CN101993888B - 诱导分泌表达生产重组葎草主要致敏蛋白Hum j 3的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种在酵母系统中诱导表达重组葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的方法，包括：构建表达SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的重组表达载体；线性化重组表达载体，转化感受态酵母细胞；筛选阳性克隆，得重组菌株，并扩大培养；重组菌株的诱导表达以及筛选：Hum j 3蛋白在酵母中以α-factor信号肽蛋白引导的分泌表达；以高活性的重组菌株为种子菌进行高密度的诱导表达重组Hum j 3蛋白；收集培养上清并分离纯化Humj 3。本发明首次在国际上确证了葎草主要致敏蛋白的全基因序列，并首次成功进行了酵母分泌表达，且证实了该重组蛋白具有免疫活性，为葎草花粉过敏患者的分子诊断和临床免疫治疗提供了全新的蛋白。

Description

诱导分泌表达生产重组葎草主要致敏蛋白Hum j 3的方法

技术领域

本发明涉及一种在酵母系统高密度诱导分泌表达葎草花粉主要致敏蛋白的方法，特别是一种在毕赤酵母(Pichia pastoris，KM71H)系统高密度诱导分泌表达葎草花粉主要致敏蛋白的方法Hum j 3的方法以及工程菌。本发明属于基因工程药物和医学诊断制剂领域，该蛋白可能在葎草花粉过敏反应疾病的临床分子诊断、变应原免疫治疗、工业生产以及质控中发挥重要作用。

背景技术

蔷薇亚纲大麻科一年生缠绕草本植物葎草(Humulus japonicus或Humulus scandens)，原产我国，广泛分布于远东地区，我国除新疆、青海以外的各省区均有分布，东亚各国(朝鲜、日本、俄罗斯、越南)以及欧洲、美国西海岸地区亦有分布。上世纪八十年代由北京协和医院牵头的第一次全国性气传致敏花粉调查中，在79个花粉收集点中有53个点可收集到葎草花粉，仅次于蒿属花粉，其分布范围基本上覆盖全国，播散高峰为八、九月。北京协和医院首次发现葎草花粉是我国夏秋季节仅次于蒿属花粉的重要致敏原，是导致临床上出现变应性鼻炎、过敏性结膜炎、花粉性皮炎、季节性哮喘等花粉症症状的重要病因，很大程度上影响了患者的生活质量。

现阶段对于花粉症的诊断和治疗，依赖于特异性变应原疫苗(SpecificAllergenic Vaccines)。变应原疫苗是指包括变应原提取物以及其它成分的生物制剂，可有效用于人类过敏性疾病的诊断、预防和治疗。变应原特异的免疫治疗(Allergen-Specific Immunotherapy，SIT)通过调节抗原提呈细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞的免疫应答以及调节介导变态反应效应细胞的功能和数量，从而减轻患者症状。WHO发布指导文件指出，SIT是唯一能影响过敏性疾病自然病程、有效阻止变应性鼻炎进展为哮喘的治疗方法。

由于重组技术的广泛运用，现阶段有大量重组过敏原成功用于临床变应性疾病免疫诊断和治疗，从而避免了天然变应原成分复杂、难于质量控制、易诱发超敏反应、产量受限的缺点。

由于葎草花粉由于地理分布广、流行病学意义重大而倍受国内外研究者重视。在国内李东栋等对武汉地区葎草花粉变应原蛋白质组分的进行了双向电泳分析，孙秀珍等对葎草花粉变应原致敏组分进行了研究；刘昀等构建葎草和初步鉴定了花粉cDNA表达文库，陶爱林等创建了葎草及豚草过敏原的嵌合基因，并对其抗原性作出评价等等。而在国外，韩国人Park JW于1999首先发现了一分子量为10kDa左右的葎草变应原主要致敏蛋白，葎草过敏患者血清sIgE结合率为72％，并且测定该蛋白的N端序列为NH4⁺-DNXFENGMKAXTSLYDXKYQ-COO^-(X为未鉴定的未知氨基酸)，但该项研究并没有得到该蛋白的全序列。而在GeneBank数据库中，Jin HS与Park JW注册了编号为AY335187的一段葎草致敏蛋白mRNA序列，但没有公开发表的具体文献说明该段序列是通过怎样的技术路线获得的，也没有血清免疫学试验证实该序列对应的蛋白为葎草主要致敏蛋白(需要葎草过敏患者血清sIgE结合率大于50％)，不过由于该序列完整，国际免疫学联合会(IUIS)下属的变应原命名委员会(www.allergen.org)仍然将该蛋白命名为Hum j 1，而且作为葎草花粉变应原主要致敏蛋白。北京协和医院变态反应科尹佳、程璇等纯化了一个葎草花粉致敏蛋白，其过敏患者血清sIgE结合率约为74％，N端序列为NH4⁺-MDNPFENGMKA-COO^-。该序列在分子量、等电点、过敏患者血清sIgE结合率、蛋白N端序列等方面均与1999年韩国人Park JW发现的10kDa的主要致敏蛋白极为接近，但仍没有获得全序列鉴定。

发明内容

鉴于上述不足，本发明人提供一种高密度诱导分泌表达葎草花粉主要致敏蛋白的方法以及工程菌，通过对酵母系统筛选以及诱导表达、纯化工序的选择，生产了具有免疫学和生物学活性的葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3重组蛋白。

为达到上述目的，本发明首先利用3′-RACE技术，设计简并引物，首次在国际上鉴定了该10kDa主要致敏蛋白对应的cDNA全序列，并依据IUIS的变应原命名规则将该蛋白命名为Hum j 3。

本发明诱导分泌表达生产重组葎草主要致敏蛋白Hum j 3的方法，包括如下步骤：

(1)构建表达SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的重组表达载体；

(2)线性化重组表达载体，转化感受态酵母细胞；

(3)筛选阳性克隆，得重组菌株，并扩大培养；

(4)重组菌株的诱导表达以及筛选：Humj 3蛋白在酵母中以α-factor信号肽蛋白引导分泌表达，筛选活性较高的重组菌；

(5)以活性较高的重组菌株为种子菌进行高密度的诱导表达重组Hum j 3蛋白；

(6)收集培养上清并分离纯化Humj 3。

上述步骤1)可以根据SEQ ID NO.2所示氨基酸序列设计编码该序列的核苷酸序列，特别是根据宿主密码子的偏爱性设计相应的核苷酸序列，将该序列插入到适宜的表达载体中，得到重组表达载体。

在本发明的一个实施例中，所述表达载体通过如下方法构建获得：根据葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的蛋白N端序列NH4⁺-MDNPFENGMKA-COO^-，设计上游简并引物F1为5′-ATG GA(C/T)AA(C/T)CC(A/G/C/T)TT(C/T)GA(A/G)AA(C/T)GG(A/G/C/T)ATGAA-3′，其下游通用引物AUAP为：5’-GGC CAC GCG TCG ACT AC-3’，葎草花粉总mRNA逆转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物经回收纯化后，连接入载体，进行T-A克隆，在含有IPTG/X-gal的平板上进行蓝白斑筛选后，挑选白斑用菌落PCR筛选，将阳性重组子用通用测序引物M13F/M13R测序，得到该cDNA序列全长，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，设计上游引物F30：5’-CGT CTC GAG AAA AGA ATGGAT AAT CCC TTC-3’；下游引物R30：5’-CGT CCG CGG TCA TCC TTGCAA ATC ACC ACA-3’，RT-PCR产物经柱纯化后，T-A克隆连接入

