CN102036651A - 用于给药蛋白质和肽的局部用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明的各个方面涉及用于稳定化、储存和输送生物活性剂(特别是肽和核酸)的组合物和方法。特别优选的实施方案包括：包含重组天然人肝细胞生长因子(HGF)(如dHGF，一种五氨基酸截短型HGF变异体)、以及至少一种在体温时保持为结晶形式的甘油一酸酯的组合物。可任选的是，所述组合物可包含胶凝剂(例如乙基纤维素)、和/或抗病原化合物(例如布比卡因)。使用这些组合物来改善、改良或治疗皮肤状况的方法也是本发明的实施方案。

Description

用于给药蛋白质和肽的局部用组合物

技术领域

本发明的各个方面涉及用于稳定、储存和输送蛋白质和肽(特别是肝细胞生长因子(HGF)及其变异体)的组合物和方法，以及使用该稳定化的组合物抑制、改善或治疗人体疾病(例如皮肤溃疡和皮肤癌或癌前病症)的方法。

背景技术

基于蛋白质/肽的药物存在给药的独特问题。蛋白质/肽易于在胃肠道变性使其不利于经口施用。因此基于蛋白质/肽的药物通常通过无菌注射溶液的形式进行全身施用。由于蛋白质/肽在血流中具有非常短的药代动力学半衰期、很快被代谢和清除掉，所以肠外施用也是无效的。因此，许多研究者试图开发替代的方法来稳定化、储存和输送基于蛋白质/肽的药剂。

在传统的创伤治疗(例如，术后或治疗皮肤溃疡)中，是将包含蛋白质/肽的无菌溶液注入创伤位点。在这些应用中，溶液的低粘度使给药变得复杂，并且溶解的蛋白质/肽容易降解，在储存过程中尤其是如此。已经描述了制造这样的基于蛋白质/肽的药剂，其中有效成分以固体粉末的形式存在，其在接触到液体时会形成半固体制剂(例如，参见美国专利No.5,192,743，其全文以引用的方式明确地并入本文)。然而，目前包含敏感蛋白质/肽的重构形式的产品通常稳定性较差，当产品在室温下储存时尤其是如此。

本领域的研究者要面对的另一个难题涉及这些产品对开放性伤口的临床应用。也就是说，许多开放性伤口(包括皮肤溃疡、磨损、美容损伤或裂伤)包含有各种病原体(例如细菌、真菌或其他病菌或微生物)，其中一些对传统治疗方法(例如抗生素治疗)具有耐药性。病原体的种类往往是“病患来源”，并不会引起全身性感染，但病原体的存在足以防止创伤愈合。例如，其中一些病原体产生的蛋白酶能降解药剂中存在的蛋白质/肽。

基于蛋白质/肽的产品的稳定性较差与制剂中存在的脂质和表面活性剂有关，该脂质和表面活性剂与蛋白质或肽相互作用，从而改变分子结构，并且降低或抑制蛋白质或肽的功能。少量脂质和表面活性剂可以改变蛋白质或肽的三维结构，从而降低产品功效。例如，已经证实婴儿配方乳中存在的甘油一酸酯可以降低产品的热稳定性(例如，参见McSweeney等，Food Hydrocolloids，第22卷，第5期，2008年7月，第888-898页)。

基于蛋白质/肽的产品的稳定性较差也使人们很难准确地提供治疗剂量的该产品。也就是说，因为蛋白质或肽(有效成分)的降解和不稳定速度可能因患者不同而不同，所以难以配制安全有效的基于蛋白质/肽的产品。通常情况下，这些问题通过提供更多有效成分(过量)解决，但是这种方法是有害的，在其中产品的药理学活性在有效成分浓度增加时与低浓度时表现不同的制剂中尤其是如此。

目前包含肝细胞生长因子(HGF)的产品就是这种情况。已知HGF能促进正常上皮细胞的生长，并且能提高细胞活力(例如，参见美国专利No.5,342,831；1994年8月30日授权)。虽然包含HGF的创伤治疗产品已经被研究了近20年，但这些产品的开发一直受到分子的稳定性较差及其独特生物学性质所阻碍。HGF是一种相对不稳定的分子，其在血液中的半衰期只有大约10分钟(例如，参见美国专利No.7,247,620；2007年7月24日授权)。HGF的刺激活性似乎是浓度依赖的，其中，所观察的最大细胞增殖浓度是2.5和5ng/ml，并且据报道更高浓度是无效的(例如，参见Bussolino等J.of Cell Biol.第119卷，第3期，629-641(1992))。这些因素导致本领域内的人员得出的结论是：特异性的、有效的施用HGF蛋白的方法，有效剂量等还尚未被发现(例如，参见美国专利No.7,247,620；2007年7月24日授权)。因此，显然应开发稳定化的基于蛋白质/肽的药剂的新制剂，特别是包含HGF的稳定化制剂。

发明概述

已经发现，可以通过包含有效量的结晶性甘油一酸酯(例如α或β-结晶性甘油一酸酯)来稳定基于蛋白质/肽的药剂、特别是包含HGF的制剂中的蛋白质/肽(“有效成分”)，所述结晶性甘油一酸酯可以具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳链长度，优选12、13或14碳的碳链长度，最优选12或14碳的碳链长度。因此，本文所描述的发明的各方面涉及一种组合物，其包含蛋白质或肽(例如，HGF分子，如全长HGF或dHGF(HGF的天然五氨基酸截短型)或其他天然HGF分子或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))，以及一种或多种甘油一酸酯的混合物，该甘油一酸酯在温度大于或等于15℃、最好大于或等于20℃、优选大于或等于23℃时保持为结晶形式，所述甘油一酸酯例如为α和/或β-结晶甘油一酸酯，其在温度大于或等于15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃时基本上保持为结晶形式，例如，结晶大于或等于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。换句话说，本文公开的所述组合物和方法利用基于蛋白质/肽的制剂(例如，包含HGF蛋白的制剂，所述HGF蛋白例如为重组天然全长HGF或dHGF或其重组天然变异体，例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，以及一种或多种甘油一酸酯(例如，α和/或β-结晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度，优选12或14碳的碳链长度)的混合物，所述甘油一酸酯在温度小于或等于42℃、41℃、40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃或15℃、优选为皮肤温度时保持为结晶形式。本发明还涵盖制备和使用上述组合物的方法(例如，改善、改良或促进创伤或皮肤癌或癌前疾病治愈的方法)。

一些实施方案还包含局部麻醉药(例如布比卡因)，以便与结晶性甘油一酸酯组合来增强抗菌效果。也就是说，在一些制剂中，可以预期到在包含结晶性甘油一酸酯的含蛋白质/肽的产品中加入局部麻醉药(例如布比卡因)能够提供增强或协同的抗菌效果，以及更稳定化的蛋白质/肽，其中所述甘油一酸酯例如为α或β-结晶性甘油一酸酯，其可具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳链长度，优选12、13或14碳的碳链长度，最优选12或14碳的碳链长度。优选的是，所含局部麻醉剂的量低于所需的局部麻醉剂的量。换句话说，在一些实施方案中，本文所公开的组合物和方法利用基于蛋白质/肽的制剂(例如，包含HGF蛋白的制剂，所述HGF蛋白例如为重组天然的全长HGF或dHGF或其重组天然变异体，例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，以及一种或多种甘油一酸酯(例如，α和/或β-结晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度，优选12或14碳的碳链长度)的混合物，所述甘油一酸酯在温度小于或等于42℃、41℃、40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃或15℃、优选为皮肤温度时保持为结晶形式，并且，其还包含治疗量的局部麻醉药(例如布比卡因)，该局部麻醉药的浓度可以为或低于局部麻醉所需的量。

