CN102014942B - 用于治疗与鞭毛虫寄生虫有关的人类和动物疾病的葫芦巴提取物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及葫芦巴提取物在制备组合物中的用途，所述组合物用于预防或有效治疗与属于后滴门的有鞭毛的原生动物有关的人类或动物疾病。

Description

用于治疗与鞭毛虫寄生虫有关的人类和动物疾病的葫芦巴提取物
本发明涉及一种葫芦巴提取物，单独使用所述提取物或将其加入到食品添加剂或药物制剂中以治疗与鞭毛虫寄生虫有关的人类或动物疾病。
虽然本发明具体被具体描述为与鞭毛虫寄生虫有关，例如组织滴虫(Histomonas meleagridis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)，但是本发明可以应用于任何结构和生理机能与上述属于后滴门(phylumMetamonada)的寄生虫相似的鞭毛虫寄生虫。
组织滴虫(Histomonas meleagridis)寄生虫是称为组织滴虫病的鸡形目鸟类的传染性寄生虫病的病因。这种病是一种具体在火鸡中传播的盲肠肝炎。这种疾病表现为硫黄色的痢疾，通常导致高死亡率。在头部肉质附属物中观察到的青紫色赋予这种疾病黑头病的名称。其他临床症状为羽毛脱落形成秃斑、厌食、困倦、步态异常、头部低垂或隐藏在翅膀下。从第14天起大量死亡。在不治疗的情况下，超过90％的动物可能死亡。未死亡的鸡形目鸟类，特别是火鸡，相对于临床上未感染的鸟类显示出延迟生长。
已经提出了许多不同的疗法来治疗组织滴虫病：具体而言硝基咪唑，特别是二甲硝咪唑(DMZ)对组织滴虫(Histomonas meleagridis)非常有效。但是，由于其对使用者的毒性，导致这一类分子已经被从市场上撤回了。阿苯达唑和其他苯并咪唑被证明在治疗组织滴虫病方面不起作用。其适用于其他目前授权销售的抗生素，以及诸如罗沙胂的抗球虫药物。此外，还没有进行对减毒株的免疫试验。
鉴于这种情况，仅有的可能预防方法包括隔离物种或使用有效的原生动物驱虫剂。
换言之，本发明的目的在于解决制备用于预防和有效治疗，特别是鸡形目鸟类中的，原生动物组织滴虫(Histomonas meleagridis)的有效制剂的问题。
更具体而言，本发明还与一种生理机能和结构与组织滴虫(Histomonasmeleagridis)相似的有鞭毛的原生动物阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)有关。阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)是一种在人体中生长特别是集中在泌尿生殖器区域的有鞭毛的原生动物。其导致一种称为阴道滴虫病的普遍的性传播的疾病。
对于女性，临床症状表现为急性外阴阴道炎，伴随有连续的泡沫状的带有恶臭的青黄色白带，或伴随灼热感的瓣膜瘙痒。并发症为宫颈瘤和早产。
对于男性，阴道滴虫病是无症状的，这有利于疾病的传播。可能出现尿道炎、附睾炎、前列腺炎和甚至不孕。
目前规定的产品属于咪唑类，具体是甲硝哒唑、氯丙硝唑、塞克硝唑、替诺尼唑和磺甲硝咪唑。虽然有效，但是必须小心使用这些产品，特别是对于怀孕或哺乳期的女性。
总之，要解决的问题在于制备一种制剂，其有效预防和治疗与有鞭毛的原生动物，特别是组织滴虫(Histomonas meleagridis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)有关的人类或动物疾病，另外，其既不是细胞毒性的也不导致突变。
令人惊讶地，就前述原生动物而言，本申请人发现并论证了葫芦巴具有杀死寄生虫或抑制寄生虫的性质，更普遍地涉及所有具有与组织滴虫(Histomonas meleagridis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)相似的结构和生理机能的属于后滴门的有鞭毛的原生动物。
文件JP 2008011731描述了一种含有葫芦巴提取物制剂，其用于治疗小猪痢疾。文件FR-A-2833813描述了一种含有葫芦巴提取物制剂，其用于治疗球虫病。
