的病毒颗粒检测峰不能与背景区分开。F/P比为3似 乎不足以与抗体染色剂中的所有抗体充分缀合，因此大量的抗体分子与荧光 团保持非缀合，并且可与病毒颗粒结合但不对标记的病毒颗粒的荧光发射响 应产生贡献。相比之下，使用F/P比为5和7时，荧光团与全部或几乎全部 抗体分子缀合，但是由于荧光团密集在抗体分子上而没有引起显著的荧光发 射淬灭。
实施例12
制备包含A型流感病毒或B型流感病毒的测试制剂，其浓度为约1x 107非缔合的病毒颗粒/毫升且包含不同浓度的M149-532荧光抗体染色剂(对于 B型流感测试制剂为1.25微克/毫升、2.5微克/毫升和3.75微克/毫升，对于 A型流感测试制剂为1.25微克/毫升和3.75微克/毫升)。还制备了包含相应 浓度(1.25微克/毫升、2.5微克/毫升和3.75微克/毫升)的M149-532且无病毒 颗粒的空白制剂。对不同的测试制剂和空白制剂进行流式细胞术。图26总 结了指示测试制剂中不同M149-532浓度的荧光染色的病毒颗粒的检测的测 量平均峰高电压和空白制剂的背景电压峰。如图26所示，来自染色的A和 B型流感病毒的电压信号的峰高随着荧光抗体染色剂浓度的增加而增加，源 自空白制剂的背景峰值也是如此。值得注意的是，B型流感制剂峰高电压和 相应的空白电压峰之间的距离在1.25微克/毫升至2.5微克/毫升的荧光抗体 染色剂间显著地增加，但从2.5微克/毫升至3.75微克/毫升并没有类似地增 加。测试更高浓度的荧光抗体染色剂将开始显示在染色的病毒颗粒峰高电压 与源自未结合的荧光抗体染色剂的背景电压峰之间的区分变差，这是由于源 自更高浓度的未结合的荧光抗体染色剂和染料聚集体导致更高的背景电压 峰。
实施例13
针对流感病毒类型的许多不同病毒尺寸颗粒制备测试制剂，包括A型流 感病毒、B型流感病毒和一些病毒样颗粒(包括不同血凝素(H)亚型)的几种血 清型。还制备了包含荧光抗体染色剂和腺病毒血清型3或腺病毒血清型5的 一些对照制剂。对于每个测试制剂和每个对照制剂的稀释系列进行流式细胞 术测试，其中每个进行流式细胞术的稀释样品包含约2.5微克/毫升的 M149-532荧光抗体染色剂浓度。表4总结了测试制剂和对照制剂的不同病 毒尺寸颗粒。
表4
Figure BDA0002536843450000361
结果总结在图27-30中，其显示了所有这些测试制剂和对照制剂的测量 的颗粒浓度作为稀释因子的函数的图。如图27-30所示，包含流感病毒类型 的病毒尺寸颗粒的所有测试制剂在整个稀释系列中都显示出良好的结果(接 近线性拟合)，而腺病毒对照制剂的结果表明M149-532荧光抗体染色剂的特 异性，其未能与腺病毒颗粒结合。
示例实施方案组合
可以是具有或不具有如上所公开的额外特征的权利要求的主题的一些 示例性实施方案组合以及各种类型的实施应用公开如下：
1.评估生物材料样品中的具有特定表位的非缔合的病毒尺寸颗粒的方 法，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所 述流体样品包含能与特定表位直接或间接结合的荧光抗体染色剂，所述流式 细胞术包括:
使流体样品流过流式细胞仪的流动池；
使流过流动池的流体样品经受能引起源自荧光抗体染色剂的荧光 发射响应的激发辐射；和
在所述荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射并评估 所检测到的辐射，以鉴定指示有非缔合的标记的病毒尺寸颗粒通过流动 池的检测事件，该非缔合的标记的病毒尺寸颗粒包含具有所述表位的所 述病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂。
对于一些病毒样颗粒应用：
2.根据示例实施方案组合1的方法，其中所述生物材料样品被怀疑包含 病毒样颗粒。
3.根据示例实施方案组合2的方法，其中所述病毒尺寸颗粒为与病毒样 颗粒不同病毒类型的杆状病毒颗粒，且该检测事件指示有包括所述病毒颗粒 的非缔合的标记的颗粒通过流动池。作为一种优选，该荧光抗体染色剂可包 括用于与作为表位的杆状病毒gp64包膜糖蛋白结合的抗体，且任选该抗体 可为单克隆的(例如，AcV1单克隆抗体)。
4.根据示例实施方案组合3的方法，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光抗体染色剂，所述表位为第一表位，所 述荧光发射为第一荧光发射，所述检测为第一检测，所述检测事件为第一检 测事件且所述病毒样颗粒具有与第一表位不同的第二表位；
所述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于 第一荧光抗体染色剂且能够与不同于第一表位的第二表位直接或间接结合， 该第二荧光抗体染色剂具有针对激发辐射的第二荧光发射响应，其与第一荧 光发射响应不同；且
所述流式细胞术包括第二检测，其在第二荧光发射的波长范围内检测源 自流动池的第二辐射，以及评估检测到的第二辐射，以评估指示有第二非缔 合的标记的病毒尺寸颗粒通过流动池的检测事件，该第二非缔合的标记的病 毒尺寸颗粒包含所述病毒样颗粒和第二荧光抗体染色剂。
5.根据示例实施方案组合3或示例实施方案组合4的方法，其中所述第 二表位指示选自以下的病毒类型：弹状病毒、野田村病毒、流感病毒、腺病 毒和腺相关病毒。
6.根据示例实施方案组合2的方法，其中所述病毒尺寸颗粒为病毒样颗 粒。
7.根据示例实施方案组合6的方法，其中所述病毒尺寸颗粒具有选自以 下的病毒类型：弹状病毒、野田村病毒、流感病毒、腺病毒和腺相关病毒。
8.根据示例实施方案组合2的方法，其中所述病毒尺寸颗粒为与病毒样 颗粒不同病毒类型的病毒颗粒，且该检测事件指示有包括所述病毒颗粒的非 缔合的标记的颗粒通过流动池。
9.根据示例实施方案组合8的方法，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光抗体染色剂，所述表位为第一表位，所 述荧光发射为第一荧光发射，所述检测为第一检测，所述检测事件为第一检 测事件且所述病毒样颗粒具有与第一表位不同的第二表位；
所述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于 第一荧光抗体染色剂且能够与不同于第一表位的第二表位直接或间接结合， 该第二荧光抗体染色剂具有针对激发辐射的第二荧光发射响应，该第二荧光 发射响应与第一荧光发射响应不同；且
所述流式细胞术包括第二检测，其在第二荧光发射的波长范围内检测源 自流动池的第二辐射，以及评估检测到的第二辐射，以评估指示第二非缔合 的标记的病毒尺寸颗粒通过流动池的检测事件，该第二非缔合的标记的病毒 尺寸颗粒包含所述病毒样颗粒和第二荧光抗体染色剂。
10.根据示例实施方案组合9的方法，其中所述第一表位指示杆状病毒类 型。作为一种优选，该第一荧光抗体染色剂可包括用于与作为表位的杆状病 毒gp64包膜糖蛋白结合的抗体，且任选该抗体可为单克隆的(例如，AcV1 单克隆抗体)。
11.根据示例实施方案组合8或示例实施方案组合9的方法，其中所述第 二表位指示选自以下的病毒类型：弹状病毒、野田村病毒、流感病毒、腺病 毒和腺相关病毒。
12.根据示例实施方案组合2-11任一项的方法，其中所述表位为第一表 位，所述流式细胞术为第一流式细胞术，所述流体样品为包含所述第一部分 生物材料样品的第一流体样品，所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标 记的颗粒且所述激发辐射为第一激发辐射，且该方法包括:
对包含第二部分生物材料样品的第二流体样品进行流式细胞术，其中所 述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于第一抗 体染色剂且能够直接或间接结合不同于第一表位的第二表位，第二流式细胞 术包括:
使第二流体样品流过流式细胞仪的流动池；
使流过流动池的第二流体样品经受第二激发辐射，该第二激发辐射 与第一激发辐射相同或不同，且能够从第二荧光抗体染色剂引起不同于 第一荧光发射响应的第二荧光发射响应；和
在所述荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射，并评估 所述检测到的辐射，以鉴定指示有第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒穿 过流动池的检测事件，该第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒包含具有第 二表位的病毒尺寸颗粒和第二荧光抗体染色剂。
13.根据示例实施方案组合12的方法，其中:
所述第一和第二流体样品各自包含至少两种不同的荧光抗体染色剂以 与两种不同的表位直接或间接结合；且
所述第一和第二流体样品各自包含至少一种不在彼此另一所述流体样 品中的荧光抗体染色剂。
14.根据示例实施方案组合13的方法，其中各个所述流体样品的至少两 种荧光抗体染色剂靶向检测所述流体样品中的至少两种不同类型的病毒尺 寸颗粒，且至少一种所述类型的颗粒在第一样品流体和第二样品流体之间不 同。
15.根据示例实施方案组合2-14任一项的方法，其中所述生物材料样品 为从用于产生病毒样颗粒的生产操作的阶段收集的样品，预期在该阶段过程 中该病毒样颗粒存在于生物材料中。
16.制备包含病毒样颗粒的产品的方法，该方法包括:
生产处理以制备包含病毒样颗粒的纯化产物，所述生产处理包括:
在生物生产操作过程中生成病毒样颗粒；