载体，重组质粒经Xhol I/Sac II双酶切后，与经过Xhol I/Sac II双酶切的pPICZαA载体相连接，构建成F30R30-pPICZαA重组质粒。

将构建好的F30R30-pPICZαA重组质粒经Sac I酶切线性化，电穿孔转化毕赤酵母，以Zeocin^TM抗生素筛选得到转化的重组菌株。所述毕赤酵母为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，KM71H菌株，基因型为arg4aox1::ARG4，表型为Mut^s，Arg⁺，Zeocin^R，得到的重组菌株命名为Hum j3-pPICZαA-KM71H。

具体所述步骤(3)阳性克隆的筛选方法是用含500，1000，2000μg/mlZeocin^TM抗生素的YPDS平板筛选，置于30℃培养2天，出现菌落者即为阳性克隆。此外还可进一步挑选Mut^s菌落进行酶切鉴定或测序鉴定，所用上游引物5′AOX1：5′-GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC-3′，下游引物3′AOX1：5′-GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC-3′，目的PCR产物大小为849bp，经测序鉴定插入了目的片段。

其中步骤(5)所述高密度诱导表达的方法是：将重组菌株接种于BMGH液体培养基中30℃/2500rpm摇瓶培养10～14h，作为一级种子；将此一级种子按接种量5％接种于BMGH液体培养基中，30℃/2500rpm摇瓶培养16-20h至OD₆₀₀为4-6，作为二级种子；将此二级种子离心，收集菌体，用原体积10％的液体BMMH培养基重悬，30℃/2500rpm摇瓶诱导培养，每隔20～28h添加甲醇至终浓度0.5％，振荡培养90～100h，其中摇瓶培养时培养基体积不超过培养瓶容积的1/10。

其中步骤(6)收集培养上清并分离纯化Hum j 3的方法是：收集培养上清，用分子截留量3.5KDa的透析袋于去离子水中透析20～30h，用抗葎草花粉天然主要致敏蛋白nHumj 3的单抗亲和柱层析，所述单抗优选为杂交瘤细胞(Hum j 3-#87-mAb，该细胞株已于2009年7月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为小鼠杂交瘤细胞，保藏号为：CGMCC No.3208)分泌的单抗。

本发明还提供一种表达Humj 3的基因工程菌，其是通过构建表达SEQID NO.1所示氨基酸序列的重组表达载体，将所述表达载体转化感受态酵母细胞，经筛选得到的阳性克隆。

本发明还提供利用上述方法制备纯化得到的葎草花粉主要致敏蛋白制备得到的各种试剂，其包括：含有纯化的重组葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3的用于诊断葎草花粉过敏的诊断试剂；含有纯化的重组葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的用于检测葎草花粉主要致敏蛋白含量的检测试剂；含有纯化的重组葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的用于免疫治疗葎草花粉主要致敏蛋白过敏病症的药物。

对筛选得到的重组酵母菌株高密度分泌表达，以BMMH诱导培养，解决了本实验室前期以大肠杆菌胞内融合或非融合表达该蛋白不能成功的问题。随后，我们对rHumj 3进行了亲和纯化，所用的单抗(编号#87)是用针对nHum j 3的单抗库筛选而来，从而建立了有效的纯化路线。

本发明的优点：本发明在国际上率先克隆了葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的基因，分析测定了基因的序列，并成功进行了酵母真核表达，本发明还提供了工程菌Hum j 3-pPICZαA-KM71H，该菌株能分泌表达有免疫学活性的rHumj 3蛋白，粗蛋白表达量可以达到100mg/L，且分离纯化步骤简单。本发明为葎草花粉过敏患者的分子诊断和临床免疫治疗提供了全新的蛋白，为后期临床试验打下了良好的基础。因而重组葎草花粉主要致敏蛋白rHum j 3具有巨大的应用前景和市场。

附图说明

图1：3’-RACE法所得目的基因Humj 3的特异性PCR扩增产物(481bp左右)，M为分子量Marker，1为Hum j 3的特异性基因PCR产物。

图2：菌落PCR筛选Hum j 3-pEASY-T3重组质粒。蓝白斑筛选平板上提取白斑1-11，蓝斑12-13。其中2，6，9号菌插入了目的基因片段。

图3：F30R30-pPICZaA与pPICZaA重组质粒的构建以及Sac I酶切线性化过程，M为分子量Marker，1为纯化的Hum j 3PCR产物，2为F30R30-Hum j 3-pCR4-TOPO重组质粒经Xhol I/Sac II双酶切后的F30R30-Hum j 3小片段切胶纯化产物，3为pPICZαA质粒经Xhol I/Sac II双酶切后的大片段，4为重组F30R30-Hum j 3-pPICZαA重组质粒经Sac I酶切线性化片段，5为纯化的F30R30-Hum j 3-pPICZαA重组质粒经Sac I酶切线性化片段，导入KM71H前的检测，6为pPICZαA质粒经Sac I酶切线性化片段，作为阴性对照导入KM71H。

图4：F30R30-pPICZaA-KM71H重组菌与pPICZaA-KM71H阴性对照阳性的菌株筛选。其中1-9为在含有100μg/ml的Zeocin^TM抗生素YPDS平板上生长的F30R30-pPICZaA-KM71H单菌落，10为在该筛选平板上生长的pPICZaA-KM71H单菌落。

图5：巴氏毕赤酵母高表达克隆菌株的Dot-ELISA方法快速筛选结果。图示NC膜上不同克隆的显色强度，其中，6、7、8号克隆被认为是高表达克隆菌株，其显色强度明显高于其它克隆。

图6：SDS-PAGE示不同时间F30R30-pPICZaA-KM71H菌株分泌表达rHum j 3蛋白情况，M为蛋白分子量Marker，1为w22葎草变应原浸液，2为pPICZaA-KM71阴性质控菌株24h诱导后分泌表达蛋白上清液，3为pPICZaA-KM71阴性质控菌株96h诱导后分泌表达蛋白上清液，4为GS115/Albumin阳性质控菌株96h诱导后分泌表达蛋白上清液，5-8分别为重组菌株F30R30-pPICZaA-KM71H于BMMH诱导24h，48h，72h，96h表达蛋白上清液。其中72h和96h诱导时，重组酵母菌株开始表达分子量约为9.6kDa重组蛋白rHum j 3。