除了所述局部麻醉药(例如，布比卡因)之外或代替所述局部麻醉药，其他实施方案还包含至少一种抗病原化合物以及所述的至少一种结晶性甘油一酸酯。在本发明的某些方面，布比卡因本身就是抗病原化合物，并且没有提供其他抗菌剂；在其他制剂中，提供了布比卡因以外的其它抗病原化合物。在一些实施方案中，除了布比卡因以外或代替布比卡因，上述组合物还包含这样的抗病原化合物，其选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物、具有3-6个碳原子的二醇、抗生素以及抗真菌组合物所组成的组。也就是说，本发明的各方面除了包含结晶性甘油一酸酯(例如，α或β-结晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳链长度，优选12、13或14碳的碳链长度，最优选12或14碳的碳链长度)的含蛋白质/肽的产品外，还包含抗病原化合物，该抗病原化合物选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物、具有3-6个碳原子的二醇、抗生素和抗真菌组合物所组成的组，并且所述的方面还可任选地包含局部麻醉药(例如布比卡因)。换句话说，在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法利用基于蛋白质/肽的制剂(例如，包含HGF蛋白的制剂，所述HGF蛋白例如重组天然全长HGF或dHGF或其重组天然变异体，例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，以及一种或多种甘油一酸酯(例如，α和/或β-结晶性甘油一酸酯，其具有12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度)的混合物，所述甘油一酸酯在温度小于或等于42℃、41℃、40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃或15℃、优选皮肤温度时保持为结晶性形式，并且所述的组合物和方法除了局部麻醉药(例如布比卡因)之外或代替局部麻醉药，还包括抗病原化合物，其选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物、具有3-6个碳原子的二醇、抗生素和抗真菌组合物所组成的组。

一些实施方案还包含一种或多种增粘剂。优选的增粘剂包括(但不限于)：选自由羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素组成的组中的纤维素衍生物。也就是说，一些实施方案除了包含结晶性甘油一酸酯(例如，α或β-结晶性甘油一酸酯，其可具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳链长度，优选12、13或14碳的碳链长度，最优选12或14碳的碳链长度)的含蛋白质/肽的产品外，还包括增粘剂，例如选自由羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素组成的组中的纤维素衍生物，该实施方案还可任选地包含局部麻醉药(例如布比卡因)和/或抗病原化合物，该抗病原化合物选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物、具有3-6个碳原子的二醇、抗生素和抗真菌组合物所组成的组。换句话说，在一些实施方案中，本文公开的所述组合物和方法利用基于蛋白质/肽的制剂(例如，包含HGF蛋白的制剂，如重组天然全长HGF或dHGF或其重组天然变异体，例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，以及一种或多种甘油一酸酯(例如，α和/或β-结晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳，优选12或14碳的碳链长度)的混合物，所述甘油一酸酯在温度小于或等于42℃、41℃、40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃或15℃、优选皮肤温度时保持为结晶形式，并且所述组合物或方法还包括增粘剂，例如选自由羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素组成的组中的纤维素衍生物，并且其任选地包括抗病原化合物(其选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物、具有3-6个碳原子的二醇、抗生素和抗真菌组合物所组成的组)和/或可任选的局部麻醉药(例如布比卡因)。

在许多实施方案中，所述组合物是干态粉末，在其他实施方案中，所述组合物是重构凝胶或乳膏。在一些实施方案中，所述重构凝胶或乳膏通过混合包含至少一种结晶性甘油一酸酯和增粘剂的干态粉末与包含蛋白质/肽、优选为HGF蛋白的液体而获得，其中，所述HGF蛋白例如为重组天然全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其重组天然变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，并且所述结晶性甘油一酸酯例如为α和/或β-结晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳链长度，优选12、13或14碳的碳链长度，最优选12或14碳的碳链长度，并且所述结晶性甘油一酸酯在温度小于或等于42℃、41℃、40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃或15℃、优选皮肤温度时保持为结晶形式。

在其他实施方案中，所述重构是在多室设备内部进行的，其中通过以下的包封设备使组合物的干态部分与组合物的液体部分相接触，所述包封设备被构造为允许不同室的内容物之间在需要时(例如在挤压、反转或破坏封口时)接触而禁止其与环境接触(例如保持封闭/无菌体系)。一种预期的设备是带有两个内部小室的袋子，其在压力下可破裂，从而允许小室中的成分混合并且启动重构反应。

本发明的多个方面还包括制备和使用上述组合物的方法。作为一种方法，通过提供包含蛋白质或肽和至少一种甘油一酸酯(例如α和/或β-结晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳，优选12或14碳的碳链长度)的溶液、并且干燥所述溶液以形成干颗粒，来制备本文所述的组合物，其中所述干燥过程保持甘油一酸酯的结晶结构，所述蛋白质或肽例如为HGF蛋白，如全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，所述甘油一酸酯在和/或低于体温时保持为结晶形式，并且在温度小于或等于42℃、41℃、40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃或15℃，优选皮肤温度时保持为结晶形式。可以使用很多可用的干燥方法来制备本文所述的一种或多种制剂。优选的是，干燥过程中的温度不超过甘油一酸酯晶体的熔点。在一些方法中，方法中使用的所述溶液还包含增粘剂，例如选自由羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素组成的组中的纤维素衍生物。一些实施方案的方法还使用这样的溶液，其包含至少一种单独的或与所述至少一种结晶性甘油一酸酯组合的抗病原化合物。在优选的方法中，所述抗病原化合物是布比卡因；然而，所述抗病原化合物可选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6个碳原子的二醇组成的组。

作为另一种合成方法，将包含至少一种在体温时和/或低于体温时保持为结晶形式的甘油一酸酯的溶液与增粘剂(例如羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)或羟乙基甲基纤维素)相组合，并且将该混合物以保持甘油一酸酯的β-结晶结构的方式干燥，以形成干颗粒，其中所述甘油一酸酯例如为α或β-结晶性甘油一酸酯，其可具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳链长度，优选12、13或14碳的碳链长度，最优选12或14碳的碳链长度。接下来，提供包含蛋白质或肽(例如HGF蛋白，如全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型))或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)的液体，并且在保留所述至少一种甘油一酸酯的结晶结构的条件下，将包含蛋白质或肽的所述液体与包含所述至少一种甘油一酸酯和增粘剂的干颗粒组合。作为一些方法，该方法使用了增粘剂，所述增粘剂为选自由羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素组成的组中的纤维素衍生物。可任选的是，这些方法中使用的溶液还包含至少一种单独的或与所述至少一种结晶性甘油一酸酯组合的抗病原化合物。优选的是，所述抗病原化合物是布比卡因；然而，所述抗病原化合物可选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6个碳原子的二醇组成的组。

本文所述的组合物能够用于改善或改良皮肤状况，或恢复对象的青春外貌的方法中。作为一种方法，确认需要改善或改良皮肤状况或恢复所述对象的青春外貌的制剂的对象，并且将一种或多种上述的组合物提供给所确认的对象。可通过临床评价或诊断测试或观察来确认需要改善或改良皮肤状况或恢复所述对象的青春外貌的制剂的对象，如本领域常规进行的那样。在一些实施方案中，本文所述组合物被用于治疗、预防、改善或改良皮肤状况，例如慢性糖尿病性皮肤溃疡、裂伤、创伤、褥疮、褥疮性溃疡、压迫性坏疽或美容缺陷。在更多实施方案中，本文所述组合物被用于改善对象的青春外貌，或改良对象的皱纹。可任选的是，在应用一种或多种所实施的组合物之后，可以通过对皮肤状况或青春外貌的改善或改良状况进行常规的诊断或临床评价或观察，来测量皮肤状况的改善或改良情况，或青春外貌的恢复情况。

因此，在本发明的一些方面中，还考虑了使用包含蛋白质或肽、结晶性甘油一酸酯、可任选的增粘剂以及可任选的酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物或具有3-6个碳原子的二醇(例如布比卡因)的混合物，来制备用于改善、改良或治疗皮肤疾病或用于恢复青春外貌(例如溃疡、糖尿病性溃疡、裂伤、穿刺、磨损、美容磨损、褥疮、褥疮性溃疡、压迫性坏疽、烧伤、术后创伤、美容重建、牛皮癣、毛发生长、除皱、皮肤张紧、皮肤肿瘤形成、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤或癌前皮肤疾病，如光化性角化病)的药物，其中所述蛋白或肽例如为HGF蛋白，如全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，所述结晶性甘油一酸酯例如为α或β-结晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳链长度，优选12、13或14碳的碳链长度，最优选12或14碳的碳链长度，并且所述增粘剂例如为羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)或羟乙基甲基纤维素。