本发明的目的在于首先使用葫芦巴提取物来得到用于预防或有效治疗与属于后滴门的有鞭毛的原生动物，特别是组织滴虫(Histomonasmeleagridis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)，有关的人类或动物疾病的制剂。
在一个有利的实施方案中，本发明所涉及的有鞭毛的原生动物属于后滴门，包括副基体(Parabasalia)纲和意欧法琳基哑(Eopharyngia)纲。
具体而言，所述提取物用于治疗鸡形目鸟类特别是家禽的组织滴虫病，更具体地用于治疗火鸡的组织滴虫病，以及用于治疗男性和/或女性的阴道滴虫病。
葫芦巴的学名是Trigonella foenum-graecum，其属于豆(Leguminosae)科。原产于北非和地中海盆地，这种一年生植物已经在亚洲，特别是在印度和中国，种植了很长时间。葫芦巴在人类或动物中有许多应用。通常其可以用作补药来刺激食欲和改善消化，用作开胃剂(orexigenic)或用于减轻呼吸道的刺激。最近，研究和临床研究表明葫芦巴可以对调节糖尿病患者血糖浓度作出贡献。
根据本发明，可以使用整个植物或植物的所有部分。
在第一实施方案中，提取物得自种子。有利的是，将种子去皮并且微粉化(至大约为50μm的尺寸)或雾化(至尺寸低于50μm)。
在第二实施方案中，提取物得自预先从发芽后的种子中分离的胚芽。
在实践中，将浸泡去皮的种子或胚芽在室温下搅拌，然后将溶液离心收取上层清液。
必须理解葫芦巴提取物可以以其本身形式使用，或者更有利的是在制剂中，特别是在赋形剂的存在下在更复杂的药物制剂中使用。还可以将其加入到固体食品添加剂或饮料中，特别是水饮料中。
可以在制剂中使用的、特别是固体添加剂形式的成分有，例如，小麦、玉米、大豆、大豆油、棕榈油或矿物盐、氨基酸、维生素和其他碳源，以及更普遍地，任何可以加入到食品中的化合物。
当其在制剂或食品添加剂或饮料中使用时，提取物占制剂重量的0.1％至5％，优选占制剂重量的0.5％至5％。
当在动物体中使用所述提取物来治疗本申请中所述的鞭毛虫寄生虫并且是以固体食品添加剂的形式时，其含量在1～3g/kg添加剂，有利的是2g/kg添加剂。
当在动物体中使用所述提取物来治疗本申请中所述的鞭毛虫寄生虫并且是在饮用水中时，其含量在1～3g/L饮料，有利的是2g/L饮料。
当在人体中使用所述提取物来治疗本申请中所述的鞭毛虫寄生虫并且是固体食品添加剂的形式时，其含量在1～3g/kg添加剂，有利的是2g/kg添加剂。
当在人体中使用所述提取物来治疗本申请中所述的鞭毛虫寄生虫并且是液体制剂形式时，其含量在100～1000μg/mL制剂，有利的是500μg/mL制剂。
所述制剂通常口服施用。在这种情况下，配置的药物通常按所述制剂的0.5％施用。
在阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)的情况下，所述提取物经阴道施用。
如已经指出的，葫芦巴提取物可以用于治疗与有鞭毛的原生动物有关的疾病，除了与前述原生动物有关外，特别是与以下所列原生动物有关的疾病：
-鸡四毛滴虫(Tetratrichomonas gallinarum)、鸟毛滴虫(Trichomonasgallinae)，鸡形目鸟类肠道寄生虫。
-牛毛滴虫(Trichomonas foetus)，牛科动物生殖道的寄生虫。
-马毛滴虫(Trichomonas equi)，马科动物肠道寄生虫。
-旋核鞭毛虫(Spironucleus vortens)，鲑科鱼类寄生虫。
-火鸡六鞭毛虫(Hexamita meleagridis)，鸡形目鸟类寄生虫。
-肠贾第虫(Giardia intestinalis)，人类寄生虫。
通过以下实施例和附图充分地描述本发明和由本发明得到的优势。
图1是本发明的提取物对组织滴虫(H.meleagridis)的体外活性的图示。
图2是比较本发明的提取物与参比制剂对组织滴虫(H.meleagridis)的活性的图示。
图3是比较本发明的提取物与二甲硝咪唑对组织滴虫(H.meleagridis)生长的功效的图示。
图4是比较本发明的提取物与DMZ对与组织滴虫(H.meleagridis)有关的菌群的效果的图示。
图5是比较本发明的提取物与二甲硝咪唑对转移至新鲜培养基中之后的组织滴虫(H.meleagridis)的生长的功效的图示。
图6是比较72小时后本发明的提取物与DMZ对与组织滴虫(H.meleagridis)有关的菌群的效果的图示。
