CN101654679B

CN101654679B - 一种抗肿瘤融合基因及其表达蛋白与应用

Info

Publication number: CN101654679B
Application number: CN2009100976520A
Authority: CN
Inventors: 沈波
Original assignee: TAIZHOU HOSPITAL OF ZHEJIANG PROVINCE
Current assignee: TAIZHOU HOSPITAL OF ZHEJIANG PROVINCE
Priority date: 2009-04-16
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2029-04-16
Also published as: CN101654679A

Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤融合基因及其表达蛋白与应用。本发明提供了包含人CXCL10-EGF融合基因重组体的构建，以及含该基因的表达型重组体的工程菌中融合蛋白CXCL10-EGF的诱导表达，为重组人CXCL10-EGF融合蛋白的大规模制备、纯化提供了技术路线。本发明还提供了其表达蛋白在抗肿瘤药物中的应用。

Description

一种抗肿瘤融合基因及其表达蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗肿瘤融合基因及其表达蛋白与应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类的常见病。近年来，针对受体、基因或关键物质的靶向性治疗药物成为药物研制的重要方向。这类药物主要靶向作用于相关的肿瘤细胞上，它在提高对肿瘤细胞的杀伤力同时可减少对正常组织细胞的不良作用，被认为是未来癌症治疗中最具前景的研究方向。

CXCL10是指在外源性因素(脂多糖等)或内源性炎性因子(IL-1、IFN-α、IFN-γ)等刺激下，由多种细胞分泌、表达的细胞趋化因子。CXCL10具有显著的抗肿瘤活性，主要包括以下两方面：介导活化的免疫效应细胞(主要是T淋巴细胞及NK细胞)向CXCL10的高浓度区进行定向运动；抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖、分化，抑制肿瘤的增殖及转移。表皮生长因子受体(EGFR)在很多肿瘤细胞表面特异性高表达(可达正常细胞的100倍)，其配体EGF含有三个保守的环状结构，其中第三环是与EGFR结合的部位，又称为EGF受体干扰序列。大量研究已经证实此干扰序列可与EGFR结合，但不具有EGF所具有的刺激肿瘤细胞增殖的活性。

中国专利文献CN 101200502A公开了一种用于治疗人类疾病的干扰素诱导型蛋白-10(IP-10或CXCL10)趋化因子类似物的方法，它们可与以CXCR3受体或IP-10类似物作为配体的任何其他受体相结合，因此此类似物可以作为IP-10趋化因子的激动剂或拮抗剂，也可以被用于预防、治疗、或缓解疾病的症状。

发明内容

本发明涉及CXCL10-EGF融合基因及其可溶性表达和用途，具体包括所述融合基因的PCR扩增、融合基因转入克隆载体、构建融合基因的表达重组体及工程菌、由此工程菌表达的融合蛋白(即重组人CXCL10-EGF融合蛋白)的分离纯化及此蛋白靶向性抗肿瘤的药物用途。

根据EGF受体干扰序列，本发明构建了人CXCL10-loop3-EGF(以下简称：重组CXCL10-EGF)融合基因，并诱导其在大肠杆菌中表达。此融合基因表达的融合蛋白以EGF受体干扰序列编码蛋白作为导向蛋白，既增强此融合蛋白对肿瘤细胞的特异性亲和力，并通过竞争性抑制干扰了天然构象EGF对肿瘤细胞生长、增殖的刺激作用，又融合了CXCL10趋化肿瘤杀伤效应细胞及抑制新生血管的生成的功能，从而更大程度上地发挥了两者的抗肿瘤生物效应。