因此，本文所述的一些实施方案包括稳定化的蛋白质组合物，其包含具有生物活性的蛋白质或肽，以及至少一种熔融温度大于或等于20℃的甘油一酸酯。在一些实施方案中，所述蛋白质是天然的肝细胞生长因子(HGF)的重组形式，并且在一些实施方案中，所述天然的HGF的重组形式是HGF的五氨基酸截短型(dHGF)，或选自由NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4组成的组中的天然HGF。在一些上述组合物中，甘油一酸酯的熔融温度大于或等于25℃、大于或等于30℃或大于或等于35℃。在一些上述实施方案中，除了至少一种甘油一酸酯以外，所述组合物还包含抗病原剂。在一些实施方案中，抗病原剂选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6个碳原子的二醇组成的组，并且在一些实施方案中，抗病原剂是布比卡因。上述组合物还可包含增粘剂，例如选自由羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素组成的组中的纤维素衍生物，并且在上述的一些实施方案中，至少一种甘油一酸酯具有10、11、12、13、14、15或16碳的碳链长度，优选12或14碳的碳链长度。

本文所述的多个实施方案涉及稳定化的蛋白质组合物，其包含配制有β-结晶性甘油一酸酯(其具有10、11、12、13、14、15或16碳，优选12或14碳的碳链长度)的dHGF蛋白，其中所述dHGF在稳定化的蛋白质组合物中的浓度小于或等于50ng/ml。在其中一些实施方案中，所述制剂包含单月桂酸1-甘油酯或单肉豆蔻酸1-甘油酯或这二者，并且该制剂还可包含增粘剂和/或抗菌剂。在一些实施方案中，所述增粘剂是羟乙基纤维素且抗菌剂是布比卡因。在本文所述的一些实施方案中，dHGF在稳定化的蛋白质组合物中的浓度小于或等于10ng/ml。

本发明的多个方面涉及一种稳定化的蛋白质组合物，其包含配制有单月桂酸1-甘油酯和单肉豆蔻酸1-甘油酯的HGF或HGF变异蛋白。在一些实施方案中，所述组合物还包含增粘剂(例如羟乙基纤维素)，并且一些上述组合物还包含抗病原剂(例如布比卡因)。在其中一些组合物中，所述HGF或HGF变异蛋白选自由NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4或与所述HGF或HGF变异蛋白具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(或在85％-99％内的任意百分比)的序列相似性或同源性的蛋白质组成的组，条件是所述相似的或同源的蛋白质保留属于HGF或HGF变异蛋白的功能，例如结合cMet受体、上皮细胞促进作用、细胞扩散、诱导细胞生长、抑制上皮细胞促进作用、抑制细胞扩散或抑制细胞生长。

本发明的多个方面还涉及一种稳定化的蛋白质组合物，其包含配制有单月桂酸1-甘油酯和单肉豆蔻酸1-甘油酯的dHGF蛋白。在一些实施方案中，这些组合物还包含增粘剂(例如羟乙基纤维素)，并且一些上述组合物还包含抗病原剂(例如布比卡因)。另外的实施方案包括稳定化的蛋白质组合物，其包含配制有单月桂酸1-甘油酯和单肉豆蔻酸1-甘油酯的HGF、NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4，并且这些组合物可任选地包含增粘剂(例如羟乙基纤维素)，并且一些上述组合物还包含抗病原剂(例如布比卡因)。

本发明的多个方面还包括制备上述组合物的方法，其中所述方法是通过以下过程实施的：提供包含dHGF蛋白和至少一种熔融温度大于30℃的甘油一酸酯的溶液，并且干燥所述溶液，以形成干态颗粒，其中所述干燥过程保持甘油一酸酯的β-结晶结构。在其中一些方法中，所述溶液还包含增粘剂。在其中一些方法中，增粘剂是选自由羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素组成的组中的纤维素衍生物，并且在其中一些方法中，至少一种甘油一酸酯具有10、11、12、13、14、15或16碳，优选12或14碳的碳链长度。在其中一些方法中，所述溶液还包含至少一种单独的或与所述至少一种结晶性甘油一酸酯组合的抗病原化合物，并且在其中一些方法中，所述抗病原化合物是布比卡因。在其中一些方法中，所述抗病原化合物选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6个碳原子的二醇组成的组。

本发明的多个方面还包括制备上述组合物的方法，其包括：提供包含至少一种熔融温度大于30℃的结晶性甘油一酸酯和增粘剂的溶液；冷冻喷雾干燥所述溶液以形成干态颗粒，其中所述冷冻干燥过程保持所述甘油一酸酯的β-结晶结构；提供包含天然HGF蛋白的重组形式的液体；以及在保留至少一种甘油一酸酯的结晶结构的条件下，将包含所述HGF蛋白的所述液体与包含所述至少一种甘油一酸酯和增粘剂的所述干态颗粒相组合。在其中一些方法中，所述天然HGF蛋白的重组形式是dHGF，并且在其中一些方法中，所述增粘剂是选自由羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素组成的组的纤维素衍生物。在其中一些方法中，至少一种甘油一酸酯具有10、11、12、13、14、15或16碳，优选12或14碳的碳链长度，并且在其中一些方法中，所述溶液还包含至少一种单独的或与所述至少一种甘油一酸酯组合的抗病原化合物。在其中一些方法中，所述抗病原化合物是布比卡因，并且在其中一些方法中，所述抗病原化合物选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6个碳原子的二醇组成的组。

本发明的多个方面还包括使用上述组合物来改善或改良对象的皮肤疾病的方法，该方法包括：确认需要改善或改良皮肤疾病的制剂的对象；并且将本文所述的所述组合物提供给所述对象。在其中一些方法中，所述皮肤疾病是慢性糖尿病性皮肤溃疡、裂伤、创伤、美容缺陷、皮肤肿瘤或基底细胞癌。可任选的是，上述方法还可包括测量皮肤疾病的改善或改良情况。

附图简要说明

图1示出乳膏ALL07001的熔融曲线，以及一种干态粉末(ALL07005C)和两种重构粉末(ALL07005A和ALL07005F)的典型曲线。

优选实施方案的详细说明

本文所述的许多实施方案涉及包含稳定化的被输送药剂(例如蛋白质或其片段和/或核酸如DNA或RNA)的局部用组合物。在优选的实施方案中，所述组合物包含至少一种结晶甘油一酸酯，例如在温度等于或低于42℃、41℃、40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃或15℃，优选等于或低于皮肤温度时保持结晶形式的甘油一酸酯。在更优选的实施方案中，所述甘油一酸酯为β-晶态。所述“晶态”是指在全部三个维度重复出现的结构，但是在全部三个方向上的重复功能不必相同。β-结晶甘油一酸酯包含固态层状结构的固体甘油一酸酯，其碳链不熔融而是固态的。

在另一个优选实施方案中，所述组合物还包含至少一种单独的或与所述结晶性甘油一酸酯组合的抗病原化合物(例如抗菌化合物、抗真菌剂、杀菌剂或抑菌剂或抗生素)，以及可任选的赋形剂。在一个特别优选的实施方案中，所述组合物还包含悬浮剂或增粘剂(例如纤维素衍生物，如羟丙基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素(例如

)、甲基纤维素、羧甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素)。

在一些实施方案中，所述局部用组合物被制备成具有液体吸收能力的干态粉末，其与液体(例如水、油或乳液)接触后产生半固体制剂。该再生的半固体产品能够局部应用，以诱导被输送药剂(例如蛋白质或其片段，核酸(如DNA或RNA)，或其组合)的表皮、真皮、透皮或皮内给药。在一些实施方案中，有效成分以液体形式存在(例如在适合的缓冲剂中)，并且将包含有效成分的水性溶液加入到含有胶凝剂或增粘剂的干燥粉末中，以制备稳定化产品的最终制剂。在对已被确认为需要有效成分的对象提供稳定化的组合物之前，可将包含有效成分的水性溶液与包含胶凝剂的干燥粉末稍作混合。

这些稳定化的被输送药剂的制剂可用于使对象(例如动物、家养动物、爬行动物、鸟类或哺乳动物如狗、猫、马、猪或人)的健康和幸福获益。一些制剂可用于治疗、改良或改善对象的皮肤疾病(例如促进或加速溃疡、创伤或皮肤肿瘤的治愈)。例如，一些实施方案被配制为用于治疗、改善或改良美容状况，或促进动物的健康和幸福。一些实施方案能够用于在动物、优选哺乳动物(例如人)中治疗、改善、改良溃疡、糖尿病性溃疡、褥疮、褥疮性溃疡、压迫性坏疽、裂伤、穿刺、磨损、美容磨损、烧伤、术后创伤、皮肤肿瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、光化性角化病、美容重建、牛皮癣、毛发生长、除皱、皮肤张紧和/或青春外貌。

