ES2935368T3 - Evaluación de material biológico de partículas del tamaño de un virus no asociado de un tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado - Google Patents
Evaluación de material biológico de partículas del tamaño de un virus no asociado de un tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado Download PDFInfo
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Abstract
Un método para evaluar un material biológico para partículas no asociadas del tamaño de un virus que tienen un epítopo particular indicativo de un tipo viral de virus adenoasociado o un tipo viral de adenovirus utiliza una tinción de anticuerpo fluorescente específica para unirse con el epítopo y una muestra de fluido con el virus- partículas de tamaño y tinción de anticuerpo fluorescente se somete a citometría de flujo con identificación de eventos de detección de emisión fluorescente indicativos del paso a través de una celda de flujo de un citómetro de flujo de partículas marcadas no asociadas de tamaño de virus, incluida dicha partícula de tamaño de virus y tinción de anticuerpo fluorescente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Evaluación de material biológico de partículas del tamaño de un virus no asociado de un tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado
Descripción
La presente descripción se refiere a la evaluación por citometría de flujo de material biológico para partículas no asociadas del tamaño de un virus de un tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés). Específicamente, la presente invención se refiere a métodos de citometría de flujo para evaluar una muestra de material biológico de partículas del tamaño de un virus no asociado de un tipo vírico seleccionado del grupo que consiste en un tipo vírico de adenovirus y un tipo vírico de virus adenoasociado. Además, la presente invención se refiere a métodos de citometría de flujo relacionados para fabricar un producto que comprende dichas partículas del tamaño de un virus.
Los adenovirus y los virus adenoasociados son virus sin envuelta que han sido especialmente difíciles de cuantificar con precisión por citometría de flujo. Por cantidad o cuantificación se entiende contar y determinar una concentración de partículas de virus individuales.
Los adenovirus son una familia de virus sin envuelta de aproximadamente 90 a 100 nanómetros de tamaño con una nucleocápside icosaédrica que contiene un genoma de ADN bicatenario que varía de 26 a 48 kpb de tamaño. El adenovirus es infectivo para una serie de hospedadores vertebrados, que incluyen muchos serotipos distintos que infectan a los seres humanos. El adenovirus es un virus importante para su uso en una serie de aplicaciones viroterápicas, que incluyen aplicaciones oncolíticas, genoterápicas e inmunoterápicas. El adenovirus es uno de los principales vehículos para suministrar cargas genéticas a tipos celulares específicos, especialmente células neoplásicas. Los adenovirus tienen un alto potencial de toxicidad, y el control y la cuantificación cuidadosos y precisos de los adenovirus son importantes a lo largo de diversas fases de fabricación y para la dosificación precisa en formulaciones viroterápicas. Por ejemplo, se sabe que el adenovirus provoca enfermedades respiratorias en seres humanos, principalmente en niños, y es esencial que los genes víricos clave se reemplacen con el gen o genes terapéuticos requeridos. Para evitar este problema, así como la probabilidad de una respuesta inmunitaria del hospedador al vector, también se están investigando cepas no humanas de adenovirus. Este punto, especialmente en lo que se refiere a la cuantificación, ha sido mencionado específicamente por la FDA: “ Dada la toxicidad potencial de las propias partículas adenovíricas, el CBER recomienda que la dosificación del paciente se base en el número de partículas” . (Directriz para la terapia con células somáticas humanas y la terapia génica, Centros para la evaluación e investigación de productos biológicos de la FDA, 1998).
Los virus adenoasociados (AAV) son una familia de virus pequeños, sin envuelta, del orden de 20 nanómetros de tamaño y un genoma de ADN monocatenario de 4,7 kb. El a Av tiene muchos serotipos que pueden infectar tanto células en división como quiescentes en hospedadores humanos. Los virus adenoasociados son virus importantes para su uso en una serie de aplicaciones viroterápicas, incluyendo como vector de terapia génica. Debido a su tamaño extremadamente pequeño, el virus adenoasociado es difícil de detectar y cuantificar con precisión, por ejemplo, en operaciones de fabricación para producir virus adenoasociados recombinantes y para el control de dosificación.
El virus adenoasociado (AAV) generalmente no se replica, requiriendo la replicación generalmente la presencia de un factor adicional. Por ejemplo, el AAV puede replicarse en presencia de adenovirus usando determinadas proteínas de genes de adenovirus. Algunas ventajas de usar AAV como vector vírico son la ausencia de patogenicidad, la baja respuesta inmunitaria del hospedador y la expresión a largo plazo. La cuantificación precisa de AAV durante las operaciones de fabricación y formulación es importante para controlar el rendimiento de las construcciones de fabricación y realizar un seguimiento de los rendimientos de producto y proporcionar una dosificación precisa. Aunque no sea patogénico, la dosificación excesiva con un agente vírico infeccioso tal como el virus adenoasociado puede provocar problemas graves a los pacientes.
Una de las etapas más problemáticas es la cuantificación de vectores víricos de adenovirus o AAV durante el crecimiento, la cosecha, la purificación y la liberación. Los métodos tales como la PCR cuantitativa y las lecturas de absorbancia a 260 nm y 280 nm son muy variables, dando como resultado en una sobreestimación o subestimación de las partículas presentes en cualquier etapa dada. Las ramificaciones para la fabricación son la pérdida de producto, los retrasos y los sobrecostes, que son graves, pero menores en comparación con los riesgos asociados a la administración de muy poco (sin efecto terapéutico) o demasiado (respuesta inmunitaria adversa) producto a los pacientes. Claramente, existe un requisito crítico para un medio rápido y más preciso para cuantificar las partículas víricas de AAV usadas para la terapia génica mediada por vectores.
Algunos otros enfoques tradicionales para la cuantificación de virus incluyen la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el ensayo de inmunodifusión radial simple (SRID). Estos enfoques tradicionales tienden a tener una o más de las siguientes limitaciones: lentos, caros, altamente técnicos, alta variabilidad en los resultados y subjetivos. Algunos enfoques más nuevos que se han propuesto generalmente para la cuantificación de virus incluyen el fraccionamiento de flujo de campo y la dispersión de luz multiángulo (FFF-MALS), la detección de pulso resistivo sintonizable (TRPS)
y el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTS). Todos estos enfoques más nuevos pueden, en algunos casos, tener algunas ventajas con respecto a los métodos de cuantificación tradicionales, pero también tienen limitaciones, que incluyen típicamente proporcionar datos de virus limitados. En el caso del AAV, el ensayo de título de placa, comúnmente usado como medida de cuantificación para muchos virus, generalmente no es una técnica útil para el AAV, debido a la naturaleza no replicante del AAV. Además, el ensayo de título de placa, comúnmente usado como medida de cuantificación para muchos virus, generalmente no es una técnica útil para el virus adenoasociado, debido a la naturaleza no replicante del AAV.
Un método muy común para cuantificar el AAV es la PCR cuantitativa, sin embargo, generalmente se considera que la técnica proporciona, en el mejor de los casos, una lectura indirecta del número de partículas, y los resultados para la misma muestra pueden variar hasta 3 veces cuando se realiza en el mismo instrumento e incluso más (hasta 10 veces) cuando la muestra se analiza en un soporte físico diferente y/o por personal de laboratorio diferente. La capacidad de usar qPCR también se confunde frecuentemente por el empaquetamiento anómalo de construcciones que superan el tamaño normal del genoma de 4,7 kb. Puesto que la qPCR típicamente subestima el número de copias (y, por inferencia, subestima el recuento de partículas), las preocupaciones sobre la inyección de cantidades de partículas de AAV superiores a las necesarias están bien fundadas.
La citometría de flujo controlada cuidadosamente usando una combinación de tinciones fluorescentes de proteínas y ácidos nucleicos también se ha usado para la cuantificación de una diversidad de virus. La citometría de flujo es una técnica analítica en la que se miden las propiedades físicas y/o químicas de las partículas a medida que fluyen en una muestra de fluido a través de una cubeta de investigación, comúnmente conocida como celda de flujo. Aunque la muestra de fluido puede investigarse sometiendo la muestra de fluido a una diversidad de estímulos, la luz es una técnica de estímulo común. Los dispositivos que contienen una celda de flujo y los componentes asociados de flujo de fluido, suministro de luz y detección de luz se denominan típicamente citómetros de flujo.
Los citómetros de flujo Virus Counter® (ViroCyt, Inc.) se han usado para detectar la presencia de partículas víricas no asociadas libres (en ocasiones denominadas viriones) de una diversidad de virus a través de una combinación de velocidad de flujo de muestra muy baja y controlada con precisión a través de la celda de flujo y el uso de dos tinciones fluorescentes fluorogénicas que tienen diferentes distintivos de emisión fluorescente, con una tinción que tiene afinidad por marcar ácido nucleico y la otra tiene afinidad por marcar proteínas. Las tinciones no son específicas en cuanto al tipo de virus, pero la identificación de eventos de detección simultáneos para las dos emisiones fluorescentes diferentes de las dos tinciones fluorescentes puede ser indicativa del paso de una partícula de virus no asociada a través de la celda de flujo. A diferencia de técnicas tales como el fraccionamiento de flujo de campo y la dispersión de luz multiángulo (FFF-MALS), la detección de pulso resistivo sintonizable (TRPS) y el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTS) que miden solo la presencia de partículas, viriones u otras partículas, los citómetros de flujo Virus Counter® proporcionan más información biológicamente relevante dada la naturaleza de los colorantes usados para la enumeración.
En este contexto, Gaudin y Barteneva (Gaudin, R. y Barteneva, N. S.; Nat. Comm, 6; 2015; Art. N.° 6022) describe distintos perfiles de infectividad revelados por clasificación de pequeñas partículas de virus infecciosas por virometría de flujo. Además, Arakelyan y col. (Arakelyan, A. y col.; J. Clin. Invest., 123(9); 2013; págs. 3716-3727) describe la virometría de flujo basada en nanopartículas para el análisis de viriones individuales. Además, Reichmuth y col. (Reichmuth, D. S. y col.; Lab Chip., 8(8); 2008; págs. 1319-1324) describe inmunoensayos electroforéticos rápidos basados en microchip para la detección del virus de la gripe porcina.
Las tinciones de proteínas y ácidos nucleicos no específicas de los tipos indicados anteriormente son fluorogénicas. Las moléculas de tinción tienen solo una respuesta fluorescente muy débil en un estado libre, no unido, pero la magnitud de la respuesta fluorescente aumenta significativamente cuando la orientación de la molécula se fija cuando se une a una partícula. Este aumento en la respuesta fluorescente desde el estado libre, no unido al estado unido, puede ser un aumento de un orden de magnitud o más. Esto permite que las fuertes señales fluorescentes de las moléculas de tinción unida se identifiquen sobre la fluorescencia de fondo de las moléculas de tinción no unida, debido a la respuesta fluorescente relativamente mucho más débil de las moléculas de tinción no unida.
Hay algunas situaciones, sin embargo, cuando dichas técnicas de citometría de flujo tienen limitaciones. Una limitación es que la técnica no es óptima para la evaluación de virus no envueltos, tales como adenovirus o virus adenoasociados. La ausencia de proteínas de envuelta fácilmente accesibles en adenovirus o virus adenoasociados puede limitar significativamente la precisión de la técnica para la cuantificación de adenovirus o virus adenoasociados.
Dada la importancia de los adenovirus o virus adenoasociados como agentes viroterápicos y los riesgos potenciales implicados con el uso de un material infeccioso de este tipo, serían deseables técnicas de cuantificación rápidas, económicas y fiables.
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
La citometría de flujo como técnica útil para evaluar cuantitativamente partículas de virus es relativamente nueva. La mayor parte de las evaluaciones por citometría de flujo de material biológico han implicado la detección e investigación
de propiedades de partículas que tienen un tamaño del orden de las células de organismos multicelulares o más grandes. Dichas partículas pueden ser células individuales o microesferas (típicamente hechas de un material tal como látex o poliestireno) funcionalizadas con una afinidad para unirse a unidades biológicas más pequeñas de interés. Dichas microesferas también se denominan en ocasiones perlas o microperlas. La presencia de partículas de células o microesferas se identifica típicamente durante la citometría de flujo mediante la detección y el análisis de la luz dispersa que sale de la celda de flujo. También se han usado diversas técnicas de tinción fluorescente para proporcionar información adicional sobre algunas propiedades biológicas específicas de dichas partículas, por ejemplo, atributos biológicos particulares de células detectadas o de material biológico unido a microesferas. La detección de partículas de células o microesferas a través de la dispersión de luz se suplementa con la detección también de la emisión fluorescente específica de la tinción fluorescente. Algunas tinciones fluorescentes incluyen una molécula fluorescente unida a un anticuerpo con capacidad de unión para un epítopo particular de interés para la evaluación. Estas tinciones, sin embargo, tienden a ser fluoróforos que presentan un alto nivel de respuesta fluorescente ya sea que se unan o no a una partícula. La cuantificación eficaz de partículas del tamaño de un virus en una muestra de fluido por citometría de flujo requiere contar partículas individuales no asociadas del tamaño de un virus, medir el flujo de muestra y calcular la concentración de partículas del tamaño de un virus a partir del recuento de partículas medido y el flujo de muestra medido. A diferencia de las tinciones fluorogénicas, la presencia de señales de fondo de las tinciones de fluoróforos no unidas es una preocupación importante. Se pueden utilizar algunas técnicas para garantizar que una señal fluorescente detectada se asocie a la célula o microesfera de interés, en lugar de provenir de desechos teñidos o de moléculas de tinción fluorescente libre y no unida que pueden permanecer en solución. Después de teñir las partículas con el colorante fluorescente deseado, las partículas se pueden separar del líquido que contiene moléculas de tinción fluorescente residual en solución, tal como por filtración o por sedimentación acelerada, tal como por centrifugación y decantación. Las células separadas o las partículas de microesferas pueden volver a suspenderse en un líquido de suspensión fresco que esté libre de tinción fluorescente no unida. Además, se puede realizar un análisis de correlación de tiempo para identificar la ocurrencia de eventos simultáneos de detección de dispersión de luz indicativa de la presencia de una célula o partícula de microesfera y detección de emisión fluorescente indicativa de la presencia de la tinción fluorescente, lo que ayuda a garantizar que una señal fluorescente detectada está de hecho asociada a propiedades del material biológico de las células o microesferas.