从该生物生产操作收获粗产物，其包含在生成过程中产生的病毒样 颗粒；
纯化至少一部分该粗产物材料以制备包含病毒样颗粒的纯化产物；
从生产处理的阶段收集生物材料样品，预期在该阶段过程中病毒样颗粒 存在于生物材料中；
评估所述样品是否存在具有特定表位的病毒尺寸颗粒，所述评估包括进 行根据示例实施方案组合2-15任一项的方法。
17.根据示例实施方案组合16的方法，包括将所述收集进行多次以从多 个不同的所述阶段收集不同的待评估的所述生物材料样品且对每个待评估 的所述收集的生物材料样品进行所述评估。
18.根据示例实施方案组合17的方法，其中多个不同的所述阶段至少包 括在所述生成或收获过程中的第一阶段和在所述纯化过程中或之后的第二 阶段。
对于一些流感应用:
19.根据示例实施方案组合1的方法，其中所述生物材料样品被怀疑包含 流感病毒颗粒。
20.根据示例实施方案组合19的方法，其中所述病毒尺寸颗粒为流感病 毒颗粒。
21.根据示例实施方案组合20的方法，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光染色剂，所述荧光发射为第一荧光发 射，所述检测为第一检测且所述检测事件为第一检测事件；
所述流体样品包含用于核酸的第二荧光染色剂，该第二荧光染色剂在附 着于核酸时针对激发辐射具有第二荧光发射响应，该第二荧光发射响应不同 于第一荧光发射响应；且
所述流式细胞术包括第二检测，其在第二荧光发射的波长范围内检测源 自流动池的第二辐射，以及评估检测到的第二辐射，以评估指示有用第二荧 光染色剂染色的包含核酸的病毒尺寸颗粒通过的检测事件；和
比较第一检测和第二检测的结果，以用于鉴定所述第一检测事件与所述 第二检测事件是否发生时间上的重合，其进一步指示有包含所述流感病毒颗 粒的所述非缔合的标记的颗粒通过流动池。
22.根据示例实施方案组合20的方法，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光抗体染色剂，所述表位为第一表位，所 述荧光发射为第一荧光发射，所述检测为第一检测且所述检测事件为第一检 测事件；
所述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于 第一荧光抗体染色剂且能够与不同于第一表位的第二表位直接或间接结合， 该第二荧光抗体染色剂具有针对激发辐射的第二荧光发射响应，该第二荧光 发射响应与第一荧光发射响应不同；且
所述流式细胞术包括第二检测，其在第二荧光发射的波长范围内检测源 自流动池的第二辐射，以及评估检测到的第二辐射，以评估指示非缔合的标 记的病毒尺寸颗粒通过流动池的检测事件，该非缔合的标记的病毒尺寸颗粒 包含具有第二表位的病毒尺寸颗粒和第二荧光抗体染色剂。
23.根据示例实施方案组合22的方法，其中所述第一表位和第二表位指 示流感病毒。
24.根据示例实施方案组合22的方法，其中所述第二表位指示与第一表 位不同的流感病毒血清型。
25.根据示例实施方案组合22-24任一项的方法，其中所述第一表位指示 流感血凝素抗原的存在，且第二表位指示流感神经氨酸酶抗原的存在。
26.根据示例实施方案组合22-24任一项的方法，其中所述第一表位指示 第一流感血凝素抗原的存在，且第二表位指示不同于第一流感血凝素抗原的 第二流感血凝素抗原的存在。
27.根据示例实施方案组合22-24任一项的方法，其中所述第一表位指示 第一流感神经氨酸酶抗原的存在，且第二表位指示不同于第一流感神经氨酸 酶抗原的第二流感神经氨酸酶抗原的存在。
28.根据示例实施方案组合22-27任一项的方法，其中流感病毒为A型 流感病毒或B型流感病毒。
29.根据示例实施方案组合20-28任一项的方法，其中所述表位为第一表 位，所述流式细胞术为第一流式细胞术，所述流体样品为包含所述第一部分 生物材料样品的第一流体样品，所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标 记的颗粒且所述激发辐射为第一激发辐射，且该方法包括:
对包含第二部分生物材料样品的第二流体样品进行流式细胞术，其中所 述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于第一抗 体染色剂且能够直接或间接结合不同于第一表位的第二表位，第二流式细胞 术包括:
使第二流体样品流过流式细胞仪的流动池；
使流过流动池的第二流体样品经受第二激发辐射，该第二激发辐射 与第一激发辐射相同或不同，且能够从第二荧光抗体染色剂引起不同于 第一荧光发射响应的第二荧光发射响应；和
在所述荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射并评估 所检测到的辐射，以鉴定指示有第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒通过 流动池的检测事件，该第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒包含具有第二 表位的病毒尺寸颗粒和第二荧光抗体染色剂。
30.根据示例实施方案组合29的方法，其中:
所述第一和第二流体样品各自包含至少两种不同的荧光抗体染色剂以 与两种不同的表位直接或间接结合；且
第一和第二流体样品各自包含至少一种不在彼此另一所述流体样品中 的荧光抗体染色剂。
31.根据示例实施方案组合30的方法，其中各个所述流体样品的至少两 种荧光抗体染色剂靶向检测所述流体样品中的至少两种不同类型的病毒尺 寸颗粒，且至少一种所述类型的颗粒在第一样品流体和第二样品流体之间不 同。
32.根据示例实施方案组合31的方法，其中第一流体样品中的至少一种 荧光抗体染色剂靶向检测第一流感病毒血清型的表位，且第二流体样品中的 至少一种荧光抗体染色剂靶向检测不同于第一流感病毒血清型的第二流感 病毒血清型的表位。
33.根据示例实施方案组合20-32任一项的方法，其中所述生物材料样品 为从产生流感病毒颗粒的生产操作的阶段收集的样品，预期在该阶段过程中 流感病毒颗粒存在于生物材料中。
34.制备包含流感病毒颗粒的产物的方法，该方法包括:
生产处理以制备包含流感病毒颗粒的纯化产物，所述生产处理包括:
在生物生产操作中生成流感病毒颗粒；
从该生物生产操作收获包含在该生成过程中产生的流感病毒颗粒 的粗产物；
纯化至少一部分该粗产物材料以制备包含流感病毒颗粒的纯化产 物；
从生产处理的阶段收集生物材料样品，预期在该阶段过程中流感病毒颗 粒存在于生物材料中；
评估所述样品是否存在具有特定表位的病毒尺寸颗粒，所述评估包括进 行根据示例实施方案组合19-34任一项的方法。
35.根据示例实施方案组合34的方法，包括将所述收集进行多次以从多 个不同的所述阶段收集不同的待评估的所述生物材料样品，且对每个待评估 的所述收集的生物材料样品进行所述评估。
36.根据示例实施方案组合35的方法，其中所述多个不同的所述阶段至 少包括在所述生成或收获过程中的第一阶段和在所述纯化过程中或之后的 第二阶段。
对于一些杆状病毒应用:
37.根据示例实施方案组合1的方法，其中所述生物材料样品被怀疑包含 杆状病毒颗粒。
38.根据示例实施方案组合37的方法，其中所述病毒尺寸颗粒为杆状病 毒颗粒。作为一种优选，该荧光抗体染色剂可包括用于与作为表位的杆状病 毒gp64包膜糖蛋白结合的抗体，且任选该抗体可为单克隆的(例如，AcV1 单克隆抗体)。
39.根据示例实施方案组合38的方法，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光染色剂，所述荧光发射为第一荧光发 射，所述检测为第一检测且所述检测事件为第一检测事件；
所述流体样品包含用于核酸的第二荧光染色剂，该第二荧光染色剂在附 着于核酸时针对激发辐射具有第二荧光发射响应，该第二荧光发射响应不同 于第一荧光发射响应；且
所述流式细胞术包括第二检测，其在第二荧光发射的波长范围内检测源 自流动池的第二辐射，以及评估检测到的第二辐射，以评估指示有用第二荧 光染色剂染色的包含核酸的病毒尺寸颗粒通过的检测事件；和
比较第一检测和第二检测的结果，以用于鉴定所述第一检测事件与所述 第二检测事件是否发生时间上的重合，其进一步指示有包含所述杆状病毒颗 粒的所述非缔合的标记的颗粒通过流动池。
40.根据示例实施方案组合38的方法，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光抗体染色剂，所述表位为第一表位，所 述荧光发射为第一荧光发射，所述检测为第一检测且所述检测事件为第一检 测事件；
所述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于 第一荧光抗体染色剂且能够与不同于第一表位的第二表位直接或间接结合， 该第二荧光抗体染色剂具有针对激发辐射的第二荧光发射响应，该第二荧光 发射响应与第一荧光发射响应不同；且
所述流式细胞术包括第二检测，其在第二荧光发射的波长范围内检测源 自流动池的第二辐射，以及评估检测到的第二辐射，以评估指示有非缔合的 标记的病毒尺寸颗粒通过流动池的检测事件，该非缔合的标记的病毒尺寸颗 粒包含具有第二表位的病毒尺寸颗粒和第二荧光抗体染色剂。
41.根据示例实施方案组合40的方法，其中所述第一表位指示杆状病毒 且第二表位指示不同于杆状病毒的第二病毒类型。
42.根据示例实施方案组合41的方法，其中所述第二病毒类型选自弹状 病毒、野田村病毒、流感病毒、腺病毒和腺相关病毒。