本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现：

一种抗肿瘤融合基因，其特征在于该融合基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

所述的抗肿瘤融合基因的表达蛋白属于本发明保护范围。

所述抗肿瘤融合基因的表达载体及宿主菌也属于本发明保护范围，表达载体可是包含该抗肿瘤基因的质粒，宿主菌可选用大肠杆菌。

所述的抗肿瘤融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用属于本发明的保护范围。

本发明的详细描述：

1、运用RT-PCR扩增人CXCL10基因

从健康献血者的外周血单个核细胞(PBMC)中提取mRNA，经过RT-PCR反应扩增获得hCXCL10基因片断。琼脂糖凝胶电泳鉴定及扩增产物割胶回收纯化。

2、重组CXCL10-EGF融合基因的获得

设计3条引物：FI、FII和FIII。采用引物搭桥法和两步PCR法以纯化后的hCXCL10为模板扩增融合基因CXCL10-EGF，并将该融合基因与pTG19-T载体连接构建重组pTG19-T-CXCL10-EGF质粒，转化大肠杆菌DH5α，经X-gal和IPTG筛选阳性菌落。

3、构建CXCL10-EGF融合基因的重组表达载体

分别设计上下游引物，菌落PCR扩增CXCL10-EGF基因，经双酶切回收产物片断后与同样经过双酶切的表达载体pET32a(+)体外连接。构建重组pET32a(+)-CXCL10-EGF质粒，转化宿主菌大肠杆菌Origami B(DE3)，筛选阳性克隆；提取重组质粒送DNA测序分析。

4、重组his-CXCL10-EGF融合蛋白在工程菌中的表达

用IPTG诱导重组his-CXCL10-EGF融合蛋白表达；融合蛋白以可溶的形式表达于菌体胞浆中，表达水平达30～40％。SDS-PAGE、Western Blot鉴定表达蛋白正确。

5、融合蛋白his-CXCL10-EGF的纯化、酶切

收集大量表达his-CXCL10-EGF融合蛋白的宿主菌，超声破碎、分离上清中的可溶性表达的融合蛋白，经过镍柱亲和层析纯化融合蛋白，再通过肠激酶酶切去除融合蛋白上his标签、再次过镍柱亲和层析获得不带标签的成熟CXCL10-EGF融合蛋白。

6、通过CXCL10-EGF融合蛋白对活化PBMC的趋化活性实验及HUVEC血管形成抑制实验验证此蛋白的抗肿瘤功能。

本发明提供了一种具有结合EGF受体、干扰EGF对肿瘤细胞的刺激效应，同时又具有CXCL10活性的双功能融合蛋白，为治疗EGFR高表达的肿瘤提供一种新的低毒性高效的靶向性药物。

本发明还提供了包含人CXCL10-EGF融合基因重组体的构建及含该基因的表达型重组体的工程菌诱导表达的方法，为重组人CXCL10-EGF融合蛋白的大规模制备、纯化提供了技术路线。

附图说明

图1是重组pET32a(+)-CXCL10-EGF质粒鉴定图。

图2是重组his-CXCL10-EGF融合蛋白SDS-PAGE图。

图3是重组his-CXCL10-EGF融合蛋白Western Blot图。

图4是重组his-CXCL10-EGF融合蛋白纯化后SDS-PAGE图。

图5是重组his-CXCL10-EGF融合蛋白酶切SDS-PAGE图。

图6是酶切后重组CXCL10-EGF融合蛋白Western Blot图。

图7是HUVEC血管形成抑制实验图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术路线做进一步的阐述，但不仅仅局限于所述的实施例：

实施例1：编码重组人CXCL10-EGF蛋白的基因获得

(1)hCXCL10基因的获得：

健康体检者静脉血5mL，等量生理盐水稀释后，用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集外周血单个核细胞(PBMC)，经IFN-γ(2000U/mL)刺激4h；Trizol抽提细胞总RNA，RT-PCR扩增人CXCL10基因。逆转录反应体系20uL，取1ug总RNA作为模板，用Olig dT为引物，按常规方法进行扩增。根据Genebank上发表的hCXCL10 cDNA序列，利用Primer5.0软件设计PCR引物。上游引物P1：5′-GAGCCTACAGCAGAGGAACC-3′；下游引物P2：5′-TTTGCTCCCCTCTGGTTTTA-3′，其扩增片断包含完整hCXCL10的编码区。PCR反应条件为：95℃5min预变性，94℃45s、58℃45s、72℃1min，30个循环，72℃10min延伸；反应体系为50μL，各成分常规配制，使用的扩增酶是Taq酶。PCR扩增产物以1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并割胶纯化回收得到346bp左右的DNA片断。

