CN102031232A

CN102031232A - 生产氨基糖的方法及专用菌株

Info

Publication number: CN102031232A
Application number: CN201010531998XA
Authority: CN
Inventors: 王士奎; 刘卫萍; 王金环; 张志民; 胡雪芳
Original assignee: Chinese Academy of Agricultural Engineering CAAE
Current assignee: Chinese Academy of Agricultural Engineering CAAE
Priority date: 2010-11-04
Filing date: 2010-11-04
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2030-11-04
Also published as: CN102031232B

Abstract

本发明公开了一种生产氨基糖的方法及专用菌株。生产氨基糖的专用菌株其保藏编号为CGMCC No.4218。生产氨基糖的方法，包括如下步骤：将生产氨基糖的专用菌株CGMCC No.4218在产酶发酵培养基中28～37℃发酵培养，获得含氨基糖的复合产物；通过非专一性转化酶水解所述含氨基糖的复合产物，过滤，浓缩，干燥得到氨基糖粉末；所述产酶发酵培养基包括如下质量百分含量的物质：1.0～2.0％的淀粉水解物、0.1～0.8％氮源、0.01～0.5％无机盐，0.01～0.1％小分子有机酸，余量为水；所述非专一性转化酶为溶菌酶、复合蛋白酶、蜗牛酶、复合纤维素酶，几丁质酶、壳聚糖酶中的任一种或几种。利用本发明的菌株OLG-1发酵生产氨基糖，糖转化能力高，超过60％，单位发酵液所含氨基糖复合物达每升5-10克原料消耗少，培养条件容易控制。

Description

生产氨基糖的方法及专用菌株

技术领域

本发明涉及一种生产氨基糖的方法及专用菌株。

背景技术

氨基糖广泛存在于动物外骨骼(甲壳类、节肢类)及微生物细胞壁中，目前随着对氨基糖及其寡聚物生物学功能研究与开发的日益深入，氨基糖在医药、食品、农业、化妆品等行业应用越来越广泛。在医药及保健及化妆品等行业方面，有很强的抗氧化性和清除自由基的能力，具有抗衰老的作用，能激活皮肤表层细胞，增强细胞引导免疫细胞的应答，同时具有杀菌功能，从而有协同抑制杀菌效果，修复受紫外线及电焊辐射线损伤的皮肤。防病治病方面，具有降低人体内的胆固醇含量、疏通血管、降低血液粘度、软化血管等作用，并对关节疼痛有良好的舒缓作用，被人们誉为保健长寿食品。在饲料工业上，其作用表现为(1)改善畜禽消化道菌群：由于被肠道内的有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等选择利用，而沙门氏杆菌、大肠杆菌等有害细菌则对其的利用很差，同时使整个肠道的pH下降，抑制有害菌的生长。因此具有促进消化道有益细菌生长，抑制有害微生物的繁殖的功能；(2)提高机体免疫力，具有--定的免疫原性，能够刺激机体免疫应答，可促进有益菌如双歧杆菌等的大量增殖，研究表明双歧杆菌可以提高机体的抗体水平，激活巨嗜细胞的吞噬活性，从而影响机体的免疫功能。在农业上，作为寡糖农药，表现为(1)对细胞的活化作用，诱导内源激素的整体调节。喷施于植物叶面上具有透气、保水之功效，喷施于叶面或施入土壤可促进根系细胞的分生，使根系发达，增强植物抗旱抗倒伏能力，茎节缩短粗壮，叶片浓绿润泽，显著提高光合作用，促进光合产物的定向运输；(2)诱导抗病抗逆性，诱导植物的结构抗病性，如使植物的细胞壁加厚或木质化程度增强；可迅速活化细胞，短时间内诱导植物产生自身多种抗性物质，提高植物的抗病能力和抵御不良环境条件的能力；(3)钝化病毒活性、干扰病毒RNA的合成；作为植物生长调节剂，具有很高的生物活性，可刺激植物体内非特异性活性因子的产生，调节内源激素的平衡，增加产量和品质，减少病虫害，增强作物抗逆性，对环境和作物本身没有任何副作用和污染。

目前氨基糖主要来自于虾蟹壳的收集与水解，由于海洋资源的过渡捕捞，及氨基糖加工处理工艺对环境的严重破坏，面对逐步拓展的氨基糖应用领域，氨基糖的供应将日趋紧张。由此，通过在自然界中筛选高效氨基糖转化菌，通过生物工程技术，将淀粉、蔗糖等普通糖物质通过特定微生物转化为胞外氨基糖生物活性物质，建立温和及环保条件下不受自然界环境控制的稳定的氨基糖(单糖和寡糖)生产新工艺，对氨基糖市场供应将产生重大影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种糖转化能力高的生产氨基糖的方法及专用菌株。

