CN102020717A

CN102020717A - 一种增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子及其制备方法

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Publication number: CN102020717A
Application number: CN 201010533669
Authority: CN
Inventors: 龚卫娟; 杨悌; 潘兴元; 季明春
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2030-11-05
Also published as: CN102020717B

Abstract

本发明涉及一种增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子及其制备方法，所说的活性因子的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。它通过以下方法制得：利用PCR分别扩增出SEQIDNO：2-4的片段，将这三个片段串联插入pQ31载体，各片段中间接上柔性片段；得到融合蛋白表达载体；再将融合蛋白表达载体转化入M15大场杆菌菌株，经IPTG诱导表达，然后洗涤包涵体，变性条件下用Ni⁺-ITA树脂纯化，进一步复性后得到dsNKg2D-IL-15蛋白。本发明能在体外大量表达dsNKg2D-IL-15蛋白，并且表达的蛋白在生理环境下稳定而不降解，具备使肿瘤细胞反式递呈IL-15激活NK细胞的活性。

Description

一种增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型生物活性因子(dsNKG2D-IL-15即双可溶性NK细胞活化性受体NKG2D与细胞因子IL-15)融合蛋白的构建和制备：基于利用肿瘤细胞自身结合、富集、并反式递呈该活性蛋白，不仅直接激活其局部微环境内的NK或细胞毒性T细胞(CTL)，并有望增强体内的特异性免疫应答，将可用于肿瘤的治疗，属于生物技术领域。

背景技术

肿瘤细胞降低HLA I类分子及共刺激分子的表达，逃逸机体内T淋巴细胞的监视，却激活了NK细胞的活性。如果NK细胞表面活化性受体传递的活化性信号强于抑制性受体传递的抑制性信号，NK细胞将被活化，分泌细胞因子及直接杀伤肿瘤细胞，被誉为是机体抗肿瘤的第一道防线。另一方面，肿瘤逃逸NK细胞监视功能的事实以及大量实验依据证明，肿瘤组织内NK细胞的数目及功能均低于正常组织。因此，如何在体内或体外促进NK细胞增殖、并提高NK细胞的生物学活性，决定以NK细胞为基础的肿瘤免疫治疗的效果。

NK细胞主要通过下面四条识别途径而活化：1)非己识别，表现为通过模式识别受体识别一些病原相关的分子模式而被活化。2)应激诱导的识别，即识别肿瘤细胞或病毒感染细胞表面的应激分子，如MICA或ULBP蛋白等，与活化性受体NKg2D结合而激活NK细胞。3)缺失自我的识别，表现为肿瘤细胞或病毒感染的细胞丢失或下调了经典HLAI类分子的表达，引起抑制性信号减弱而使NK细胞活化。4)细胞因子介导的活化，也是NK细胞活化的最有效刺激剂，例如DC细胞来源的IL-15是促进NK细胞增殖、活化及发挥细胞毒效应的关键细胞因子；IL-12是促进NK细胞分泌IFN-γ最有效的细胞因子；而IL-18可能促进NK细胞向淋巴结或脾脏内迁移，并与DC相互作用。

IL-15被誉为是NK细胞的生长因子，也是NK细胞发育分化过程中的关键细胞因子。IL-15与IL-2空间结构相似，含有4个α螺旋，分子量14～15KD。IL-15除其特异性α受体外，与IL-2共有β受体，与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-21共有γ受体。与IL-2相比，IL-15可有效延长NK细胞生命周期，促进记忆性CD8⁺T细胞在体内的长期存活，维持免疫记忆。虽然IL-2已被FDA批准用于转移性肾癌和恶性黑色素瘤的治疗，但IL-2诱导肿瘤抗原限制性T细胞凋亡的特点会降低其抗肿瘤效应。另外IL-2具有抑制记忆性T细胞存活、维持CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的特点，提示用IL-15代替IL-2用于肿瘤治疗，将产生更好的效果。