(2)重组CXCL10-EG F融合基因的获得：

设计了FI、FII和FIII三条引物，均由上海捷瑞生物公司合成。

上游引物FI为：5’-GTACCTCTCTCTAGAACCGTACG-3’；

下游引物FII为：

5’-TACTGACATCGCTCCCCGATGTAGCCAACAACACAGTTGGAACCACCGCCACCAGGAGATCTTTTA-3’；

下游引物FIII为：

5’-TTATCATTCCCACCACTTCAGGTCTCGGTACTGACATCGCTCCC-3’

采用引物搭桥法和两步PCR法扩增融合基因CXCL10-EGF：首先以纯化后CXCL10基因为模板，以FI、FII为引物，按常规方法进行PCR扩增284bp基因序列；然后以该基因序列为模板，以FI、FIII为引物，用Ex Taq PCR试剂盒再次进行PCR扩增，得到312bp的CXCL10-EGF融合基因，并将该融合基因与pTG19-T载体连接构建重组pTG19-T-CXCL10-EGF质粒。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，经X-gal和IPTG诱导蓝白筛选平板上的白色阳性菌落。挑取白色单克隆菌落转移至5mL LB培养液中37℃摇床摇菌培养8h。

人CXCL 10-EGF融合基因的DNA序列为：

1 gtacctctct ctagaactgt acgctgtacc tgcatcagca ttagtaatca acctgttaat

61 ccaaggtctt tagaaaaact tgaaattatt cctgcaagcc aattttgtcc acgtgtcgag

121 atcattgcta caatgaaaaa gaagggtgag aagagatgtc tgaatccaga atcgaaggcc

181 atcaagaatt tactgaaagc agttagcaag gaaaggtcta aaagatctcc tggtggcggt

241 ggttccaact gtgttgttgg ctacatcggg gagcgatgtc agtaccgaga cctgaagtgg

301 tgggaatgat aa

重组CXCL10-EGF融合基因编码的氨基酸序列为：

VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKK

GEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPGGGGSNCVVGYIGERC

QYRDLKWWE^**

实施例2：融合基因CXCL10-EGF表达型重组体pET32a(+)-CXCL10-EGF的构建

分别设计上下游引物从含有重组pTG19-T-CXCL 10-EGF质粒的阳性菌落中PCR扩增CXCL10-EGF全长基因：p1：5’-GTGGAATTCGTACCTCTCTCTAGAACTGTACGC-3’；p2：5’-TTATCATTCCCACCACTCTCGAGTCT-3’，两端分别引入Ecol I及Xhol I酶切位点，经胶回收后分别以Ecol I及Xhol I双酶切，回收产物片断与同样经双酶切的pET32a(+)载体连接，构建重组pET32a(+)-CXCL10-EGF表达载体。重组pET32a(+)-CXCL10-EGF质粒酶切鉴定结果如图1所示，其中条带1为DNA ladder；条带2为质粒pET32a(+)-CXCL 10-EGF经Ecol I及Xhol I双酶切的图谱。

实施例3：重组his-CXCL10-EGF融合蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

将pET32a(+)-CXCL10-EGF表达载体转化宿主菌大肠杆菌Origami B(DE3)，构建工程菌pET32a(+)-CXCL 10-EGF/OrigamiB(DE3)，将此工程菌接种于5mL LB培养液(含100ug/mL氨苄青霉素)37℃振摇培养过夜，分别取2mL菌液抽提质粒送测序鉴定及10μL重新接种入8mL LB培养液(含100ug/mL氨苄青霉素)37℃振摇培养，至菌悬液OD₆₀₀达到0.6时，取出2mL放入试管1，其余加入终浓度为0.05mmol/L的IPTG于25℃诱导8h，各取出2mL放入试管2及试管3。将试管3的菌液12000rpm离心10min后弃上清，以20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)洗涤3次。以超声裂解缓冲液(含1mmol/L PMSF、1mg/mL溶菌酶、20mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0)1mL悬浮细菌反复冻融3次后进行超声裂菌(超声时间5s，间隔时间5s，功率为400W，共10～20次，视菌体浓度而定)，至菌体清亮为止，12000rpm×10min分别收集上清和沉淀，沉淀加入200uL的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)混匀。以上试管1取全菌、试管3取收集的上清(可溶性表达)和沉淀(包涵体表达)、试管2取全菌分别加入上样缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，100mmol/DDT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)混匀，100℃沸水浴保持10min，10000rpm×3min，取上清(5μl)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。并通过考马斯亮蓝R-250染色后，观察分析，并照相记录重组his-CXCL10-EGF融合蛋白的表达情况(其中his为质粒pET32a(+)上所携带的标签蛋白，用于蛋白纯化)，其SDS-PAGE电泳结果见图2，其中条带1为蛋白Mark，条带2为经IPTG诱导表达的总蛋白(试管2)，条带3为经IPTG诱导呈可溶性表达的总蛋白(试管3上清)，条带4为经IPTG诱导呈包涵体表达的总蛋白(试管3沉淀)，条带5为未经IPTG诱导表达的总蛋白(试管1)。