Sin embargo, se ha descubierto que la cuantificación por citometría de flujo de partículas de adenovirus o virus adenoasociados se puede realizar usando tinción de anticuerpos fluorescente, y sin identificación de partículas por detección de dispersión de luz, sin separar las partículas de adenovirus o virus adenoasociados teñidas del líquido con tinción de anticuerpos no unida residual después de la tinción de partículas de virus, y sin requerir la detección simultánea de tinciones de proteínas y ácidos nucleicos no específicas o detección de dispersión de luz. Esto facilita el uso práctico de las tinciones de anticuerpos de fluoróforos para la detección y cuantificación de las partículas de tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado, y sin las complicaciones de identificar partículas del tamaño de un virus a través de la detección de dispersión de luz o la detección simultánea de tinciones fluorogénicas de ácido nucleico y proteína y sin la eliminación de partículas teñidas de fluoróforos de tinción de anticuerpos no unida residual en la muestra de fluido después de la tinción. Esto es especialmente destacable dado el tamaño extremadamente pequeño de dichas partículas y, en particular, de las partículas de AAV.
Un aspecto de esta descripción es un método para evaluar una muestra de material biológico de partículas del tamaño de un virus no asociado que tengan un epítopo particular, es decir, una capacidad particular de unión a anticuerpos, indicativo de un tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado. El método incluye someter a citometría de flujo una muestra de fluido que comprende al menos una parte de una muestra de material biológico que ha de evaluarse, en donde la muestra de fluido comprende una tinción de anticuerpos fluorescente capaz de unirse, directa o indirectamente, con el epítopo particular. La citometría de flujo incluye hacer fluir la muestra de fluido a través de una celda de flujo de un citómetro de flujo; someter la muestra de fluido que fluye a través de la celda de flujo a radiación de excitación capaz de provocar una respuesta de emisión fluorescente de la tinción de anticuerpos fluorescente; y detectar la radiación de la celda de flujo dentro de un intervalo de longitudes de onda de la emisión fluorescente y evaluar la radiación detectada para identificar los eventos de detección indicativos del paso a través de la celda de flujo de partículas marcadas no asociadas del tamaño de un virus que incluyen dicha partícula del tamaño de un virus que tiene el epítopo y la tinción de anticuerpos fluorescente. Cada uno de dichos eventos de detección se corresponde con una única partícula marcada no asociada de este tipo.
El método puede incluir preparar una muestra de fluido que incluya el material biológico para evaluar la presencia de las partículas no asociadas del tamaño de un virus y al menos una tinción de anticuerpos fluorescente que sea capaz de unirse, directa o indirectamente, con las partículas no asociadas del tamaño de un virus a través del epítopo para formar partículas marcadas no asociadas del tamaño de un virus que pueden detectarse durante la citometría de flujo. La preparación de la muestra de fluido puede incluir mezclar el material biológico o una parte del mismo que ha de evaluarse con la tinción de anticuerpos fluorescente. Someter la muestra de fluido a citometría de flujo puede incluir hacer fluir la muestra de fluido a través de una celda de flujo de un citómetro de flujo en condiciones de flujo para el paso de partículas del tamaño de un virus individualmente a través de la celda de flujo.
Una ventaja importante del método es que no es necesario eliminar de la muestra de fluido la tinción de anticuerpos fluorescente no unida y residual en solución antes de la citometría de flujo. La separación de la tinción de anticuerpos fluorescente no unida restante de las partículas marcadas con fluorescencia del tamaño de un virus de interés para la
evaluación requeriría un procesamiento engorroso y lento, tal como la ultracentrifugación. Esto es significativamente diferente de separar la tinción de anticuerpos de partículas marcadas más grandes, tales como células o microesferas de inmunoensayo en aplicaciones anteriores, y separar la tinción de anticuerpos fluorescente de partículas del tamaño de un virus es significativamente más complicado, lento y caro que en contextos de partículas más grandes. En las implementaciones preferidas, la preparación de una muestra de fluido incluye, después de la mezcla, no eliminar la tinción de anticuerpos fluorescente no unida, es decir, la tinción de anticuerpos fluorescente no unida a las partículas marcadas no asociadas (por ejemplo, libres en solución), de la muestra de fluido antes de la citometría de flujo. En otras palabras, la tinción de anticuerpos fluorescente no unida residual de la mezcla puede retenerse en la muestra de fluido para permanecer en la muestra de fluido cuando la muestra de fluido se somete a citometría de flujo. Dicha tinción de anticuerpos fluorescente no unida puede representar la mayoría o incluso la mayor parte de la tinción de anticuerpos fluorescente que se mezcla con el material biológico durante la etapa de mezcla indicada. Sin embargo, una consideración importante para el rendimiento de la citometría de flujo es el control de la concentración de dichas moléculas de tinción de anticuerpos fluorescente no unida y residual en solución, de manera que las señales de emisión fluorescente de dichas moléculas de tinción de anticuerpos fluorescente no unida no superen o dominen las señales de emisión fluorescente de las partículas marcadas no asociadas del tamaño de un virus y evitar la diferenciación de las señales de emisión de las partículas marcadas no asociadas. En algunas implementaciones preferidas, la muestra de fluido alimentada al citómetro de flujo puede tener una concentración de dicha tinción de anticuerpos fluorescente no unida, no unida en partículas marcadas no asociadas, en un intervalo que tiene un límite inferior de 0,25 microgramos por mililitro, 0,5 microgramos por mililitro, 0,7 microgramos por mililitro, 1 microgramo por mililitro, 2 microgramos por mililitro, 3 microgramos por mililitro o 5 microgramos por mililitro y un límite superior de 10 microgramos por mililitro, 8 microgramos por mililitro, 7 microgramos por mililitro, 6 microgramos por mililitro, 5 microgramos por mililitro, 4 microgramos por mililitro, 3 microgramos por mililitro, 2,5 microgramos por mililitro o 2 microgramos por mililitro, siendo el límite superior mayor que el límite inferior. Cuando una muestra de fluido incluye múltiples tipos diferentes de tinciones de anticuerpos fluorescentes, una concentración de este tipo de tinción de anticuerpos fluorescente no unida y residual se puede aplicar a una concentración de cada tipo de tinción de anticuerpos fluorescente por separado y/o a una concentración combinada de algunas o todas las tinciones de anticuerpos fluorescentes. Puede preferirse para muchas implementaciones una concentración de este tipo de tinción de anticuerpos fluorescente no unida y residual de aproximadamente 2, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 3 microgramos por mililitro o dentro de un intervalo relativamente estrecho (por ejemplo, dentro de 0,5 microgramos por mililitro) por encima o por debajo de 2, 2,5 o 3 microgramos por mililitro. En algunas implementaciones preferidas, la muestra de fluido que se alimenta al citómetro de flujo puede tener una concentración total de una tinción de anticuerpos fluorescente, que incluye la tinción de anticuerpos fluorescente no unida y residual y la tinción de anticuerpos fluorescente unida en partículas marcadas no asociadas en un intervalo que tiene un límite inferior de 0,25 microgramos por mililitro, 0,5 microgramos por mililitro, 0,7 microgramos por mililitro, 1 microgramo por mililitro, 2 microgramos por mililitro, 3 microgramos por mililitro o 5 microgramos por mililitro y un límite superior de 10 microgramos por mililitro, 8 microgramos por mililitro, 7 microgramos por mililitro, 6 microgramos por mililitro, 5 microgramos por mililitro, 4 microgramos por mililitro, 3 microgramos por mililitro, 2,5 microgramos por mililitro o 2 microgramos por mililitro, siendo el límite superior mayor que el límite inferior. Puede preferirse para muchas implementaciones una concentración total de este tipo de tinción de anticuerpos fluorescente de aproximadamente 2, 2,5 o 3 microgramos por mililitro o dentro de un intervalo relativamente estrecho (por ejemplo, dentro de 0,5 microgramos por mililitro) por encima o por debajo de 2, 2,5 o 3 microgramos por mililitro. Cuando una muestra de fluido incluye múltiples tipos diferentes de tinciones de anticuerpos fluorescentes, una concentración total de este tipo de tinción de anticuerpos fluorescente se puede aplicar a una concentración total de cada tipo de anticuerpo fluorescente por separado y/o a una concentración total combinada para algunas o todas las tinciones de anticuerpos fluorescentes. Puede preferirse para muchas implementaciones una concentración de este tipo de aproximadamente 2, 2,5 o 3 microgramos por mililitro o dentro de un intervalo relativamente estrecho (por ejemplo, dentro de 0,5 microgramos por mililitro) por encima o por debajo de 2, 2,5 o 3 microgramos por mililitro. Como se apreciará, una concentración óptima para una concentración total de este tipo de tinción de anticuerpos fluorescente o para una concentración de este tipo de tinción de anticuerpos no asociada y residual puede variar algo entre aplicaciones particulares, pero los intervalos especificados pueden ser aplicables en general a través de muchas aplicaciones. La concentración óptima para una aplicación particular puede depender de variables tales como la concentración de partículas no asociadas diana del tamaño de un virus, la cantidad del epítopo (número de sitios de unión para la tinción de anticuerpos fluorescente) en dichas partículas no asociadas y la afinidad de la tinción de anticuerpos fluorescente para la unión con el epítopo sobre las partículas no asociadas. En algunas implementaciones preferidas, la muestra de fluido alimentada al citómetro de flujo puede tener una concentración de las partículas marcadas no asociadas en un intervalo que tiene un límite inferior de 1 x 105, 1 x 106 o 1 x 107 partículas por mililitro y un límite superior de 1 x 109, 1 x 108 o 1 x 107partículas por mililitro, siempre que el límite superior sea mayor que el límite inferior. Cuando una muestra de fluido incluye múltiples tipos diferentes de partículas que tienen diferentes epítopos que han de detectarse con diferentes tipos de tinciones de anticuerpos fluorescentes, una concentración de este tipo de partículas marcadas no asociadas se puede aplicar a una concentración de las partículas marcadas no asociadas de cada tipo de partícula y/o a una concentración combinada para algunas o todas las partículas marcadas no asociadas de todos los tipos de partículas que han de detectarse. En algunas implementaciones preferidas, esencialmente todas las partículas de un tipo que ha de detectarse están en partículas marcadas no asociadas del tamaño de un virus cuando la muestra de fluido se alimenta al citómetro de flujo. En algunas implementaciones preferidas, cuando ocurren eventos de detección durante la citometría de flujo que son indicativos de partículas marcadas no asociadas del tamaño de un virus durante la citometría de flujo, hay una cantidad de dichos eventos de detección por minuto que están en un intervalo que tiene
un límite inferior de 300, 1000 o 10.000 de dichos eventos de detección por minuto y un límite superior de 325.000 o 100.000 de dichos eventos de detección por minuto. Como se apreciará, es posible que sea necesario realizar el fluido de muestra en una diversidad de diluciones diferentes para obtener las concentraciones deseadas de partículas marcadas no asociadas y tinciones fluorescentes (asociadas y no asociadas con partículas marcadas no asociadas) y recuentos apropiados por minuto de eventos de detección.
Otra ventaja del procesamiento descrito en la presente descripción es que las partículas del tamaño de un virus de tipo específico (por ejemplo, como se indica por tener una capacidad particular de unión a antígeno) pueden identificarse usando citometría de flujo sin detectar la dispersión de luz para identificar la presencia de partículas, como ha sido el caso, por ejemplo, cuando se identificó el tipo vims en una célula hospedadora o unido a una microesfera. En implementaciones preferidas, la citometría de flujo no incluye (es en ausencia de) la detección de dispersión de luz, y puede incluir solo la detección de emisiones fluorescentes de tinciones fluorescentes o solo la detección de emisiones fluorescentes de una o más tinciones de anticuerpos fluorescentes.