图7是比较本发明的提取物与参比分子在24小时(图7a)和48小时(图7b)的细胞毒性。
图8是24小时后(图8a)和48小时(图8b)后本发明的提取物对阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)的功效。
材料和方法
1.1.提取物的制备
通过研磨去皮的种子来得到葫芦巴提取物，将其微粉化至50μm的颗粒尺寸，然后将其记为S520。将1g这种粉末置于5mL无菌水中(浓度200mg/mL)。将溶液在室温下搅拌过夜，然后在4℃、16100g下离心10分钟。收取上层清液并再次在4℃下、16100g下离心10分钟。然后将上层清液在-80℃下以1mL等分存储。
1.2.培养组织滴虫(Histomonas meleagridis)
从实验性地寄生了组织滴虫(H.meleagridis)卵的火鸡盲肠中分离出组织滴虫(H.meleagridis)菌株。将寄生虫在39℃于装有3mL补充型M199培养基的密封玻璃管中培养。一周将它们转移两次。为此，将80μL的预培养物加入到3mL的在39℃水浴中预热的新鲜培养基中。
补充型M199培养基
-M199        42mL
-马血清      5mL
-稻淀粉溶液  4mL
pH＝7.4
稻淀粉溶液：碳源
-稻淀粉      0.6g
-NaCl        0.325g
-NaHCO3    0.05g
-CaCl2     0.015g
-H2O qsp   50mL
1.3.培养与组织滴虫(H.meleagridis)有关的菌群
取一等分的组织滴虫(H.meleagridis)培养物。在液体胰蛋白胨大豆培养基中制备4个连续稀释液(10-4至10-7)。将20μL的每个稀释液铺展在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上。在37℃下培养过夜。
1.4培养阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)
阴道毛滴虫(T.vaginalis)菌株为ATCC 30243(参比菌株)。在35℃下将寄生虫在过滤后的Hollander培养基中培养。每3天转移一次。为此，将80μL的培养物加入到3mL的在35℃水浴中预热的新鲜培养基中。
Hollander培养基：
-胰蛋白酶解酪蛋白 20.00g
-酵母提取物       10.00g
-麦芽糖           5.00g
-抗坏血酸         1.00g
-KCl              1.00g
-KHCO3            1.00g
-KH2PO4           1.00g
-K2HPO4           1.00g
-FeSO4·7H2O      0.18g
-H2O qsp 1000mL
pH＝6.2
1.5.寄生虫计数
用0.4％的锥虫蓝染色后在马拉赛(Malassez)计数室中进行计数。对计数室的100个区域进行计数。
1.6.抗组织滴虫活性的研究
在不同的浓度下对S520进行测试。培养72小时后进行3次寄生虫计数。通过仅用溶剂(无菌水)代替提取物来制备阴性对比。为了研究计量依赖效应，每个测试使用不同的浓度进行三次，在24小时、48小时和72小时对寄生虫进行计数。通过仅用溶剂代替提取物来制备阴性对比。
1.7.抗毛滴虫活性的研究
在4个浓度下测试S520：1mg/mL、500μg/mL、100μg/mL和50μg/mL。用样品培养24小时、48小时和72小时之后对阴道毛滴虫(T.vaginalis)培养物进行计数。每个试验进行三次。
1.8细胞毒性测试
1.8.1MRC5细胞的培养
在37℃、5％CO2的室内，将MRC5细胞(初级人类胎肺纤维母细胞)在25或75cm2的培养皿中于补充型MEM(最基本培养基，Life TechnologiesGibco公司)中培养。
用胎牛血清(最终10％)、2mM的谷氨酸盐(5mL)、抗生素(5mL盘尼西林/链霉素，即0.1mU/mL，0.5mL氨比西林，即10μg/mL，0.25mL庆大霉素，即25μg/mL)和杀真菌剂(5mL二性霉素，即2.5μg/mL)补充500ml的MEM。
当细胞达到细胞覆盖时，将其胰蛋白酶化并以1～2×105个细胞/孔转移至96孔培养板中。然后，在测试之前，在37℃、5％CO2下培养24小时。