43.根据示例实施方案组合38-42任一项的方法，其中所述表位为第一表 位，所述流式细胞术为第一流式细胞术，所述流体样品为包含所述第一部分 生物材料样品的第一流体样品，所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标 记的颗粒且所述激发辐射为第一激发辐射，且该方法包括:
对包含第二部分生物材料样品的第二流体样品进行流式细胞术，其中所 述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于第一抗 体染色剂且能够直接或间接结合不同于第一表位的第二表位，第二流式细胞 术包括:
使第二流体样品流过流式细胞仪的流动池；
使流过流动池的第二流体样品经受第二激发辐射，该第二激发辐射 与第一激发辐射相同或不同，且能够从第二荧光抗体染色剂引起不同于 第一荧光发射响应的第二荧光发射响应；和
在所述荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射并评估 所检测到的辐射，以鉴定指示有第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒通过 流动池的检测事件，该第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒包含具有第二 表位的病毒尺寸颗粒和第二荧光抗体染色剂。
44.根据示例实施方案组合43的方法，其中:
所述第一和第二流体样品各自包含至少两种不同的荧光抗体染色剂以 与两种不同的表位直接或间接结合；且
第一和第二流体样品各自包含至少一种不在彼此另一所述流体样品中 的荧光抗体染色剂。
45.根据示例实施方案组合44的方法，其中各个所述流体样品的至少两 种荧光抗体染色剂靶向检测所述流体样品中的至少两种不同类型的病毒尺 寸颗粒，且至少一种所述类型的颗粒在第一样品流体和第二样品流体之间不 同。
46.根据示例实施方案组合45的方法，其中第一流体样品中的至少一种 荧光抗体染色剂靶向检测杆状病毒的表位，且第二流体样品中的至少一种荧 光抗体染色剂靶向检测不同于杆状病毒的第二病毒类型的表位。
47.根据示例实施方案组合38-46任一项的方法，其中所述生物材料样品 为从用于产生杆状病毒颗粒的生产操作的阶段收集的样品，预期在该阶段过 程中杆状病毒颗粒存在于生物材料中。
48.制备包含杆状病毒颗粒的产物的方法，该方法包括:
生产处理以制备包含杆状病毒颗粒的纯化产物，所述生产处理包括:
在生物生产操作中生成杆状病毒颗粒；
从该生物生产操作收获包含在生成过程中产生的杆状病毒颗粒的 粗产物；
纯化至少一部分该粗产物材料以制备包含杆状病毒颗粒的纯化产 物；
从生产处理的阶段收集生物材料样品，预期在该阶段过程中杆状病毒颗 粒存在于生物材料中；
评估所述样品是否存在具有特定表位的病毒尺寸颗粒，所述评估包括进 行根据示例实施方案组合37-47任一项的方法。
49.根据示例实施方案组合48的方法，包括将所述收集进行多次以从多 个不同的所述阶段收集不同的待评估的所述生物材料样品且对每个待评估 的所述收集的生物材料样品进行所述评估。
50.根据示例实施方案组合49的方法，其中所述多个不同的所述阶段至 少包括在所述生成或收获过程中的第一阶段和在所述纯化过程中或之后的 第二阶段。
51.根据示例实施方案组合48-49任一项的方法，其中所述杆状病毒已被 修饰以表达重组蛋白，且该方法包括生成和回收重组蛋白。
对于一些病毒应用:
52.根据示例实施方案组合1的方法，其中所述生物材料样品被怀疑包含 病毒类型的病毒颗粒。
53.根据示例实施方案组合52的方法，其中所述病毒尺寸颗粒为病毒类 型的病毒颗粒。
54.根据示例实施方案组合53的方法，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光染色剂，所述荧光发射为第一荧光发 射，所述检测为第一检测且所述检测事件为第一检测事件；
所述流体样品包含用于核酸的第二荧光染色剂，该第二荧光染色剂在附 着于核酸时针对激发辐射具有第二荧光发射响应，该第二荧光发射响应不同 于第一荧光发射响应；且
所述流式细胞术包括第二检测，其在第二荧光发射的波长范围内检测源 自流动池的第二辐射，以及评估检测到的第二辐射，以评估指示有用第二荧 光染色剂染色的包含核酸的病毒尺寸颗粒通过的检测事件；和
比较第一检测和第二检测的结果，以用于鉴定所述第一检测事件与所述 第二检测事件是否发生时间上的重合，其进一步指示包括所述病毒颗粒的所 述非缔合的标记的颗粒通过流动池。
55.根据示例实施方案组合53的方法，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光抗体染色剂，所述表位为第一表位，所 述荧光发射为第一荧光发射，所述检测为第一检测且所述检测事件为第一检 测事件；
所述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于 第一荧光抗体染色剂且能够与不同于第一表位的第二表位直接或间接结合， 第二荧光抗体染色剂具有针对激发辐射的第二荧光发射响应，该第二荧光发 射响应与第一荧光发射响应不同；且
所述流式细胞术包括第二检测，其在第二荧光发射的波长范围内检测源 自流动池的第二辐射，以及评估检测到的第二辐射，以评估指示有非缔合的 标记的病毒尺寸颗粒通过流动池的检测事件，该非缔合的标记的病毒尺寸颗 粒包含具有第二表位的病毒尺寸颗粒和第二荧光抗体染色剂。
56.根据示例实施方案组合55的方法，其中所述第一表位指示第一病毒 类型且第二表位指示不同于第一病毒类型的第二病毒类型。
57.根据示例实施方案组合56的方法，其中所述第一病毒类型为杆状病 毒。作为一种优选，该第一荧光抗体染色剂可包括用于与作为表位的杆状病 毒gp64包膜糖蛋白结合的抗体，且任选该抗体可为单克隆的(例如，AcV1 单克隆抗体)。
58.根据示例实施方案组合56或示例实施方案组合57的方法，其中所述 第二病毒类型选自弹状病毒、野田村病毒、流感病毒、腺病毒和腺相关病毒。
59.根据示例实施方案组合53-58任一项的方法，其中所述表位为第一表 位，所述流式细胞术为第一流式细胞术，所述流体样品为包含所述第一部分 生物材料样品的第一流体样品，所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标 记的颗粒且所述激发辐射为第一激发辐射，且该方法包括:
对包含第二部分生物材料样品的第二流体样品进行流式细胞术，其中所 述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于第一抗 体染色剂且能够直接或间接结合不同于第一表位的第二表位，第二流式细胞 术包括:
使第二流体样品流过流式细胞仪的流动池；
使流过流动池的第二流体样品经受第二激发辐射，该第二激发辐射 与第一激发辐射相同或不同，且能够从第二荧光抗体染色剂引起不同于 第一荧光发射响应的第二荧光发射响应；和
在所述荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射并评估 所检测到的辐射，以鉴定指示有第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒通过 流动池的检测事件，该第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒包含具有第二 表位的病毒尺寸颗粒和第二荧光抗体染色剂。
60.根据示例实施方案组合59的方法，其中:
所述第一和第二流体样品各自包括至少两种不同的荧光抗体染色剂以 与两种不同的表位直接或间接结合；且
第一和第二流体样品各自包含至少一种不在彼此另一所述流体样品中 的荧光抗体染色剂。
61.根据示例实施方案组合60的方法，其中各个所述流体样品的至少两 种荧光抗体染色剂靶向检测所述流体样品中的至少两种不同类型的病毒尺 寸颗粒，且至少一种所述类型的颗粒在第一样品流体和第二样品流体之间不 同。
62.根据示例实施方案组合61的方法，其中第一流体样品中的至少一种 荧光抗体染色剂靶向检测第一病毒类型的表位且第二流体样品中的至少一 种荧光抗体染色剂靶向检测不同于第一病毒类型的第二病毒类型的表位。
63.根据示例实施方案组合53-62任一项的方法，其中所述生物材料样品 为从用于产生病毒颗粒的生产操作的阶段收集的样品，预期在该阶段过程中 病毒颗粒存在于生物材料中。
64.制备包含病毒颗粒的产物的方法，该方法包括:
生产处理以制备包含所述病毒颗粒的纯化产物，所述生产处理包括:
在生物生产操作中生成病毒颗粒；
从该生物生产操作收获包含在该生成过程中产生的病毒颗粒的粗 产物；
纯化至少一部分该粗产物材料以制备包含所述病毒颗粒的纯化产 物；
从生产处理的阶段收集生物材料样品，预期在该阶段过程中病毒颗粒存 在于生物材料中；
评估所述样品是否存在具有特定表位的病毒尺寸颗粒，所述评估包括进 行根据示例实施方案组合52-63任一项的方法。
65.根据示例实施方案组合64的方法，包括将所述收集进行多次以从多 个不同的所述阶段收集不同的待评估的所述生物材料样品，且对每个待评估 的所述收集的生物材料样品进行所述评估。
66.根据示例实施方案组合65的方法，其中多个不同的所述阶段至少包 括在所述生成或收获过程中的第一阶段和在所述纯化过程中或之后的第二 阶段。
对于一些纳米颗粒应用:
67.根据示例实施方案组合1的方法，其中所述病毒尺寸颗粒为纳米颗 粒，其为外来体或不为外来体。
一些其它示例实施方案组合:
68.根据示例实施方案组合1-67任一项的方法，其中所述流体样品中的 生物材料为纯化生物材料，其中去除了较大尺寸组分，过滤尺寸不大于2微 米，且该流体样品包含的未结合至非缔合的标记的颗粒的荧光抗体染色剂的 浓度范围为0.25微克/毫升的流体样品至10微克/毫升的流体样品。
69.根据示例实施方案组合1-68任一项的方法，其中进样至流式细胞仪 的所述流体样品包含的荧光抗体染色剂的总浓度范围为0.25微克/毫升至10 微克/毫升。
70.根据示例实施方案组合1-69任一项的方法，其中所述非缔合的标记 的颗粒具有的最大截面尺寸范围为10纳米至2微米。
71.根据示例实施方案组合1-70任一项的方法，其中所述激发辐射包括 在520纳米至550纳米的波长范围内的辐射。
72.根据示例实施方案组合1-71任一项的方法，其中所述荧光发射具有 的斯托克斯位移为至少10纳米的波长。
73.根据示例实施方案组合1-72任一项的方法，其中进样至流式细胞仪 的流体样品包含的未结合至非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体染色剂的浓 度范围为0.25微克/毫升至10微克/毫升。
74.根据示例实施方案组合1-73任一项的方法，其中进样至流式细胞仪 的流体样品具有的非缔合的标记的颗粒的浓度范围为1x 105至1x 109个颗 粒/毫升。
75.根据示例实施方案组合1-74任一项的方法，其中所述荧光抗体染色 剂包含附着至抗体分子的荧光团。
76.根据示例实施方案组合75的方法，其中所述荧光抗体染色剂每个抗 体分子包含平均3至8个附着的荧光团。
77.根据示例实施方案组合75或示例实施方案组合76的方法，其中所述 抗体分子为单克隆的。
78.根据示例实施方案组合75或示例实施方案组合76的方法，其中所述 抗体分子为多克隆的。
79.根据示例实施方案组合1-78任一项的方法，其中所述流式细胞术包 括将所述流体样品以250至3000纳升/分钟范围内的流体样品流速流过流动 池。
80.根据示例实施方案组合1-79任一项的方法，包括:
制备该流体样品，包括将待评估是否存在非缔合的颗粒的生物材料与荧 光抗体染色剂混合，该荧光抗体染色剂能与表位直接或间接结合以形成非缔 合的标记的病毒尺寸颗粒。
81.根据示例实施方案组合80的方法，其中所述制备流体样品包括，在 混合之前，纯化生物材料的粗样品以制备用于进行流式细胞术的流体样品的 生物材料，所述纯化包括以不大于2微米的过滤尺寸过滤出粗样品的颗粒并 层析去除至少一部分小于病毒尺寸的杂质。
82.根据示例实施方案组合81的方法，其中所述层析去除包括在离心机 中旋转层析。
83.根据示例实施方案组合80-82任一项的方法，其中所述制备流体样品 包括，在混合后，在流式细胞术之前不从流体样品中去除未结合在非缔合的 标记的颗粒中的荧光抗体。
84.根据示例实施方案组合1-84任一项的方法，其中所述荧光抗体染色 剂包括生物素化抗体和荧光团缀合的抗生蛋白链菌素。
85.根据示例实施方案组合84的方法，其中当被提供进行示例实施方案 组合80-83任一项所提到的混合时，所述荧光团缀合的抗生蛋白链菌素附着 至生物素化抗体。
86.根据示例实施方案组合85的方法，其中所述荧光团缀合的抗生蛋白 链菌素和生物素化抗体在独立的制剂中被提供进行混合，且该荧光团缀合的 抗生蛋白链菌素在混合过程中在溶液中附着至生物素化抗体。
87。根据示例实施方案组合1-86任一项的方法，其中所述流式细胞术 不检测光散射。
88.根据示例实施方案组合1-87任一项的方法，其中进样至流式细胞仪 的流体样品包含的荧光抗体染色剂的总浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/ 毫升。
89.根据示例实施方案组合1-88任一项的方法，其中进样至流式细胞仪 的流体样品包含的未结合在非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体染色剂的浓 度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。
90.根据示例实施方案组合1-89任一项的方法，其中所述荧光抗体染色 剂为第一荧光染色剂，且所述流体样品包含具有由激发辐射引起的第二荧光 发射响应的第二荧光染色剂，该第二荧光发射响应不同于第一荧光染色剂的 第一荧光发射响应。
91.根据示例实施方案组合90的方法，其中所述第二荧光染色剂包括对 颗粒类型不具有特异性的荧光核酸染色剂。
92.根据示例实施方案组合90的方法，其中:
所述非缔合的颗粒为第一非缔合的颗粒，所述表位为第一表位，所述非 缔合的颗粒为第一颗粒类型且所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标 记的颗粒；
所述第二荧光染色剂为不同于第一荧光抗体染色剂的第二荧光抗体染 色剂，且该第二荧光抗体染色剂能够结合第二非缔合的病毒尺寸颗粒，其具 有指示不同于第一颗粒类型的第二颗粒类型的第二表位以形成第二非缔合 的标记的病毒尺寸颗粒；和
该方法包括在第二荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射 并评估所检测到的辐射，以鉴定指示有第二非缔合的标记的颗粒通过流动池 的检测事件。
93.根据示例实施方案组合90-92任一项的方法，其中所述第二荧光发射 具有的峰值波长与第一荧光发射的峰值波长有至少20纳米的不同。
94.根据示例实施方案组合1-93任一项的方法，其中各个所述荧光抗体 染色剂能够与对应的所述非缔合的颗粒直接结合以形成对应的所述非缔合 的标记的颗粒。
95.根据示例实施方案组合1-94任一项的方法，其中所述流式细胞术包 括用鞘液将流体样品流通过流体动力集中，并使流体样品和鞘液流过流动 池。
96.根据示例实施方案组合1-95任一项的方法，其中所述流式细胞术包 括独立检测至少两种不同的荧光发射且不检测光散射。
97.根据示例实施方案组合1-96任一项的方法，其中所述非缔合的标记 的颗粒为病毒类型的病毒颗粒。
98.根据示例实施方案组合97的方法，其中所述病毒颗粒包括选自以下 的成员：病毒类型的病毒颗粒、病毒类型的病毒样颗粒及其组合。
99.根据示例实施方案组合97或示例实施方案组合9的方法，其中所述 病毒类型为杆状病毒类型。
100.根据示例实施方案组合97或示例实施方案组合98的方法，其中所 述病毒类型为腺病毒类型。
101.根据示例实施方案组合97或示例实施方案组合98的方法，其中所 述病毒类型为腺相关病毒类型。
102.根据示例实施方案组合97或示例实施方案组合98的方法，其中所 述病毒类型为流感病毒类型。
103.根据示例实施方案组合1-102任一项的方法，其中非缔合的病毒颗 粒具有的最大截面尺寸范围为10纳米至2微米。
104.根据示例实施方案组合1-103任一项的方法，其中所述荧光抗体染 色剂为第一荧光染色剂，且所述流体样品包含具有由激发辐射引起的第二荧 光发射响应的第二荧光染色剂，该第二荧光发射响应不同于第一荧光染色剂 的第一荧光发射响应。
105.根据示例实施方案组合104的方法，其中所述第二荧光染色剂包括 对颗粒类型不具有特异性的荧光核酸染色剂。
106.根据示例实施方案组合104的方法，其中:
所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标记的颗粒，所述表位为第一 表位，所述病毒尺寸颗粒为第一病毒尺寸颗粒，所述病毒类型为第一病毒类 型且所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标记的颗粒；
所述第二荧光染色剂为不同于第一荧光抗体染色剂的第二荧光抗体染 色剂，且该第二荧光抗体染色剂能够与具有第二表位的第二病毒尺寸颗粒结 合以形成第二的非缔合的标记的病毒尺寸颗粒，该第二表位指示不同于第一 病毒类型的第二病毒类型；和
该方法包括在第二荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射 并评估所检测到的辐射，以鉴定指示第二非缔合的标记的颗粒通过流动池的 检测事件。
107.根据示例实施方案组合106的方法，其中所述第二荧光发射具有的 峰值波长与第一荧光发射的峰值波长有至少20纳米的不同，且该流式细胞 术包括独立检测至少第一和第二荧光发射且不检测光散射。
108.根据示例实施方案组合107的方法，其中所述第二病毒尺寸颗粒包 括第二病毒类型的病毒样颗粒。
109.根据示例实施方案组合1-108任一项的方法，其中所述病毒尺寸颗 粒被修饰以表达重组蛋白。
110.根据示例实施方案组合109的方法，其中所述流式细胞术不检测光 散射。
111.根据示例实施方案组合110的方法，包括制备该流体样品，所述制 备该流体样品包括:
将待评估是否存在非缔合的病毒尺寸颗粒的生物材料与荧光抗体染色 剂混合；和
在混合后，在流式细胞术之前不从流体样品中去除未结合在非缔合的标 记的颗粒中的荧光抗体。
112.制备包含病毒类型的病毒尺寸颗粒的产物的方法，该方法包括:
生产处理以制备包含所述病毒类型的病毒尺寸颗粒的纯化产物，所述生 产处理包括:
在生物生产操作中生成病毒尺寸颗粒；
从该生物生产操作收获包含在该生成中产生的病毒尺寸颗粒的粗 产物；
纯化至少一部分该粗产物材料以制备包含病毒尺寸颗粒的纯化产 物；
从生产处理的阶段收集生物材料样品，预期在该阶段过程中该病毒尺寸 颗粒存在于生物材料中；