Una tinción de anticuerpos fluorescente puede incluir un componente o componentes fluorescentes unidos a una molécula de anticuerpo que es específica para unirse a un epítopo de una partícula diana de tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado. Dicho componente o componentes fluorescentes pueden ser cualquier componente o componentes con actividad fluorescente que actúen como un marcador fluorescente unido a las moléculas de anticuerpo. La unión de un componente fluorescente a la molécula de anticuerpo puede ser directa o indirecta. La unión puede ser a través de un enlace químico u otro mecanismo de adherencia. Algunos ejemplos de componentes fluorescentes que pueden incluirse en la tinción de anticuerpos fluorescente incluyen fluoróforos (compuestos químicos fluorescentes), nanocristales conductores fluorescentes (puntos cuánticos), polímeros fluorescentes, ficobilinas fluorescentes y proteínas fluorescentes recombinantes. La descripción de la presente descripción se ejemplifica principalmente con referencia al uso de fluoróforos, pero la descripción se aplica también a otros componentes fluorescentes que podrían unirse a la molécula de anticuerpo. En el caso de un fluoróforo, la tinción de anticuerpos fluorescente puede incluir preferiblemente un número promedio de grupos fluoróforos unidos (moléculas de colorante) por molécula de anticuerpo de la tinción de anticuerpos fluorescente (relación F/P) en un intervalo que tiene un límite inferior de 3, 4 o 5 y un límite superior de 10, 9, 8 o 7, prefiriéndose un intervalo de 5 a 7 para muchas aplicaciones. Las moléculas de anticuerpo de una tinción de anticuerpos fluorescente pueden ser monoclonales o policlonales. Pueden preferirse anticuerpos monoclonales para la detección de dianas en muchas situaciones. Sin embargo, puede preferirse un anticuerpo policlonal para algunas aplicaciones dirigidas a la evaluación de diversos serotipos de virus, por ejemplo, cuando un anticuerpo monoclonal no se une a la gama completa de serotipos diana. El epítopo diana de una tinción de anticuerpos fluorescente puede estar en una proteína constituyente de una partícula del tamaño de un virus diana o puede ser un epítopo conformacional que está presente en una cápside ensamblada de una partícula vírica, pero no presente en las proteínas constituyentes individuales. Para virus adenoasociados en particular, algunos anticuerpos preferidos para tinciones de anticuerpos fluorescentes se unen a epítopos conformacionales de cápsides ensambladas de virus adenoasociados. Especialmente con el tamaño extremadamente pequeño de los virus adenoasociados, dirigirse a un epítopo conformacional ayuda a distinguir la estructura intacta del virus de los fragmentos que pueden contener proteínas individuales.
El tipo vírico diana de la evaluación es el tipo vírico de adenovirus o el tipo vírico de virus adenoasociado. El tipo vírico se refiere a la categoría particular de atributo vírico a la que se dirige la detección y discriminación, y que puede ser a nivel de familia, subfamilia, especie o serotipo, o cualquier subconjunto identificable de los anteriores. Como algunos ejemplos, un tipo vírico diana puede incluir un único serotipo específico de un virus o puede incluir múltiples serotipos de un virus que comparten un atributo antigénico común para la interacción con una tinción de anticuerpos fluorescente (por ejemplo, múltiples serotipos que incluyen un epítopo común que se une con la misma tinción de anticuerpos fluorescente monoclonal). Los diferentes tipos víricos que son diana para la identificación pueden representar, por ejemplo, diferentes familias, subfamilias, géneros, especies o serotipos. Otro ejemplo de este tipo puede ser la evaluación de diferentes especies de virus como los diferentes tipos víricos.
Cada uno de los virus adenoasociados y adenovirus en particular incluye muchos serotipos identificados, y una tinción de anticuerpos fluorescente puede dirigirse a un único serotipo o a dos o más serotipos diferentes de un tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado. Por ejemplo, una tinción de anticuerpos fluorescente puede ser monoclonal y dirigirse a un epítopo particular asociado con un único serotipo o puede dirigirse a un epítopo particular que es común a dos o más serotipos diferentes. Como otro ejemplo, una tinción de anticuerpos fluorescente puede ser policlonal y capaz de unirse a diferentes epítopos de diferentes serotipos.
En algunas aplicaciones, las partículas del tamaño de un virus de un tipo vírico de uno de adenovirus o virus adenoasociado pueden ser la diana como un primer tipo vírico y las partículas del tamaño de un virus del otro tipo vírico pueden ser la diana como un segundo tipo vírico.
En algunas aplicaciones, las partículas del tamaño de un virus de un tipo vírico de bacoluvirus pueden ser diana como un segundo tipo vírico, por ejemplo, en aplicaciones que implican partículas similares a virus de un tipo vírico de adenovirus o un tipo vírico de virus adenoasociado producido usando un sistema de expresión génica de baculovirus.
Los baculovirus son una familia de virus en forma de bastón de hasta 300 nm de longitud y que son particularmente útiles para producir proteínas recombinantes. Los baculovirus normalmente infectan células de insectos y se replican en ellas, y la expresión de proteínas recombinantes en sistemas de células de insectos usando un vector de expresión de Baculovirus genéticamente modificado es una técnica bien conocida. El baculovirus también se puede modificar genéticamente para incluir promotores de mamíferos para impulsar la expresión de proteínas recombinantes en células de mamíferos. Los sistemas de baculovirus modificados que incluyen promotores de mamíferos que son útiles para la transferencia de material genético insertado por transducción a células de mamíferos frecuentemente reciben el nombre de sistema “ BacMam” para la transferencia de genes de Baculovirus a células de Mamíferos.
El Baculovirus también es muy útil en la producción de partículas similares a virus, que pueden incluir una diversidad de proteínas víricas. Los ejemplos de tipos víricos que pueden expresarse en dichas partículas similares a virus incluyen un tipo vírico de adenovirus o un tipo vírico de virus adenoasociado. Dependiendo del proceso particular o de la etapa de procesamiento dentro de un proceso, el baculovirus puede ser un producto deseable o un contaminante indeseable. En cualquier caso, la monitorización y cuantificación precisas de baculovirus en diversos puntos de una operación de producción son importantes para el control de procesos y productos. La presencia de suero bovino fetal (FBS) en algunos sistemas de expresión de proteínas de baculovirus (por ejemplo, el sistema BacMam) puede complicar significativamente la diferenciación de señales fluorescentes de proteínas teñidas en partículas víricas de interés de un alto nivel de señales fluorescentes de fondo de proteínas séricas teñidas cuando se usa la técnica anterior de uso de una combinación de tinciones de proteínas y ácidos nucleicos fluorogénicas y no específicas.
La tinción de anticuerpos fluorescente puede unirse a la partícula vírica directa o indirectamente a través de un epítopo. Por unión directa a través de un epítopo se entiende que un sitio en la parte de anticuerpo de la tinción de anticuerpos fluorescente se une al epítopo. Por unión indirecta a través de un epítopo, se entiende que existe una unidad de unión intermedia entre los epítopos y la tinción de anticuerpos fluorescente. Por ejemplo, la unidad de unión intermedia puede ser un anticuerpo diferente (diferente del anticuerpo de la tinción de anticuerpos fluorescente) que se une directamente con los epítopos y la tinción de anticuerpos fluorescente se une a ese anticuerpo, uniendo de este modo la tinción de anticuerpos fluorescente en la partícula marcada no asociada.
La tinción de anticuerpos fluorescente puede incluir un componente fluorescente, por ejemplo un fluoróforo, que se excita por cualquier radiación de excitación conveniente y con un desplazamiento de Stokes apropiado entre el espectro de absorción de la radiación de excitación y el espectro de emisión de la emisión fluorescente. El fluoróforo puede ser proporcionado por una molécula de colorante fluorescente unida o conjugada con otra molécula en una forma en la que el colorante está en un estado fijo altamente fluorescente. Un colorante fluorescente se puede conjugar directamente con un anticuerpo o se puede conjugar con otro componente que después se une al anticuerpo (por ejemplo, la tinción de anticuerpos fluorescente biotinilada, que se analiza a continuación).
La radiación de excitación para una tinción de anticuerpos fluorescente, o para otras tinciones fluorescentes que también pueden usarse, puede estar en cualquier intervalo de longitudes de onda adecuado o intervalos para la tinción o tinciones fluorescentes que se usan. Cuando se usan múltiples tinciones fluorescentes, se prefiere que los espectros de emisión de las diferentes tinciones fluorescentes no se superpongan o solo se superpongan mínimamente para facilitar la detección individual. La radiación de excitación frecuentemente puede estar en el espectro visible o casi visible (por ejemplo, desde el ultravioleta hasta el infrarrojo cercano). Algunos ejemplos de fuentes de radiación de excitación incluyen LED y láseres que proporcionan un espectro de luz estrecho. Una diversidad de pequeños láseres están disponibles para su uso como fuente de radiación de excitación. Algunos ejemplos de láseres son láseres de luz verde, por ejemplo, láseres verdes He-Ne o Nd:YAG. Otros posibles láseres para proporcionar radiación de excitación se analizan, por ejemplo, en: Methods in Molecular Biology, Vol. 263, Flow Cytometry Protocols, 2d. ed., Editado por Hawley, Teresa S. y Haley Robert G., Humana Press, 2004, Capítulo 23 “ Small Lasers in Flow Cytometry” , de Telford, William G., páginas 399-418; Methods in Cell Biology, Vol. 102, Recent Advances in Cytometry, Parte A: Instrumentation, Methods, Editado por Darzynkiewicz, Zbigniew y col., Elsevier, 2011, Capítulo 15 “ Lasers in Flow Cytometry” , de Telford, William G., páginas 375-407; y Telford, William G. y col., Supercontinuum white light lasers for flow cytometry, Cytometry A. Mayo de 2009, 75(5): 450-459. doi:10.1002/cyto.a.20687.
En algunas implementaciones preferidas, cuando se utilizan dos o más tinciones fluorescentes diferentes para una única muestra de fluido, por ejemplo, para evaluar diferentes componentes de material biológico, que pueden ser diferentes tipos víricos (por ejemplo, adenovirus como un tipo vírico y virus adenoasociado como un segundo tipo vírico, o viceversa; o uno de adenovirus o virus adenoasociado como un tipo vírico y un segundo tipo vírico que es distinto de un tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado; o dos tipos víricos que son serotipos de virus adenoasociados diferentes o que son serotipos de adenovirus diferentes), las tinciones fluorescentes múltiples pueden excitarse preferiblemente por la misma radiación de excitación de espectro estrecho, aunque en otras implementaciones pueden usarse múltiples fuentes de radiación de excitación o una única fuente (por ejemplo, fuente de luz blanca sintonizable) que proporcione múltiples espectros de radiación de excitación siempre que las respuestas de emisión fluorescente de las diferentes tinciones fluorescentes se distingan de dichos espectros de radiación de excitación diferentes. Algunos ejemplos de radiación de excitación para muchas aplicaciones pueden ser espectros estrechos que incluyan una de las siguientes longitudes de onda: 350 nanómetros, 405 nanómetros, 488 nanómetros, 532 nanómetros, 543 nanómetros, 561 nanómetros y 635 nanómetros. Los espectros de emisión fluorescente pueden incluir cualquier espectro estrecho, típicamente en el espectro visible y casi visible. Frecuentemente es preferible que
un espectro de emisión fluorescente de una tinción fluorescente, que incluye una tinción de anticuerpos fluorescente, tenga un desplazamiento de Stokes significativo en la longitud de onda máxima con respecto a la longitud de onda del espectro de excitación máxima para esa tinción fluorescente. El desplazamiento de Stokes en la longitud de onda puede ser de al menos 5 nanómetros, al menos 10 nanómetros, al menos 20 nanómetros o más. Muchas tinciones fluorescentes tienen un desplazamiento de Stokes en un intervalo de 10 a 50 nanómetros, aunque algunas pueden tener desplazamientos de Stokes mucho mayores.
En la Tabla 1 se muestran algunos ejemplos de anticuerpos para su uso en tinciones de anticuerpos fluorescentes para algunos tipos víricos.
Un anticuerpo de una tinción de anticuerpos fluorescente puede ser un anticuerpo pan-serotipo (que se une a múltiples serotipos). El producto policlonal M149 de Takara es un anticuerpo policlonal de conejo anti-gripe humana A, B que es pan-serotipo en diversos serotipos del virus de la gripe, incluyendo el virus de la gripe de tipo B y diversos serotipos del virus de la gripe de tipo A. El anticuerpo monoclonal de la tinción de anticuerpos fluorescente puede ser específico de serotipo o puede ser pan-serotipo hasta cierto punto. Por ejemplo, ADK8/9 enumerado en la Tabla 1 es pan-serotipo para los serotipos AAV-8 y AAV-9. Como otro ejemplo, para el adenovirus, un anticuerpo en una tinción de anticuerpos fluorescente, por ejemplo, se une a una proteína de la cápside que está presente en múltiples serotipos. Este es el caso, por ejemplo, del 8C4 enumerado en la Tabla 1, que se une a la proteína hexón que está presente en múltiples serotipos de adenovirus.
Se puede utilizar una amplia diversidad de fluoróforos en las tinciones de anticuerpos fluorescentes. Un fluoróforo se puede unir directamente al anticuerpo o a través de un grupo de unión. Un grupo de unión de este tipo puede ser un grupo de unión derivado de biotina en un anticuerpo biotinilado a través del cual una estreptavidina conjugada con fluoróforo puede unirse al anticuerpo. Por conveniencia de referencia, dichas tinciones de anticuerpos fluorescentes que tienen un fluoróforo unido a un anticuerpo biotinilado pueden denominarse en la presente descripción tinción de anticuerpos fluorescente biotinilada. La Tabla 2 muestra algunos ejemplos de productos de colorantes fluorescentes en la línea de productos Alexa Fluor (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) que se pueden usar en forma conjugada como fluoróforos y la longitud de onda de excitación (absorción) máxima y longitud de onda de emisión para conjugados de las moléculas de colorante. El desplazamiento de Stokes del conjugado es la diferencia entre estas longitudes de onda:
En la Tabla 3 se muestran algunos colorantes de ejemplo para su uso como fluoróforos en forma conjugada con una fuente de luz de excitación de láser verde, útil con una diversidad de anticuerpos para producir una tinción de anticuerpos fluorescente.