Western Blot分析：未经IPTG诱导表达的总蛋白(试管1)及经IPTG诱导呈可溶性表达的总蛋白(试管3上清)以12％SDS-PAGE进行电泳以250mA×30min条件，将蛋白转移至PVDF膜上，膜以封闭液(含5％脱脂奶粉和0.5％Tween-20的PBS，pH7.5)于4℃封闭过夜后，加入以封闭液稀释(1∶1000)的小鼠抗人CXCL10单抗，于室温温育2h，用封闭液洗膜3次后加入以封闭液稀释(1∶1000)的HRP-羊抗小鼠IgG于室温孵育2h，分别用TBST(20mmol/L Tris-HCl、500mmol/LNaCl、0.25％Tween-20，pH7.4)及TBS(20mmol/L Tris-HCl、500mmol/LNaCl，pH7.4)洗膜3次后，加入DAB显色液避光显色10min，其WesternBlot结果见图4，其中条带1为蛋白Mark，条带2为未经IPTG诱导，条带3为经IPTG诱导。

实施例4：工程菌的大量培养及重组his-CXCL10-EGF融合蛋白的纯化

(1)工程菌大量培养：

工程菌pET32a(+)-CXCL10-EGF/Origami B(DE3)接种入200ml LB(含100ug/mL氨苄青霉素)培养液中37℃摇床培养。蛋白获取条件及方法同上。

(2)可溶性表达融合蛋白his-CXCL10-EGF的纯化、除盐及浓缩：

将初步纯化的可溶性his-CXCL10-EGF融合蛋白经0.45um滤器过滤后，开始进行镍柱亲和层析，流速调整为每小时10个柱体积。样品与等体积2×结合缓冲液(500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl、20mmol/L咪唑，pH＝7.9)混合后，上经洗涤缓冲液(500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl、20mmol/L咪唑，pH＝7.9)预洗涤5个柱体积的镍亲和层析柱。用4个柱体积的洗脱缓冲液(500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl、200mmol/L咪唑，pH＝7.9)洗脱结合的蛋白，分管收集洗脱蛋白1mL/管，直至流过液A250＜0.01。用6个柱体积的结合缓冲液洗柱。对收集过柱纯化后的样品进行SDS-PAGE电泳鉴定。将鉴定正确的样本管转入截留分子量为5KD的超滤管中以5000g，离心15min除盐及浓缩成(1/20)倍体积，留取浓缩后蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定，鉴定结果如图3所示，其中条带1为蛋白Mark，条带2为纯化后的重组his-CXCL10-EGF(29KD)融合蛋白。

(3)肠激酶酶切及重组CXCL10-EGF融合蛋白纯化、除盐及浓缩：

浓缩后重组his-CXCL10-EGF融合蛋白经蛋白定量后加入肠激酶(每50ug蛋白加入1U肠激酶)，16℃酶切16h切下his标签和硫氧还原蛋白成为成熟的重组融合蛋白CXCL10-EGF。酶切产物过镍亲和层析柱去除his标签，步骤同上，但分管收集的是穿透液。进行SDS-PAGE电泳鉴定；将鉴定正确的样本转入截留分子量为5KD的超滤管中以5000g离心力离心15min除盐及浓缩成(1/20)倍体积。SDS-PAGE电泳鉴定结果见图5，其中条带1为蛋白Mark，条带2为重组his-CXCL10-EGF融合蛋白，条带3为重组his-CXCL10-EGF融合蛋白经肠激酶酶切16h，条带4为重组CXCL10-EGF融合蛋白酶切后过柱纯化产物。