IL-15及IL-15Rα基因敲除小鼠实验证明IL-15主要被细胞反式递呈而发挥效应，即IL-15被树突状细胞或其他基质细胞分泌后，立即与这些细胞表面的受体α结合(Ka＝10^-11)，再激活表达β与γ受体的邻近细胞(如NK细胞，CD8+T细胞)。而且Lucas等制备可诱导性清除体内CD11c^high DC的小鼠模型，发现淋巴结或脾脏内的DC细胞反式递呈IL-15，是引起NK细胞致敏(细胞浆内储备颗粒酶和干扰素)的必要因素。另外，Kobayashi等将IL-15Rα转染小鼠高转移性结肠腺癌细胞株MC38，移植普通小鼠可抑制肿瘤转移，而移植IL-15基因敲除鼠，短时间内肿瘤转移到肺组织导致小鼠死亡。这些现象提示若建立肿瘤细胞反式递呈IL-15的作用方式，NK细胞不仅高效扩增与活化，还具备靶向抗肿瘤的特点。

若要肿瘤细胞反式递呈IL-15，首要方法是给肿瘤细胞转染IL-15Rα，但如何让体内肿瘤细胞特异性摄取外源性的基因载体，目前的技术手段仍然困难。另一种较为简便的策略是制备某种融合蛋白，既使其氨基端与肿瘤细胞特异性结合，又在羧基端携带IL-15分子，从而具备激活NK细胞的效应。因此，选择合适的在肿瘤细胞与IL-15之间“搭桥”的分子非常关键，既可制备某一肿瘤抗原的单克隆抗体，也可以选取该抗原分子的受体。

MHC I类相关分子A(MHC class I chain-related antigen A，MICA)是机体受到应激反应后表达在细胞表面的一种糖蛋白，在大多数上皮性肿瘤细胞和病毒感染的细胞表面广泛表达，而仅于正常肠道上皮组织中微量表达，成为肿瘤治疗很好的候选靶点。NKg2D为MICA分子的受体，属于C-型凝集素家族成员，1个MICA分子可与两个同源性的NKg2D分子结合，二者之间的亲和力相对较高(K_d为8×10^-7～4×10^-9M)。因此体外制备的NKG2D分子在理论上具备体内靶向识别肿瘤的活性。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种生物活性因子dsNKG2D-IL-15的序列及其制备方法，该方法能在体外大量表达dsNKg2D-IL-15蛋白，并且表达的dsNKg2D-IL-15蛋白在生理环境下稳定而不降解。体内应用时，该活性因子可靶向结合肿瘤细胞，并使肿瘤细胞反式递呈IL-15而激活NK细胞。

本发明的方案是取NKg2D胞外区基因序列，通过柔性片段连接另一段相同NKg2D的胞外区序列，体外表达后可在空间构象上形成二聚体。然后在其羧基端加上IL-15，既靶向识别肿瘤细胞，又可以反式递呈IL-15，达到刺激NK细胞活化和增殖的目的。

本发明所说的增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子，是双可溶性NK细胞活化性受体NKG2D与细胞因子IL-15融合蛋白dsNKG2D-IL-15，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还公开了dsNKG2D-IL-15的制备方法，其步骤如下：

1)dsNKg2D-IL-15表达载体的构建：以原核表达载体pQ31为骨架，利用PCR分别扩增两个相同人NKG2D受体的胞外区片段SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3，将这两个片段先后插入pQ31载体，中间接上柔性片段；然后将IL-15的PCR扩增片段SEQ ID NO：4插入pQ31载体，与上述两个胞外区片段形成串联，中间接上柔性片段，得到融合蛋白表达载体；

2)dsNKg2D-IL-15蛋白的表达和纯化：将上述融合蛋白表达载体转化入M15大场杆菌菌株，经IPTG诱导表达，然后洗涤包涵体，变性条件下用Ni⁺-ITA树脂纯化，进一步复性后得到dsNKg2D-IL-15蛋白。

本发明还通过正交实验摸索出适合该蛋白的特定复性条件：包括所需的最佳离子浓度、缓冲体系和酸碱度，分别为pH7.5，Tris-Base 20mM，Nacl 20mM，甘油10％。大量复性后超滤浓缩，交换在PBS缓冲体系，置于4℃条件下一周，蛋白质无明显沉淀及降解。

得到的dsNKg2D-IL-15蛋白经测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；其中氨基酸残基位置1-3为dsNKg2D-IL-15基因片段插入载体后在连接部位产生的无关序列；氨基酸残基4-142为第一个NKG2D胞外区的序列；165-303为第二个NKG2D胞外区的序列；氨基酸残基326-439为IL-15的序列；氨基酸残基143-162、304-323为柔性片段的序列；氨基酸残基163-164、324-325为两个片段连接时产生的无关序列。