若干实施方案涉及包含、由或基本上由有效成分或被输送药物(如蛋白质，编码蛋白质的核酸或蛋白质片段或编码所述蛋白质片段的核酸)组成的局部用组合物。可在本文所述的制剂或产品中用作被输送药物的示例性蛋白质包括(但不限于)：生长激素，包括人生长激素(hGH)、肝细胞生长因子或扩散因子(HGF)和去-N-甲硫氨酰基人生长激素；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；甲状腺素；脂蛋白；α1-抗胰蛋白酶；胰岛素α-链；胰岛素β-链；胰岛素原；凝血因子，如VIIIC因子、IX因子、组织因子和冯维勒布兰德氏(von Willebrands)因子；抗凝血因子，如蛋白C；心钠肽；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子(TNF)α和β；脑啡肽；血清白蛋白如人血清白蛋白；缪勒管抑制(mullerian-inhibiting)物质；松弛素A链；松弛B链；松弛素原；DNA酶；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；激素或生长因子受体；整合素；血小板生成素；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)；或神经生长因子如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-γ；胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；骨形态发生蛋白(BMP)；促生长素；干扰素(IFN)如IFN-α、IFN-β和IFN-γ；集落刺激因子(CSF)如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表膜蛋白；衰变加速因子；归巢受体；禀呈素；调节蛋白或抗体。

加入到本文所述的一种或多种组合物中的特别优选的有效成分包括重组产生或天然分离的HGF蛋白，例如全长HGF或dHGF(HGF的天然五氨基酸截短型)或其天然变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，以及结晶性甘油一酸酯(例如α和/或β-结晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳，优选12或14碳的碳链长度，并且在温度小于或等于42℃、41℃、40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃或15℃，优选皮肤温度时保持为结晶形式)。本发明的多个方面还包括含有被输送药剂的制剂，其中所述被输送药剂包含、基本上由或由编码和/或干扰上述所列的多肽或其突变体种的任意一种的核酸(例如DNA、RNA，包括干扰RNA如RNAi)组成。多个实施方案包括上述所列多肽的片段和编码和/或干扰所述片段的核酸(例如DNA、RNA，包括干扰RNA如RNAi)。

例如，在一些实施方案中使用的被输送药剂或有效成分包括在局部应用于组织(例如皮肤)时具有治疗、改良或改善效果的蛋白质或编码该蛋白质的核酸，例如HGF  (肝细胞生长因子或扩散因子)、hGH、TGF-α、TGF-β、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子-1和2(IGF-I和/或IGF-2)、t-PA、因子VIII、松弛素、胰岛素、IFN-γ和/或TGF-γ。一些实施方案可包含上述蛋白质的片段或突变体或编码所述片段或突变体的核酸。

在一些实施方案中，制剂包含编码一种或多种蛋白质或其片段的核酸(例如除了所述蛋白质或蛋白质片段之外，或替代所述蛋白质或蛋白质片段)。例如，在一些实施方案中，根据本文所述的教导将编码HGF、HGF片段或HGF突变形式或HGF片段的突变形式(例如全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))的核酸，以及β结晶性甘油一酸酯配制在局部用产品中，其中所述β结晶性甘油一酸酯例如为α或β-结晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳链长度，优选12、13或14碳的碳链长度，最优选12或14碳的碳链长度，并且所述制剂还可包含HGF蛋白、HGF蛋白片段、或HGF蛋白或其片段的突变体(例如全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))。也就是说，在一些实施方案中，编码蛋白质(例如HGF蛋白或HGF蛋白突变体或其片段)的DNA可配制在本文所述的含有或不含有HGF蛋白或HGF蛋白突变体或其片段的组合物中。可以将这些核酸加入到适合于特别对象的表达质粒中(例如特别适合在人、猫、狗、马、猪或鸡中指导表达的质粒)。此外，所述DNA被输送药剂能够为特别对象(例如人、猫、狗、马、猪或鸡)进行密码子优化，以便在对象内提供改善的肽产品。例如，可根据本文的教导将密码子优化的HGF或突变体HGFDNA(例如全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))配制在局部用凝胶中，并且可以将所述密码子优化的HGF或突变体HGF DNA(例如编码全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)的核酸)在狗、猫、马、猪或人中进行优化表达。

能够在本文所述制剂中使用的蛋白质/肽包括所有天然的和合成的蛋白质/肽，无论其是通过天然来源、化学合成获得的，还是通过重组技术产生的均是如此。在一些实施方案中，所述白质/肽可为糖蛋白、磷蛋白、碘蛋白、硫蛋白、甲基化蛋白、未修饰的蛋白质/肽、或包含其他修饰的蛋白质/肽。尽管可以将本文所述的组合物配制成包含宽泛范围的蛋白质浓度，或者可以将其配制为输送宽泛范围的蛋白质浓度，但是根据适合于治疗效果的特定蛋白质/肽的量，优选将组合物配制为使得这些包含于产品中或通过产品输送的蛋白质/肽的浓度小于或等于10mg/ml、5mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml或1ng/ml。换句话说，本文所述组合物和方法能包含或利用一定浓度的蛋白质或肽，或输送一定浓度的蛋白质或肽，该浓度足以达到治疗目的，并且根据蛋白质/肽或预期的治疗，该浓度小于、在其之间或等于9-10mg/ml、8-9mg/ml、7-8mg/ml、6-7mg/ml、5-6mg/ml、4-5mg/ml、3-4mg/ml、2-3mg/ml、1-2mg/ml、0.5-1mg/ml、0.25-0.5mg/ml、0.1-0.25mg/ml、0.05-0.1mg/ml、0.02-0.05mg/ml、10-20μg/ml、9-10μg/ml、8-9μg/ml、7-8μg/ml、6-7μg/ml、5-6μg/ml、4-5μg/ml、3-4μg/ml、2-3μg/ml、1-2μg/ml、0.5-1μg/ml、0.3-0.5μg/ml、0.1-0.3μg/ml、0.05-0.1μg/ml、0.02-0.05μg/ml、10-20ng/ml、9-10ng/ml、8-9ng/ml、7-8ng/ml、6-7ng/ml、5-6ng/ml、4-5ng/ml、3-4ng/ml、2-3ng/ml、1-2ng/ml中的任一数值。

对于众多用于改善、改良或治疗皮肤疾病(例如创伤、溃疡和皮肤肿瘤)的局部用组合物，优选的是，产物中包含的制剂的有效成分(例如全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))的浓度或者由产物输送的有效成分浓度小于或等于5μg/ml、4μg/ml、3μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml、100ng/ml、95ng/ml、90ng/ml、85ng/ml、80ng/ml、75ng/ml、70ng/ml、65ng/ml、60ng/ml、55ng/ml、50ng/ml、45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、20ng/ml、19ng/ml、18ng/ml、17ng/ml、16ng/ml、15ng/ml、14ng/ml、13ng/ml、12ng/ml、11ng/ml、10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml或1ng/ml中的任一数值。

在优选的实施方案中，将所述蛋白质/肽配制为作为包含凝胶形成化合物的制剂的一部分用于局部给药。可以将任何悬浮剂或增粘剂用在所述制剂中，该悬浮剂或增粘剂包括(但不限于)：阿拉伯胶、琼脂、藻酸、单硬脂酸铝、膨润土、纯化膨润土、膨润土岩浆、卡波姆934p、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠12、角叉胶、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠纤维素、糊精、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素(例如

)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸铝镁、甲基纤维素、果胶、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚维酮、海藻酸丙二醇酯、二氧化硅、胶体二氧化硅、海藻酸钠、黄蓍胶和黄原胶。在优选的实施方案中，将纤维素衍生物(其包括但不限于：羟乙基纤维素(例如

)、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素)用作凝胶形成化合物。所述凝胶形成化合物优选为能提供半固体产品的量。凝胶形成化合物的例子包括纤维素衍生物，例如上述的那些。