图7：Tricine-SDS-PAGE示还原和非还原状态下nHum j 3和rHum j 3的蛋白分子量，M为蛋白分子量Marker(单位kDa)，1为pPICZaA-KM71阴性质控菌株96h诱导后分泌表达蛋白上清液(上样缓冲液中加入DTT)，2为pPICZaA-KM71阴性质控菌株96h诱导后分泌表达蛋白上清液(上样缓冲液中不加入DTT)；3为GS115/Albumin阳性质控菌株96h诱导后分泌表达蛋白上清液(上样缓冲液中加入DTT)，4为GS115/Albumin阳性质控菌株96h诱导后分泌表达蛋白上清液(上样缓冲液中不加入DTT)；5为F30R30-pPICZaA-KM71重组菌株96h诱导后分泌表达蛋白上清液(上样缓冲液中加入DTT)，6为F30R30-pPICZaA-KM71重组菌株96h诱导后分泌表达蛋白上清液(上样缓冲液中不加入DTT)；7为葎草花粉变应原浸液可溶性蛋白(上样缓冲液中加入DTT)，8为葎草花粉变应原浸液可溶性蛋白(上样缓冲液中不加入DTT)。

图8：Western Blotting分析nHum j 3和rHum j 3与葎草过敏患者血清结合的情况。其中，A表示抗原为葎草花粉变应原浸液，B为重组葎草花粉主要致敏原rHum j 3，M为蛋白分子量Marker，A1为葎草花粉浸液Western Blotting后丽春红染色结果，A2为葎草花粉阴性血清池免疫印迹结果，A3-A9为7份葎草过敏患者阳性血清免疫印迹结果，均对9.6kDa蛋白有阳性反应；A10为小鼠单抗的阴性对照，不与葎草9.6kDa蛋白反应，A11-17，分别是针对葎草nHumj 3获得的单抗，编号分别为#50、#59、#66、#67、#68、#87、#92。B1为F30R30-pPICZaA-KM71H菌株表达的包含rHumj 3蛋白的上清分泌液Western Blotting后丽春红染色结果，B2是葎草花粉阴性血清池与rHum j 3免疫印迹结果，B3-B9为相同7份葎草过敏患者阳性血清与rHum j 3免疫印迹结果，B10为小鼠单抗的阴性对照，不与葎草9.6kDa蛋白反应，B11-17分别是编号#50、#59、#66、#67、#68、#87、#92的小鼠单抗与rHumj 3免疫印迹结果。结果显示对葎草变应原浸液9.6kDa蛋白有免疫反应的患者血清与F30R30-pPICZaA-KM71H菌株表达的rHum j 3蛋白也有结合，而与天然nHum j 3反应的7株小鼠单抗中，#66、#68、#87、#92四株单抗与rHum j 3蛋白也有结合。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南(第二版，黄培堂等译，科学出版社，2002)，或按照EasySelect^TM Pichia Expression Kit手册(invitrogen公司，Version H，2005.)，以及相关制造厂商所建议的要求。

实施例1

1.葎草花粉总RNA的提取和cDNA的合成

(1).葎草(Humulus japonicus)花粉总RNA的提取。在2007年9月采集北京郊区新鲜葎草花粉，晴天晾晒干，9号分样筛过滤，丙酮脱脂风干后立即装入瓶中，-80℃冷冻保存。使用

Plant Mini kits(QIAGEN^TM，Catalog No.74903)试剂盒提取葎草花粉总RNA，按照试剂盒操作程序提取。提取时将75mg左右的花粉投入液氮罐中反复研磨，使用试剂盒中的Buffer RLT来破坏花粉组织。得到的总RNA量最后约20-60μg/75mg花粉，A260/A80＝1.81，甲醛琼脂糖凝胶电泳(1.2％琼脂糖)显示rRNA有16S、18S、23S、25S等清晰的条带，显示总RNA质量完好，最后得到的总RNA浓度约为0.9mg/ml。

(2).葎草花粉cDNA的合成。第一链cDNA的合成使用3’RACE Systemfor Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒(Invitrogen^TM，CatalogNo.18373-019)中的SuperScript^TMII RT逆转录酶，按照试剂盒操作程序完成葎草花粉cDNA的合成。简述如下：6μl总RNA(0.9mg/ml)，5μl DEPC处理过的超纯水，1μl AP引物(10μM，)加入200μl EP管，混匀，70℃10min；置冰上冷却至少1min，然后加入10×PCR Buffer 2μl，25mM MgCl₂ 2μl，2.5mM dNTP Mix 1μl，0.1M DDT 2μl，混匀后离心，42℃平衡5min；加入1μl SuperScript^TMII RT逆转录酶使总体积达到20μl，42℃水浴50min；然后70℃15min终止反应，冰上预冷1min后，加入1μl RNase H，混匀离心后置37℃20min以消化RNA，于-20℃冷冻保存逆转录得到的cDNA。该步骤中的AP引物序列为5′-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT TTT TTTTTT TTT TTT TTT T-3′。

2.Hum j 3基因序列(cDNA)的获得与验证

(1).Hum j 3基因序列(cDNA)的获得。该cDNA序列的获得使用3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒(Invitrogen^TM，Catalog No.18373-019)完成。操作简述如下：建立3’RACE的PCR反应体系，取2μl上述合成的cDNA，10×PCR Buffer 5μl，25mM MgCl₂3μl，灭菌双蒸水36.5μl，2.5mM dNTP Mix 1μl，所设计的简并引物F1(10μM)1μl，引物AUAP(10μM)1μl，Taq DNA polymerase(5units/μl)0.5μl，混匀离心，配成50μl反应体系。PCR反应条件为94℃3min变性；94℃45s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下检测到490bp左右的PCR产物。该步骤中简并引物F1序列为5′-ATG GA(C/T)AA(C/T)CC(A/G/C/T)TT(C/T)GA(A/G)AA(C/T)GG(A/G/C/T)ATG AA-3′，下游通用引物AUAP序列为5’-GGC CAC GCGTCG ACT AC-3’。

(2).Hum j 3基因(cDNA)的克隆测序与验证。将上述490bp左右的PCR产物用

Gel Extraction kit(QIAGEN^TM，Catalog No.28704)试剂盒切胶纯化后进行T-A克隆测序。使用Transgen^TM的

载体，进行T-A克隆，在含有IPTG/X-gal的平板上进行蓝白斑筛选后，挑选白斑用菌落PCR筛选，将阳性重组子用通用测序引物M13F/M13R测序，得到该cDNA序列全长，序列信息见附图。使用载体(Transgen^TM)试剂盒进行T-A克隆，所建立的克隆反应体系和操作程序简述如下：上述PCR产物2μl，试剂盒盐溶液1μl，超纯水2μl，

载体1μl，混匀离心该6μl反应体系，室温(22-25℃)反应10min进行载体和目的片段的连接，然后从中取2μl与一管500μl的化学感受态One

TOP10 E.Coli菌株轻轻混匀，冰浴15min，然后42℃准确热激30s(禁止摇晃)，立即置于冰上，然后加入250μl平衡至室温的S.O.C.培养基，37℃/250rpm条件下水平振荡培养1h后，取50μl转化的TOP10 E.Coli菌株均匀涂布于含8μl500mM IPTG以及40μl 40mg/ml X-gal于37℃30min预热的LB培养基上，37℃孵箱过夜培养。次日挑选白斑克隆10个，用通用测序引物M13F、M13R做PCR筛选鉴定，选择大小接近700bp的片段，使用EasyPure PCRPurification Kit(Transgen^TM)进行PCR产物纯化后，用#2号克隆菌株送上海英骏生物技术有限公司测序。所使用的引物M13F：5′-GTA AAA CGACGG CCA G-3′；M13R：5′-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3′。PCR筛选克隆的条件：10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)5μl，2.5mM dNTP Mix 4μl，M13F(10μM)1μl，M13R(10μM)1μl，Taq DNA polymerase(5units/μl)0.5μl，灭菌双蒸水38.5μl，用枪头挑取单克隆菌落，反复吹吸于反应体系中，混匀离心，配成50μl反应体系。PCR反应条件为94℃3min变性；94℃30s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。得到的全部序列图见附表。