Puede usarse cualquiera de los colorantes de ejemplo enumerados en las Tablas 2 y 3, u otros colorantes, en una tinción de anticuerpos fluorescente con cualquiera de los anticuerpos de ejemplo enumerados en la Tabla 1.
La muestra de fluido puede incluir solo una única tinción fluorescente, que sería una tinción de anticuerpos fluorescente. En implementaciones alternativas, la muestra de fluido puede incluir múltiples tinciones fluorescentes (es decir, dos o más de dos tinciones fluorescentes diferentes), al menos una de las cuales es una tinción de anticuerpos fluorescente. Cuando se usan múltiples tinciones fluorescentes, dos o más de dos de las tinciones fluorescentes pueden ser tinciones de anticuerpos fluorescentes y/o una o más de una puede ser una tinción fluorescente distinta de una tinción de anticuerpos fluorescente, por ejemplo, una tinción fluorogénica no específica. Un ejemplo de una tinción fluorogénica no específica de este tipo es una tinción para marcar ácidos nucleicos. Por tinción fluorescente no específica se entiende una tinción fluorescente que no es específica en cuanto al tipo vírico. Un ejemplo de una tinción fluorogénica no específica para ácido nucleico que es excitable por una fuente de luz láser verde es POPO-3 de Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). Cuando se usan múltiples tinciones de anticuerpos fluorescentes diferentes, las diferentes tinciones de anticuerpos fluorescentes pueden estar dirigidas a identificar diferentes tipos víricos de partículas víricas, en cuyo caso cada una de las diferentes tinciones de anticuerpos fluorescentes será capaz de unirse con diferentes partículas víricas de diferentes tipos víricos para formar diferentes partículas marcadas no asociadas. Como ejemplo, una primera tinción de anticuerpos fluorescente puede unirse con un virus adenoasociado, mientras que una segunda tinción de anticuerpos fluorescente puede unirse con un adenovirus, o viceversa. También se pueden usar múltiples tinciones de anticuerpos fluorescentes diferentes para unirse a múltiples serotipos de virus diferentes. Como ejemplo, una primera tinción de anticuerpos fluorescente puede unirse con un primer serotipo de virus adenoasociado y una segunda tinción de anticuerpos fluorescente puede unirse con un segundo serotipo de virus adenoasociado. Como otro ejemplo, una primera tinción de anticuerpos fluorescente puede unirse con un primer serotipo de adenovirus y una segunda tinción de anticuerpos fluorescente puede unirse con un segundo serotipo de adenovirus. La citometría de flujo puede incluir detectar radiación de la celda de flujo dentro de diferentes intervalos de longitudes de onda de las diferentes tinciones de anticuerpos Fluorescentes para identificar eventos de detección indicativos del paso de los diferentes tipos de partículas marcadas no asociadas a través de la celda de flujo, que son indicativos de la presencia de los diferentes tipos víricos.
La mezcla de material biológico para la evaluación con la tinción de anticuerpos fluorescente se puede realizar en un medio líquido, por ejemplo, en un líquido acuoso tamponado. Durante la mezcla, la tinción de anticuerpos fluorescente se puede proporcionar en una forma en la que el fluoróforo ya está unido al anticuerpo o la tinción de anticuerpos fluorescente se puede formar in situ durante la mezcla de componentes precursores proporcionados a la mezcla. La tinción de anticuerpos fluorescente se puede formar en solución a partir de dichos precursores durante la mezcla y después unirse a partículas no asociadas y/o puede formarse sobre las partículas no asociadas para formar partículas
marcadas no asociadas. Por ejemplo, en el caso de una tinción de anticuerpos fluorescente biotinilada, la tinción de anticuerpos biotinilada puede prepararse previamente y proporcionarse a la mezcla en el estado preparado previamente, tal como dispersada en una solución tamponada, o los precursores de la tinción de anticuerpos biotinilada pueden proporcionarse por separado a la mezcla y pueden ponerse en contacto en primer lugar durante la mezcla para formar el anticuerpo biotinilado in situ. Como un ejemplo, un anticuerpo biotinilado preparado previamente y un conjugado de fluoróforo:estreptavidina preparado previamente pueden suministrarse por separado a la mezcla, por ejemplo, en formulaciones de solución tamponada separadas. El anticuerpo biotinilado preparado previamente y el conjugado de fluoróforo:estreptavidina preparado previamente pueden reaccionar para formar la tinción de anticuerpos fluorescente biotinilada. Dicha reacción puede ocurrir antes de la unión del anticuerpo a una partícula no asociada y/o dicha reacción puede ocurrir después de que un anticuerpo fluorescente biotinilado ya se haya unido a una partícula no asociada, en cuyo caso la tinción del anticuerpo fluorescente biotinilado puede formarse directamente sobre la partícula no asociada, formando de este modo una partícula marcada no asociada con la formación de la tinción de anticuerpos fluorescente biotinilada. Cuando se proporcionan dichos precursores por separado a la mezcla, los precursores pueden añadirse en proporciones apropiadas para proporcionar una concentración deseada de la tinción de anticuerpos fluorescente resultante y preferiblemente sin mucho conjugado de fluoróforo no asociado y residual:estreptavidina que añadiría una fluorescencia de fondo adicional significativa.
Las partículas del tamaño de un virus diana para la detección son partículas víricas. Por partículas víricas se entiende partículas individuales de virus (por ejemplo, viriones) o partículas similares a virus y tipo vírico se refiere al tipo particular de virus o partículas similares a virus asociadas con ese tipo de virus. Como se apreciará, las partículas similares a virus son partículas que son similares a un virus, pero que no son infecciosas porque carecen de una estructura completa de virus, tal como material genético vírico. Las partículas del tamaño de un virus diana para la detección pueden ser exosomas u otras nanopartículas que tengan un epítopo para la unión a un anticuerpo.
Por partícula del tamaño de un virus o partícula del tamaño de un virus, se entiende una partícula de un tamaño del orden de partículas de virus libres individuales, o viriones, que típicamente están en un intervalo de decenas de nanómetros a cientos de nanómetros. En algunas implementaciones, las partículas del tamaño de un virus pueden tener un tamaño en un intervalo que tiene un límite inferior de 10 nanómetros, 20 nanómetros, 40 nanómetros, 60 nanómetros, 80 nanómetros y un límite superior de 2 micrómetros, 1 micrómetro, 600 nanómetros, 300 nanómetros, 200 nanómetros, 100 nanómetros, 75 nanómetros o 50 nanómetros siempre que el límite superior sea mayor que el límite inferior. En algunas implementaciones, las partículas del tamaño de un virus pueden tener una o más de dimensión de longitud, dimensión de diámetro o dimensión transversal máxima dentro en un intervalo de este tipo. Por una partícula no asociada se entiende que la partícula no es parte de una estructura de partículas más grande que el tamaño del virus, por ejemplo, la partícula no asociada no está dentro de una célula hospedadora o unida a una microesfera o es parte de un aglomerado que es mayor que el tamaño del virus. El adenovirus tiene una forma generalmente icosaédrica de aproximadamente 90 a 100 nanómetros de diámetro. El virus adenoasociado tiene una forma icosaédrica del orden de aproximadamente 20 nanómetros de tamaño (diámetro). Una partícula marcada no asociada será algo más grande debido a la presencia de tinciones de anticuerpos unidas con respecto a la partícula del tamaño de un virus no marcada (por ejemplo, virión o partícula similar a un virus no marcados). Incluso con la tinción de anticuerpos fluorescente unida, las partículas marcadas no asociadas tienen el tamaño de un virus y, frecuentemente, pueden tener una dimensión transversal máxima mayor que la dimensión transversal máxima de la partícula del tamaño de un virus no marcada que está en un intervalo que tiene un límite inferior de 10 nanómetros, 20 nanómetros o 30 nanómetros y un límite superior de 200 nanómetros, 150 nanómetros, 100 nanómetros, 50 nanómetros o 25 nanómetros, siendo el límite superior mayor que el límite inferior. Por ejemplo, es común que las moléculas de anticuerpos individuales tengan un tamaño del orden de aproximadamente 5 a 10 nanómetros y pueden aumentar la dimensión transversal máxima de la partícula marcada en el doble de esa cantidad, o en aproximadamente 10 a 20 nanómetros, con respecto a las partículas del tamaño de un virus no marcadas. Como se apreciará, la tinción de anticuerpos unida indirectamente puede aumentar la dimensión transversal máxima en una cantidad mayor como resultado de los grupos de unión intermedios. Con el tamaño extremadamente pequeño del virus adenoasociado, la partícula marcada no asociada que incluye una partícula de virus adenoasociado con tinción de anticuerpos fluorescente unida puede tener, por ejemplo, frecuentemente una dimensión transversal máxima (por ejemplo, diámetro) del orden de 2 a 4 veces más grande que la partícula de virus adenoasociado a la que se une la tinción de anticuerpos fluorescente.
El material biológico que ha de evaluarse puede obtenerse de cualquier fuente. Algunos ejemplos de fuentes incluyen operaciones de fabricación en las que se cultivan virus, se producen partículas víricas modificadas genéticamente (por ejemplo, partículas similares a virus) tales como formas alternativas de vacunas, en las que se producen virus modificados genéticamente para la expresión de proteínas recombinantes, o para el suministro de material genético para viroterapia, o en la que se preparan lotes de partículas purificadas del tamaño de un virus para probar los límites de exclusión en la fabricación de fluidos biológicos. El método puede realizarse en asociación con o como parte de dicha operación de fabricación. El material biológico puede ser el resultado del procesamiento previo de un material biológico inicial, que puede ser un material en crudo que se ha purificado o procesado de otro modo para preparar una muestra más adecuada para la evaluación por citometría de flujo. El material biológico se puede proporcionar para mezclarlo con la tinción de anticuerpos fluorescente en cualquier forma conveniente, incluso en una solución tamponada acuosa, por ejemplo, una solución tamponada con fosfato, que puede incluir uno o más aditivos u otros reactivos útiles para el procesamiento. De la misma manera, la tinción de anticuerpos fluorescente se puede
proporcionar en cualquier forma conveniente, incluso en una solución tamponada, por ejemplo, una solución tamponada con fosfato u otra solución tamponada. El material biológico puede proporcionarse en una forma purificada tal como puede resultar del proceso de purificación. Dicho proceso de purificación puede ser como se describe en la Publicación de Patente Internacional WO2014/210370A1. El material biológico se puede proporcionar para mezclarlo con la tinción de anticuerpos fluorescente en una solución tampón T ris-HCl como se describe para su uso en citometría de flujo en el documento WO2014/210370A1, o una solución tamponada diferente. El citómetro de flujo puede ser, por ejemplo, un citómetro de flujo Virus Counter® 2100 o preferiblemente un citómetro de flujo Virus Counter® 3100 (ViroCyt, Inc.). Dichos citómetros de flujo están diseñados específicamente para operar a velocidades de flujo de muestra muy bajas para evaluar muestras de fluido para determinar partículas del tamaño de un virus. También se pueden usar otros citómetros de flujo, aunque menos preferidos, que proporcionen un enfoque adecuado de partículas del tamaño de un virus en el centro de un flujo de muestra de fluido para investigación en la celda de flujo. Algunos ejemplos de otros citómetros de flujo equipados con una fuente de láser de luz verde para la radiación de excitación son Attune® NxT (Thermo Fisher Scientific), CyFlow® Space (Sysmex) y SlOOOEXi (Stradedigm). Algunos ejemplos de otros citómetros de flujo que pueden incluir una fuente de radiación de excitación que no sea un láser de luz verde son ACSCalibur™ (Becton Dickinson), BD LSRFortessa™ (Becton Dickinson), BD FACSCanto™ (Becton Dickinson), FACSVerse (Becton Dickinson), Gallios™ (Beckman Coulter), CyAn™ ADP (Beckman Coulter), SE520EXi (Stratedigm) y SP6800 (SONY). Como se ha indicado anteriormente, el material biológico en la muestra de fluido puede estar en forma purificada para una evaluación por citometría de flujo potenciada, y que puede ser el resultado de la purificación de una muestra en crudo de material biológico según el procesamiento descrito en el documento WO2014/210370A1.
La preparación de una muestra de fluido puede incluir, antes de mezclar el material biológico para su evaluación con la tinción de anticuerpos fluorescente, purificar una muestra en crudo de material biológico para preparar el material biológico para la muestra de fluido que se somete a la citometría de flujo. La purificación puede incluir filtrar partículas de impurezas de mayor tamaño de la muestra en crudo. Dichas impurezas de mayor tamaño pueden incluir partículas más grandes que el tamaño del virus. Dichas impurezas de mayor tamaño pueden incluir, por ejemplo, desechos celulares, bacterias, agregados de proteínas de micobacterias, lípidos, ensamblajes de lípidos, ensamblajes de lípidos y proteínas, lecitinas, agregados de lípido-proteína, liposomas, ribosomas, vesículas, complejos de proteína-ácido nucleico u otros materiales. La filtración puede incluir filtración con un tamaño de separación de filtro, o tamaño de filtración, que no sea superior a 2 micrómetros, no sea superior a 1,5 micrómetros, no sea superior a 1,3 micrómetros, no sea superior a 1 micrómetro, no sea superior a 0,9 micrómetros, no sea superior a 0,8 micrómetros o no sea superior a 0,75 micrómetros. El tamaño de separación puede ser frecuentemente de al menos 0,05 micrómetros, al menos 0,1 micrómetros, al menos 0,3 micrómetros, al menos 0,4 micrómetros, al menos 0,5 micrómetros, al menos 0,6 micrómetros o al menos 0,7 micrómetros. La purificación puede incluir la eliminación cromatográfica de al menos una parte de las impurezas de menor tamaño que pueden ser más pequeñas que el tamaño de un virus. Dichas impurezas de menor tamaño pueden incluir, por ejemplo, proteínas y/o ácidos nucleicos, y material derivado de virus, tales como fragmentos o desechos de virus. La eliminación cromatográfica puede incluir cromatografía por rotación en una centrífuga. La cromatografía por rotación puede incluir la centrifugación de la muestra que se ha de purificar, que puede estar en una solución tampón, en presencia de medios cromatográficos que capturan impurezas de menor tamaño. El sobrenadante, incluyendo el material biológico restante, puede procesarse adicionalmente, tal como mediante filtrado, o proporcionarse directamente para mezclarlo con una tinción de anticuerpos fluorescente.