上述复性完全的dsNKg2D-IL-15重组蛋白，利用间接ELISA的方法分别鉴定NKG2D和IL-15抗体结合该重组蛋白的能力；利用夹心ELISA和间接免疫荧光法鉴定该融合蛋白结合MICA配体及超表达在K562细胞表面MICA分子的能力；最后鉴定该蛋白刺激NK细胞活化、分泌IFN-γ及杀伤靶细胞的能力。实验结果证实该体外制备的dsNKg2D-IL-15重组蛋白，具有靶向识别肿瘤细胞表面相应配体及激活NK活化、增殖及杀伤肿瘤细胞的活性。

附图说明

图1.dsNKg2D-IL-15融合基因片段的构建策略图。

图2.dsNKg2D-IL-15蛋白介导肿瘤细胞反式递呈IL-15激活NK细胞的模式图。

图3.pQE31-dsNKG2D-IL-15重组载体经BamH I和Hind III双酶切后的电泳图(1.Marker，2.PQE31-dsNKG2D-IL-15/B+H，3.PQE31-dsNKG2D-IL-15，4.PQE31-dsNKG2D-IL-15，5.PQE31-dsNKG2D-IL-15/B+H)。

图4.利用DNAstar软件分析插入序列和标准序列之间的比对情况。

图5.经不同时间IPTG诱导后重组蛋白表达的电泳图(1.未诱导，2.诱导后4h，3.诱导后5h，4.诱导后6h)。

图6.重组蛋白纯化过程中各步骤收集液体的PGAE电泳结果(1.包涵体，2.上样穿透，3.W1，4.W2，5.E1，6.E2，7.Marker)。

图7.重组蛋白质在不同缓冲体系中的PAGE电泳图(1.Marker，2～10.为表3条件下dsNKg2D-IL-15电泳图)。

图8.显示重组蛋白经超滤管交换缓冲液后的PAGE电泳图(1.纯化后蛋白，2.复性第1天蛋白，3.复性第2天蛋白，4.复性第3天蛋白，5.超滤上液，6.超滤下液，7.Marker)。

图9.NKG2D抗体鉴定重组蛋白的间接ELISA法检测结果。

图10.IL-15抗体鉴定重组蛋白的间接ELISA法检测结果。

图11.夹心ELISA法检测重组蛋白与其配体MICA结合的结果。

图12.流式细胞仪检测不同浓度重组蛋白分别与K562、K562-MICA细胞结合的结果。

图13.流式细胞仪检测可溶性或固定型dsNKg2D-IL-15蛋白对NK细胞表达CD69影响的情况。

图14.流式细胞仪检测可溶性dsNKg2D-IL-15蛋白对NK细胞毒活性和IFN-γ分泌影响的情况。

具体实施方式

1.dsNKg2D-IL-15基因重组表达载体的构建：

11PCR扩增的引物序列：利用生物信息学的手段，分别设计相应的引物(见表1)扩增出sNKG2D(a)、sNKG2D(b)及IL-15的基因片段。在sNKG2D(a)和sNKG2D(b)的下游引物序列上分别加上(Gly4Ser)4的反向互补序列(表中方框内显示)，并考虑到密码子的兼并性原则，提高该蛋白的翻译效率。图1显示dsNKg2D-IL-15融合基因片段的构建策略。

表1.sNKG2D(a)、sNKG2D(b)及IL-15基因扩增的引物序列

sNKG2D(a)的PCR扩增产物序列如SEQ ID NO：2所示，其中第1-6位碱基为BamH I酶切位点的序列；第7位为避免NKG2D发生移码突变而随机加入的核苷酸；第8-425为NKG2D胞外区的基因序列；426-482为柔性片段的基因序列；483-488为Stu I酶切位点序列。

sNKG2D(b)的PCR扩增产物序列如SEQ ID NO：3所示，其中碱基第1-6为Stu I酶切位点序列；7-424为NKG2D胞外区的基因序列；425-484为柔性片段的基因序列；485-490为Pst I酶切位点序列。