(4)透析：

将浓缩蛋白转入透析袋(截留蛋白分子量为3KD)中，以PB缓冲液(0.2mol/L NaH₂PO₄、0.2mol/L Na₂HPO₄，pH＝7.4)透析24h，每3h更换新的PB缓冲液。透析后蛋白进行Western Blot鉴定，结果如图6，其中条带1为蛋白Mark，条带2为重组CXCL10-EGF融合蛋白。

(6)Transwell细胞趋化实验：

采用密度梯度离心法从人淋巴细胞分离液从外周血中分离PBMC。经PHA(8ug/ml)刺激3d后使其中淋巴细胞活化。根据Transwell趋化小室下层是否培养A431细胞将趋化实验分为2组：(1)A431细胞组：该组又继续分为4组，小室下层分别进行如下处理：实验组加入融合蛋白CXCL10-EGF(100ng/ml)、阻断实验组先加入Human EGF标准蛋白(100ng/ml)4h后换液并加入融合蛋白CXCL10-EGF(100ng/ml)；以上两组细胞于培养3h后均换液以去除处理因素。阳性对照组加入Human CXCL10标准蛋白(100ng/ml)，阴性对照组不加任何蛋白；每组重复3个孔。(2)无A431细胞组：该组又分为3组，小室下层分别进行如下处理：实验组加入融合蛋白CXCL10-EGF(100ng/ml)、阳性对照组加入Human CXCL10标准蛋白(100ng/ml)、阴性对照不加任何蛋白；每组3个孔。在小室上层底部铺Matrigel(100μl/孔，冰上操作)，37℃孵育1h待Matrigel凝固后，在其上加入预先活化的PBMC(5×10⁵/孔，200μL)。根据分组情况进行趋化实验。镜下观察PBMC是否趋化至小室下层，趋化12h后，拍照记录，并收集下层PBMC细胞并计数，计算趋化指数(chemotaticindex，CI)，统计分析趋化效应。CI＝实验组趋化至下室的上层细胞数/对照组趋化至下次的上层细胞数，当CI≥2时判断为有趋化效应，实验结果见表1。

(7)HUVEC血管形成/抑制实验：

按M.Lourdes Ponce的方法进行。加入梯度稀释的重组CXCL10-EGF融合蛋白或Human CXCL10标准蛋白(20ul/孔)：0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml；每个梯度重复3个孔。镜下观察HUVEC形成血管情况，并拍照记录，结果如图7所示，其中A、B、C为CXCL10-EGFC融合蛋白处理组，浓度依次为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml，D、E、F为Human CXCL10蛋白处理组，浓度依次为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。

表1

序列表

<110>浙江省台州医院

<120>一种抗肿瘤融合基因及其表达蛋白与应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>324

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gaattcgtac ctctctctag aactgtacgc tgtacctgca tcagcattag taatcaacct

60

gttaatccaa ggtctttaga aaaacttgaa attattcctg caagccaatt ttgtccacgt

120

gtcgagatca ttgctacaat gaaaaagaag ggtgagaaga gatgtctgaa tccagaatcg

180

aaggccatca agaatttact gaaagcagtt agcaaggaaa ggtctaaaag atctcctggt

240

ggcggtggtt ccaactgtgt tgttggctac atcggggagc gatgtcagta ccgagacctg

300

aagtggtggg aatgataact cgag

324

Claims

1.一种抗肿瘤融合基因，其特征在于该融合基因的核苷酸序列是SEQID NO：1。

2.权利要求1所述的抗肿瘤融合基因的表达蛋白。

3.含有权利要求1所述抗肿瘤融合基因的表达载体。

4.权利要求2所述的抗肿瘤融合基因的表达蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。