在优选的实施方案中，此处所设想的制剂包含在温度低于皮肤温度时为固体晶态的脂质。在优选实施方案中使用的脂质具有有助于脂质在温度低于42℃时保持为固态的脂质链熔融温度。也就是说，能在本文所述组合物或方法中使用的结晶性甘油一酸酯具有这样的熔融温度，其小于或等于42℃、41℃、40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃或15℃。脂质化合物作为干燥产品的一部分应该具有的含量为约90％至约1％，优选约85％至约5％，更优选约80％至约10％，更加优选约75％至约15％，还更优选约70％至约20％，更优选约65％至约25％并且优选约60至约40％。本文所用优选脂质的例子包括脂肪酸的结晶性甘油一酸酯。所述脂肪酸包括(但不限于)：具有最优选为12或14个碳，优选10至16个碳原子，并且最好是10至18个碳原子的饱和脂肪酸(也就是说，具有至少为或等于或为10、11、12、13、14、15、16、17或18之间的任何数值的碳原子)。优选的组合物包含具有10、11、12、13、14、15或16碳的碳链长度的结晶性甘油一酸酯，其包括单月桂酸1-甘油酯，单肉豆蔻酸1-甘油酯，单棕榈1-甘油酸酯和单硬脂酸1-甘油酯。最优选的是，组合物包含具有12或14个碳的β-结晶性甘油一酸酯。如市售可得的那样，结晶性甘油一酸酯可以以均态或非均态存在。本文所述组合物和方法中使用的优选的甘油一酸酯包括单月桂酸甘油酯和/或单肉豆蔻酸1-甘油酯。

结晶性甘油一酸酯的混合物也可用于一些制剂中。因此，一些实施方案包括一种或多种结晶性甘油一酸酯(例如α或β-结晶性甘油一酸酯)的混合物，所述结晶性甘油一酸酯可具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳链长度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳链长度，优选12、13或14碳的碳链长度，最优选12或14碳的碳链长度。示例性的比例包括1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19或1∶20或更多。优选的组合物包括比例为1∶9或9∶1的单月桂酸1-甘油酯和单肉豆蔻酸1-甘油酯的混合物。

由于产品是半固体的，所以能够调节蛋白质/肽的给药速度。这个可通过改变凝胶形成化合物的量和脂质的量来实现。所期望的给药速度取决于所用的蛋白质/肽，并且所述组合物可以针对各种蛋白质/肽进行调制。α或β-结晶性甘油一酸酯的结晶百分比对特定制剂也是重要的，并且能根据商业来源、纯度、异质性而不同。因此，一些实施方案包括一定量的α或β-结晶性甘油一酸酯，其中α或β-结晶性甘油一酸酯含有的结晶性甘油一酸酯分子大于或等于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或这些百分比之间的任意数值。在本文所用的某些方面中，术语结晶性甘油一酸酯是指这样的甘油一酸酯，其中在特定温度下以晶态存在的甘油一酸酯的百分比大于非晶态的甘油一酸酯。例如，结晶性甘油一酸酯可为α或β-结晶性甘油一酸酯，其在小于或等于42℃、41℃、40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃或15℃时，晶态分子百分比大于非晶态分子的百分比。可由差示扫描量热法(DSC)确定在任何特定的α或β-结晶性甘油一酸酯中的结晶化形式的百分比。

另外的实施方案涉及这样的方法，其中将本文所述的一种或多种重构凝胶或乳膏制剂提供给需要其的对象(例如，诸如狗、猫、马、猪或人等对象)，以治疗、改良或改善下列疾病：溃疡、糖尿病性溃疡、褥疮、褥疮性溃疡、压迫性坏疽、裂伤、穿刺、磨损、美容磨损、烧伤、术后创伤、皮肤肿瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、美容重建、牛皮癣、毛发生长、除皱、皮肤紧硬和/或青春外貌。在这样的方法中，所述对象优选经确认为需要治疗、改良或改善以下状况中的一种或多种的组合物的对象：溃疡、糖尿病性溃疡、褥疮、褥疮性溃疡、压迫性坏疽、裂伤、穿刺、磨损、美容磨损、烧伤、术后创伤、皮肤肿瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、光化性角化病、美容重建、牛皮癣、毛发生长、除皱、皮肤紧硬和/或青春外貌。可以通过本领域已知的临床或诊断评价进行所述确认操作，所述临床或诊断评价包括医生、外科医生或其他保健服务提供者咨询或进行诊断测试或活检。可任选的或可供选用的是，这样的对象被确认为需要诱导上皮细胞增殖和/或在创伤位点形成肉芽的制剂或抑制癌细胞增殖或扩散的制剂的对象。同样，可以通过本领域已知的临床或诊断评价进行所述的确认操作，所述临床或诊断评价可包括医生、外科医生或其他保健服务提供者咨询或进行诊断测试或活检。

一旦对象被确认，可向他们提供或施用一种或多种本文所述的组合物。优选的是，通过提供以下的组合物实施所述方法，所述组合物被配制为使得包含于产品中或通过产品输送的蛋白质/肽的浓度小于或等于10mg/ml、5mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml或1ng/ml。换句话说，一旦对象被确认为需要特定治疗剂的患者，可向他们提供或施用一种或多种本文所述的组合物，根据蛋白质/肽和治疗目的，其可包含或利用足以达到治疗目的浓度的蛋白质或肽，或输送足以达到治疗目的浓度的蛋白质或肽，根据蛋白质/肽或预期的疗法，所述浓度例如为小于、在其之间或等于9-10mg/ml、8-9mg/ml、7-8mg/ml、6-7mg/ml、5-6mg/ml、4-5mg/ml、3-4mg/ml、2-3mg/ml、1-2mg/ml、0.5-1mg/ml、0.25-0.5mg/ml、0.1-0.25mg/ml、0.05-0.1mg/ml、0.02-0.05mg/ml、10-20μg/ml、9-10μg/ml、8-9μg/ml、7-8μg/ml、6-7μg/ml、5-6μg/ml、4-5μg/ml、3-4μg/ml、2-3μg/ml、1-2μg/ml、0.5-1μg/ml、0.3-0.5μg/ml、0.1-0.3μg/ml、0.05-0.1μg/ml、0.02-0.05μg/ml、10-20ng/ml、9-10ng/ml、8-9ng/ml、7-8ng/ml、6-7ng/ml、5-6ng/ml、4-5ng/ml、3-4ng/ml、2-3ng/ml、或1-2ng/ml中的任一数值。

在一些优选方法中，提供基于HGF的制剂，例如，包含全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)的组合物，所提供的组合物被配制为使得上述有效成分包含于产品中或通过产品输送的浓度小于或等于5μg/ml、4μg/ml、3μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml、100ng/ml、95ng/ml、90ng/ml、85ng/ml、80ng/ml、75ng/ml、70ng/ml、65ng/ml、60ng/ml、55ng/ml、50ng/ml、45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、20ng/ml、19ng/ml、18ng/ml、17ng/ml、16ng/ml、15ng/ml、14ng/ml、13ng/ml、12ng/ml、11ng/ml、10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml或1ng/ml中的任一数值。

给药方案、施用频率和给药时间可以由医师或其他保健服务提供者考虑所期望的应用和患者或对象状况的细节来确定。在一些实施方案中，每两天提供一种或多种本文所述的组合物，并且相应地对患者的改善情况进行监测和/或测量。也就是说，可以任选地通过本领域已知的临床或诊断评价来测量或监测所述对象的恢复情况或其标志物，如血管生成、肉芽组织形成、出现治疗后组织的、创伤渗出、恢复健康组织、肿瘤病变或角化病的消失。

许多创伤或美容皮肤状态会感染病原体或有感染病原体的风险。虽然存在于创伤中的病原体的种类通常是“病患来源”，但是这些生物体的存在并不总是会导致全身性感染。但是，许多病原体能够产生可能会破坏某些蛋白质的结构与功能的蛋白酶。在某些实施方案中，向制剂中单独或与结晶性甘油一酸酯和蛋白质/肽有效成分(例如全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))组合加入抗病原化合物(例如抗菌化合物、抗真菌剂、杀菌或抑菌剂或抗生素)，以抑制、减少或治疗存在于对象中的病原体。