IL-15的PCR扩增产物序列如SEQ ID NO：4所示，其中碱基第1-6为Pst I酶切位点序列；7-348为IL-15的基因序列；349-351为终止密码子序列；352-357为HindIII酶切位点序列。

1.2pQ31重组载体的酶切鉴定：上述3段PCR产物各自分别经BamHI/Stu I、StuI/PstI、Pst I和Hind III双酶切后，通过T4连接酶连接，先后插入载体pQE31(pQE31来源于Qiagen公司)。图3显示pQE31-dsNKG2D-IL-15重组载体经BamH I和Hind III双酶切后的电泳结果，结果显示重组基因片段已被稳定插入pQE31载体。

1.3全长片段测序比对：所有片段插入pQ31载体后，再进行插入片段的全部测序，经DNA star软件比对，结果如图4所示，同源性为99％。

2.dsNKg2D-IL-15蛋白的表达、纯化和复性：

2.1重组蛋白IPTG诱导后的小量表达：上述1.2中得到的重组载体转化入M15菌株，经IPTG诱导不同时间后，分别PGAE电泳观察其表达情况，结果如图5所示，dsNKG2D-IL-15蛋白有明显的表达。

2.2重组蛋白经Ni⁺树脂纯化：在确定小量表达后，洗涤包涵体，按下列流程大量制备该重组蛋白。

包涵体洗涤流程：

1)挑取单个菌落至20ml LB培养基(Amp，Kan)中培养摇过夜；

2)将1L培养基预温至37℃；

3)吸取12mL至1L培养基(添加Amp，Kan)中，培养至OD600达0.6。(第一次做，须观察需要多长时间)。吸取1ml菌液，离心，-20℃冻存；

4)添加1M IPTG至终浓度为1mM；

5)37℃摇床培养4小时，吸取0.5ml菌液，离心，-20℃冻存，观察诱导后表达的情况；

6)将1L菌液分装至4个大的离心管中，4000rpm离心15分钟(4℃)；

7)将沉淀用Resuspension Buffer重悬，共60ml(每管15ml)。该溶液可保存于-70℃数周；

8)将细菌悬液置于100ml烧杯中，内置一小磁棒；

9)将烧杯置于磁力搅拌器上，半速旋转；

10)成滴加入细菌裂解液如表2：

表2

试剂名	使用量	终浓度
			50mg/ml溶菌酶	1.2ml	1mg/ml
1.0M MgCl2	300ul	5mM
			2mg/ml Dnase I	1.5ml	0.05mg/ml
Triton-X 100	600ul	1％
			1M DTT	600ul	10mM

11)将60ml的细菌悬液装至玻璃管中，至冰上，超声裂解仪裂解。200W，超10秒，间歇10秒，3～5次，视溶液变清；(可达15次)

12)将60ml的液体转移入5ml的塑料管中，立式离心机最大速度4℃离心10分钟。

13)弃去上清，每管加入1mlWashBuffer，涡旋至悬浮，吸出悬液至50ml塑料管中，加Wash Buffer至总量为15ml，继续涡旋至沉淀完全分散；

14)至冰上继续超声200W，超10秒，间歇10秒，3～5次，视溶液变清；(可达15次)

15)转移至5ml的塑料管中，立式离心机最大速度4℃离心10分钟；

16)弃去上清。(此时观察沉淀是否为白色，上清是否为澄清，必要时重复洗涤步骤)；

17)将沉淀用Wash Buffer without Triton X-100(pH8.0)15ml重悬；

18)转移至5ml的塑料管中，立式离心机最大速度4℃离心10分钟；

19)弃去上清，将沉淀重悬于200～1000ul双蒸水中；

20)糊状物出现后，加入10ml Urea Solution。转移至5ml的塑料管中，立式离心机最大速度4℃离心10分钟；

21)吸取上清至一新塑料管中；

22)吸取2ul至98ul的Urea Solution中，测蛋白浓度；

23)计算蛋白浓度，将蛋白-70℃冻存；

24)取诱导前、诱导后及最终尿素中的样品进行SDS-PAGE电泳。所需试剂：

LB培养基

1.0M IPTG

50mg/ml溶菌酶

1.0M MgCl2

2mg/ml Dnase I配于50％甘油，75mM NaCl

Triton-X 100

1MDTT

Resuspension Buffer(pH8.0)

50mM Tris-HCL(pH8.0)