3.含有Humj 3基因的分泌性酵母表达重组质粒(Humj 3-pPICZαA)的构建

(1).引物设计与PCR扩增。根据测序得到的Hum j 3cDNA序列设计引物，在5’端加上Xhol I酶切位点，因此上游引物F30设计为5’-CGT CTC GAG AAA AGA ATG GAT AAT CCC TTC-3’(下划线标示的是Xhol I酶切位点)；在3’端加上Sac II酶切位点，因此下游引物R30设计为5’-CGT CCG CGG TCC TTG CAAATC ACC ACA-3’(下划线标示的是Sac II酶切位点，方框标示的是引入终止密码子)。使用QIAGEN^TM的HotStar HiFidelityPolymerase kit(Catalog No.202602)进行高保真的PCR扩增，建立的反应体系为：5×HotStar HiFidelity PCR Buffer(包含dNTPs)10μl，F30(10μM)1μl，R30(10μM)1μl，HotStar HiFidelity DNA Polymerase(2.5units/μl)1μl，cDNA模板2μl，灭菌双蒸水35μl，混匀离心，配成50μl反应体系。PCR反应条件为95℃5min变性；94℃15s，52℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。

(2).目的基因的克隆扩增与纯化。得到的PCR产物经EasyPure PCRPurification Kit(Transgen^TM)柱纯化后，T-A克隆连接入Invitrogen^TM的

载体(TOPO TA

Kit for Sequencing试剂盒)。所建立的克隆反应体系和操作程序简述同步骤2。筛选鉴定阳性克隆后，扩大培养含有F30R30-Hum j 3-pCR4-TOPO重组质粒的TOP10菌株，以Spin Miniprep kit(QIAGEN^TM，Catalog No.27104)试剂盒提取纯化质粒。操作详见说明书。

(3).含目的基因克隆载体的双酶切。将含有目的基因的pCR4-TOPO重组质粒经Xhol I/Sac II(New England BioLabs^TM，Catalog No.R0146/R0157)双酶切，建立如下50μl酶切体系：10×NEB Buffer#45μl，质粒DNA 40μl，Xhol I(20000U/ml)2μl，Sac II(20000U/ml)2μl，H₂O 1μl；酶切条件为37℃2h后，65℃20min灭活。1.5％TAE琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收277bp的添加了Xhol I/Sac II双酶切位点的目的基因。

(4).pPICZαA穿梭质粒的扩增与双酶切。使用EasySelect^TM PichiaExpression Kit(Invitrogen^TM)中的pPICZαA穿梭质粒，转化TOP10F’化学感受态菌株，在含有25μg/ml Zeocin^TM抗生素的LB低盐平板上筛选。经菌落PCR鉴定后，在含有25μg/ml Zeocin^TM抗生素的LB液体培养基中扩大培养。然后用

Spin Miniprep kit(QIAGEN^TM)提取纯化质粒pPICZαA，酶切体系和条件同上。1.5％TAE琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收3522bp的载体片段。上述菌落PCR筛选含pPICZαA质粒菌株条件为：10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)5μl，2.5mM dNTP Mix 4μl，5’AOX1引物(10μM)1μl，3’AOX1引物(10μM)1μl，Taq DNApolymerase(5units/μl)0.5μl，灭菌双蒸水38.5μl，用枪头挑取单克隆Zeocin^R菌落，反复吹吸于反应体系中，混匀离心，配成50μl反应体系。PCR反应条件为94℃3min变性；94℃30s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

(5).目的基因与pPICZαA质粒双酶切片段的连接。建立目的基因和pPICZαA酶切片段的20μl连接体系：10×NEB Buffer 2μl，目的DNA(10ng/μl)8μl，目的载体(20ng/μl)8μl，T₄DNA连接酶(400000U/ml，New England BioLabs^TM，Catalog No.M0202)2μl，室温连接2h，65℃20min灭活。

(6).含F30R30-Hum j 3-pPICZαA重组质粒阳性克隆的筛选与扩大培养：将连接好的F30R30-Hum j 3-pPICZαA重组质粒转化TOP10F’化学感受态菌株，以5’AOX1/3’AOX1为引物做菌落PCR筛选阳性克隆菌株，然后大量提取质粒。菌落PCR和质粒提取的方法同上。

(7).重组质粒F30R30-Hum j 3-pPICZαA与空质粒pPICZαA/的线性化：将用Spin Miniprep kit试剂盒提取的质粒用Sac I内切酶线性化处理。：50μl酶切体系和条件为：10×NEB Buffer 5μl，空质粒/重组质粒DNA(10ng/μl)35μl，Sac I内切酶(400000U/ml，New England BioLabs^TM，Catalog No.R0156)2μl，H₂O 8μl，37℃过夜酶切，65℃20min灭活。然后用乙醇沉淀法纯化线性质粒，以灭菌双蒸水溶解沉淀的DNA，使其浓度为1-2μg/μl。

4.制备酵母感受态细胞(Pichia pastoris，KM71H)

将KM71H酵母菌株接种于装有5ml YPD液体培养基的50ml离心管中30℃过夜培养，取0.5ml过夜培养菌液接种于装有500ml新鲜YPD培养基的2000ml的摇瓶中过夜培养直至OD₆₀₀＝1.3-1.5，然后4℃1500g×5min离心，弃上清，用500ml冰冷的(0℃)灭菌去离子水重悬沉淀，4℃1500g×5min再次离心后，用250500ml冰冷的(0℃)灭菌去离子水重悬沉淀，4℃1500g×5min第三次离心后，用20ml冰冷的(0℃)1M的山梨醇重悬沉淀，4℃1500g×5min第四次离心，最后用1ml冰冷的(0℃)1M的山梨醇重悬沉淀，此时总体积约为1.5-3ml，随后立即进行电击操作。

5.电穿孔将线性化空质粒pPICZαA/重组质粒F30R30-Hum j3-pPICZαA导入酵母感受态细胞。

取80μl感受态酵母细胞，加入10μl(1μg/μl)的空质粒/线性化重组质粒，混匀后，转入冰冷(0℃)的0.2cm的电穿孔杯中，冰浴5min，用Bio-RadGene Pulser电转仪进行电击，条件为电压1500V，电容25μF，电阻400Ω，＞5ms。然后立即往电转杯中加入冰冷(0℃)的1M山梨醇1ml，随后转移至15ml灭菌离心管中，30℃孵育1-2h，不振荡；分别取10，25，50，100，200μl涂布于含100μg/ml，100μg/ml，250μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml的Zeocin^TM抗生素的YPDS平板上，置30℃孵箱培养3-4天直至阳性克隆出现。