评估所述样品是否存在具有指示所述病毒类型的特定表位的病毒尺寸 颗粒，所述评估包括进行根据示例实施方案组合1-111任一项的方法。
113.根据示例实施方案组合112的方法，包括将所述收集进行多次以从 多个不同的所述阶段收集不同的待评估的所述生物材料样品，且对每个待评 估的所述收集的生物材料样品进行所述评估。
114.根据示例实施方案组合113的方法，其中所述多个不同的所述阶段 至少包括在所述生成或收获过程中的第一阶段和在所述纯化过程中或之后 的第二阶段。
115.用于进样至流式细胞仪以进行流式细胞术评估的流体样品，包含：
水性液体介质；
在水性液体介质中的非缔合的标记的病毒尺寸颗粒，其浓度为1x 105至1x 109个非缔合的标记的颗粒/毫升，其中所述非缔合的标记的颗粒各自 包含具有指示病毒类型的特定表位的病毒类型的病毒尺寸颗粒和对于与所 述表位直接或间接结合有特异性的荧光抗体染色剂；和
未结合在非缔合的标记的颗粒中的未结合的荧光抗体染色剂在水性液 体介质中的浓度范围为0.25微克/毫升至10微克/毫升。
116.根据示例实施方案组合115的流体样品，其中水性液体介质中未结 合的荧光抗体染色剂的浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。
117.根据示例实施方案组合115或示例实施方案组合116的流体样品， 其中所述流体样品包含的荧光抗体染色剂的总浓度范围为0.25微克/毫升至 10微克/毫升。
118.根据示例实施方案组合117的流体样品，其中所述荧光抗体染色剂 的总浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。
119.根据示例实施方案组合115-118任一项的流体样品，其中流体样品 中的生物材料为去除了较大尺寸组分的纯化生物材料，过滤尺寸不大于2微 米。
120.根据示例实施方案组合115-119任一项的流体样品，其中所述荧光 抗体染色剂包括附着至抗体分子的荧光团，且该流体样品中的荧光抗体染色 剂每个抗体分子包含平均3至8个附着的荧光团。
121.根据示例实施方案组合115-120任一项的流体样品，其中抗体染色 剂的抗体为单克隆的。
122.根据示例实施方案组合115-120任一项的流体样品，其中抗体染色 剂的抗体为多克隆的。
123.根据示例实施方案组合115-122任一项的流体样品，其中所述病毒 尺寸颗粒被修饰以表达重组蛋白。
124.根据示例实施方案组合115-123任一项的流体样品，其中：
所述荧光抗体染色剂为具有第一荧光发射的第一荧光染色剂；且
所述流体样品包含用于核酸的第二荧光染色剂，所述第二荧光染色剂具 有不同于第一荧光发射的第二荧光发射。
125.根据示例实施方案组合115-123任一项的流体样品，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光抗体染色剂，所述表位为第一表位，所 述荧光发射为第一荧光发射，所述病毒类型为第一病毒类型且所述非缔合的 标记的颗粒为第一非缔合的标记的病毒尺寸颗粒；
所述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于 第一荧光抗体染色剂且能够与不同于第一表位的第二表位直接或间接结合， 第二表位指示不同于第一病毒类型的第二病毒类型,且该第二荧光抗体染色 剂具有不同于第一荧光发射响应的第二荧光发射响应。
126.根据示例实施方案组合125的流体样品，其中所述具有第二表位的 病毒尺寸颗粒为病毒样颗粒。
127.根据示例实施方案组合115-126任一项的流体样品，其中所述病毒 类型为杆状病毒。
128.根据示例实施方案组合115-126任一项的流体样品，其中所述病毒 类型为腺病毒。
129.根据示例实施方案组合115-126任一项的流体样品，其中所述病毒 类型为腺相关病毒。
130.根据示例实施方案组合115-126任一项的流体样品，其中所述病毒 类型为流感病毒。
对于一些其它杆状病毒应用:
1B.评估生物材料样品的杆状病毒类型的非缔合的病毒尺寸颗粒的流式 细胞术方法，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所 述流体样品包含能直接或间接与杆状病毒类型的表位结合的荧光抗体染色 剂，所述流式细胞术包括:
使流体样品流过流式细胞仪的流动池；
使流过流动池的流体样品经受能够从荧光抗体染色剂引起荧光发 射响应的激发辐射；和
在所述荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射并评估 所检测到的辐射，以鉴定指示有非缔合的标记的病毒尺寸颗粒通过所述 流动池的检测事件，该非缔合的标记的病毒尺寸颗粒包含与一部分荧光 抗体染色剂结合的杆状病毒类型的所述病毒尺寸颗粒。
2B.根据示例实施方案组合1B的流式细胞术方法，其中进样至流式细胞 仪的流体样品包含的未结合在非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体染色剂的 浓度范围为0.25(或0.5)微克/毫升至10克/微升。
3B.根据示例实施方案组合2B的流式细胞术方法，其中进样至流式细胞 仪的流体样品包含的荧光抗体染色剂的总浓度范围为0.25(或0.5)微克/毫升 至10微克/毫升。
4B.根据示例实施方案组合1B-3B任一项的流式细胞术方法，其中所述 表位为杆状病毒gp64包膜糖蛋白，且任选所述荧光抗体染色剂包括AcV1 单克隆抗体。
5B.根据示例实施方案组合1B-4B任一项的流式细胞术方法，其中所述 病毒尺寸颗粒包括杆状病毒颗粒。
6B.根据示例实施方案组合5B的流式细胞术方法，其中所述杆状病毒颗 粒表达重组蛋白。
7B.根据示例实施方案组合1B-6B任一项的流式细胞术方法，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光染色剂，所述荧光发射为第一荧光发 射，所述检测为第一检测且所述检测事件为第一检测事件；
所述流体样品包含用于核酸的第二荧光染色剂，该第二荧光染色剂当附 着于核酸时针对激发辐射具有不同于第一荧光发射响应的第二荧光发射响 应；且
所述流式细胞术包括第二检测，其在第二荧光发射的波长范围内检测源 自流动池的第二辐射，以及评估检测到的第二辐射，以评估指示有用第二荧 光染色剂染色的包含核酸的病毒尺寸颗粒通过的检测事件；和
比较第一检测和第二检测的结果，以用于鉴定所述第一检测事件与所述 第二检测事件是否发生时间上的重合，其进一步指示包含杆状病毒类型的所 述病毒尺寸颗粒的所述非缔合的标记的颗粒通过流动池。
8B.根据示例实施方案组合1B-6B任一项的流式细胞术方法，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光抗体染色剂，所述表位为第一表位，所 述荧光发射为第一荧光发射，所述检测为第一检测，所述病毒类型为第一病 毒类型，所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标记的病毒尺寸颗粒且所 述检测事件为第一检测事件；
所述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于 第一荧光抗体染色剂且能够与不同于第一表位的第二表位直接或间接结合， 第二表位指示不同于杆状病毒的第二病毒类型，且该第二荧光抗体染色剂具 有针对激发辐射的第二荧光发射响应，该第二荧光发射响应与第一荧光发射 响应不同；且
所述流式细胞术包括第二检测，其在第二荧光发射的波长范围内检测源 自流动池的第二辐射，以及评估检测到的第二辐射，以评估指示有第二非缔 合的标记的病毒尺寸颗粒通过流动池的检测事件，该第二非缔合的标记的病 毒尺寸颗粒包含具有第二表位的病毒尺寸颗粒和第二荧光抗体染色剂。
9B.根据示例实施方案组合8B的流式细胞术方法，其中所述具有第二表 位的病毒尺寸颗粒包括病毒样颗粒。
10B.根据示例实施方案组合8B或示例实施方案组合9B的流式细胞术方 法，其中所述第二病毒类型选自弹状病毒类型和诺如病毒类型。
11B.根据示例实施方案组合1B-6B任一项的流式细胞术方法，其中所述 表位为第一表位，所述流式细胞术为第一流式细胞术，所述流体样品为包含 第一部分生物材料样品的第一流体样品，所述非缔合的标记的颗粒为第一非 缔合的标记的颗粒且所述激发辐射为第一激发辐射，且该方法包括:
对包含第二部分生物材料样品的第二流体样品进行流式细胞术，其中所 述流体样品包含不同于第一荧光抗体染色剂的第二荧光抗体染色剂，且该第 二荧光抗体染色剂能够与不同于第一表位的第二表位直接或间接结合，第二 表位指示不同于杆状病毒的第二病毒类型且第二流式细胞术包括:
使第二流体样品流过流式细胞仪的流动池；
使流过流动池的第二流体样品经受第二激发辐射，该第二激发辐射 与第一激发辐射相同或不同，且能够从第二荧光抗体染色剂引起不同于 第一荧光发射响应的第二荧光发射响应；和
在所述荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射，并评估 所检测到的辐射，以鉴定指示有第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒通过 流动池的检测事件，该第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒包含具有第二 表位的病毒尺寸颗粒和第二荧光抗体染色剂。
12B.根据示例实施方案组合11B的流式细胞术方法，其中:
所述第一和第二流体样品各自包含至少两种不同的荧光抗体染色剂以 与两种不同的表位直接或间接结合；且
第一和第二流体样品各自包括至少一种不在彼此另一所述流体样品中 的荧光抗体染色剂。
13B.根据示例实施方案组合12B的流式细胞术方法，其中各个所述流体 样品的至少两种荧光抗体染色剂靶向检测所述流体样品中的至少两种不同 类型的病毒尺寸颗粒，且至少一种所述类型的颗粒在第一样品流体和第二样 品流体之间不同。
14B.根据示例实施方案组合1B-13B任一项的流式细胞术方法，其中所 述生物材料样品为从用于生产杆状病毒颗粒的生产操作的阶段收集的样品， 预期在该阶段过程中杆状病毒类型的病毒尺寸颗粒存在于生物材料中。
15B.制备包含杆状病毒类型的病毒尺寸颗粒的产物的流式细胞术方法， 该方法包括:
生产处理以制备包含杆状病毒类型的病毒尺寸颗粒的纯化产物，所述生 产处理包括:
在生物生产操作中生成病毒尺寸颗粒；
从该生物生产操作收获粗产物，其包含在该生成操作中产生的病毒 尺寸颗粒；
纯化至少一部分该粗产物材料以制备包含病毒尺寸颗粒的纯化产 物；
从生产处理的阶段收集生物材料样品，预期在该阶段过程中该病毒尺寸 颗粒存在于生物材料中；
评估所述样品是否存在具有指示杆状病毒类型的表位的病毒尺寸颗粒， 所述评估包括进行根据示例实施方案组合1B-13B任一项的方法。
16B.根据示例实施方案组合15B的流式细胞术方法，包括将所述收集进 行多次以从多个不同的所述阶段收集不同的待评估的所述生物材料样品，且 对每个待评估的所述收集的生物材料样品进行所述评估。
17B.根据示例实施方案组合16B的流式细胞术方法，其中多个不同的所 述阶段至少包括在所述生成或收获过程中的第一阶段和在所述纯化过程中 或之后的第二阶段。
18B.根据示例实施方案组合1B-17B任一项的流式细胞术方法，其中流 体样品中的生物材料为去除了较大尺寸组分的纯化生物材料，过滤尺寸不大 于2微米。
19B.根据示例实施方案组合1B-18B任一项的流式细胞术方法，其中进 入流式细胞仪的流体样品具有的非缔合的标记的颗粒的浓度范围为1x 105至1x 109个颗粒/毫升。
20B.根据示例实施方案组合1B-19B任一项的流式细胞术方法，其中所 述荧光抗体染色剂包含附着至抗体分子的荧光团，且该流体样品中的荧光抗 体染色剂每个所述抗体分子包含平均3至8个附着的荧光团。
21B.根据示例实施方案组合1B-20B任一项的流式细胞术方法，其中荧 光染色剂的抗体为单克隆的。
22B.根据示例实施方案组合1B-21B任一项的流式细胞术方法，其中所 述流式细胞术包括将所述流体样品以250至3000纳升/分钟范围内的流体样 品流速流过流动池。
23B.根据示例实施方案组合1B-22B任一项的流式细胞术方法，包括:
制备该流体样品，包括将待评估是否存在非缔合的病毒尺寸颗粒的生物 材料与荧光抗体染色剂混合。
24B.根据示例实施方案组合23B的流式细胞术方法，其中制备该流体样 品包括，在混合之前，纯化生物材料的粗样品以制备用于进行流式细胞术的 流体样品的生物材料，所述纯化包括以不大于2微米的过滤尺寸过滤出粗样 品的颗粒，且包括在离心机中旋转层析以去除至少一部分小于病毒尺寸的杂 质。
25B.根据示例实施方案组合23B或示例实施方案组合24B的流式细胞术 方法，其中制备流体样品包括，在混合后，在流式细胞术之前，不从流体样 品去除未结合在非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体染色剂。
26B.根据示例实施方案组合23B-25B任一项的流式细胞术方法，其中所 述荧光抗体染色剂包含生物素化抗体和荧光团缀合的抗生蛋白链菌素。
27B.根据示例实施方案组合26B的流式细胞术方法，其中所述荧光团缀 合的抗生蛋白链菌素在被提供进行混合步骤时附着至生物素化抗体。
28B.根据示例实施方案组合27B的流式细胞术方法，其中所述荧光团缀 合的抗生蛋白链菌素和该生物素化抗体在独立制剂中被提供进行混合步骤， 且该荧光团缀合的抗生蛋白链菌素在混合过程中在溶液中附着至生物素化 抗体。
29B.根据示例实施方案组合1B-28B任一项的流式细胞术方法，其中所 述流式细胞术不检测光散射。
30B.根据示例实施方案组合3B的流式细胞术方法，其中进样至流式细 胞仪的流体样品具有的非缔合的标记的颗粒的浓度范围为1x 105至1x 109个颗粒/毫升。
31B.根据示例实施方案组合30B的流式细胞术方法，其中所述荧光抗体 染色剂包含附着至抗体分子的荧光团，且该流体样品中的荧光抗体染色剂每 个所述抗体分子包含平均3至8个附着的荧光团。
32B.根据示例实施方案组合31B的流式细胞术方法，其中所述荧光抗体 染色剂为第一荧光染色剂，且所述流体样品包含具有由激发辐射引起的第二 荧光发射响应的第二荧光染色剂，该第二荧光发射响应不同于第一荧光染色 剂的第一荧光发射响应。
33B.根据示例实施方案组合32B的流式细胞术方法，其中所述第二荧光 染色剂包括对颗粒类型不具有特异性的荧光核酸染色剂。
34B.根据示例实施方案组合32B的流式细胞术方法，其中:
所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标记的颗粒，所述表位为第一 表位，所述病毒尺寸颗粒为第一病毒尺寸颗粒，所述杆状病毒类型为第一病 毒类型且所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标记的颗粒；
所述第二荧光染色剂为不同于第一荧光抗体染色剂的第二荧光抗体染 色剂，且该第二荧光抗体染色剂能够与具有第二表位的第二病毒尺寸颗粒结 合以形成第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒，所述第二表位指示不同于第一 病毒类型的第二病毒类型；和
该方法包括在第二荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射 并评估所检测到的辐射，以鉴定指示有第二非缔合的标记的颗粒通过流动池 的检测事件。
35B.根据示例实施方案组合34B的流式细胞术方法，其中所述第二荧光 发射具有的峰值波长与第一荧光发射的峰值波长有至少20纳米的差异，且 该流式细胞术包括独立检测至少第一和第二荧光发射且不检测光散射。
36B.根据示例实施方案组合35B的流式细胞术方法，其中所述第二病毒 尺寸颗粒包括第二病毒类型的病毒样颗粒。
37B.根据示例实施方案组合31B的流式细胞术方法，其中所述表位为杆 状病毒gp64包膜糖蛋白且所述荧光抗体染色剂包括AcV1单克隆抗体。
38B.根据示例实施方案组合30B-37B任一项的流式细胞术方法，其中所 述病毒尺寸颗粒包括被修饰以表达重组蛋白的杆状病毒。
39B.根据示例实施方案组合38B的流式细胞术方法，其中所述流式细胞 术不检测光散射。
40B.根据示例实施方案组合38B的流式细胞术方法，包括制备该流体样 品，制备该流体样品包括:
将待评估是否存在非缔合的病毒尺寸颗粒的生物材料与荧光抗体染色 剂混合；和
在混合后，在流式细胞术之前不从流体样品中去除未结合在非缔合的标 记的颗粒中的荧光抗体。
41B.用于进样至流式细胞仪以进行流式细胞术评估的流体样品，包含：
水性液体介质；
在水性液体介质中的非缔合的标记的病毒尺寸颗粒，其浓度为1x 105至1x 109个非缔合的标记的颗粒/毫升，其中所述非缔合的标记的颗粒各自 包含具有指示杆状病毒类型的表位的杆状病毒类型的病毒尺寸颗粒和对于 与所述表位的直接或间接结合有特异性的荧光抗体染色剂；和
未结合在非缔合的标记的颗粒中的未结合的荧光抗体染色剂在水性液 体介质中的浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。
42B.根据示例实施方案组合41B的流体样品，其中所述流体样品包含的 荧光抗体染色剂的总浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。
43B.根据示例实施方案组合41B或示例实施方案组合42B的流体样品， 其中流体样品中的生物材料为去除了较大尺寸组分的纯化生物材料，过滤尺 寸不大于2微米。
44B.根据示例实施方案组合41B-43B任一项的流体样品，其中所述非缔 合的标记的颗粒具有的最大截面尺寸不大于600纳米。
45B.根据示例实施方案组合41B-44B任一项的流体样品，其中所述荧光 抗体染色剂包含附着至抗体分子的荧光团，且该流体样品中的荧光抗体染色 剂每个抗体分子包含平均3至8个附着的荧光团。
46B.根据示例实施方案组合41B-45B任一项的流体样品，其中抗体染色 剂的抗体为单克隆的。
47B.根据示例实施方案组合41B-46B任一项的流体样品，其中所述病毒 尺寸颗粒包括被修饰以表达重组蛋白的杆状病毒。
48B.根据示例实施方案组合41B-47B任一项的流体样品，其中所述表位 为杆状病毒gp64包膜糖蛋白且所述荧光抗体染色剂包括AcV1单克隆抗体。
49B.根据示例实施方案组合41B-48B任一项的流体样品，其中所述荧光 抗体染色剂包含生物素化抗体和荧光团缀合的抗生蛋白链菌素。
50B.根据示例实施方案组合41B-49B任一项的流体样品，其中：
所述荧光抗体染色剂为具有第一荧光发射的第一荧光染色剂；且
所述流体样品包含用于核酸的第二荧光染色剂，所述第二荧光染色剂具 有不同于第一荧光发射的第二荧光发射。