25％(W/V)蔗糖

1mMEDTA

0.1％叠氮钠

10mM DTT (add fresh)

Wash Buffer(pH8.0)

50mM Tris-HCL(pH8.0)

0.5％Triton-X 100

100mM NaCl

1mMEDTA

0.1％叠氮钠

10mM DTT (add fresh)

Wash Buffer without Triton X-100(pH8.0)

50mM Tris-HCL(pH8.0)

100mM NaCl

1mMEDTA

0.1％叠氮钠

10mM DTT (add fresh)

Urea Solution(pH6.0)

25mM MES(pH6.0)

8M尿素

10mM EDTA

0.1mM DTT (add fresh)

Ni ⁺ -ITA纯化蛋白流程：

1.试剂配方：

Denaturing IMAC lysis buffer 500ml PH 8.0

②Wash buffer1同上

③Wash buffer 2250ml PH 8.0

④Elution buffer 250ml PH 8.0

⑤Cleaning solution I 500ml PH 8.0

⑥Cleaning solution II 500ml PH 4.5

⑦20％酒精保存纯化镍柱

2.纯化步骤：

移开柱子顶盖，把柱子连到层析系统；打开底盖，将柱子排出口连到系统；用2CV(columnvolume)水以10ml/min清除20％乙醇。流速不超过10ml/min。

①平衡水柱10ml超纯水

②Wash buffer 110ml

③上样包涵体蛋白不超过5ml

④Wash buffer 130ml

⑤Wash buffer 230ml

⑥Elution buffer 11ml

⑦Elution buffer 15ml

⑧Cleaning solution I 25ml

⑨Cleaning solution II 25ml

⑩超纯水25ml

最后用乙醇25ml清洗镍柱，并4℃保存。

蛋白最终被洗脱在Elution buffer的下液中，分别取③至⑦下液进行SDS-PAGE电泳。并保存其下液。

3.注意事项

1)、所有Buffer加水到500ml，pH用KOH和H₃PO₄调至8.0，0.2uM滤膜过滤。

denaturing buffers必须现配，7天内用；或-20℃冷冻保存以后用。

2)、还原剂使用2-ME，避免使用DTT，因为DTT会造成Ni/Co离子还原。

3)、在未知His-tag融台蛋白稳定性的情况下，整个纯化过程最好在4℃完成，可以使用蛋白酶抑制剂防止降解，但是EDTA应当在纯化完成以后再加入。

图6显示重组蛋白纯化过程中各步骤收集液体的PGAE电泳结果，在洗脱液E1中重组蛋白可被纯化而获得。

2.3重组蛋白的复性：

2.3.1利用正交实验确定该重组蛋白所需要的缓冲体系、离子浓度和pH值。

1)首先按照表3分别依次配置溶液，调好pH值。

2)分别取出5ml溶液放入离心管中，将包涵体蛋白稀释成2mg/ml，然后每管加入500ul蛋白，放入4度冰箱，12h，24h，48h观察蛋白是否有沉淀析出。

3)48h后将上述离心管放入立式离心机离心，12000rpm 4°离心20min。取上清跑PAGE电泳。图7显示重组蛋白质在不同缓冲体系中的PAGE电泳图，第5泳道内蛋白的量为最大。

表3

试管号

pH值

Tris浓度

Nacl浓度

甘油浓度

1	7	20mM (0.242g)	20mM(0.1168g)	5％
					2	7	20mM (0.242g)	50mM (0.292g)	10％
3	7	20mM (0.242g)	100mM (0.584g)	15％
					4	7.5	20mM (0.242g)	20mM (0.1168g)	10％
5	7.5	20mM (0.242g)	50mM (0.292g)	15％
					6	7.5	20mM (0.242g)	100mM (0.584g)	5％
7	8	20mM (0.242g)	20mM (0.1168g)	15％
					8	8	20mM (0.242g)	50mM (0.292g)	5％
9	8	20mM (0.242g)	100mM (0.584g)	10％

4)根据电泳结果我们选用pH7.5，Tris-Base20mM，Nacl20mM，甘油10％条件作为复性后交换Buffer的配方。

2.3.2dsNKg2D-IL-15重组蛋白稳定复性的流程：

所需试剂：

折叠缓冲液(pH7.5)MW 250ml

4℃预冷。

使用时加：

(取3-4ml折叠缓冲液，作为折叠后测蛋白浓度用)

复性步骤：

(1)将需要折叠复性的蛋白稀释至1.2mg/ml左右后，缓慢滴加进折叠缓冲液中(或用恒流泵最低流速流加)，需加入的总蛋白(约55mg)分三次加(每隔24h，依次加入25mg，15mg，15mg)。

取部分折叠前样品，备SDS-PAGE.