本发明所提供的生产氨基糖的专用菌株，命名为OLG-1已于2010年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.4218。

本发明所提供的生产氨基糖的方法，包括如下步骤：

将生产氨基糖的专用菌株CGMCC No.4218在产酶发酵培养基中28～37℃发酵培养，获得含氨基糖的复合产物；

通过非专一性转化酶水解所述含氨基糖的复合产物，过滤，浓缩，干燥得到氨基糖粉末；

所述产酶发酵培养基包括如下质量百分含量的物质：

0.5～2.0％的淀粉水解物、0.5～1％氮源、0.1～0.5％无机盐，0.01～0.1％小分子有机酸，余量为水；

所述非专一性转化酶为溶菌酶、复合蛋白酶、蜗牛酶、复合纤维素酶，几丁质酶、壳聚糖酶中的任一种或几种。

本发明的生产氨基糖的方法，其中：所述淀粉水解物为葡萄糖或麦芽糖。

本发明的生产氨基糖的方法，其中：所述小分子有机酸为乙酸、乳酸或柠檬酸。

本发明的生产氨基糖的方法，其中：所述产酶发酵培养基pH值为6.0～7.2。

本发明的生产氨基糖的方法，其中：所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸铵、氨基酸或蛋白水解物。

本发明的生产氨基糖的方法，其中：所述水解温度为40℃～50℃，pH为6.0～7.0。

本发明的生产氨基糖的方法，其中：所述非专一性转化酶与含氨基糖的复合产物的体积比(0.1～1)∶10。

本发明的生产氨基糖的方法，其中：所述无机盐包括如下质量百分含量的物质：磷酸二氢钾或磷酸氢二钾0.05～0.1％，氯化钠0.05～0.1％，硫酸镁0.01～0.1％，硫酸亚铁0.01～0.1％，氯化钙0.01～0.1％。

本发明的生产氨基糖的方法，其中：所述生产氨基糖的专用菌株CGMCC No.4218在接入所述产酶发酵培养基前进行扩大培养。

利用本发明的菌株OLG-1发酵生产氨基糖，糖转化能力高，超过60％，单位发酵液所含氨基糖复合物达每升5-10克原料消耗少，培养条件容易控制。发酵及酶解反应的时间短，可在短时间内提高生产效率，节约生产成本。酶解反应条件温和，易于控制反应条件以获得氨基糖及不同分子量分布范围的含氨基的寡聚产物。

具体实施方式

下述实施例中的百分含量如无特殊说明均为质量百分含量。

本发明在特殊土壤环境下筛选出可将淀粉水解物转化成氨基糖的可工业化生产的优良菌株。经过对上述筛选出来的优良菌株OLG-1，在诱导培养基中培养，其具有较高的氨基糖转化活性和十分稳定的遗传性，在15-40℃的条件下密封保存半年以上不失活，初步鉴定其属链球菌属(Streptococcus SP)，其生物学特征如下：

(一)形态染色

菌体呈球形或卵圆形，革兰氏染色阳性菌，直径0.6～1.0um，呈链状排列，短者4～20个细菌组成。幼龄培养物形成的荚膜。无芽胞，无鞭毛。

(二)培养特性

兼性厌氧菌，最适温度37℃，最适PH7.4～7.6，在琼脂平板上形成乳白、光滑、圆形突起小菌落。

(三)生化反应

能利用葡萄糖、麦芽糖、半乳糖等糖类，产酸不产气。

菌株OLG-1已于2010年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.4218。

实施例1、

选择培养基：淀粉水解物2％(葡萄糖)，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾0.1％，氯化钠0.05％，硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙各0.01％，蛋白胨0.5％，pH值7.2。

产酶发酵培养基：淀粉水解物2％(葡萄糖)，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾0.1％，氯化钠0.05％，硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙各0.01％，蛋白胨0.5％，乙酸0.1％，pH值7.2。

将菌株OLG-1接入选择培养基中35℃，培养20小时。将300mL获得的培养液加入300L发酵罐(罐内有上述产酶发酵培养基200L)，35℃发酵20小时，终止发酵，过滤浓缩即得液体型氨基糖复合物。在500L反应釜内，将非专一性转化酶(蜗牛酶)液与10％氨基糖复合物按1∶10体积比混匀，混合液为250L，45℃，pH7.0条件下反应6小时，升温至60℃灭酶活，离心或板框过滤，纳滤超滤浓缩10倍后喷雾干燥得到氨基糖粉末。淀粉水解物转化率大于65％，可获得2.6公斤产物。

经检测氨基糖粉末的结构式为：

实施例2、

选择培养基：淀粉水解物(麦芽糖)0.5％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.05％，硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙各0.01％，pH值7.2。