6.菌落PCR检测目的基因的整合

用枪头挑去单克隆菌落悬浮于10μl去离子水，加入2.5μl Lyticase(10U/μl，TIANGEN^TM，Catalog No.RT410-01)，30℃孵育10min后置入-80℃10min以裂解酵母。建立50ul筛选重组子的PCR反应体系：10×PCRBuffer(Mg²⁺Plus)5μl，2.5mM dNTP Mix 4μl，5’AOX1引物(10μM)1μl，3’AOX1引物(10μM)1μl，酵母裂解液5μl，灭菌双蒸水33.5μl，混匀，置PCR仪95℃5min后，加入Taq DNApolymerase(5units/μl)0.5μl。PCR反应条件为94℃3min变性；94℃45s，54℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。取5μl PCR产物进行1.5％TAE琼脂糖凝胶电泳鉴定。根据PCR产物分子量大小鉴定外源基因的整合情况。对整合有外源基因的克隆PCR产物纯化后直接用5’AOX1引物/3’AOX1引物测序，验证其与pPICZαA载体的α-factor信号肽同框。

7.阳性克隆的诱导表达以及高表达克隆的筛选

用无菌牙签随机挑取含Zeocin^TM抗生素的YPDS上的47个转化子，接种到MM板上(质量分数1.34％YNB，4×10^-5生物素、0.5％甲醇和1.5％琼脂)，同时接种了不含目的片段的pPICZαA载体的KM71H空白菌株作为克隆对照。待长成直径约2mm的克隆后，将灭菌后的NC膜贴于MM板上，做好标记，倒置30℃继续培养。，待克隆位置被湿透后(约3～4d)，揭下NC膜，37℃干燥，固相抗原斑点。经质量分数3％BSA封闭1.5h，加入抗葎草主要致敏蛋白Hum j 3的小鼠杂交瘤单抗(Hum j 3-#87-mAb，CGMCC No.3208)，37℃1h，洗涤5次，加入1∶1000酶标羊抗鼠IgG二抗，37℃1h，洗涤5次，加入DAB-H₂O₂底物显色，观察斑点颜色深浅。

从以上MM平板上挑选Dot-ELISA普通显色强度的5株阳性克隆(编号1-5)和显色强度最深的3株菌株克隆(编号6、7、8)，经PCR和测序鉴定的整合有Hum j 3基因后，分别接种于5ml BMGH培养基，同时另外接种一株不插入任何外源基因的pPICZaA-KM71阴性质控菌株，30℃/2500rpm振摇12h，取4ml菌种分装保存于含15％甘油的YPD培养基中。另取1ml接种到100ml BMGH培养基中直至OD₆₀₀为4-6左右，1500g×5min离心，弃上清，菌体沉淀用10ml BMMH重悬，每24小时加100％甲醇至终浓度0.5％，诱导4天。每天取样1ml室温1500g×5min离心，将上清和菌体沉淀液氮速冻后，保存于-80℃。

将上述9株菌株分泌的上清液以0.5ug/孔包被于96孔酶标板，4℃12h；5次洗板后；加入100μl以1∶10稀释的20位葎草过敏患者混合血清，37℃反应3h；5次洗板后；加入100μl以1∶2000稀释的HRP标记抗人IgE单抗；5次洗板后在OD492nm处显色。显示菌株#7分泌表达的rHum j 3的蛋白与葎草过敏患者血清中sIgE显色强度明显优于其它菌株(见表1，编号1-8的菌株来自图5所示的克隆。可见6、7、8号克隆的rHum j 3蛋白表达水平的确高于1-5号非高表达克隆)。故经Dot-ELISA筛选得到的菌株#7是高分泌表达的rHum j 3的菌株，将该株命名为F30R30-pPICZaA-KM71(该菌株已于2009年07月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，保藏号为：CGMCC No.3215。)

表1ELISA显示高表达克隆与普通克隆rHumj 3蛋白表达水平的差异

将菌株#7于24h、48h、72h、96h不同表达时间等体积离心得到的分泌蛋白上清经SDS-PAGE后银染，显示最佳诱导时间为96h，与空质粒对照，显示重组酵母菌表达了一分子量约为9.7kDa的外源蛋白，该蛋白约占分泌蛋白总量的30％，表达量100mg/L。所有水平振荡培养时，为保证通气，摇瓶都使用3-4层纱布中间夹一层薄棉绒的形式封口。

8.重组蛋白的质谱鉴定

将诱导表达的上清悬液浓缩20倍，Tricine-SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色，将9.7kDa分子量蛋白切胶，做MOLDI-TOF质谱鉴定。结果显示，表达的外源蛋白正是由鉴定的cDNA推演的蛋白序列。

9.扩大培养表达Hum j 3重组蛋白

成功进行实验室条件下的小体积培养后，确定大体积诱导表达Hum j 3重组蛋白的条件。挑取单克隆重组菌株于装有10ml BMGH培养基的100ml摇瓶中，30℃/2500rpm振摇16-20h直至OD₆₀₀＝5左右；将该10mlBMGH培养液加入到装有1L BMGH培养基的4L摇瓶中，30℃/2500rpm振摇16-20h直至OD₆₀₀＝5左右；室温1500g×5min离心，收获菌体沉淀，用100mlBMMH重悬菌体，置于1L摇瓶中，30℃/2500rpm诱导酵母表达外源蛋白，每隔24h添加100％甲醇500μl(甲醇作为诱导物在培养基中的终浓度为0.5％，V/V)，振荡培养4天(96h)后，离心搜集上清。然后将上清液用3.5KDa cut-off值的透析袋置于去离子水中透析24h，以1.1ml/瓶分装于10ml青霉素小瓶，冻干保存。

10.rHum j 3重组蛋白的纯化

参照200710122175.X公开的方法制备单克隆抗体，选择其中一株综合性状较好的单克隆抗体(#87)用于进一步实验。将编号#87的杂交瘤单抗经Protein G亲和柱(GE Heealth Care，Catlog.17-1128-01)纯化后，以抗体偶联缓冲液(0.2M NH₄HCO₃，0.5M NaCl，pH 8.3)透析所得纯化单抗，以Vivascience Vivaspin 15R(VS15RH21)超滤离心(3000g)，抗体浓度浓缩至10mg/ml。以1mM的冰冷的HCl过NHS-活化的Sepharose HP柱，流速2ml/min，体积40ml。将#87单抗注入NHS-活化的Sepharose HP柱，置入4℃冰箱过夜，充分偶联。然后以3倍柱体积封闭缓冲液(0.2M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 8.3)，以3倍柱体积清洗缓冲液(0.1M乙酸钠，0.5M NaCl，pH4.)过柱封闭。以3倍柱体积的封闭缓冲液和偶联缓冲液分别过柱洗脱，连续两次。不立即进行亲和层析时，以储存缓冲液液(0.2M imidazole，0.5MNaCl，pH 7)保存亲和层析柱。