(2)置4℃搅拌，72小时。

(3)将复性后的蛋白溶液转移至50ml离心管中离心3500rpm 30min(去除沉淀，防堵膜孔)。

(4)离心后溶液以装有分子量排限(MWCO)为10KD超滤膜^【1】的超滤浓缩器超滤浓缩。将离心后溶液转入超滤小室中，不装太满，安装好超滤器，接上压力泵，将超滤器放置到4℃搅拌器上，调节转速使旋起的液体约为总量的1/3，适当调节压力泵压力使液体流出速度为1ml/min。

(5)浓缩至20ml左右取出。

留取部分样品备SDS-PAGE。

(6)以1ml Buffer冲洗超滤膜两次。

留取样品，备SDS-PAGE看膜的吸附量。

超滤弃液也取部分备SDS-PAGE。

(7)将浓缩的20ml左右溶液转移至30KD截留离心管^【2】中继续浓缩至约1ml。

留取部分样品备SDS-PAGE，其余冻存至-70℃。

(8)以1ml Buffer或超纯水冲洗超滤膜两次。

留取样品，备SDS-PAGE看膜的吸附量。

截留弃液也取部分备SDS-PAGE。

注意事项：

【1】超滤膜处理：以高压过的超纯水浸泡，至少1h，中间换液至少3次。后以超纯水浸泡4℃过夜平衡。[注意：区分滤膜的光滑面，预处理时将光滑面向下浸于去离子水中，超滤浓缩时将滤膜光滑面向上朝向超滤浓缩液。]

【2】截留离心管(离心式过滤器，Milipore，Amicon Ultra-4)：30KD，出厂时超滤膜上有甘油，使用前用超纯水冲洗即可，若仍对实验有影响，可用0.1NNaOH冲洗后再使用。

使用完以超纯水冲洗，20％乙醇保存。

【3】复性buffer配好后以0.45μm滤膜过滤除去颗粒及絮状物。

【4】复性完成后先离心(7000rpm×30min)再超滤，将管中絮状沉淀离除压实，超滤完

成后需再次离心(7000rpm×1h)，以充分去除絮状物，防堵截留离心管膜孔。

2.3.3使用蛋白前利用超滤管交换Buffer对蛋白进行交换纯化，逐渐转入PBS缓冲体系中。

交换Buffer1： PH7.5 100ml

交换Buffer2： PH7.5 100ml

步骤：

(1)首先取1ml截留产物放入截留离心管内，同时加入9ml Buffer 1，进行离心截留，当离心管内产物剩余1ml时继续加入9ml Buffer 1。当离心管内产物剩下1ml时，留取100ul测定蛋白浓度并跑电泳用。

(2)将前面离心剩余溶液加入9ml Buffer 2进行离心截留，当离心管内产物剩余1ml时继续加入9ml Buffer 2当离心管内产物剩下1ml时，留取100ul测定蛋白浓度并跑电泳用。

(3)将交换所剩蛋白分装并放入-20℃保存，并对蛋白进行ELISA检测。同时将部分蛋白利用0.22um醋酸纤维素膜除菌放入-20℃备用。

图8显示重组蛋白经超滤管交换缓冲液后的PAGE电泳图，第5泳道内即超滤上清内蛋白的浓度最高。

3.dsNKg2D-IL-15蛋白的结构鉴定

3.1NKG2D结构域的鉴定：将重组蛋白按5μg的总量包被在聚苯乙烯塑料板，同时包被牛血清白蛋白(阴性对照)，商品化的NKG2D-Ig蛋白(阳性对照)，加入NKG2D抗体孵育后，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。洗涤后加入底物检测，结果显示重组dsNKG2D-IL-15蛋白可与NKG2D抗体结合。图9为NKG2D抗体鉴定重组蛋白的间接ELISA法检测结果。