51B.根据示例实施方案组合41B-49B任一项的流体样品，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光抗体染色剂，所述表位为第一表位，所 述荧光发射为第一荧光发射，所述病毒类型为第一病毒类型且所述非缔合的 标记的颗粒为第一非缔合的标记的病毒尺寸颗粒；
所述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于 第一荧光抗体染色剂且能够与不同于第一表位的第二表位直接或间接结合， 第二表位指示不同于杆状病毒的第二病毒类型，且该第二荧光抗体染色剂具 有不同于第一荧光发射响应的第二荧光发射响应。
52B.根据示例实施方案组合51B的流体样品，其中具有第二表位的病毒 尺寸颗粒为病毒样颗粒。
53B.根据示例实施方案组合51B或示例实施方案组合52B的流体样品， 其中所述第二病毒类型选自弹状病毒类型和诺如病毒类型。
54B.根据示例实施方案组合42B的流体样品，其中所述荧光抗体染色剂 包含附着至抗体分子的荧光团，且该流体样品中的荧光抗体染色剂每个抗体 分子包含平均3至8个附着的荧光团。
55B.根据示例实施方案组合54B的流体样品，其中所述荧光抗体染色剂 包含生物素化抗体和荧光团缀合的抗生蛋白链菌素。
56B.根据示例实施方案组合54B的流体样品，其中：
所述荧光抗体染色剂为具有第一荧光发射的第一荧光染色剂；且
所述流体样品包含用于核酸的第二荧光染色剂，所述第二荧光染色剂具 有不同于第一荧光发射的第二荧光发射。
57B.根据示例实施方案组合54B的流体样品，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光抗体染色剂，所述表位为第一表位，所 述荧光发射为第一荧光发射，所述病毒类型为第一病毒类型且所述非缔合的 标记的颗粒为第一非缔合的标记的病毒尺寸颗粒；
所述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于 第一荧光抗体染色剂且能够与不同于第一表位的第二表位直接或间接结合， 第二表位指示不同于杆状病毒的第二病毒类型且该第二荧光抗体染色剂具 有不同于第一荧光发射响应的第二荧光发射响应。
58B.根据示例实施方案组合57B的流体样品，其中所述具有第二表位的 病毒尺寸颗粒为病毒样颗粒。
59B.根据示例实施方案组合54B-58B任一项的流体样品，其中所述病毒 尺寸颗粒包括被修饰以表达重组蛋白的杆状病毒。
60B.根据示例实施方案组合59B的流体样品，其中所述表位为杆状病毒 gp64包膜糖蛋白且所述荧光抗体染色剂包括AcV1单克隆抗体。
1C.根据权利要求1-114和1B-40B任一项的方法，其中所述流式细胞术 包括:
将检测事件计数为所出现的通过流动池的非缔合的标记的颗粒的个体， 以确定通过流动池的一定体积流体样品中非缔合的标记的颗粒的计数；
确定与计数相对应的通过流动池的流体样品的体积；和
使用非缔合的标记的颗粒的计数确定通过流动池的所述流体样品体积 中非缔合的标记的颗粒的浓度。
2C.根据示例实施方案组合1C的方法，其中所述流式细胞术包括:
根据与检测事件对应的辐射的检测，实时地对所述非缔合的标记的颗粒 进行计数；和
根据通过流动池的流体样品的体积来实时确定浓度。
3C.根据权利要求1C或权利要求2C的方法，其中确定流体样品通过流 动池的体积包括用流量传感器实时地测量流体样品到流动池的流速，并随时 间积分所得到的流速测量数据。
4C.根据权利要求1C-3C任一项的方法，其中鉴定指示有非缔合的标记 的颗粒通过流动池的检测事件是在没有与光散射检测相关联的信息的情况 下确定的。
本发明及其不同方面的前述讨论呈现用于说明和描述的目的。前述内容 并不意欲将本发明仅限定为本文中所特定公开的形式。因此，与上面教导以 及相关领域的技术和知识相当的变化和修改处于本发明的范围内。上文中所 述的实施例进一步用于解释用于实践本发明的已知的最好方式，并使本领域 其它技术人员能够以这样或其它的实施例以及本发明的特定应用或使用所 需的各种修改利用本发明。请注意，所附权利要求应理解为包括现有技术所 允许程度的替代实施例。尽管本发明的说明已包括一个或多个可能实施方式 的描述以及某些变化和修改，但是在理解本发明之后，其它变化和修改在本 发明的范围内，例如处于本领域技术和知识范围内的变化和修改。本发明意 在获得包含所允许范围内的替代实施例的权益，包括所要求的替代的、可互 换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤，不管这种替代的、可互换的和/ 或等同的结构、功能、范围或步骤是否在本文中公开，本发明并不意图捐献 任何可获得专利的主题。而且，相对于任何所公开的变化所描述和主张的任 何特征可与任何其它变化中的一个或多个任何特征以任意结合的方式相结合，甚至于这些特征可能在技术上是不兼容的，并且，所有这样的结合都包 含在本发明的范围内。特定组合中的一个或多个特征的描述不排除包括附加 一个或多个特征。处理步骤和排序仅用于说明，并且这样的示例不排除包括 其他步骤或其他步骤顺序。在所示处理步骤之间或在任何所示处理步骤之前 或之后可以包括附加步骤。
术语“包括”及这些术语的语法变体意在是包含性的和非限制性的，因 为使用这样的术语说明存在一些情况或特征，但并不排除任何其它情况或特 征。使用术语“包括”及这些术语的语法变体指代一个或多个部件、子部件 或材料的存在，也包括并意在公开更特定的实施例，其中，术语“包括”(或 这样的术语的变体)由更窄的术语“基本由…构成”或“由…构成”或“仅 由…构成”(或这样的更窄术语的适当语法变体)替代。例如，某物“包括”一定元件的表述还意在包括并公开“由一定元件基本构成”的物体以及“由 一定元件构成”的物体的更多特定的更窄实施例。各特征的示例已提供用于 解释的目的，术语“示例”、“例如”等指代示例性示例，其不限制并不应解 释或理解为限制特征为任何特定的示例。后面有一数字的术语“至少”(例 如至少一个)意味着数字可大于所示数字。术语“至少一部分”意味着所有 或小于所有的一部分。术语“至少一部分”意味着所有或小于所有的一部分。
例如生物材料样品的“部分”或材料，是指这种材料的一些组分或成分， 包括材料的相同组成等分部分和材料的加工部分，该加工部分其不再具有相 同的组成，但具有来自该材料的一种或多种组分并且可以与其它不是源自该 材料的组分(例如，缓冲溶液，试剂)混合。例如，即使流体样品仅包含与粗 样品分离的一些纯化的生物成分，包含要进行流式细胞术的生物材料的流体 样品也包括收集的粗生物材料样品的一部分。作为另一个例子，如果制备为 包括用于评估的一些生物材料的流体样品批次被分成单独的等分试样用于单独的等分试样的单独的流式细胞计数运行，则每个这样的等分试样包括该 批次的一部分生物材料，并且包括来自可能已经被纯化的生物材料的粗品样 品的生物材料的部分。

Claims (40)

1.评估生物材料样品中的具有特定表位的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所述流体样品包含荧光抗体染色剂，所述荧光抗体染色剂能与所述特定表位直接或间接结合以形成包括具有所述表位的病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂的非缔合的标记的颗粒，
其中在流式细胞术期间进样至流式细胞仪的流体样品包含的未结合在非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体染色剂的浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。
2.评估生物材料样品中的具有特定表位的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所述流体样品包含荧光抗体染色剂，所述荧光抗体染色剂能与所述特定表位直接或间接结合以形成包括具有所述表位的病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂的非缔合的标记的颗粒，且
在流式细胞术之前，制备该流体样品，包括：
将待评估是否存在非缔合的颗粒的生物材料与荧光抗体染色剂混合，该荧光抗体染色剂能与所述表位直接或间接结合以形成非缔合的标记的病毒尺寸颗粒，
在混合后，在流式细胞术之前不从流体样品中去除未结合在非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体。
3.评估生物材料样品中的具有特定表位的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所述流体样品包含荧光抗体染色剂，所述荧光抗体染色剂能与所述特定表位直接或间接结合以形成包括具有所述表位的病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂的非缔合的标记的颗粒；
其中所述流式细胞术不检测光散射。
4.根据权利要求3的方法，其中所述流式细胞术包括仅检测荧光发射。
5.评估生物材料样品中的具有特定表位的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所述流体样品包含荧光抗体染色剂，所述荧光抗体染色剂能与所述特定表位直接或间接结合以形成包括具有所述表位的病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂的非缔合的标记的颗粒；
其中所述荧光抗体染色剂包含附着至抗体分子的荧光团，每个抗体分子包含平均3至8个附着的荧光团。