En otras implementaciones, la muestra de fluido puede incluir una muestra de material biológico en una forma en crudo que no se ha purificado o no se ha purificado en un grado significativo. Incluso usando una muestra en crudo de este tipo de material biológico, la especificidad de las señales de pico de tinción de anticuerpos fluorescente de partículas del tamaño de un virus marcadas puede distinguirse de las lecturas de fondo.
En algunas implementaciones preferidas, la citometría de flujo puede incluir hacer fluir la muestra de fluido a través de la celda de flujo del citómetro de flujo a una velocidad de flujo de muestra de fluido muy baja. Una velocidad de flujo de fluido de muestra de este tipo puede estar en un intervalo de 250 a 3000 nanolitros por minuto. Como se ha indicado anteriormente, también se pueden usar citómetros de flujo con velocidades de flujo más grandes que son capaces de enfocar partículas del tamaño de un virus en el centro de un flujo de muestra de fluido para su investigación en la celda de flujo. Dichos citómetros de flujo pueden, por ejemplo, tener flujos de muestra de fluido de hasta 1 mililitro por minuto. En implementaciones preferidas, la citometría de flujo puede incluir enfocar hidrodinámicamente el flujo de la muestra de fluido con un fluido envolvente y hacer fluir la muestra de fluido y el fluido envolvente a través de la celda de flujo. Además, en algunas implementaciones más preferidas, la citometría de flujo o un citómetro de flujo usado para dicha citometría de flujo (por ejemplo, el citómetro de flujo Virus Counter® 3100) puede emplear la evaluación de atributos de partículas a partir de señales de emisión fluorescente como se describe en la solicitud de patente internacional n.° PCT/US2015/033907 (publicada como el documento WO2015/187783) titulada FLOW CYTOMTER PEAK SIGNAL IDENTIFICATION EMPLOYING DYNAMIC THRESHOLDING. Dicha evaluación usa una determinación de umbral dinámico para identificar el umbral de señal pico para el recuento de partículas, y que es particularmente ventajoso para su uso con los métodos descritos en la presente descripción para evaluar cuantitativamente las partículas no asociadas marcadas del tamaño de un virus. Se ha descubierto que el citómetro de flujo Virus Counter® 3100 tiene capacidades ventajosas para diferenciar las señales de respuesta fluorescente de partículas marcadas no asociadas del tamaño de un virus de las señales de fondo de tinción de anticuerpos fluorescente no unida residual, identificar eventos de detección de respuesta fluorescente indicativos del paso de una
partícula marcada no asociada del tamaño de un virus a través de la celda de flujo del citómetro de flujo, contando dichas partículas marcadas no asociadas en la muestra de fluido basándose en dichos eventos de detección, y calcular y mostrar la concentración de las partículas marcadas no asociadas en la muestra de flujo en tiempo real con respecto al paso de la muestra de fluido a través de la celda de flujo. El citómetro de flujo Virus Counter® 3100 monitoriza, mide y controla cuidadosamente la velocidad de flujo de la muestra de fluido a la celda de flujo y, a diferencia de otros citómetros de flujo, usa datos de velocidad de flujo medidos integrados a lo largo del tiempo para determinar el volumen de fluido de la muestra que pasa a través de la celda de flujo para calcular la concentración. Se proporciona información adicional en el documento WO2010/132053.
En algunas implementaciones, la citometría de flujo puede incluir contar los eventos de detección como apariciones de partículas individuales de las partículas marcadas no asociadas que pasan a través de la celda de flujo para determinar un recuento de partículas marcadas no asociadas en un volumen de la muestra de fluido que pasa a través de la celda de flujo; determinar el volumen de muestra de fluido que pasa a través de la celda de flujo que se corresponde con el recuento; y determinar una concentración de las partículas marcadas no asociadas en el volumen de la muestra de fluido que pasa a través de la celda de flujo usando el recuento de partículas marcadas no asociadas. Dicho recuento se puede realizar en tiempo real con respecto a la detección de la radiación correspondiente al evento de detección, y la determinación de la concentración también se puede realizar en tiempo real con respecto al paso del volumen de la muestra de fluido a través de la celda de flujo. Determinar el volumen de muestra de fluido que pasa a través de la celda de flujo puede incluir medir en tiempo real con un sensor de flujo la velocidad de flujo de la muestra de fluido con respecto a la celda de flujo e integrar los datos de velocidad de flujo medidos resultantes a lo largo del tiempo. La identificación de eventos de detección indicativos del paso a través de la celda de flujo de las partículas marcadas no asociadas puede determinarse en ausencia de correlación con la información de detección de dispersión de luz. El control de la operación de citometría de flujo y la adquisición y el análisis de datos (por ejemplo, identificación de eventos de detección, recuento, determinación del volumen, determinación de la concentración, medición de datos de velocidad de flujo, integración de datos de velocidad de flujo medidos) pueden realizarse mediante un controlador electrónico, por ejemplo, usando un sitómetro de flujo Virus Counter® 3100.
La muestra de fluido puede incluir múltiples tinciones fluorescentes (dos o más tinciones fluorescentes), al menos una de las cuales es una tinción de anticuerpos fluorescente. En algunas implementaciones, una tinción fluorescente puede ser una primera tinción fluorescente que tenga una primera emisión fluorescente y la muestra de fluido puede incluir una segunda tinción fluorescente diferente (y posiblemente también una tercera diferente o incluso más tinciones fluorescentes diferentes) que tenga una segunda emisión fluorescente diferente. Las emisiones fluorescentes primera y segunda pueden detectarse por separado. Los primeros eventos de detección para la primera emisión fluorescente pueden ser indicativos de una propiedad de la primera partícula (por ejemplo, presencia de un epítopo) y los segundos eventos de detección para la segunda emisión fluorescente pueden ser indicativos de una segunda propiedad de partícula (por ejemplo, presencia de un epítopo diferente o alguna otra propiedad). Las diferentes propiedades de los eventos de detección primero y segundo pueden estar relacionadas con que ambas propiedades estén presentes en una única partícula del tamaño de un virus (en cuyo caso, los eventos de detección primero y segundo coincidirán temporalmente con el paso de una única partícula a través de la celda de flujo) o pueden ser con respecto a cada una de las propiedades que están presentes en diferentes partículas (en cuyo caso los eventos de detección primero y segundo no coincidirán temporalmente). Dichas tinciones fluorescentes primera y segunda pueden o no ser excitadas por las mismas longitudes de onda de la radiación de excitación, aunque por simplicidad de operación es conveniente tener ambas tinciones fluorescentes excitadas por el mismo espectro estrecho de radiación de excitación.
En algunas implementaciones, una primera tinción fluorescente puede ser una tinción de anticuerpos fluorescente y la segunda tinción fluorescente puede ser una tinción para ácido nucleico, que puede ser una tinción fluorogénica no específica. Los eventos de detección para la segunda emisión fluorescente pueden ser indicativos del paso de partículas del tamaño de un virus que contienen ácido nucleico teñido con la tinción de ácido nucleico fluorescente. Los resultados de la detección separada de la primera y la segunda tinción fluorescente pueden compararse para identificar las apariciones de dicho primer evento de detección que coincide temporalmente con dicho segundo evento de detección, lo que puede ser una indicación adicional del paso a través de la celda de flujo de una partícula marcada no asociada que incluye tanto el epítopo como las propiedades de ácido nucleico, por ejemplo, que pueden ser indicativas de una partícula de virus intacta. La comparación de los eventos de detección primero y segundo como alternativa o adicionalmente puede incluir la identificación de apariciones de un primer evento de detección que no coincida temporalmente con un segundo evento de detección, lo que puede ser, por ejemplo, indicativo de una partícula similar a un virus o un exosoma (u otra nanopartícula) que tiene la propiedad de epítopo pero no la propiedad de ácido nucleico, debido a la ausencia de material genético. La comparación de los eventos de detección primero y segundo puede incluir como alternativa o adicionalmente la identificación de apariciones de un segundo evento de detección que no coincide temporalmente con un primer evento de detección, por ejemplo, lo que puede ser indicativo de un exosoma (u otra nanopartícula) que incluye la propiedad de ácido nucleico, pero no la propiedad de epítopo.
Cuando se usan múltiples tinciones fluorescentes, puede haber múltiples tinciones de anticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, una primera tinción de anticuerpos fluorescente con una primera emisión fluorescente puede ser capaz de unirse a un primer epítopo y una segunda tinción de anticuerpos fluorescente diferente con una segunda emisión fluorescente puede ser capaz de unirse a un segundo epítopo diferente. También se pueden usar una tercera o más tinciones de anticuerpos fluorescentes adicionales y/o una o más tinciones no específicas (por ejemplo, tinción de
ácido nucleico no específica), aunque el citómetro de flujo usado deberá tener la capacidad de discriminar todos los diferentes espectros de emisión fluorescente. Las emisiones fluorescentes primera y segunda pueden detectarse cada una por separado. Los primeros eventos de detección de radiación de la primera emisión fluorescente pueden ser indicativos del paso de partículas marcadas no asociadas del tamaño de un virus, incluyendo partículas del tamaño de un virus que incluyen el primer epítopo, y los segundos eventos de detección de radiación de la segunda emisión fluorescente pueden ser indicativos del paso de partículas marcadas no asociadas del tamaño de un virus que incluyen partículas del tamaño de un virus que incluyen el segundo epítopo. En el caso de que una partícula del tamaño de un virus tenga tanto el primer como el segundo epítopo, el primer y el segundo evento de detección coincidirán temporalmente, mientras que cuando hay dos tipos diferentes de partículas del tamaño de un virus, teniendo un tipo el primer epítopo y teniendo el otro el segundo epítopo, los eventos de detección primero y segundo no coincidirán temporalmente. Por ejemplo, un primer epítopo puede ser indicativo de partículas de un primer tipo vírico y el segundo epítopo puede ser indicativo de partículas de un segundo tipo vírico diferente. De forma alternativa, el primer y el segundo epítopo pueden ser ambos indicativos del mismo tipo vírico, por ejemplo, cuando una partícula vírica incluye tanto el primer como el segundo epítopo. Por ejemplo, un primer tipo vírico puede ser un tipo vírico de virus adenoasociado y el segundo tipo vírico puede ser para un virus diferente (por ejemplo, adenovirus o baculovirus). O, por ejemplo, un primer tipo vírico puede ser un adenovirus y el segundo tipo vírico puede ser para un virus diferente (por ejemplo, virus adenoasociado o baculovirus). Como otro ejemplo, el primer y segundo tipo vírico pueden ser serotipos de virus adenoasociados diferentes o los tipos víricos primero y segundo pueden ser serotipos de adenovirus diferentes.
Para obtener incluso más especificidad con respecto al contenido de una muestra de material biológico en evaluación, se pueden evaluar por separado diferentes partes de la muestra por citometría de flujo con diferentes tinciones de anticuerpos fluorescentes usadas en cada una de las diferentes muestras de fluido sujetas a las diferentes evaluaciones de citometrías de flujo. De esta forma, se puede procesar una pluralidad de partes de una muestra de material biológico para producir una matriz de diferentes muestras de fluido para citometría de flujo con diferentes combinaciones de tinciones fluorescentes para probar diferentes combinaciones de propiedades de partículas en la muestra de material biológico. Cada una de las diferentes muestras de fluido puede incluir, por ejemplo, diferentes combinaciones de tinción de anticuerpos fluorescente con una tinción fluorogénica no específica (por ejemplo, tinción de ácido nucleico) y/o con múltiples tinciones de anticuerpos fluorescentes. Dicha evaluación de tipo matriz puede usarse, por ejemplo, para preparar y probar por citometría de flujo una o más de una muestra de fluido marcada de manera diferente para evaluar la presencia de una partícula de producto del tamaño de un virus deseado y/o para evaluar la presencia de partículas de contaminante no deseado del tamaño de un virus.