3.2IL-15结构域的鉴定：将重组蛋白按5μg的总量包被在聚苯乙烯塑料板，同时包被牛血清白蛋白(阴性对照)，商品化的IL-15蛋白(阳性对照)，加入鼠抗人IL-15抗体孵育后，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。洗涤后加入底物检测，结果显示重组dsNKG2D-IL-15蛋白可与IL-15抗体结合。图10为IL-15抗体鉴定重组蛋白的间接ELISA法检测结果。

3.3融合蛋白结合包被的MICA抗原的活性：为鉴定重组dsNKG2D-IL-15蛋白是否与其配体MICA结合，将本室自行制备的MICA蛋白包被在聚苯乙烯板，加入不同浓度的重组蛋白后，再分别加入NKG2D和IL-15的抗体孵育，通过二抗及底物显色后，测定OD450的吸光度值。结果显示该蛋白可与培养板上MICA抗原结合，且结合后保持了与IL-15抗体的结合能力。而不能NKG2D抗体结合说明MICA抗原和NKG2D的抗体与NKG2D结合时，可能存在空间位阻效应；或二者竞争同一结合部位。图11显示夹心ELISA法检测重组蛋白与其配体MICA结合的结果。

3.4融合蛋白结合K562细胞表面MICA抗原的活性：为进一步鉴定该重组蛋白是否具备结合细胞膜表面MICA抗原的活性，利用本室已经建立的稳定转染并表达MICA抗原的K562细胞株(K562-MICA)，将不同浓度的重组dsNKG2D-IL-15蛋白分别与K562、K562-MICA细胞孵育后，加入PE-NKG2DmAb，流式细胞仪(FCM)检测荧光强度的变化。同时将K562、K562-MICA细胞与PE-MICAmAb抗体孵育，作为阳性对照。结果显示该重组蛋白在10μg/mL时可与细胞膜表面MICA有效结合。图12显示流式细胞仪检测不同浓度重组蛋白分别与K562、K562-MICA细胞结合的结果。

4.dsNKg2D-IL-15蛋白的活性鉴定

4.1重组dsNKg2D-IL-15蛋白刺激NK细胞表达CD69的鉴定：为观察该dsNKg2D-IL-15蛋白是否激活NK细胞，分离正常个体外周血单个核细胞，分别设无刺激及可溶性dsNKg2D-IL-15蛋白、固定型dsNKg2D-IL-15蛋白、IL-15刺激过夜，检测CD56⁺NK细胞表面CD69的表达。结果显示，可溶性和固定型dsNKg2D-IL-15蛋白均可高度活化NK细胞。图13显示流式细胞仪检测可溶性或固定型dsNKg2D-IL-15蛋白对NK细胞表达CD69影响的情况。

4.2重组dsNKg2D-IL-15蛋白刺激NK细胞活性增强的分析：为进一步鉴定该蛋白对NK细胞功能的影响，分离正常个体外周血单个核细胞，分别设无刺激及dsNKg2D-IL-15蛋白、IL-15刺激过夜，胞内染色法检测NK细胞分泌IFN-γ的变化。另外，将受刺激的细胞与K562细胞按3∶1比例孵育，给NK细胞标记CD107a作为评估NK细胞毒活性的一种方法。结果显示，与阳性对照IL-15相似，重组dsNKg2D-IL-15蛋白不仅促进NK细胞分泌IFN-γ，还增强其杀伤靶细胞活性。图14显示流式细胞仪检测可溶性dsNKg2D-IL-15蛋白对NK细胞毒活性和IFN-γ分泌影响的情况。

Claims

1.一种增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子，其特征在于，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1）表达载体的构建：以原核表达载体pQ31为骨架，利用PCR分别扩增两个相同人NKG2D受体的胞外区片段SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，将这两个片段先后插入pQ31载体，中间接上柔性片段；然后将IL-15的PCR扩增片段SEQ ID NO：4插入pQ31载体，与上述两个胞外区片段形成串联，中间接上柔性片段，得到融合蛋白表达载体；

2）蛋白的表达及高效复性：将步骤（1）得到的融合蛋白表达载体转化入M15大场杆菌菌株，经IPTG诱导表达，然后洗涤包涵体，变性条件下用 Ni⁺-ITA树脂纯化，进一步复性后得到dsNKg2D-IL-15蛋白。