在包含结晶性甘油一酸酯(优选β-结晶性甘油一酸酯)的制剂中引入抗病原化合物能够协同地抑制、减少或治疗病原体。也就是说，在一些实施方案中，考虑到当将所述化合物与结晶性甘油一酸酯(优选β-结晶性甘油一酸酯)一起应用时，抗病原化合物能协同抑制病原体(例如细菌或真菌)的增殖。在一些实施方案中，还考虑到包含抗病原剂、结晶性甘油一酸酯(优选β-结晶性甘油一酸酯)和蛋白质的制剂在改良、改善或治疗疾病(例如皮肤疾病，如皮肤溃疡)方面优于包含单独的蛋白质/肽或与结晶性甘油一酸酯(优选β-结晶性甘油一酸酯)组合的蛋白质/肽或与抗微生物化合物组合的蛋白质/肽的制剂，其中所述蛋白质例如为全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)。

如本文讨论的那样，特定的结晶性甘油一酸酯(优选β-结晶性甘油一酸酯)与某些特定组的化学物质的组合能在抗菌性质方面提供协同效果(见美国专利No.5,550,145，其全文以引用的方式明确地并入本文)。抗菌有效量的结晶性甘油一酸酯(优选β-结晶性甘油一酸酯)和选自下列组中的至少一种化学物质的组合能有效地赋予抗菌性质，其中所述结晶性甘油一酸酯包括(但不限于)月桂酸、肉豆蔻酸的甘油一酸酯或其混合物，并且所述的组为：i)酰胺型局部麻醉药；ii)尿素；iii)抗菌、抗细菌、抗真菌物质，咪唑衍生物或硝基咪唑衍生物；以及iv)具有3-6个碳原子的二醇。

可用于本文所述制剂或方法中的特别优选的酰胺型局部麻醉药包括(但不限于)利多卡因、丙胺卡因、甲哌卡因、辛可卡因、布比卡因、普鲁卡因、地布卡因、丁卡因、丁氧普鲁卡因、奥西卡因和依替卡因。在本文所述的制剂或方法中使用的所述局部麻醉药中，布比卡因是特别优选的物质。

除了局部麻醉药之外或代替局部麻醉药，尿素化合物、磺胺胍、磺脲(sulfanilylure)、脲类衍生物、夫西地酸、头孢菌素P也可用于本文所述的一种或多种制剂或方法中。咪唑衍生物(其包括硝酸益康唑、硝酸咪康唑、联苯苄唑和克霉唑)也可用于本文所述的一种或多种制剂或方法中。抗病原物质(例如硝基咪唑化合物，包括替硝唑和甲硝唑)也可用于本文所述的一种或多种制剂或方法中。具有3-6个碳原子的二醇化合物包括(但不限于)：丙二醇(如1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇、2，2-二甲基-1，3丙二醇)、丁二醇(如1，2-丁二醇、1，3-丁二醇(丁二醇)、1，4-丁二醇，2，3-丁二醇)，戊二醇(如1，2-戊二醇(戊二醇)、1，3-戊二醇、1，4-戊二醇、1，5-戊二醇、2，3-戊二醇，2，4戊二醇)和己二醇(如1，2-己二醇，1，3己二醇、1，4-己二醇、1，5己二醇、1，6己二醇、2，3-己二醇、2，4-己二醇和2，5-己二醇、环己二醇、1，2-环己二醇、1，4-环己二醇)，并且其也可用于本文所述的一种或多种制剂或方法中。

在一些实施方案中，将制造过程设计为产生包含具有液体吸收能力的有效成分或被输送药剂(例如全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))的干燥粉末。这种干燥粉末在接触水或适合的缓冲剂后有产生半固体。所述制造过程包括溶解或分散组分的初始步骤，和之后干燥、除去液体，以及形成适合重构的颗粒的步骤。在制造过程中，在脂质的结晶性结构不改变的温度下保持脂质是很重要的。例如，在制造过程中的温度可低于脂质的熔融温度，例如不超过42℃。

在其他实施方案中，所进行的制造过程产生只包含胶凝剂(例如

)和甘油一酸酯的干燥粉末，并且该干燥粉末用包含有效成分或被输送药剂(例如全长HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其变异体(例如NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))的水性溶液(例如适合的缓冲剂)进行重构。如上所述，所述制造过程包括溶解或分散结晶性甘油一酸酯(优选β-结晶性甘油一酸酯)和胶凝剂的初始步骤，以及之后干燥、除去液体，以及形成适合重构的颗粒的步骤。优选的是，保持温度小于35℃，使得脂质的结晶性结构保持不变。可在向需要的对象提供产品之前将所述包含胶凝剂和结晶性甘油一酸酯(优选β-结晶性甘油一酸酯)的粉末进行重构，或可以将重构材料储存到使用，优选在低于室温的温度下储存。下面提供了本发明各方面的非限制性的实施例。

实施例1

本文所述的一些实施方案包括具有以下序列的重组人肝细胞生长因子(rhHGF)：

  1mwvtkllpal llqhvllhll llpiaipyae gqrkrrntih efkksakttl ikidpalkik

 61tkkvntadqc anrctrnkgl pftckafvfd karkqclwfp fnsmssgvkk efghefdlye

121nkdyirncii gkgrsykgtv sitksgikcq pwssmipheh sflpssyrgk dlqenycrnp

181rgeeggpwcf tsnpevryev cdipqcseve cmtcngesyr glmdhtesgk icqrwdhqtp

241hrhkflpery pdkgfddnyc rnpdgqprpw cytldphtrw eycaiktcad ntmndtdvpl

301etteciqgqg egyrgtvnti wngipcqrwd sqyphehdmt penfkckdlr enycrnpdgs

361espwcfttdp nirvgycsqi pncdmshgqd cyrgngknym gnlsqtrsgl tcsmwdknme

421dlhrhifwep dasklnenyc rnpdddahgp wcytgnplip wdycpisrce gdttptivnl

481dhpviscakt kqlrvvngip trtnigwmvs lryrnkhicg gslikeswvl tarqcfpsrd

541lkdyeawlgi hdvhgrgdek ckqvlnvsql vygpegsdlv lmklarpavl ddfvstidlp

601nygctipekt scsvygwgyt glinydgllr vahlyimgne kcsqhhrgkv tlneseicag

661aekigsgpce gdyggplvce qhkmrmvlgv ivpgrgcaip nrpgifvrva yyakwihkii

721ltykvpqs(SEQ.ID.NO.1).

本文所述的更多实施方案包括具有以下序列的dHGF：

  1mwvtkllpal llqhvllhll llpiaipyae gqrkrrntih efkksakttl ikidpalkik

 61tkkvntadqc anrctrnkgl pftckafvfd karkqclwfp fnsmssgvkk efghefdlye

121nkdyirncii gkgrsykgtv sitksgikcq pwssmipheh syrgkdlqen ycrnprgeeg

181gpwcftsnpe vryevcdipq csevecmtcn gesyrglmdh tesgkicqrw dhqtphrhkf

241lperypdkgf ddnycmpdg qprpwcytld phtrweycai ktcadntmnd tdvplettec

301iqgqgegyrg tvntiwngip cqrwdsqyph ehdmtpenfk ckdlrenycr npdgsespwc

361fttdpnirvg ycsqipncdm shgqdcyrgn gknymgnlsq trsgltcsmw dknmedlhrh

421ifwepdaskl nenycrnpdd dahgpwcytg nplipwdycp isrcegdttp tivnldhpvi

481scaktkqlrv vngiptrtni gwmvslryrn khicggslik eswvltarqc fpsrdlkdye

541awlgihdvhg rgdekckqvl nvsqlvygpe gsdlvlmkla

avlddfvs tidlpnygct

601ipektscsvy gwgytgliny dgllrvahly imgnekcsqh hrgkvtlnes eicagaekig

661sgpcegdygg plvceqhkmr mvlgvivpgr gcaipnrpgi fvrvayyakw ihkiiltykv

721pqs(SEQ.ID.NO.2).