复制培养板用于在24小时和48小时之后进行蛋白质分析。
1.8.2.蛋白质分析
该测试包括在提取物的存在下培养细胞，然后将全部蛋白质沉淀以测定其的浓度。
将MRC5细胞放入200μL的含有不同浓度待测提取物的补充型MEM中。每个提取物在3个浓度下进行测试：2mg/mL、1mg/mL和500μg/mL。每个稀释液进行三次测试，取平均值。
使用两个对比：
-阴性对比：仅在补充型MEM中的细胞
-阳性对比：在补充型MEM与50％DMSO的混合物存在下的细胞
然后将培养板在37℃、5％CO2下培养24小时或48小时。在24小时或48小时后，除去含有提取物的培养基，并用新鲜的培养基代替。用50μL的50％的三氯乙酸(TCA)沉淀出全部蛋白质。在4℃下培养2小时后用自来水清洗板孔。培养板一干燥，就向每个孔中加入0.4％的硫基碱性蕊香红(sulphorhodamine)(SRB)以使蛋白质染色。培养20分钟之后，用1％的乙酸冲洗板孔，并且将蛋白质溶解于10mM的pH值10.5的三羟甲基氨基甲烷(tris-base)缓冲液中。使每个板孔中的物质均匀化，并在记录490nm下的光密度。
1.9回复突变试验
使用一家加拿大公司(EBPI)销售的设备：Muta-ChromoplateTM Kit-S9分析提取物的诱变性。这种显色试验设备基于最通用且有效的细菌回复突变测试，其被称为埃姆斯(Ames)试验。这个测试采用具有组氨酸生物合成操纵子编码突变的鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)的突变体。当这些细菌暴露于诱变剂中时，在特定条件下，发生回复突变并且初始组氨酸营养缺陷型细菌变成原养型的。在用S9激活或者不用S9激活的情况下对产品进行测试。S9是模拟肝脏新陈代谢的鼠类肝脏均浆，并可以对产品及其代谢物进行测试。
在测试的前一天，用培养基将细菌的冻干产物再水化，然后在37℃下培养16至18小时。根据设备说明制备反应介质和S9混合物。向所有含有待测提取物的试管中加入反应介质。仅向在激活条件下测试提取物的试管中加入S9。向除了无菌对比之外的每个试管中加入5μL的鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)(TA100)。向96孔培养板的每个孔中移入200μL的混合物：1个用于每个对比的培养板和2个用于每个提取物的培养板(一个活化的，一个未活化的)。用盖子将培养板封闭，放入无菌塑料袋中以保持湿度并在37℃下培养5天。
使用5个对比：
-无菌对比(空白)：只有反应介质
-未活化的自然回复突变对比(背景1)：细菌和反应介质
-活化的自然回复突变对比(背景2)：细菌、S9混合物和反应介质
-未活化的带有诱变剂的对比(标准诱变剂1)：细菌、诱变物质(叠氮化钠NaN3)和反应介质
-活化的带有诱变剂的对比(标准诱变剂2)：细菌、诱变物质(2-氨基-蒽)、S9混合物和反应介质
2/结果
2.1.S520的抗组织滴虫活性
如图1所示，从1mg/mL和从24小时起S520具有杀组织滴虫作用。在500μg/mL的条件下S520减缓寄生虫的增殖(在72小时：抑制51％)。效果是剂量依赖性的。
还进行了与以下用于抗组织滴虫病的物质的功效对比：
Figure BPA00001253390600091
(Santamix公司)、
Figure BPA00001253390600092
(Prisma公司)和硝呋索尔(Nifursol)(图3)。结果用相对于对比的生长百分比表示。
如图2所示，从1mg/mL起
Figure BPA00001253390600093
是抑制组织滴虫的(在72小时：2mg/mL的条件下抑制88％，在1mg/mL的条件下抑制50％)。未发现
Figure BPA00001253390600094
对组织滴虫(H.meleagridis)的增殖有明显的效果。在2mg/mL的条件下硝呋索尔有轻微的抑制组织滴虫的效果(在72小时：抑制38％)。
因此，在相同的浓度下，S520是抑制组织滴虫(H.meleagridis)增殖最有效的提取物。
最后，对S520进行与二甲硝咪唑(DMZ)平行的测试。结果如图3所示。如图所示，DMZ在25μg/mL的条件下是杀寄生虫物质，同时DMZ是抑制寄生虫的。