产酶发酵培养基：淀粉水解物(麦芽糖)1.0％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.05％，氯化钠0.05％，硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙各0.01％，柠檬酸0.01％，pH值6.0。

将菌株OLG-1接入选择培养基中30℃培养28小时，得到扩大菌种。将扩大菌种50公斤加到事先放有300L产酶发酵培养基的500L发酵罐中，35℃，发酵28小时，终止发酵，板框过滤浓缩即得氨基糖复合物。在500L反应釜内，将非专一性转化酶(溶菌酶)液与10％氨基糖复合物按1∶10体积比混匀，混合液为250L，45℃，pH7.0条件下反应3小时，升温至70℃灭酶活，离心或板框过滤，纳滤超滤浓缩10倍后喷雾干燥得到氨基糖粉末。淀粉水解物转化率大于60％，可获得1.8公斤产物。

经检测氨基糖粉末的结构式为

实施例3、

选择培养基：淀粉水解物2％(葡萄糖)，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾0.1％，氯化钠0.1％，硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙各0.01％，蛋白胨0.5％，pH值7.2。

产酶发酵培养基：淀粉水解物(麦芽糖)1.0％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.05％，氯化钠0.05％，硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙各0.1％，乳酸0.1％，pH值6.0。

将菌株OLG-1接入选择培养基，25℃通气培养24小时，得到液体扩大菌种。将扩大菌种加到事先放有700L产酶发酵培养基的发酵罐中，28℃发酵25小时，终止发酵，浓缩后即得氨基糖复合物。在500L反应釜内，将非专一性转化酶(几丁质酶及壳聚糖酶按体积比1∶1混合)液与5％氨基糖复合物按0.1∶10体积比混匀，混合液为250L，50℃，pH6.0条件下反应5小时，升温至70℃灭酶活，离心或板框过滤，纳滤超滤浓缩10倍后喷雾干燥得到氨基糖粉末。淀粉水解物转化率大于60％，可获得4.2公斤产物。

经检测氨基糖粉末的结构式为

实施例4、

选择培养基：淀粉水解物2％(葡萄糖)，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾0.1％，氯化钠0.05％，硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙各0.01％，蛋白胨0.5％，pH值7.0。

产酶发酵培养基：淀粉水解物1.5％，尿素0.5％，磷酸二氢钾0.05％，氯化钠0.05％，硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙各0.01％，柠檬酸0.01％，pH7.0。

将菌株OLG-1在固体选择培养基的斜面上划线培养，25℃培养2天，得到扩大菌种。将扩大菌种接入有2000L产酶发酵培养基的3000L发酵罐中，37℃，发酵30小时，终止发酵，浓缩至原体积1/4时即为氨基糖复合物。将非专一性转化酶(溶菌酶和蜗牛酶按体积比1∶1的混合物)与5％氨基糖复合物溶液混匀按1∶10体积比混匀，温度为40℃，pH6.0条件下酶解4小时，加热至80℃5分钟终止反应。离心除渣，超滤除蛋白质及浓缩糖液，纳滤除单糖及无机盐后，喷雾干燥或真空冷冻干燥得到氨基糖粉末。淀粉水解物转化率大于65％，可获得19.5公斤产物。

经检测氨基糖粉末的结构式为

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.生产氨基糖的专用菌株，其保藏编号为CGMCC No.4218。

2.生产氨基糖的方法，包括如下步骤：

所述产酶发酵培养基包括如下质量百分含量的物质：

3.根据权利要求2所述的生产氨基糖的方法，其特征在于：所述淀粉水解物为葡萄糖或麦芽糖。

4.根据权利要求2或3所述的生产氨基糖的方法，其特征在于：所述小分子有机酸为乙酸、乳酸或柠檬酸。

5.根据权利要求4所述的生产氨基糖的方法，其特征在于：所述产酶发酵培养基pH值为6.0～7.2。

6.根据权利要求5所述的生产氨基糖的方法，其特征在于：所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸铵、氨基酸或蛋白水解物。

7.根据权利要求6所述的生产氨基糖的方法，其特征在于：所述水解温度为40℃～50℃，pH为6.0～7.0。

8.根据权利要求7所述的生产氨基糖的方法，其特征在于：所述非专一性转化酶与5～10％所述含氨基糖的复合产物的体积比(0.1～1)∶10。

9.根据权利要求8所述的生产氨基糖的方法，其特征在于：所述无机盐包括如下质量百分含量的物质：磷酸二氢钾或磷酸氢二钾0.05～0.1％，氯化钠0.05～0.1％，硫酸镁0.01～0.1％，硫酸亚铁0.01～0.1％，氯化钙0.01～0.1％。

10.根据权利要求9所述的生产氨基糖的方法，其特征在于：所述生产氨基糖的专用菌株CGMCC No.4218在接入所述产酶发酵培养基前进行扩大培养。