El método de evaluación que incluye la citometría de flujo puede ser parte de, o puede realizarse junto con, un método para fabricar un producto que comprende partículas del tamaño de un virus. Dicha fabricación puede incluir: generar las partículas del tamaño de un virus en una operación de producción biológica; recoger de la operación de producción biológica el producto en crudo que comprende las partículas del tamaño de un virus; y purificar al menos una parte de material del producto en crudo para preparar un producto purificado que incluye partículas del tamaño de un virus. Un producto purificado de este tipo puede ser un producto final o puede ser un producto intermedio que puede someterse a procesamiento adicional. La evaluación por citometría de flujo realizada como parte o junto con la fabricación puede incluir recoger una muestra de material biológico de una fase del procesamiento de producción durante la cual se esperaría que hubiera partículas de virus presentes en el material biológico y evaluar la muestra para detectar la presencia de partículas del tamaño de un virus que tiene un epítopo particular, incluyendo someter al menos una parte de la muestra a citometría de flujo. Dicha evaluación, que incluye la citometría de flujo, puede incluir, por ejemplo, cualquiera de las características o cualquier combinación de las características indicadas anteriormente. Dicha fabricación puede incluir realizar la recogida múltiples veces para recoger diferentes muestras de material biológico que han de evaluarse de múltiples fases diferentes de la fabricación y realizar una evaluación que incluya citometría de flujo en cada una de dichas muestras de material biológico recogidas que han de evaluarse. De esta manera, el rendimiento y la calidad del producto pueden verificarse a través de las diversas fases del procesamiento de fabricación y pueden identificarse problemas de procesamiento, analizarlos y tomar medidas correctivas rápidamente. Por ejemplo, la recogida se puede realizar en una primera fase durante la generación o recogida y en una segunda fase durante o después de la purificación.
El método de evaluación, incluyendo la citometría de flujo, se puede realizar en un entorno que no forma parte ni está relacionado con dicha fabricación. Por ejemplo, el método puede realizarse junto con actividades de investigación o diagnóstico.
Una aplicación para el método descrito en la presente descripción es evaluar una muestra de material biológico para determinar partículas similares a virus cuando se sospecha que la muestra de material biológico incluye partículas similares a virus. Este puede ser el caso, por ejemplo, durante o junto con operaciones de fabricación para producir partículas similares a virus o productos que incluyen partículas similares a virus, por ejemplo, para su uso en vacunas o como portador (vector).
Una aplicación para el método descrito en la presente descripción es evaluar un material biológico para detectar partículas de virus intactas. Dicha detección de virus puede ser para evaluar contaminantes de virus y/o para evaluar la presencia de productos de virus deseados. En una variación, el virus puede ser un virus programado para
viroterapia. Dicho virus puede ser, por ejemplo, un virus oncolítico contra el cáncer, un vector vírico para terapia génica o inmunoterapia.
Otro aspecto de la presente descripción que no forma parte de la invención es una composición en forma de una formulación fluida,
tal como para una muestra de fluido en preparación para la evaluación por citometría de flujo. La formulación fluida comprende:
un medio líquido acuoso;
partículas marcadas no asociadas del tamaño de un virus en el medio líquido acuoso a una concentración de 1 x 105 a 15x109 de las partículas marcadas no asociadas por mililitro, en donde las partículas marcadas no asociadas incluyen, cada una, una partícula del tamaño de un virus que tiene un epítopo particular indicativo de un tipo vírico de adenovirus o un tipo vírico de virus adenoasociado y una tinción de anticuerpos fluorescente específica para la unión, directa o indirectamente con el epítopo; y
una concentración de la tinción de anticuerpos fluorescente que está en un estado no asociado en el medio líquido acuoso no unido en las partículas marcadas no asociadas en un intervalo de 0,25 (o más) microgramos por mililitro a 10 (o menos) microgramos por mililitro.
Una formulación de fluido de este tipo puede ser o tener cualquier característica o características descritas con respecto a la muestra de fluido del aspecto del método. Cualquiera del medio líquido acuoso, las partículas marcadas no asociadas y la concentración y los componentes de las mismas, la partícula del tamaño de un virus, el epítopo, la tinción de anticuerpos fluorescente y la concentración de la concentración no asociada de la tinción de anticuerpos fluorescente pueden ser o tener cualquier característica o características descritas con respecto a la muestra de fluido del aspecto del método.
Otras características de este y otros aspectos se entenderán mejor con referencia a los dibujos y en vista del análisis que se proporciona a continuación, a las implementaciones de ejemplo que se describen a continuación y a las reivindicaciones.
Las cifras muestran:
La Figura 1 muestra un diagrama de bloques de proceso general para algunas implementaciones de un método de citometría de flujo.
La Figura 2 muestra un diagrama de bloques de proceso que ilustra algunas implementaciones de procesamiento más específicas dentro del procesamiento general de la Figura 1.
La Figura 3 ilustra un ejemplo de procesamiento que se puede realizar durante la citometría de flujo con el procesamiento que se muestra en la Figura 2.
La Figura 4 muestra un diagrama de bloques de proceso que ilustra algunas otras implementaciones de procesamiento más específicas dentro del procesamiento general de la Figura 1.
La Figura 5 ilustra un ejemplo de procesamiento que se puede realizar durante la citometría de flujo con el procesamiento que se muestra en la Figura 4.
La Figura 6 muestra un diagrama de bloques de proceso que ilustra algunas otras implementaciones de procesamiento más específicas dentro del procesamiento general de la Figura 1.
La Figura 7 ilustra un ejemplo de procesamiento que se puede realizar durante la citometría de flujo con el procesamiento que se muestra en la Figura 6.
La Figura 8 muestra un diagrama de bloques de proceso que ilustra algunas otras implementaciones de procesamiento más específicas dentro del procesamiento general de la Figura 1.
La Figura 9 muestra un diagrama de bloques de proceso que ilustra algunas implementaciones de procesamiento más específicas dentro de una etapa de la muestra en crudo de purificación del procesamiento de la Figura 8.
La Figura 10 es un gráfico que resume los resultados del Ejemplo 1 que se presenta a continuación.
Las Figuras 11-12 son gráficos que resumen los resultados del Ejemplo 2 que se presenta a continuación.
La Figura 13 es un gráfico que resume los resultados del Ejemplo 3 que se presenta a continuación.
La Figura 14 es un gráfico que resume los resultados del Ejemplo 4 que se presenta a continuación.
La Figura 1 muestra un diagrama de bloques de proceso general del procesamiento para un método de citometría de flujo para evaluar material biológi
adenovirus o virus adenoasociado diana. El procesamiento que se muestra en la Figura 1 incluye una etapa de preparación de una muestra de fluido 102 para preparar una muestra de fluido 104 que después se somete a citometría de flujo 106. La muestra de fluido 104 resultante de la etapa de preparación de la muestra de fluido 102 incluye una tinción de anticuerpos fluorescente capaz de unirse, directa o indirectamente, a las partículas víricas no asociadas del tipo vírico diana para formar partículas marcadas no asociadas que pueden detectarse durante la citometría de flujo 106. La preparación de la muestra de fluido 102 puede incluir mezclar el material biológico que ha de probarse con al menos una tinción de anticuerpos fluorescente. La Figura 2 muestra un diagrama de bloques del proceso de una implementación de ejemplo más específica del procesamiento general que se muestra en la Figura 1, en el que la preparación de la muestra de fluido 102 incluye una etapa de mezcla 108 durante la cual el material biológico 110 que ha de evaluarse se mezcla con una tinción 112 de anticuerpos fluorescente que es capaz de unirse, directa o indirectamente, a epítopos indicativos del tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado diana para el cual se está evaluando el material biológico 110. Como se introduce en el mezclador 108, el material biológico 110 puede estar en una solución tamponada a una concentración apropiada para el procesamiento y puede ser el resultado de un procesamiento previo a partir de una muestra en crudo inicial de material biológico. Una solución de este tipo en la que el material biológico 110 puede alimentarse al mezclador 108 también puede incluir otros aditivos o reactivos útiles durante el procesamiento. De la misma manera, la tinción de anticuerpos fluorescente se puede proporcionar a la etapa de mezcla 108 en una solución tamponada apropiadamente con uno o más aditivos u otros reactivos. Por ejemplo, la tinción 112 de anticuerpos fluorescente se puede proporcionar en una solución tampón que también incluye reactivos para estabilizar, ayudar a conservar o dispersar la tinción 112 de anticuerpos fluorescente antes de la mezcla 108. Por ejemplo, la tinción 112 de anticuerpos fluorescente se puede proporcionar en una solución tamponada que contiene un agente antiaglomerante (por ejemplo, albúmina bovina) y/o un agente antimicrobiano (por ejemplo, azida sódica). La solución tamponada puede ser una solución tamponada de fosfato u otra solución tamponada a un PH apropiado.
La Figura 3 ilustra un ejemplo de procesamiento que se puede realizar durante la citometría de flujo 106 de la implementación de ejemplo de la Figura 2. Como se muestra en la Figura 3, un flujo de la muestra de fluido 104 a través de una celda de flujo 114 de un citómetro de flujo se somete en la celda de flujo 114 a radiación de excitación 116, por ejemplo, de un láser, LED u otra fuente de luz. En el ejemplo que se muestra en la Figura 3, el flujo de muestra de fluido 104 a través de la celda de flujo 114 está en la dirección de la flecha de flujo 118. Un sistema detector 120 incluye componentes ópticos para detectar la radiación proveniente de la celda de flujo dentro de un intervalo de longitudes de onda de la emisión fluorescente de la tinción 112 de anticuerpos fluorescente. En la Figura 3 se ilustra el paso de una partícula marcada no asociada 122 del tamaño de un virus que incluye una partícula vírica de tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado y que tiene una tinción de anticuerpos fluorescente unida a la misma. La Figura 3 también ilustra un diagrama de tiempo 124 de ejemplo de la salida (Cl) de un fotodetector que detecta la emisión fluorescente y muestra una tensión máxima en el tiempo t1 correspondiente al paso de una partícula marcada no asociada 122 de este tipo a través de la celda de flujo 114. En la Figura 3 también se muestran con fines ilustrativos la tinción 112 de anticuerpos fluorescente no unida y residual en la muestra de fluido 104 que puede contribuir a algunos de los picos de fondo más grandes en el gráfico de tiempo 124.
La muestra de fluido 104 de la Figura 1 sometida a la citometría de flujo 106 se puede preparar usando dos o más tinciones fluorescentes diferentes, al menos una de las cuales es una tinción de anticuerpos fluorescente para un tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado. La Figura 4 muestra un procesamiento de ejemplo que es el mismo que el que se muestra en la Figura 2, excepto por que durante la mezcla 108 se proporciona una segunda tinción fluorescente 126 a la etapa de mezcla 108 para su inclusión en la muestra de fluido 104 que se somete a la citometría de flujo 106. En el ejemplo que se muestra en la Figura 4, la segunda tinción fluorescente 126 es una tinción para ácido nucleico que no es selectiva en cuanto al tipo vírico. La segunda tinción fluorescente 126 puede ser una tinción fluorogénica y puede proporcionarse en una única formulación con la tinción 112 de anticuerpos fluorescente o puede proporcionarse en una formulación separada. En una situación de procesamiento preferida, la tinción 112 de anticuerpos fluorescente y la segunda tinción fluorescente 126 se pueden proporcionar en una única formulación, tal como una única solución tamponada en las proporciones deseadas para su inclusión en la muestra de fluido 104. La Figura 5 ilustra un ejemplo de procesamiento para la citometría de flujo 106 de la Figura 4. Como se muestra en la Figura 5, un flujo de la muestra de fluido 104 a través de la celda de flujo 114 se somete en la celda de flujo 114 a la radiación de excitación 116. En la ilustración que se muestra en la Figura 5, el sistema de detección 120 incluye un primer fotodetector para detectar la emisión fluorescente de la tinción 112 de anticuerpos fluorescente y un segundo fotodetector para detectar una emisión fluorescente diferente de la segunda tinción fluorescente. La Figura 5 muestra una partícula marcada no asociada 128 de ejemplo que incluye una partícula vírica de un tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado que tiene unida a la misma tanto la tinción 112 de anticuerpos fluorescente como la segunda tinción fluorescente 126. La Figura 5 muestra un primer gráfico de tiempo 130 con una salida (Cl) de ejemplo del primer fotodetector que detecta la emisión fluorescente de la tinción 112 de anticuerpos fluorescente y un segundo gráfico de tiempo 132 que muestra la salida (C2) de ejemplo del segundo fotodetector que detecta la emisión fluorescente de la
segunda tinción fluorescente 126. La coincidencia de tiempo de los picos de tensión en el tiempo t2 en el primer gráfico de tiempo 130 y el segundo gráfico de tiempo 132 es indicativa del paso de la partícula marcada no asociada 128 a través de la celda de flujo 114. Los picos de tensión en los tiempos t1 y t3 que se muestran en el segundo gráfico de tiempo 132 son indicativos del paso de partículas a través de la celda de flujo 114 que contienen la segunda tinción fluorescente pero que no contienen la tinción 112 de anticuerpos fluorescente. Dichas partículas que pueden incluir la segunda tinción fluorescente 126 y no la tinción 112 de anticuerpos fluorescente pueden ser, por ejemplo, partículas víricas de un tipo vírico diferente del tipo vírico de la partícula vírica de la partícula marcada no asociada 128. La mayor magnitud del fondo y los picos de fondo más grandes que se muestran en el gráfico de tiempo 130 pueden ser indicativos del paso de la tinción 112 de anticuerpos fluorescente no unida a través de la celda de flujo 114. Con fines ilustrativos, la Figura 5 muestra la presencia de dicho anticuerpo fluorescente 112 no unido en la muestra de fluido 104 que pasa a través de la celda de flujo 114. El segundo diagrama de tiempo 132 incluye un patrón de fondo con picos de fondo más pequeños indicativo de la segunda tinción fluorescente que es un material fluorogénico que proporciona muy poca emisión fluorescente de fondo cuando no se une al ácido nucleico con una partícula.