以流速1ml/min的PBS平衡缓冲液洗柱，以每毫升树脂0.03mg目的蛋白的上样量，1ml/min的流速进样，搜集流出组分。以大约20-30个柱体积的PBS平衡缓冲液洗柱，直至A₂₈₀搜集回复至基线，搜集流出组分。加0.12ml中和缓冲液(2M Tris-HCl，pH 8.6)至20个搜集管中，该步骤对于最大保存蛋白活性有意义。以48ml洗脱缓冲液(0.1Glycerin-HCl pH 2.25)1ml/min，以2.4ml/每搜集管(前述加入中和缓冲液的搜集管)搜集洗脱液。以25ml的清洗缓冲液(100mM的磷酸钠，1.5M NaCl pH7.4)，流速1ml/min洗柱后，以25ml的储存缓冲液液(0.2M imidazole，0.5M NaCl，pH 7)，流速1ml/min洗柱，保存。

11.重组蛋白rHum j 3免疫学活性的鉴定

表达rHumj 3蛋白的免疫学活性以western blotting检测。将冻干的分泌上清蛋白使用灭菌双蒸水按原体积的1/10浓缩复溶，加入2×TricineLoading Buffer(含有终浓度0.2mol/L的DTT)，40℃处理30min，于Tris-tricine缓冲液系统电泳(Tricine Peptide配方：分离胶10％，积层胶4％)，每孔15μl，同时加预染低分子量的蛋白Marker(14-94kDa，Transgen，CatalogNo.DM-111-01)5μl，条件为稳压80V电泳30min直至蛋白进入分离胶后，调至150V直至考马斯亮蓝G-250示踪染料得到凝胶底部，停止电泳。电泳胶一块用考马斯亮蓝染色，一块转印至PVDF膜(0.45μm，Millipore，Catalog No.IPVH00010)用于western blotting检测，所用的一抗是葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3过敏患者血清(经天然蛋白nHum j 3验证有结合的患者血清)，使用时1∶4稀释，室温反应3h后置4℃过夜孵育；二抗是HRP标记的鼠抗人IgE单抗(中国医学科学院基础医学研究所产品)，使用时1∶1000稀释，室温反应3h后用OPD-H₂O₂底物显色系统显色，结果见图8。结果显示对葎草变应原浸液9.6kDa蛋白有免疫反应的患者血清与F30R30-pPICZaA-KM71H菌株表达的rHum j 3蛋白也有结合，而与天然nHum j 3反应的7株小鼠单抗中，#66、#68、#87、#92四株单抗与rHum j 3蛋白也有结合。

实验说明：

1.实验材料

本发明中，所使用的菌株、质粒、引物、工具酶、抗生素、抗体、材料以及试剂等来源、配制方法、相关资料简述如下：

(1).菌株：巴斯德毕赤酵母菌株KM71H、GS115/Albumin，E.Coli菌株TOP10F’、One

TOP10均来自Invitrogen^TM公司，相关基因型和表型见表。

(2).质粒：pPICZαA、

-TOPO质粒均来自Invitrogen^TM公司，

质粒来自Transgen^TM公司。

(3).引物合成与序列信息：均由上海英骏公司完成，使用浓度均为10μM，信息如表。

引物序列信息如下

(4).酶：SuperScript^TM II RT逆转录酶(Invitrogen^TM)、Taq DNA polymerase(Takara^TM)、HotStarHiFidelity DNA Polymerase(QIAGEN^TM)、Xhol I、Sac II、Sac I限制性内切酶(New EnglandBioLabs^TM)、T₄DNA连接酶(New England BioLabs^TM)、Lyticase(TIANGEN^TM)。

(5).抗生素：Zeocin^TM(Invitrogen^TM)、Ampicillin(QIAGEN^TM)

(6).抗体：血清采集自中国医学科学院北京协和医院门诊，葎草过敏患者的诊断标准为：1)典型夏秋季花粉过敏病史：季节性鼻炎、眼结膜炎和或支气管哮喘，夏秋季节(7月～10月)发病；2)葎草花粉浸液皮内试验≥++；3)葎草花粉RAST sIgE≥II级(0.70kU/l)，对葎草主要致敏蛋白过敏患者的确定是以天然蛋白nHum j 3对血清的western blotting结果确认的；HRP酶标鼠抗人IgE二抗为中国医学科学院基础医学研究所免疫室产品。#87mAb为鼠抗nHum j 3单抗，是北京协和医院变态反应分子生物学实验室自行研究生产，HRP酶标羊抗鼠IgG二抗(Santa Cruz Biotechology)。

(7).核酸提取与纯化试剂盒：

Plant Mini kits(QIAGEN^TM)、3’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends(Invitrogen^TM)、Gel Extraction kit(QIAGEN^TM)、EasyPure PCRPurification Kit(Transgen^TM)、

Spin Miniprep kit(QIAGEN^TM)。

(8).分子量Marker：DNA Marker DL2000(100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，Takara^TM公司，)；DL2000 Plus DNA Marker(100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp，Takara^TM公司)；预染低分子量蛋白质分子量标准(14kDa，20kDa，30kDa，40Da，62kDa，100kDa，Transgen^TM)。

(9).化学试剂：YP Base Medium、YP BaseAgar Medium、Yeast Nitrogen Base：美国Invitrogen^TM公司；Peptone、Tryptone、Yeast Extract：英国OXOID；D-Biotin：Japan日本田斌；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二氨基联苯胺、DAB·4HCl琼脂、DEPC、考马斯亮蓝R-250：美国SIGMA；十二烷基硫酸钠：瑞典Pharmacia biotechAB；Tris(MW：121.14)：北京市方润生物中心；Tricine：Amresco公司；公司；甘氨酸：B.M.；丽春红S(Ponceau S)，北京市方润生物中心；β-巯基乙醇：香港Farcochemical supplies；DTT：德国Merck；牛血清白蛋白：江晨生物科技有限公司；溴酚蓝：北京市方润生物中心；TEMED：美国Fluka，北京市方润生物中心；过硫酸胺：美国Amresco；琼脂糖：Amresco公司；甲醇、乙酸(冰醋酸)、盐酸、无水乙醇、50％戊二醛、37％甲醛、硝酸银、无水碳酸钠、Dextrose、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钾、硫代硫酸钠、氯化锂LiCl·H₂O、30％过氧化氢H₂O₂、三氯乙酸、丙三醇(甘油)：北京化学试剂公司；氨基黑10B(amido black 10B)：北京化学试剂三厂。

2.相关溶液和制剂配制与方法

(1).细菌培养基制备

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂20g，用5N NaOH调节pH至7.0，蒸馏水定容至1000ml，于15psi/121℃20min灭菌。用于抗生素筛选时加入Ampicillin至终浓度为100μg/ml；用于蓝白斑筛选时，取8μl 500mM IPTG以及40μl 40mg/ml X-gal均匀涂布于LB培养基上并于37℃30min预热。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，用5NNaOH调节pH至7.0，蒸馏水定容至1000ml，于15psi/121℃20min灭菌。使用时加入Ampicillin至终浓度为100μg/ml。