实施例2

制造包含具有水吸收能力的dHGF的干燥粉末。所制造的组合物在干燥前包含大约2.5μg dHGF、37.8g β-结晶性甘油一酸酯(单月桂酸1-甘油酯)、12.6g β-结晶性甘油一酸酯(单肉豆蔻酸1-甘油酯)、48g羟乙基纤维素(例如

)，以及将组合物加至1200mL的水。

制备在水中的脂质的混合物，其中将甘油一酸酯、单月桂酸1-甘油酯和单肉豆蔻酸1-甘油酯与200g水混合，并加热到70℃至75℃。在70℃至75℃下混合15分钟后，将脂质溶液缓慢冷却到20℃至30℃，以提供β-结晶性甘油一酸酯。采用其余部分的水溶解凝胶形成化合物、羟乙基纤维素(例如

)，以及分散dHGF。将三种混合物或溶液混合，并且喷雾干燥至最终含水量小于5％(例如在底层有液氮的容器中冷冻)。收集产品的冷冻颗粒，并冷冻干燥至含水量小于5％。

实施例3

在其他实施方案中，制造只包含胶凝剂和甘油一酸酯的干燥粉末，并且将该干燥粉末在包含dHGF的溶液(例如适合的缓冲剂)中重构。所制造的组合物在干燥前包含大约37.8g单月桂酸1-甘油酯、12.6g单肉豆蔻酸1-甘油酯、48g羟乙基纤维素(例如)、以及将组合物加至1200mL的水。

制备脂质的混合物，其中将甘油一酸酯、单月桂酸1-甘油酯和单肉豆蔻酸1-甘油酯与200g水混合，并加热到70℃至75℃。在70℃至75℃下混合15分钟后，将脂质溶液缓慢冷却到20℃至30℃，以提供β-结晶性甘油一酸酯。采用其余部分的水溶解羟乙基纤维素(例如

)。然后将所述两种混合物或溶液(即甘油一酸酯混合物和羟乙基纤维素混合物)混合，并且喷雾干燥至最终含水量小于5％(例如在底层有液氮的容器中冷冻)。收集产品的冷冻颗粒，并冷冻干燥至含水量小于5％。然后将所述冷冻干燥粉末在包含dHGF的溶液(例如包含大约2.5μg dHGF的适合的缓冲剂)中重构。所述重构产品形成准备局部应用于创伤的凝胶。

实施例4

在本试验中，通过使用差示扫描量热法(DSC)分析制剂在加热时的能量需求来确定各种甘油一酸酯制剂的结晶度。

将包含β结晶性甘油一酸酯和水的乳膏ALL07001(见表1)与粉末ALL07005A和ALL07005F(见表2，其按照实施例2提出的方法制造并在DSC分析前重构)的结晶度进行比较。ALL07005C粉末没有进行重构，并且将其包括其中作为对照。

表1

乳膏组合物

表2

干燥前粉末的组成

成分/粉末	ALL07005A	ALL07005C	ALL07005F
				甘油一酸酯	7％	6％	2％
海藻酸钠	2％	2％	3％
				水	至100％	至100％	至100％

用缓冲剂制造所述ALL07001乳膏。在制造容器中加入水，并且加入盐酸布比卡因和NaCl，并且控制pH值(大约为5)。在机械搅拌下将水相加热至75℃，然后加入脂质。将混合物在75℃下保持15分钟，然后在搅拌的同时将温度相对较快地下降至35℃。然后将制剂在这个温度下保持15分钟，期间发生结晶(直到乳膏变得发亮且高粘性为止)。然后在缓慢搅拌下将温度下降至室温。

将乳膏形式的结晶性甘油一酸酯与干燥海藻酸颗粒在搅拌下混合。由于要冷冻干燥的物质应为液体，因此要加入更多的水。然后使用CO₂(g)作为喷雾气体将混合物在液氮中喷雾冷冻。将氮在-34℃下蒸发3个小时。将混合物冷冻干燥共21小时。

然后通过DSC(Perkin Elmer DSC 7)使用下列程序分析产品和原材料的熔融行为：

冷却至-35℃达5分钟

以10℃/分钟的速度从-35℃加热至80℃。

重构粉末(ALL07005A和ALL07005F)以及乳膏(ALL07001)的熔融点(能量需求的峰值)在大约35℃，这也符合已知的β-结晶性甘油一酸酯在水中的熔融温度(见图1)。非重构粉末的熔融点超过50℃，这也符合干态甘油一酸酯的熔融温度。这些数据表明在干燥过程存留了在乳膏的制造过程中形成的β-结晶性晶体，并且在与水接触后重构。

实施例5

将根据实施例2中所述的方法制备的粉末dHGF制剂用稀释缓冲剂稀释5倍，并且使用商购试剂盒、通过ELISA分析确定dHGF的存在和回收。其结果表明，所述制备方法回收了大于90％的带电dHGF。

实施例6

然后对各种甘油一酸酯对dHGF制剂稳定性的影响进行分析。在该试验中，将包含dHGF和β-结晶性甘油一酸酯的组合物的稳定性与包含dHGF和α-结晶性甘油一酸酯的组合物，以及包含dHGF和非结晶性材料的组合物的稳定性进行比较。

制造下列组合物：

制剂6A*

单月桂酸1-甘油酯      12.6g

单肉豆蔻酸1-甘油酯    38.4

水                    149g

*根据DSC分析，该组合物包含大约80％的β-晶体。

制剂6B**

单硬脂酸1-甘油酯         40g

硬脂酸聚乙醇酯(Myrj 62)  4g

水                       156g

**该组合物包含大约70％的α晶体。

制剂6C***

单油酸1-甘油酯    40g

水               160g

***该组合物为非结晶性。

将制剂在75℃下搅拌加热15分钟，然后缓慢地在20分钟内将其冷却至室温(20℃)，以形成甘油一酸酯晶体。制剂6A和6B为白色乳膏，而制剂6C是半透明的且包含上清液水。所述结晶性结构由微观评价证实。

然后将大约10.0g的制剂6A、6B和6C用包含dHGF的缓冲剂稀释至1∶3，并在2℃至8℃、以及室温(大约20℃)下储存在10ml试管中。在制造并储存7天后将样品取出并冷冻。dHGF的稳定性通过Elisa(B-Bridge)评价并且结果显示在表3中。

表3

在大约20℃下长期储存的dHGF的稳定性

制剂	制造7天后的回收率％	制造后回收的下降率％
			6A	87.5	12.5

6B	78.5	21.5
			6C	60.9	39.1

这些结果提供了有力的证据表明，结晶性甘油一酸酯(尤其是β-结晶性甘油一酸酯)显著提高了包含蛋白质和肽的制剂(特别是包含dHGF制剂)的稳定性和储存性，这继而相对于局部应用而言改善了将特定量的蛋白质选择性地投放和/或输送到靶向位点的能力。这个发现对于像HGF及其变异体(例如dHGF)之类的分子尤为重要，因为许多身体对蛋白质的反应(包括上皮细胞的增殖和扩散)都紧密地受到局部蛋白质的量调节。

实施例7

在对已获得实验性诱导创伤的

SPF小型猪实施的临床前研究中对两种不同的局部用HGF制剂进行评价。因此，将每种制剂施加于4只受到人工创伤的雌性SPF小型猪上，并且随时间的推移监测/测量并评价每个创伤的愈合。

驯化期后，动物的体重约为31.1-37.7kg。在抵达后，通过口服施用(2.0ml/动物)

Ileitis vet(得自Boehringer Ingelheim公司)对全部动物进行接种以对抗细胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)。允许有3周的预处理期(包括5天驯化期)，期间每天观察动物，以便淘汰状态不好的动物。

按照Nayeri的美国专利申请No.10/398,304所述的方法制备第一种dHGF制剂(“标准组合物”)，并且其含有20.9ng/ml dHGF、白蛋白、肝素和稀释缓冲液(见下)

标准dHGF组合物：

治疗1：dHGF 20.9ng/ml

治疗2：dHGF安慰剂(对照)

按照实施例2所述的方法制备本发明的稳定化制剂，其包含10ng/ml dHGF(见下)

稳定化的dHGF组合物：

治疗3：dHGF 10ng/ml

治疗4：dHGF安慰剂(对照)