La Figura 6 muestra un procesamiento de ejemplo que es el mismo que el que se muestra en la Figura 4, excepto por que la segunda tinción fluorescente proporcionada a la mezcla 108 es una segunda tinción 134 de anticuerpos fluorescente que es específica para unirse a epítopos de partículas víricas de un tipo vírico diferente (por ejemplo, diferente del adenovirus o virus adenoasociado o de un serotipo diferente de adenovirus o virus adenoasociado) que la tinción 112 de anticuerpos fluorescente. Puede usarse un procesamiento tal como el que se muestra en la Figura 6 para discriminar entre las presencias de partículas víricas de diferentes tipos víricos presentes en el material biológico 110 y para cuantificar la presencia de partículas víricas de cada uno de los dos tipos diferentes en la muestra de fluido. La Figura 7 ilustra un ejemplo de procesamiento que puede ocurrir durante la citometría de flujo 106 del ejemplo de procesamiento que se muestra en la Figura 6. La Figura 7 es la misma que la Figura 5, excepto por que muestra la muestra de fluido 104 que incluye un primer tipo de ejemplo de partícula marcada no asociada 136 que incluye una partícula vírica de un primer tipo vírico de adenovirus o virus adenoasociado con la tinción 112 de anticuerpos fluorescente adherida a la misma y un segundo tipo de partícula marcada no asociada 138 que incluye una partícula vírica de un segundo tipo vírico que tiene la segunda tinción 134 de anticuerpos unida a la misma. La Figura 7 muestra un primer gráfico de tiempo 140 que ilustra la salida (Cl) de ejemplo de un primer fotodetector que detecta emisiones fluorescentes de la tinción 112 de anticuerpos fluorescente y un segundo gráfico de tiempo 142 que ilustra la salida (C2) de ejemplo de un segundo fotodetector que detecta emisiones fluorescentes de la segunda tinción 134 de anticuerpos. Con fines ilustrativos, la muestra de fluido 104 en la Figura 7 se muestra incluyendo la primera tinción 112 de anticuerpos fluorescente no asociada y la segunda tinción 134 de anticuerpos fluorescente no asociada. Como se muestra en la Figura 7, un pico de tensión en el primer gráfico de tiempo 140 en el tiempo t1 es indicativo del paso del primer tipo de partícula marcada no asociada 136 a través de la celda de flujo 114 y el pico de tinción en t2 que se muestra en el segundo gráfico de tiempo 142 es indicativo del paso del segundo tipo de partícula marcada no asociada 138 a través de la celda de flujo 114.
La Figura 8 muestra un ejemplo de procesamiento según el procesamiento general que se muestra en la Figura 1 en el que la preparación de una muestra de fluido 102 incluye una etapa 144 de muestra en crudo de purificación antes de la mezcla 108. Durante la purificación de la muestra en crudo 144, una muestra en crudo de material biológico 146 se somete a un proceso de purificación para eliminar al menos una parte de las impurezas que pueden interferir con la citometría de flujo 106, para preparar el material biológico 110 en una forma más pura que ha de mezclarse con la tinción 112 de anticuerpos fluorescente durante la mezcla 108 para preparar la muestra 104 de fluido. Con fines ilustrativos, el procesamiento de la Figura 8 incluye proporcionar una segunda tinción fluorescente 148 al mezclador 108 para su inclusión en la muestra de fluido. La segunda tinción fluorescente 148 puede ser una segunda tinción de anticuerpos fluorescente que es diferente de la tinción 112 de anticuerpos fluorescente o puede ser una tinción fluorescente no específica, por ejemplo, una tinción de ácido nucleico. La muestra en crudo de material biológico 146 puede proporcionarse o no en forma diluida con solución tampón u otros reactivos y puede o no haber sido sometida a procesamiento antes de la introducción en la etapa 144 de muestra en crudo de purificación.
La Figura 9 muestra un ejemplo de procesamiento que se puede realizar durante la etapa 144 de muestra en crudo de purificación del procesamiento general que se muestra en la Figura 8. En el procesamiento de ejemplo que se muestra en la Figura 9, la muestra en crudo de purificación 144 incluye una etapa 150 de eliminación cromatográfica seguida de una etapa 152 de filtración. Durante la eliminación cromatográfica 150, se eliminan impurezas de menor tamaño 154 de la muestra en crudo de material biológico 146 mediante cromatografía, reteniéndose las impurezas de menor tamaño 154 dentro del medio cromatográfico. Las impurezas de menor tamaño pueden ser impurezas más pequeñas que el tamaño de un virus. El líquido procesado 156 de la eliminación cromatográfica 150 después se somete a la filtración 152 para filtrar las impurezas de mayor tamaño 158. Las impurezas de mayor tamaño 158 pueden eliminarse como retenido del filtro y el material biológico 110 proporcionado a la mezcla 108 puede ser o incluir filtrado de la filtración 152 o partes del mismo, con o sin procesamiento adicional.
Ejemplos
En los ejemplos a continuación, las pruebas de citometría de flujo se realizan en un citómetro de flujo Virus Counter® 3100 (ViroCyt, Inc.). Los gráficos en las Figuras a las que se hace referencia en estos ejemplos que representan la concentración de partículas de virus frente al factor de dilución son gráficos log-log. Las pruebas de citometría de flujo
que usan tinción de anticuerpos fluorescente se realizan sin lavar las muestras de virus teñidas después de la tinción y sin detección de dispersión de luz para ayudar con la detección de partículas. Salvo que se indique lo contrario a continuación, las tinciones de anticuerpos fluorescentes en estos ejemplos generalmente incluyen un número promedio de moléculas de colorante adheridas (fluoróforos) por molécula de anticuerpo en la tinción de anticuerpos fluorescente (relación F/P) de 3 a 7. Las concentraciones de tinciones de anticuerpos fluorescentes proporcionadas en estos ejemplos son concentraciones totales en las muestras. Como se apreciará, parte de esta tinción de anticuerpos fluorescente se une y tiñe partículas de virus en las muestras, pero la mayor parte de la tinción de anticuerpos fluorescente en las muestras típicamente estará en un estado no unido cuando las muestras se someten a citometría de flujo. Todos los fluidos de muestra en estos ejemplos se preparan a un pH dentro de un intervalo de pH 7 a pH 8 con solución tamponada.
Ejemplos 1-2:
En los Ejemplos 1 y 2 a continuación, se realizan pruebas de citometría de flujo para evaluar el serotipo 2 de virus adenoasociado (AAV-2) usando una tinción de anticuerpos fluorescente que incluye el anticuerpo monoclonal anti-AAV-2 A20 (PROGEN Biotechnik) conjugado con el colorante Alexa Fluor 532 (identificado a continuación como tinción de anticuerpos CF-A20). A20 es un anticuerpo para un epítopo conformacional de la cápside ensamblada de AAV-2 y AAV-3.
Ejemplo 1:
Las pruebas de citometría de flujo comparativas se realizan en formulaciones de prueba de AAV-2 usando la tinción de anticuerpos fluorescente CF-A20 con respecto a los controles de AAV-5 y AAV-9 que no son antigénicos para el anticuerpo A20. Se preparan dos formulaciones de prueba de AAV-2 diferentes usando AAV-2 obtenido de diferentes fuentes comerciales. Para todas las pruebas, la concentración total de la tinción del anticuerpo CF-A20 (tanto unido como no unido a AAV-2) en las soluciones de prueba es de aproximadamente 2,5 microgramos por mililitro. Se preparan cinco soluciones de prueba en diferentes diluciones de la solución madre de virus para cada serie de diluciones, para proporcionar cinco concentraciones de virus diferentes para la prueba en solución tamponada. Para un control de especificidad, la tinción de anticuerpos fluorescente se probó contra los serotipos AAV-5 y AAV-9, así como una solución tamponada que incluía CF-A20 pero sin virus de ningún tipo.
Los resultados se resumen en la Figura 10, que muestra un gráfico de la concentración de AAV-2 para cada muestra de AAV-2 determinada por citometría de flujo en función del factor de dilución para las pruebas de tinción de CF-A20 y para los controles. Tanto el eje vertical como el horizontal son de escala logarítmica. Como se observa en la Figura 10, las concentraciones de AAV-2 indicadas para las pruebas de CF-A20 son cercanas para cada una de las dos formulaciones de prueba de AAV-2. La Figura 10 también resume los datos de las formulaciones de control con respecto a un límite de detección inferior aproximado para el citómetro de flujo (aproximadamente 1055 partículas por mililitro). Los resultados demuestran que los datos de las muestras de AAV-2 tratadas con tinción de anticuerpos fueron razonablemente consistentes entre diferentes fuentes de AAV-2. Además, el anticuerpo no consiguió unirse a AAV-5 o AAV-9, lo que confirma la especificidad de la tinción de anticuerpos fluorescente para AAV-2 con respecto a esos otros serotipos. Además, la tinción de anticuerpos fluorescente no aumentó el fondo a niveles inaceptables cuando se añadió al medio en blanco.
Ejemplo 2:
Las series de dilución de citometría de flujo que usan una diversidad de concentraciones de tinción de anticuerpos se realizan frente a una titulación de la solución de AAV-2 que contiene aproximadamente 1 x 105 a 1 x 108 partículas de AAV-2 por mililitro. Cada serie de dilución incluye citometría de flujo de muestras de 200 microlitros preparadas en diferentes diluciones de la solución madre de AAV-2, con todas las muestras en cada serie de dilución que contienen la misma concentración de la tinción de anticuerpos fluorescente. Se realizan tres series de dilución a concentraciones de tinción de anticuerpos de aproximadamente 0,91, 1,82 y 2,73 microgramos de tinción de anticuerpos CF-A20 por mililitro de muestra. Se realizan pruebas de citometría de flujo para detectar y evaluar las emisiones fluorescentes del AAV-2 teñido. Los resultados de las pruebas de citometría de flujo para cada serie de dilución se resumen en las Figuras 11 y 12. La Figura 11 muestra un gráfico de la concentración de AAV-2 sin corregir (partículas de virus por mililitro) determinada para las muestras por las pruebas de citometría de flujo, mientras que la Figura 12 muestra un gráfico de los mismos datos pero con el factor de dilución corregido. Ambas figuras son diagramas log-log. Las Figuras 11 y 12 muestran generalmente buenos resultados (cercanos al ajuste lineal) en factores de dilución intermedios, con los resultados de citometría de flujo corregidos para la dilución que se muestra en la Figura 12 cerca de las concentraciones reales de AAV-2 de la solución madre de AAV-2 para los factores de dilución intermedios. Con factores de dilución más bajos (concentraciones más altas de AAV-2 en la muestra) y factores de dilución más altos (concentraciones más bajas de AAV-2 en las muestras), los resultados tienden a degradarse, lo que puede indicar recuentos más bajos debido a la posible aglomeración de algunas partículas de AAV-2 en los factores de dilución menores y recuentos mayores debido a la posible interferencia de las señales de fondo de la tinción de anticuerpos no unida en los factores de dilución mayores.
Ejemplos 3-4:
En los Ejemplos 3 y 4 a continuación, se realizan pruebas de citometría de flujo para evaluar múltiples serotipos de adenovirus usando como tinción de anticuerpos fluorescente un conjugado de anticuerpo monoclonal 8C4-CF 532 (identificado a continuación CF-8C4). El anticuerpo 8C4 es específico para la proteína hexón de adenovirus y es eficaz en diferentes serotipos de adenovirus (probado contra al menos los serotipos 2 a 6).
Ejemplo 3:
Se realizan pruebas de citometría de flujo comparativa en formulaciones de prueba de adenovirus usando la tinción de anticuerpos fluorescente CF-8C4 en dos formulaciones de prueba diferentes que contienen diferentes serotipos de adenovirus. Una formulación de prueba incluía serotipo de adenovirus 4 y la otra formulación de prueba incluía serotipo de adenovirus 5. Para todas las pruebas, la concentración total de la tinción del anticuerpo CF-8C4 (tanto unido como no unido al adenovirus) en las soluciones de prueba es de aproximadamente 2,5 microgramos por mililitro. Para cada formulación de prueba, se preparan cuatro soluciones de prueba en diferentes diluciones de la solución madre de adenovirus para cada una de las series de dilución, para proporcionar cuatro concentraciones de virus diferentes para probar en solución tamponada para cada formulación de prueba.
Los resultados se resumen en la Figura 13, que muestra un gráfico de la concentración de adenovirus para cada dilución de la serie de dilución para cada uno de los diferentes serotipos determinados por citometría de flujo como función del factor de dilución. Tanto el eje vertical como el horizontal son de escala logarítmica. Como se ve en la Figura 13, las concentraciones para cada serie de dilución caen casi en una línea que indica que el CF-8C4 se une a ambos serotipos, aunque los datos tienden a divergir con factores de dilución altos donde las concentraciones están en el límite de detección del citómetro de flujo o por debajo de este (aproximadamente 1055 partículas por mililitro).
Ejemplo 4:
Las pruebas de citometría de flujo comparativas se realizan en formulaciones de prueba de adenovirus usando la misma tinción de anticuerpos fluorescente que se usó en el Ejemplo 1 (CF-8C4) con respecto a los controles de un virus de influenza y lentivirus, que no son antigénicos para el anticuerpo 8C4. El adenovirus usado en las formulaciones de prueba es el serotipo 4. Para todas las pruebas, la concentración total de la tinción del anticuerpo CF-8C4 (tanto unido como no unido al adenovirus) en las soluciones de prueba es de aproximadamente 2,5 microgramos por mililitro. Se preparan seis soluciones de prueba en diferentes diluciones de la solución madre de adenovirus para cada una de las series de diluciones, para proporcionar seis concentraciones de virus diferentes para la prueba en solución tamponada. Para un control de especificidad, la tinción de anticuerpos fluorescente se probó frente a virus no relacionados de tipo gripe y lentivirus.