然后对比培养48小时后不同浓度的S520和DMZ对相关细菌群的作用。结果以每mL细菌的数量表示(图4)。S520提取物从1mg/mL起有杀死组织滴虫的作用。其对相关细菌群没有效果。二甲硝咪唑在72小时从25μg/mL起有杀死组织滴虫作用。另一方面，其从400μg/mL起有杀菌作用。
用S520和DMZ处理72小时后，将寄生虫放入新鲜的培养基中96小时从而分析杀死组织滴虫效果(图5)。
S520：在2mg/mL的条件下没有培养物再生长，但是在1mg/mL和500μg/mL的条件下发生再生长。这证实S520在2mg/mL的条件下有杀死组织滴虫的作用。在1mg/mL的条件下有少量寄生虫存活，因此其是抑制组织滴虫的而不是杀死组织滴虫的。
DMZ：在1mg/mL和400μg/mL的条件下没有培养物再生长，但在25μg/mL(但相对于对比仅仅约30％的生长)和12.5μg/mL的条件下再生长。
这证实DMZ从500μg/mL起有杀死组织滴虫作用。其似乎仅在25μg/mL的条件下是抑制组织滴虫的，因为培养物的再生长表明一些寄生虫在处理过程中存活。应当注意，在400μg/mL的条件下DMZ对相关的菌群起作用(图4)。
对相关细菌群超过72小时的研究表明不同浓度的S520对这个菌群不起作用(图6)。
2.2.细胞毒性测试
对MRC5细胞培养物进行测试。将提取物与以下三种不同物质进行对比：
Figure BPA00001253390600101
和硝呋索尔。每个提取物我们测试4个浓度：2mg/mL、1mg/mL、500μg/mL和100μg/mL(图7a和图7b)。仅被认为是细胞毒性的，因为在500μg/mL的条件下，从细胞培养24小时起，其导致比对比低60％的细胞生长。S520对培养物中的人体细胞无毒性。这对于
Figure BPA00001253390600103
和硝呋索尔也是一样。
2.3.回复突变测试
对于在产肉的家禽饲养中使用的S520而言，必须确保其不导致突变(并因此致癌)。因此在2mg/mL、1mg/mL和500μg/mL的条件下对S520进行测试。
结果如下表所示：
在不用S9活化的情况下，自然回复突变率为54.2％。对于测试的三个浓度的S520，得到较低的自然回复突变率。
在用S9活化的情况下，自然回复突变率为84.4％。S520仍然给出较低的比率。因此，无论活化与否，S520都不导致突变。
2.4S520的抗阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)活性
对于每个测试制备加入寄生虫的Hollander培养基混合物：
35℃下24体积的补充型Hollander培养基+1体积的阴道毛滴虫(T.vaginalis)培养物。
在4个浓度下对S520进行测试：1mg/mL、500μg/mL、100μg/mL和50μg/mL。
在24小时、48小时和72小时后对阴道毛滴虫(T.vaginalis)培养物进行计数。
每个实验进行3次。
结果(图8和图9)表明S520从500μg/mL起是杀死毛滴虫的(在72小时与对比相比生长1％)。
从100μg/mL起其是抑制毛滴虫的(在72小时与对比相比生长5％)。
通过之前的说明充分地描述了本发明和因而产生的优势。特别是当提取物为微粉化的去皮种子的形式时，应当注意葫芦巴提取物对鞭毛虫寄生虫的功效。
因此，所述提取物可以用于治疗诸如特别是鸡形目鸟类的组织滴虫病的疾病，所述鸡形目鸟类具体是火鸡。其还可以用于治疗人类的阴道滴虫病。在所有情况下，其不仅有效，而且不导致突变，也不是细胞毒性的。

Claims (4)

1.葫芦巴水提取物在制备由葫芦巴水提取物和赋形剂组成的组合物中的用途，所述组合物用于预防或有效治疗与包括组织滴虫(Histomonas meleagridis)的有鞭毛的原生动物有关的动物疾病，其中所述提取物得自去皮的、微粉化的或雾化的种子。
2.如权利要求1所述的用途，用于治疗鸡形目鸟类的组织滴虫病。
3.如权利要求2所述的用途，所述的鸡形目鸟类是火鸡。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于将所述提取物加入到食品添加剂或饮料中，并且占制剂重量的0.1～5％。
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