S.O.C.液体培养基：胰蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl 0.5g，溶解于950ml去离子水中，加入10ml250mmol/L KCl溶液，用5N NaOH调节pH至7.0，去离子水定容至1000ml，于15psi/121℃20min灭菌，待冷却至室温后加入5ml灭菌的2mol/LMgCl₂溶液，20ml过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液。

低盐LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，用5NNaOH调节pH至7.5，蒸馏水定容至1000ml，于15psi/121℃20min灭菌。用于抗生素筛选时加入Zeocin至终浓度为25μg/ml。

低盐LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂15g，用5NNaOH调节pH至7.5，蒸馏水定容至1000ml，于15psi/121℃20min灭菌。用于抗生素筛选时加入Zeocin至终浓度为100μg/ml。

(2).酵母培养基的配制

10×YNB：含硫酸铵、无氨基酸的13.4％酵母基础氮源培养基。134gYNB溶于1000ml水中，过滤除菌，4℃保存。

500×B：0.02％生物素(Biotin)。20mg生物素溶于100ml水中，过滤除菌，4℃保存。

10×D：20％葡萄糖(Dextrose)。200gD-葡萄糖溶于1000ml水中，于15psi/121℃20min高压灭菌。

10×M：5％甲醇(Methnol)。将5ml甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。

10×GY：10％甘油(Glycerol)。100ml甘油和900ml水混匀后，于15psi/121℃20min高压灭菌。

1M磷酸钾缓冲液(potassium phosphate buffer，pH 6.0)。将1mol/L的K₂HPO₄溶液132ml与1mol/L的KH₂PO₄溶液868ml混匀，用磷酸或氢氧化钾调pH＝6.0。

YPD或YPED：Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(1L)。1％Yeast Extract，2％Peptone，2％Dextrose(glucose)。配制方法：溶解10g Yeast Extract，20g Peptone于900ml水中(如制平板加入20g琼脂粉)，于15psi/121℃20min灭菌，加入100ml 10×D。

YPD+Zeocin^TM：1％Yeast Extract，2％Peptone，2％Dextrose(glucose)，100μg/ml Zeocin^TM。配制方法：溶解10g Yeast Extract，20g Peptone于900ml水中(如制平板加入20g琼脂粉)，于15psi/121℃20min灭菌，待冷却至60℃时加入100ml 10×D以及1ml 100mg/ml的Zeocin^TM。

YPDS+Zeocin^TM+Agar：1％Yeast Extract，2％Peptone，2％Dextrose(glucose)，100μg/mlZeocin^TM。配制方法：溶解10g Yeast Extract，20g Peptone，18.2g山梨醇于900ml水中(如制平板加入20g琼脂粉)，于15psi/121℃20min灭菌，待冷却至60℃时加入100ml 10×D以及1ml 100mg/ml的Zeocin^TM。

BMG和BMM：Buffered Minimal Glycerol和Buffered Minimal Methanol(1L)。100mM磷酸缓冲液，1.34％YNB，4×10-⁵％生物素，1％甘油或者0.5％甲醇。配方：灭菌700ml水，冷至室温，加入下列：100ml 1M磷酸钾缓冲液pH6.0，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×GY；制BMM时，加入100ml 10×M取代10×GY，于4℃放置。

(3).Tris-tricine缓冲液系统电泳相关试剂配制：

30％丙烯酰胺单体溶液(单体总百分浓度T＝30.8％，交联百分浓度C＝2.6％)：含30％(w/v)丙烯酰胺Acr和0.8％(w/v)甲叉双丙烯酰胺Bis。Acr 60g，Bis 1.6g，加160ml蒸馏水加热搅拌溶解，再加蒸馏水定容至200ml，过滤。棕色瓶，4℃保存。

阴极缓冲液：Tris 12.11g、Tricine 17.92g、SDS 1g溶于800ml蒸馏水搅拌混匀，再定容至1000ml，不校正PH值，4℃保存。

阳极缓冲液：Tris 24.22g溶于100ml蒸馏水后，用浓盐酸调pH值至8.9，再定容至1000ml。4℃保存。

Tris-Cl/SDS，pH8.45：Tris 91g溶于150ml蒸馏水后，用1mol/L盐酸调pH值至8.45，再定容至250ml。0.45μm滤膜过滤，4℃保存。

4×Tris-Cl/SDS，pH6.8：Tris 6.05g溶于40ml蒸馏水后，用1mol/L盐酸调pH值至6.8，再定容至100ml。0.45μm滤膜过滤，4℃保存。

2×Tricine SDS-PAGE上样缓冲液缓冲液：4×Tris-Cl/SDS，pH6.82ml，SDS 0.8g，甘油2.4ml，DTT 0.31g，考马斯亮蓝G-2502mg，加水补至10ml，-20℃保存。

10％过硫酸胺AP：0.1gAP溶于1ml蒸馏水中，立即使用。

分离胶和积层胶配制：

考马斯亮蓝CBB R-250染色液：蒸馏水45ml，甲醇45ml，冰醋酸10ml，溶解0.25g CBB R-250。室温保存，过滤后可反复使用。

考马斯亮蓝脱色液(体积比为水∶甲醇∶冰醋酸＝9∶9∶2)：蒸馏水450ml，甲醇450ml，冰醋酸100ml。

(4).Western blotting相关试剂配制：

转移缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加蒸馏水定容至1000ml。室温保存。

洗涤缓冲液(0.01mol/l PBS，pH 7.2)：NaH₂PO₄0.438g，Na₂HPO₄2.51g，NaCl 8.76g，加蒸馏水定容至1000ml。4℃保存，临用时加Tween-20配成0.05％Tween-20/PBS。

封闭液兼一抗二抗稀释液(3％BSA/PBST)：现用现配。

染色液：

10×丽春红S染色液：丽春红S 2g，三氯乙酸30g，5-磺基水杨酸30g，加蒸馏水溶解，并定容至100ml。临用时取2ml 10×原液加18ml蒸馏水配成1×溶液使用。4℃保存。

0.5％氨基黑10B：氨基黑10B 0.5g，冰醋酸14ml，加蒸馏水溶解，并定容至100ml。可过滤回收反复使用。室温保存。

0.01mol/l Tris-HCl(pH 7.6)：0.606g Tris溶于400ml水中后，用浓盐酸调pH为7.6，在加水定容至500ml。4℃保存。

0.3％LiCl：100ml蒸馏水中溶解0.3gLiCl，4℃保存。

显色液：临用时配制。0.01mol/l Tris-HCl(pH 7.6)18ml，DAB 12mg，0.3％LiCl 2ml，30％H₂O₂20μl。

(5).DNA测序和蛋白质谱鉴定：DNA测序由上海英骏公司完成，蛋白质谱分析鉴定由北京蛋白质组中心完成。

SEQUENCE LISTING

<110>中国医学科学院北京协和医院

<120>诱导分泌表达生产重组葎草主要致敏蛋白Hum j 3的方法

<130>KHP09112596.3

<160>11

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>261

<212>DNA

<213>Humulus japonicus

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(261)