Los resultados se resumen en la Figura 14, que muestra un gráfico de la concentración de adenovirus para cada dilución determinada por citometría de flujo en función del factor de dilución para las diferentes formulaciones de prueba. Tanto el eje vertical como el horizontal son de escala logarítmica. Como se ve en la Figura 14, para el adenovirus el gráfico de concentraciones para la serie de dilución muestra una buena linealidad. La Figura 14 también resume los datos para las formulaciones de control con respecto a un límite de detección inferior aproximado para el citómetro de flujo (aproximadamente 1055 partículas por mililitro), lo que indica que la tinción de anticuerpos fluorescente no se unió a los controles del virus de la gripe y el lentivirus, lo que confirma la especificidad de la tinción de anticuerpos fluorescente.
El análisis anterior de la invención y diferentes aspectos de la misma se han presentado a título ilustrativo y de descripción. Las realizaciones descritas anteriormente en la presente descripción tienen además por objeto explicar los mejores modos conocidos para poner en práctica la invención y permitir que otros expertos en la técnica utilicen la invención en estas u otras realizaciones y con diversas modificaciones requeridas por las aplicaciones o usos particulares de la presente invención. Además, cualquier característica descrita o reivindicada con respecto a cualquier variación descrita puede combinarse en cualquier combinación con una o más de cualquier otra característica de cualquier otra variación o variaciones. La descripción de una característica o características en una combinación particular no excluye la inclusión de una característica o características adicionales. Las etapas de procesamiento y la secuencia son solo para ilustración, y dichas ilustraciones no excluyen la inclusión de otras etapas u otra secuencia de etapas. Pueden incluirse etapas adicionales entre las etapas de procesamiento ilustradas o antes o después de cualquier etapa de procesamiento ilustrada.
Las expresiones “que comprende” , “que contiene” , “que incluye” y “que tiene” , y las variaciones gramaticales de estas expresiones, pretenden ser inclusivos y no limitantes en el sentido de que el uso de dichas expresiones indica la presencia de alguna condición o característica, pero no la exclusión de la presencia también de cualquier otra condición o característica. El uso de las expresiones “que comprende” , “que contiene” , “que incluye” y “que tiene” , y las variaciones gramaticales de esos términos para referirse a la presencia de uno o más componentes, subcomponentes o materiales, también incluyen y pretenden describir realizaciones más específicas en las que la expresión “que comprende” , “que contiene” , “que incluye” o “que tiene” (o la variación de dicha expresión), según sea el caso, se reemplaza por cualquiera de las expresiones más específicas “que consisten esencialmente en” o
“que consiste en” o “que consiste únicamente en” (o la variación gramatical apropiada de dichas expresiones más restringidas). Por ejemplo, una declaración de que algo “comprende” un elemento o elementos declarados también tiene la intención de incluir y describir las realizaciones más específicas y restringidas de la cosa “que consiste esencialmente en” el elemento o elementos declarados, y la cosa “que consiste en” el elemento o elementos declarados. Se han proporcionado ejemplos de diversas características con fines ilustrativos, y las expresiones “ejemplo” , “ por ejemplo” y similares indican ejemplos ilustrativos que no son limitantes y no deben considerarse como una limitación de una característica o características a ningún ejemplo particular. La expresión “ al menos” seguida de un número (por ejemplo, “ al menos uno” ) significa ese número o más que ese número. La expresión “ al menos una parte” significa todo o una parte que es menos que todo. La expresión “al menos una parte” significa todo o una parte que es menos que todo.
Una “parte” o un material, por ejemplo, de una muestra de material biológico, se refiere a algún componente o componentes de dicho material e incluye alícuotas de igual composición de un material y partes procesadas del material que ya no tienen la misma composición pero que tienen uno o más componentes del material y que pueden mezclarse con otros componentes (por ejemplo, solución tampón, reactivos) que no pertenecen al material. Por ejemplo, una muestra de fluido que incluye material biológico que ha de someterse a citometría de flujo incluye una parte de una muestra de material biológico en crudo recogida incluso si la muestra de fluido incluye solo algunos componentes biológicos purificados separados de la muestra en crudo. Como otro ejemplo, si se prepara un lote de muestra de fluido que incluye algún material biológico para la evaluación y se divide en alícuotas separadas para ciclos de citometría de flujo separados de las alícuotas individuales, cada alícuota incluye tanto una parte del material biológico del lote como una parte del material biológico que se originó a partir de una muestra en crudo de material biológico que puede haber sido sometida a purificación.
Claims (16)
- REIVINDICACIONESi. Un método de citometría de flujo para evaluar una muestra de material biológico de partículas del tamaño de un virus no asociado de un tipo vírico seleccionado del grupo que consiste en un tipo vírico de adenovirus y un tipo vírico de virus adenoasociado, comprendiendo el método:someter a citometría de flujo una muestra de fluido que comprende al menos una parte de la muestra de material biológico, en donde la muestra de fluido comprende una tinción de anticuerpos fluorescente capaz de unirse, directa o indirectamente, con un epítopo del tipo vírico, comprendiendo la citometría de flujo:hacer fluir la muestra de fluido a través de una celda de flujo de un citómetro de flujo; someter la muestra de fluido que fluye a través de la celda de flujo a radiación de excitación capaz de provocar una respuesta de emisión fluorescente de la tinción de anticuerpos fluorescente; y detectar la radiación de la celda de flujo dentro de un intervalo de longitudes de onda de la emisión fluorescente y evaluar la radiación detectada para identificar los eventos de detección indicativos del paso a través de la celda de flujo de partículas marcadas no asociadas del tamaño de un virus que incluyen dicha partícula del tamaño de un virus del tipo vírico unida con una parte de la tinción de anticuerpos fluorescente;en donde la muestra de fluido alimentada al citómetro de flujo comprende una concentración de la tinción de anticuerpos fluorescente libre en solución y no unida a las partículas marcadas no asociadas en un intervalo de 0,5 microgramos por mililitro a 10 microgramos por mililitro y una concentración total de la tinción de anticuerpos fluorescente en un intervalo de 0,5 microgramos por mililitro a 10 microgramos por mililitro.
- 2. Un método de citometría de flujo para fabricar un producto que comprende partículas del tamaño de un virus de un tipo vírico seleccionado del grupo que consiste en un tipo vírico de adenovirus y un tipo vírico de virus adenoasociado, comprendiendo el método:procesamiento de producción para preparar un producto purificado que incluye las partículas del tamaño de un virus del tipo vírico, incluyendo el procesamiento de producción:generar las partículas del tamaño de un virus en una operación de producción biológica; recoger de la operación de producción biológica el producto en crudo que comprende las partículas del tamaño de un virus generadas durante la generación;purificar al menos una parte de material del producto en crudo para preparar un producto purificado que incluye partículas del tamaño de un virus;recoger una muestra de material biológico de una fase del procesamiento de producción durante la que se esperaría que las partículas del tamaño de un virus estuvieran presentes en el material biológico;evaluar la muestra para detectar la presencia de partículas del tamaño de un virus que tienen un epítopo particular indicativo del tipo vírico, comprendiendo la evaluación realizar el método según la Reivindicación 1.
- 3. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 2, que comprende realizar la recogida múltiples veces para recoger dichas muestras de material biológico diferentes que han de evaluarse de dichas múltiples fases diferentes y realizar dicha evaluación en cada muestra de material biológico recogida que ha de evaluarse; yen donde dichas fases múltiples diferentes incluyen al menos una primera fase durante la generación o la recogida y una segunda fase durante o después de la purificación.
- 4. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 1, que comprende:preparar la muestra de fluido, que comprende mezclar material biológico que ha de evaluarse para determinar la presencia de las partículas del tamaño de un virus no asociadas con la tinción de anticuerpos fluorescente; ydespués de la mezcla, no eliminar la tinción de anticuerpos fluorescente no unida a las partículas marcadas no asociadas de la muestra de fluido antes de la citometría de flujo.
- 5. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 1, en donde la citometría de flujo es en ausencia de detección de dispersión de luz.
- 6. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 1, en donde la muestra de fluido alimentada al citómetro de flujo tiene una concentración de las partículas marcadas no asociadas en un intervalo de 1 * 105 a 1 x 109 partículas por mililitro; yla tinción de anticuerpos fluorescente comprende fluoróforo unido a moléculas de anticuerpo y la tinción de anticuerpos fluorescente en la muestra de fluido comprende un promedio de 3 a 8 de los fluoróforos unidos por dicha molécula de anticuerpo en la tinción de anticuerpos fluorescente.
- 7. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 6, en donde el tipo vírico es el tipo vírico de adenovirus.
- 8. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 6, en donde el tipo vírico es el tipo vírico de virus adenoasociado.
- 9. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 6, en donde la tinción de anticuerpos fluorescente es una primera tinción fluorescente y la muestra de fluido comprende una segunda tinción fluorescente que tiene una segunda respuesta de emisión fluorescente, diferente de la primera respuesta de emisión fluorescente de la primera tinción fluorescente, provocada por la radiación de excitación; yla segunda tinción fluorescente comprende una tinción de ácido nucleico fluorescente que no es específica del tipo de partícula.
- 10. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 6, en donde:la tinción de anticuerpos fluorescente es una primera tinción fluorescente y la muestra de fluido comprende una segunda tinción fluorescente que tiene una segunda respuesta de emisión fluorescente, diferente de la primera respuesta de emisión fluorescente de la primera tinción fluorescente, provocada por la radiación de excitación;las partículas marcadas no asociadas son las primeras partículas marcadas no asociadas, el epítopo es un primer epítopo, las partículas del tamaño de un virus son las primeras partículas del tamaño de un virus, el tipo vírico es un primer tipo vírico y las partículas marcadas no asociadas son las primeras partículas marcadas no asociadas;la segunda tinción fluorescente es una segunda tinción de anticuerpos fluorescente que es diferente de la primera tinción de anticuerpos fluorescente y es capaz de unirse con las segundas partículas del tamaño de un virus que tienen un segundo epítopo indicativo de un segundo tipo vírico que es diferente del primer tipo vírico para formar las segundas partículas marcadas no asociadas del tamaño de un virus; yel método comprende detectar la radiación de la celda de flujo dentro de un intervalo de longitudes de onda de la segunda emisión fluorescente y evaluar la radiación detectada para identificar los eventos de detección indicativos del paso de las segundas partículas marcadas no asociadas a través de la célula de flujo.
- 11. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 7, en donde el epítopo es proteína hexón de adenovirus y la tinción de anticuerpos fluorescente comprende un anticuerpo monoclonal.
- 12. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 11, en donde el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal 8C4.
- 13. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 8, en donde el epítopo es un epítopo conformacional de la cápside ensamblada.
- 14. Un método de citometría de flujo según la Reivindicación 8, en donde el epítopo es un epítopo conformacional de la cápside ensamblada de un serotipo de virus adenoasociado y la tinción de anticuerpos fluorescente comprende un anticuerpo monoclonal para el epítopo conformacional, y el método comprende uno cualquiera o más de los siguientes:(i) dicho serotipo es AAV-1 y dicho anticuerpo monoclonal es ADKIa;(ii) dicho serotipo es AAV-2 y dicho anticuerpo monoclonal es A20;(iii) dicho serotipo es AAV-3 y dicho anticuerpo monoclonal es A20;(iv) dicho serotipo es AAV-4 y dicho anticuerpo monoclonal es ADK4;(v) dicho serotipo es AAV-5 y dicho anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en ADK5a, ADK5b y combinaciones de los mismos;(vi) dicho serotipo es AAV-6 y dicho anticuerpo monoclonal es ADK6;(vii) dicho serotipo es AAV-8 y dicho anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en ADK8, ADK8/9 y combinaciones de los mismos; y(viii) dicho serotipo es AAV-9 y dicho anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en ADK9, ADK8/9 y combinaciones de los mismos.
- 15. Un método de citometría de flujo según una cualquiera de las Reivindicaciones 6-14, en donde la citometría de flujo es en ausencia de detección de dispersión de luz; yla citometría de flujo comprende detectar únicamente la respuesta de emisión fluorescente.
- 16. Un método según una cualquiera de las Reivindicaciones 1-15, en donde cada dicha citometría de flujo comprende:contar los eventos de detección como apariciones de partículas individuales de las partículas marcadas no asociadas que pasan a través de la celda de flujo para determinar un recuento de partículas marcadas no asociadas en un volumen de la muestra de fluido que pasa a través de la celda de flujo;determinar el volumen de muestra de fluido que pasa a través de la celda de flujo que se corresponde con el recuento;determinar una concentración de las partículas marcadas no asociadas en el volumen de la muestra de fluido que pasa a través de la celda de flujo usando el recuento de partículas marcadas no asociadas;realizar el recuento de dicha partícula marcada no asociada en tiempo real con respecto a la detección de la radiación correspondiente al evento de detección; ydeterminar la concentración en tiempo real con respecto al paso del volumen de la muestra de fluido a través de la celda de flujo;la determinación del volumen de muestra de fluido que pasa a través de la celda de flujo comprende medir en tiempo real con un sensor de flujo la velocidad de flujo de la muestra de fluido con respecto a la celda de flujo e integrar los datos de velocidad de flujo medidos resultantes a lo largo del tiempo; yla identificación de eventos de detección indicativos del paso a través de la celda de flujo de las partículas marcadas no asociadas se determina en ausencia de correlación con la información de detección de dispersión de luz.
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