在施加dHGF产品之前，用无菌水清洗周围皮肤，如有需要的话进行剃毛。此外，用无菌纱布和无菌水轻轻除去前一天给药测试项目的可能残留物(如需要的话)。

关于标准dHGF组合物的测试，在创伤后立即局部施加20.9ng/ml标准组合物，并在以后的14天每天施加在小型猪的圆形全层创伤上(直径20mm)。在这种治疗后，与对照治疗的创伤(安慰剂)相比，没有发现创伤愈合过程的不利影响。观察到了创伤愈合得到轻微改善(见表4)。

关于稳定化的dHGF制剂，结果是显著的(见表4)。在所有创伤中，使用dHGF 10ng/ml制剂治疗的愈合过程是等级最高的，其特征在于所有创伤中都存在有具有良好组织的肉芽组织(在所有创伤中评级都非常高)。在低剂量组(10ng/ml)中，再次形成上皮在14/24创伤中评级非常高，其显著地高于在安慰剂组观察到的结果(对照组中为3/24)。

表4

在小型猪中的创伤愈合效果

因此，本试验表明，与安慰剂相比，稳定化的dHGF制剂在再次形成上皮方面明显更有效；而标准HGF制剂没有该效果。此外，结果表明，稳定化的dHGF制剂相对于安慰剂和标准制剂对创伤愈合具有改善的效果。

Claims (57)

1.一种稳定化的蛋白质组合物，其包含：

具有生物活性的蛋白质或肽；以及

至少一种甘油一酸酯，所述甘油一酸酯的熔融温度大于或等于20℃。

2.权利要求1所述的组合物，其中蛋白质为天然肝细胞生长因子(HGF)的重组形式。

3.权利要求2所述的组合物，其中所述的天然HGF的重组形式为HGF的五氨基酸截短型(dHGF)。

4.权利要求2所述的组合物，其中所述的天然HGF的重组形式选自由NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4组成的组。

5.权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述甘油一酸酯的熔融温度大于或等于25℃。

6.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述甘油一酸酯的熔融温度大于或等于30℃。

7.权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述甘油一酸酯的熔融温度大于或等于35℃。

8.权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含除了所述的至少一种甘油一酸酯之外的抗病原剂。

9.权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述抗病原化合物选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6个碳原子的二醇组成的组。

10.权利要求9所述的组合物，其中所述抗病原剂是布比卡因。

11.权利要求1-10中任一项所述的组合物，其还包含增粘剂。

12.权利要求11所述的组合物，其中所述增粘剂为选自由羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素组成的组中的纤维素衍生物。

13.权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述的至少一种甘油一酸酯具有10、11、12、13、14、15或16碳的碳链长度。

14.一种稳定化的蛋白质组合物，其包含：

配制有具有10、11、12、13、14、15或16碳的碳链长度的β-结晶性甘油一酸酯的dHGF蛋白，其中所述dHGF在所述稳定化的蛋白质组合物中的浓度小于或等于50ng/ml。

15.权利要求14所述的组合物，其中所述制剂包含单月桂酸1-甘油酯或单肉豆蔻酸1-甘油酯或这二者。

16.权利要求14-15中任一项所述的组合物，其还包含增粘剂。

17.权利要求14-16中任一项所述的组合物，其还包含抗菌剂。

18.权利要求17中任一项所述的组合物，其中所述增粘剂是羟乙基纤维素，并且所述抗菌剂是布比卡因。

19.权利要求14-18中任一项所述的组合物，其中所述dHGF在所述稳定化的蛋白质组合物中的浓度小于或等于10ng/ml。

20.一种制备权利要求1-19中任一项所述的组合物的方法，该方法包括：

提供包含dHGF蛋白和至少一种熔融温度大于30℃的甘油一酸酯的溶液；并且

干燥所述溶液以形成干颗粒，其中所述干燥过程保持所述甘油一酸酯的β-结晶性结构。

21.权利要求20所述的方法，其中所述溶液还包含增粘剂。

22.权利要求21所述的方法，其中所述增粘剂为选自由羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素组成的组中的纤维素衍生物。

23.权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述的至少一种甘油一酸酯具有10、11、12、13、14、15或16碳的碳链长度。

24.权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述溶液还包含至少一种单独的或与所述至少一种甘油一酸酯组合的抗病原化合物。

25.权利要求24所述的方法，其中所述抗病原化合物是布比卡因。

26.权利要求24所述的方法，其中所述抗病原化合物选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6个碳原子的二醇组成的组。

27.一种制备权利要求1-19中任一项所述的组合物的方法，该方法包括：

提供包含至少一种熔融温度大于30℃的结晶性甘油一酸酯和增粘剂的溶液；

冷冻喷雾干燥所述溶液以形成干颗粒，其中所述冷冻干燥过程保持所述甘油一酸酯的β-结晶性结构；

提供包含天然HGF蛋白的重组形式的液体；以及

在保留所述的至少一种甘油一酸酯的结晶性结构的条件下，将包含所述HGF蛋白的所述液体与包含所述至少一种甘油一酸酯和增粘剂的所述干颗粒相组合。

28.权利要求27所述的方法，其中所述的天然HGF蛋白的重组形式是dHGF。

29.权利要求27或28中任一项所述的方法，其中所述增粘剂为选自由羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(E464)和羟乙基甲基纤维素组成的组中的纤维素衍生物。

30.权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述的至少一种甘油一酸酯具有10、11、12、13、14、15或16碳的碳链长度。

31.权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述溶液还包含至少一种单独的或与所述至少一种甘油一酸酯组合的抗病原化合物。

32.权利要求31所述的方法，其中所述抗病原化合物是布比卡因。

33.权利要求31所述的方法，其中所述抗病原化合物选自由酰胺型局部麻醉药、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6个碳原子的二醇组成的组。

34.一种使用权利要求1-19中任一项所述的组合物来改善或改良对象的皮肤状况的方法，该方法包括：

确认需要改善或改良皮肤状况的制剂的对象；并且

将权利要求1-19中任一项所述的组合物提供给所述对象。

35.权利要求34所述的方法，其中所述皮肤状况是慢性糖尿病性皮肤溃疡。

36.权利要求34所述的方法，其中所述皮肤状况是裂伤。

37.权利要求34所述的方法，其中所述皮肤状况是创伤。

38.权利要求34所述的方法，其中所述皮肤状况是美容缺陷。

39.权利要求34所述的方法，其中所述皮肤状况是皮肤肿瘤。

40.权利要求34所述的方法，其中所述皮肤状况是基底细胞癌。

41.权利要求34-40中任一项所述的方法，该方法还包括测量所述皮肤状况的改善或改良情况。

42.一种稳定化的蛋白质组合物，其包含：

配制有单月桂酸1-甘油酯和单肉豆蔻酸1-甘油酯的HGF或HGF变异蛋白。

43.权利要求42所述的组合物，其还包含增粘剂。

44.权利要求43所述的组合物，其还包含抗病原剂。

45.权利要求43所述的组合物，其中所述增粘剂是羟乙基纤维素。

46.权利要求44所述的组合物，其中所述抗病原剂是布比卡因。

47.权利要求42-46中任一项所述的组合物，其中所述HGF或HGF变异蛋白选自由NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4或与所述HGF或HGF变异蛋白具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相似性或同源性的蛋白质组成的组，条件是所述相似的或同源的蛋白质保留属于所述HGF或HGF变异蛋白的功能，例如结合cMet受体、上皮细胞促进作用、细胞扩散、诱导细胞生长、抑制上皮细胞促进作用、抑制细胞扩散或抑制细胞生长。

48.一种稳定化的蛋白质组合物，其包含：

配制有单月桂酸1-甘油酯和单肉豆蔻酸1-甘油酯的dHGF蛋白。

49.权利要求48所述的组合物，其还包含增粘剂。

50.权利要求48所述的组合物，其中所述增粘剂是羟乙基纤维素。

51.权利要求48所述的组合物，其还包含抗病原剂。

52.权利要求48所述的组合物，其中所述抗病原剂是布比卡因。

53.一种稳定化的蛋白质组合物，其包含：

配制有单月桂酸1-甘油酯和单肉豆蔻酸1-甘油酯的HGF、NK1、dNK1、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4。

54.权利要求51所述的组合物，其还包含增粘剂。

55.权利要求53所述的组合物，其中所述增粘剂是羟乙基纤维素。

56.权利要求53所述的组合物，其还包含抗病原剂。

57.权利要求48所述的组合物，其中所述抗病原剂为布比卡因。