<400>1

atg gat aat ccc ttc gaa aac ggt atg aaa gca tgc act agt tta tat     48

Met Asp Asn Pro Phe Glu Asn Gly Met Lys Ala Cys Thr Ser Leu Tyr

1               5                   10                  15

gat aag tat tat caa aac tgt gta atg aaa cta ccg cca ggg gca tgt     96

Asp Lys Tyr Tyr Gln Asn Cys Val Met Lys Leu Pro Pro Gly Ala Cys

            20                  25                  30

att gat agt gag aat tat cga aag tgc cta acg aac cat att ggt agc    144

Ile Asp Ser Glu Asn Tyr Arg Lys Cys Leu Thr Asn His Ile Gly Ser

        35                  40                  45

tgc gat att gac acc tgc ttt gaa gac gtt tcg ata gca tgc cgt agt    192

Cys Asp Ile Asp Thr Cys Phe Glu Asp Val Ser Ile Ala Cys Arg Ser

    50                  55                  60

att tat ccg agt aat tat gca gaa tgc gca aca aca cat cat aat atc    240

Ile Tyr Pro Ser Asn Tyr Ala Glu Cys Ala Thr Thr His His Asn Ile

65                  70                  75                  80

tgt ggt gat ttg caa gga tga                                        261

Cys Gly Asp Leu Gln Gly

                85

<210>2

<211>86

<212>PRT

<213>Humulus japonicus

<400>2

Met Asp Asn Pro Phe Glu Asn Gly Met Lys Ala Cys Thr Ser Leu Tyr

1               5                   10                  15

Asp Lys Tyr Tyr Gln Asn Cys Val Met Lys Leu Pro Pro Gly Ala Cys

            20                  25                  30

Ile Asp Ser Glu Asn Tyr Arg Lys Cys Leu Thr Asn His Ile Gly Ser

        35                  40                  45

Cys Asp Ile Asp Thr Cys Phe Glu Asp Val Ser Ile Ala Cys Arg Ser

    50                  55                  60

Ile Tyr Pro Ser Asn Tyr Ala Glu Cys Ala Thr Thr His His Asn Ile

65                  70                  75                  80

Cys Gly Asp Leu Gln Gly

                85

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt tttttttttt               40

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>″n″is for ″C″or″T″

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>″n″is for ″C″or″T″

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>″n″is for″A″or″G″or″C″or″T″

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>″n″is for″C″or″T″

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>″n″is for″A″or″G″

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>″n″is for″C″or″T″

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>″n″is for″A″or″G″or″C″or″T″

<400>4

atgganaanc cnttnganaa nggnatgaa                29

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ggccacgcgt cgactac                             17

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgtctcgaga aaagaatgga taatcccttc               30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cgtccgcggt catccttgca aatcaccaca               30

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gtaaaacgac ggccag                         16

<210>9

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

caggaaacag ctatgac                        17

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gactggttcc aattgacaag c                   21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gcaaatggca ttctgacatc c                   21

Claims (6)

1.一种诱导分泌表达生产重组葎草主要致敏蛋白Hum j 3的方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)构建表达SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的重组表达载体；

(2)线性化重组表达载体，转化感受态酵母细胞；

(3)筛选阳性克隆，得重组菌株，并扩大培养；

(4)重组菌株的诱导表达以及筛选：Humj 3蛋白在酵母中以α-factor信号肽蛋白引导的分泌表达，筛选活性较高的重组菌；

(5)以活性较高的重组菌株为种子菌进行高密度的诱导表达重组Hum j 3蛋白；

(6)收集培养上清并分离纯化Humj 3；

其中步骤(1)所述表达载体的构建方法如下：根据葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的蛋白N端序列NH4⁺-MDNPFENGMKA-COO^-，设计上游简并引物F1为5′-ATG GA(C/T) AA(C/T) CC(A/G/C/T) TT(C/T) GA(A/G)AA(C/T) GG(A/G/C/T) ATG AA-3′，其下游通用引物AUAP为：5’-GGC CACGCG TCG ACT AC-3’，葎草花粉总mRNA逆转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物经回收纯化后，连接入 

载体，进行T-A克隆，在含有IPTG/X-gal的平板上进行蓝白斑筛选后，挑选白斑用菌落PCR筛选，将阳性重组子用通用测序引物M13F/M13R测序，得到该cDNA序列全长，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，设计上游引物F30：5’-CGTCTC GAG AAA AGA ATG GAT AAT CCC TTC-3’；下游引物R30：5’-CGTCCG CGG TCA TCC TTG CAA ATC ACC ACA-3’，RT-PCR产物经柱纯化后，T-A克隆连接入 

载体，重组质粒经Xhol I/Sac II双酶切后，与经过Xhol I/Sac II双酶切的pPICZαA载体相连接，构建成F30R30-pPICZαA重组质粒；

其中步骤(2)所述酵母为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，KM71H菌株，基因型为arg4 aox1::ARG4，表型为Mut^s，Arg⁺，Zeocin^R；

所述步骤(3)阳性克隆的筛选方法是用含100，250，500，1000μg/ml Zeocin^TM抗生素的YPDS平板筛选，置于30℃培养2天，出现菌落者即为阳性克隆；

其中步骤(5)所述高密度诱导表达的方法是：将重组菌株接种于BMGH液体培养基中30℃/2500rpm摇瓶培养10～14h，作为一级种子；将此一级种子按接种量5％接种于BMGH液体培养基中，30℃/2500rpm摇瓶培养16-20h至OD₆₀₀为4-6，作为二级种子；将此二级种子离心，收集菌体，用原体积10％的液体BMMH培养基重悬，30℃/2500rpm摇瓶诱导培养，每隔20～28h添加甲醇至终浓度0.5％，振荡培养90～100h，其中摇瓶培养时培养基体积不超过培养瓶容积的1/10；

其中步骤(6)收集培养上清并分离纯化Hum j 3的方法是：收集培养上清，用分子截留量3.5KDa的透析袋于去离子水中透析20～30h，用抗葎草花粉天然主要致敏蛋白nHum j 3的单抗亲和柱层析，所述单抗为杂交瘤细胞Hum j 3-#87-mAb CGMCC No.3208分泌的单抗。

2.表达Hum j 3的基因工程菌，其是通过构建表达SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的重组表达载体，将所述表达载体转化感受态酵母细胞，经筛选得到的阳性克隆，所述阳性克隆为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)F30R30-pPICZαA-KM71H保藏号为CGMCC No.3215。

3.表达Hum j 3的基因工程菌，其是通过构建表达SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的重组表达载体，将所述表达载体转化感受态酵母细胞，经筛选得到的阳性克隆，所述阳性克隆为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)F30R30-pPICZαA-KM71H保藏号为CGMCC No.3215。

4.一种含有纯化的重组葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的用于诊断葎草花粉过敏的诊断试剂，所述致敏蛋白Hum j 3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种含有纯化的重组葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的用于检测葎草花粉主要致敏蛋白含量的检测试剂，所述致敏蛋白Hum j 3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.一种含有纯化的重组葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的用于免疫治疗葎草花粉主要致敏蛋白过敏病症的药物，所述致敏蛋白Hum j 3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

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