6.评估生物材料样品中的具有特定表位的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所述流体样品包含荧光抗体染色剂，所述荧光抗体染色剂能与所述特定表位直接或间接结合以形成包括具有所述表位的病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂的非缔合的标记的颗粒；
其中所述荧光抗体染色剂为具有第一荧光发射响应的第一荧光染色剂，且所述流体样品包含具有第二荧光发射响应的第二荧光染色剂，该第二荧光发射响应不同于第一荧光染色剂的第一荧光发射响应，且所述流式细胞术包括检测在第一荧光发射响应的第一波长范围内以及在第二荧光发射响应的第二波长范围内的辐射。
7.根据权利要求6的方法，其中所述第二荧光染色剂包括对颗粒类型不具有特异性的荧光核酸染色剂。
8.根据权利要求6的方法，其中所述表位为第一表位，且所述第二荧光染色剂包含能与不同于第一表位的第二表位结合的第二荧光抗体染色剂。
9.根据权利要求6的方法，其中:
所述非缔合的颗粒为第一非缔合的颗粒，所述表位为第一表位，所述非缔合的颗粒为第一颗粒类型且所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标记的颗粒；
所述第二荧光染色剂为不同于第一荧光抗体染色剂的第二荧光抗体染色剂，且该第二荧光抗体染色剂能够结合第二非缔合的病毒尺寸颗粒以形成第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒，所述第二非缔合的病毒尺寸颗粒具有指示不同于第一颗粒类型的第二颗粒类型的第二表位。
10.根据权利要求6的方法，其中所述第二荧光发射具有的峰值波长与第一荧光发射的峰值波长有至少20纳米的不同。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述流式细胞术包括:
使流体样品流过流式细胞仪的流动池；
使流过流动池的流体样品经受能引起源自荧光抗体染色剂的荧光发射响应的激发辐射；和
在所述荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射并评估所检测到的辐射，以鉴定指示有非缔合的标记的病毒尺寸颗粒通过流动池的检测事件，该非缔合的标记的病毒尺寸颗粒包含具有所述表位的所述病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂。
12.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中在流式细胞术期间进样至流式细胞仪的流体样品包含的荧光抗体染色剂的总浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。
13.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中在流式细胞术期间进样至流式细胞仪的流体样品具有的非缔合的标记的颗粒的浓度为至多1x 109个颗粒/毫升。
14.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中在流式细胞术期间进样至流式细胞仪的流体样品具有的非缔合的标记的颗粒的浓度范围为1x 105至1x 109个颗粒/毫升。
15.制备包含病毒类型的病毒尺寸颗粒的产物的方法，该方法包括:
生产处理以制备包含所述病毒类型的病毒尺寸颗粒的纯化产物；
从生产处理的阶段收集生物材料样品，预期在该阶段过程中该病毒尺寸颗粒存在于生物材料中；和
评估所述样品是否存在具有指示所述病毒类型的特定表位的病毒尺寸颗粒，所述评估包括进行根据权利要求1-10中任一项的方法。
16.根据权利要求15的方法，包括将所述收集进行多次以从多个不同的所述生产处理阶段收集不同的待评估的所述生物材料样品，且对每个待评估的所述收集的生物材料样品进行所述评估。
17.根据权利要求16的方法，其中所述生产处理包括:
在生物生产操作中生成病毒尺寸颗粒；
从该生物生产操作收获包含在该生成中产生的病毒尺寸颗粒的粗产物；
纯化至少一部分该粗产物材料以制备包含病毒尺寸颗粒的纯化产物。
18.根据权利要求17的方法，其中所述多个不同的所述阶段至少包括在所述生成或收获过程中的第一阶段和在所述纯化过程中或之后的第二阶段。
19.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述流式细胞术包括将所述流体样品以250至3000纳升/分钟范围内的流体样品流速流过流式细胞仪的流动池。
20.根据权利要求2-10中任一项的方法，其中进样至流式细胞仪的流体样品包含的未结合在非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体染色剂的浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。
21.根据权利要求1和3-10中任一项的方法，包括:
制备该流体样品，包括将待评估是否存在非缔合的颗粒的生物材料与荧光抗体染色剂混合，该荧光抗体染色剂能与所述表位直接或间接结合以形成非缔合的标记的病毒尺寸颗粒；和
在混合后，在流式细胞术之前不从流体样品中去除未结合在非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体染色剂。
22.用于进样至流式细胞仪以进行流式细胞术评估的流体样品，包含：
水性液体介质；
在水性液体介质中的非缔合的标记的病毒尺寸颗粒，其浓度为至多1x 109个非缔合的标记的颗粒/毫升，其中所述非缔合的标记的颗粒各自包含具有指示病毒类型的特定表位的病毒类型的病毒尺寸颗粒和对于与所述表位直接或间接结合有特异性的荧光抗体染色剂；和
未结合在非缔合的标记的颗粒中的未结合的荧光抗体染色剂在水性液体介质中的浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。
23.根据权利要求22的流体样品，其中所述流体样品包含的荧光抗体染色剂的总浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。
24.根据权利要求22的流体样品，其中：
所述荧光抗体染色剂为具有第一荧光发射的第一荧光染色剂；且
所述流体样品包含用于核酸的第二荧光染色剂，所述第二荧光染色剂具有不同于第一荧光发射的第二荧光发射。
25.根据权利要求22的流体样品，其中：
所述荧光抗体染色剂为具有第一荧光发射的第一荧光抗体染色剂，且所述表位为第一表位；
所述流体样品包含具有不同于第一荧光发射的第二荧光发射的第二荧光抗体染色剂；且
所述第二荧光染色剂包含能够与不同于第一表位的第二表位结合的第二荧光抗体染色剂。
26.根据权利要求22的流体样品，其中：
所述荧光抗体染色剂为第一荧光抗体染色剂，所述表位为第一表位，所述荧光发射为第一荧光发射，所述病毒类型为第一病毒类型且所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标记的病毒尺寸颗粒；
所述流体样品包含第二荧光抗体染色剂，该第二荧光抗体染色剂不同于第一荧光抗体染色剂且能够与不同于第一表位的第二表位直接或间接结合，第二表位指示不同于第一病毒类型的第二病毒类型，且该第二荧光抗体染色剂具有不同于第一荧光发射响应的第二荧光发射响应。
27.根据权利要求22的流体样品，其中所述流体样品具有的非缔合的标记的颗粒的浓度范围为1x 105至1x 109个颗粒/毫升。
28.根据权利要求1-10和22-27中任一项的方法或流体样品，其中所述非缔合的标记的颗粒具有的最大截面尺寸范围为10纳米至2微米。
29.根据权利要求1-4、6-10和22-27中任一项的方法或流体样品，其中所述荧光抗体染色剂包含附着至抗体分子的荧光团，每个抗体分子包含平均3至8个附着的荧光团。
30.根据权利要求1-10和22-27中任一项的方法或流体样品，其中所述病毒尺寸颗粒为外来体。
31.根据权利要求1-10和22-27中任一项的方法或流体样品，其中所述病毒尺寸颗粒为病毒样颗粒。
32.根据权利要求1-10和22-27中任一项的方法或流体样品，其中所述病毒尺寸颗粒为病毒颗粒。
33.根据权利要求1-10和22-27中任一项的方法或流体样品，其中病毒类型为杆状病毒。
34.根据权利要求1-10和22-27中任一项的方法或流体样品，其中病毒类型为诺如病毒。
35.根据权利要求1-10和22-27中任一项的方法或流体样品，其中病毒类型为肠病毒。
36.根据权利要求1-10和22-27中任一项的方法或流体样品，其中病毒类型为流感病毒。
37.根据权利要求1-10和22-27中任一项的方法或流体样品，其中所述病毒尺寸颗粒被修饰以表达重组蛋白。
38.制备荧光抗体染色剂的方法，所述荧光抗体染色剂用于染色具有目标表位的病毒尺寸颗粒，所述方法包括：
在pH为pH 7至pH 8的水性液体介质中直接或间接将荧光团附着到靶向结合目标表位的抗体分子，每个抗体分子附着的荧光团的平均数量的范围为3至8个。
39.根据权利要求38的方法，其中所述水性液体介质包含缓冲溶液。
40.根据权利要求39的方法，其中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
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