CN102007411A - 酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶b5(trap 5b)的底物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的底物的用途。在用于测量受试者样本中TRAP 5b的量的测定中使用所述底物，所述TRAP 5b的量作为骨吸收率的指标，以及因此作为类似病况，例如骨质疏松的指标。本发明也提供了包含酞类化合物的单磷酸酯和任选包含结合总TRAP的抗体的试剂盒，以及方法。

Description

酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶B5(TRAP 5B)的底物的用途
技术领域
本发明涉及酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase，TRAP)，优选TRAP 5b的底物的用途。本发明也涉及测量在受试者样本中作为骨吸收率指标的TRAP 5b的量，以及与其相关的方法。本发明也提供了酞类化合物的单磷酸酯在测量样本中TRAP 5b中的用途，和实施本发明的方法的试剂盒。
背景技术
骨由2种主要的细胞类型组成：负责形成骨的成骨细胞和负责破坏(吸收)骨的破骨细胞。破骨细胞是进入矿化骨，将其破坏为其组成部分的多核细胞。吸收过程包括破骨细胞向骨单位的附着。然后破骨细胞引发其细胞膜的内摺，并分泌胶原酶和其它在吸收过程中重要的酶。由于骨被吸收，高水平的钙、镁、磷酸根和胶原的产物被释放到细胞外液。通常成骨细胞和破骨细胞处于平衡中，以使吸收的骨的量和形成的骨的量相同。在童年，骨形成超过吸收，但随年龄增长，吸收超过形成。
已知若干医学病况与骨吸收率的变化相关，可能最广泛存在的是骨质疏松。这种特定病况被认为是破骨细胞活性增加的结果，其特别是在绝经后妇女中导致骨量减少。这导致骨的弱化并增加了对骨折的易感性。该年龄组的妇女中骨折可能是潜在严重的，由骨质疏松引起的这些和其它症状的治疗是昂贵的并需要医学专业。长期以来对那些易患骨质疏松的人的诊断被认为是重要的，以预防这种病况的潜在严重后果。已日益通过例如雌性激素替代治疗或双膦酸酯治疗成功治疗骨质疏松。
骨质疏松或其易感性的指标是测量受试者中骨密度，其中低的骨密度暗示骨吸收过量，因此有骨质疏松或其它病况的可能。由于该组人群被认为是重要的商业市场，特别是在西方国家，已发展了很多方法和仪器以测量骨密度。其中，以那些特异性、快速和廉价的为人所欢迎。
根据其电泳迁移率，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)属于酸性磷酸酶的5型种类。它是已鉴定的7种酸性磷酸酶中酸性最强的，并且是唯一一种抵抗酒石酸引起的抑制的酸性磷酸酶。TRAP是一种在分子的活性位点含有自旋-偶联铁单位的碱性糖蛋白。TRAP的双核铁单位含有2个高铁离子，其使蛋白质呈紫色，因此它也被称为紫色酸性磷酸酶。这种蛋白有32kd的分子量。当酶被例如β-巯基乙醇还原，其中一个高铁离子被还原，酶变为粉红色。TRAP在体外可以作为蛋白酪氨酸磷酸酶起作用，其氨基酸序列含有与磷蛋白磷酸酶同源的区域。但是，TRAP的天然底物依然是未知的。
若干研究已涉及在骨吸收过程中的TRAP。小鼠中TRAP基因的破坏(Hayman，A.R et al Development 122：3151-3162，1996)导致软骨内骨化被破坏和轻度骨质疏松，其暗示TRAP通过对骨基质吸收的关键作用在骨发展、保持成年骨的完整性和更新中对于软骨正常的矿化是必需的。
在人类中，已发现存在TRAP的正常细胞仅有破骨细胞和激活的巨噬细胞。已发现在骨吸收期间TRAP被破骨细胞分泌到血液中。因此暗示TRAP在血清中的浓度作为骨吸收的标记，并且已发现TRAP在血清中的浓度与骨吸收率相关(Kraenzlin M. E et al.Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 71(2)：442-451，1990；Cheung C.K et al.Clin.Chem 41(5)：679-686，1995；Chamberlain P.et al.Clin.Chem.41(10)：1495-1499，1995和Halleen J.et al.Journal of Bone and Mineral Research 11(10)：1444-1452，1996)。
已鉴定出2种TRAP的同工型，TRAP 5a和TRAP 5b(Lam W.K.W.et al.(Clin.Chem.24(7)：1105-1108，1978))。TRAP 5a在较低最佳pH比TRAP 5b更具活性，由此允许对TRAP各同工型的的功能测定。为了测定例如骨吸收率而进行的TRAP 5b血清或血浆的浓度测量中的主要困难，是存在主要由巨噬细胞和树突细胞产生的酶的5a同工型。这两种同工型都是acp5基因的产物，区别仅在于在翻译后修饰中的变异。TRAP 5b缺少某些在TRAP 5a中存在的唾液酸残基(在蛋白质的糖基团上)。所述同工型也在如下方面有所不同：氨基酸链的约14个残基片段已经从TRAP 5b被蛋白水解切除。另外，核心蛋白是相同的，在单纯免疫学基础上没有区分这两种同工型的方法。因此，商业上存在的TRAP 5b免疫测定利用这两种形式之间的生化差异。
可以通过分光光度计测定TRAP的活性，例如在酒石酸存在时通过给予对硝基苯基磷酸酯(pNPP)作为底物，酒石酸抑制大多数其它酸性磷酸酶。但是，该方法特异性不强，因此为了测定TRAP，已发展了更具特异性的方法即免疫测定。已发展了多种使用多克隆抗体的TRAP的测定方法(Stepan J.J et al(Biochem，Biophs.Res.Commun.165：1027-1034，1989)，Kraenzlin M.E et al(Journal of Clinical Endrocrinology and Metabolism 71(2)：442-451，1990)和Cheung C.Ket al(Clin.Chem.41(5)：679-686，1995))。针对TRAP使用多克隆抗体的研究显示儿童和绝经后妇女具有升高的血清TRAP浓度(Halleen J.et al Journal of Bone and Mineral Research 11(10：1444-1452，1996)。
Chamberlain P.et.Al(Clin.Chem.41(10)：1495-1499，1995)描述了针对重组产生的TRAP使用单克隆抗体的测定。
基于TRAP 5b是比总TRAP更具特异性的骨吸收的生化标记的发现，国际专利申请No.WO 1999/050662描述了TRAP 5b的测定，所述测定在具有确定pH范围的缓冲液中使用普通磷酸酶底物，对硝基苯基磷酸酯(pNPP)以使5b同工型的活性最大化，而降低TRAP 5a的干扰。
欧洲专利No.1598670描述了适于测量TRAP 5b的酸性磷酸酶底物，其中实施例底物之一，2-氯-4-硝基苯基磷酸酯，对TRAP 5b相对TRAP 5a的相对活性仅仅比上述WO1999/050662中获得的活性高0.8倍。
美国专利No.7,074,903描述了自称相对TRAP 5a显示对TRAP 5b的特异性的单克隆抗体。但是该抗体显示与重组人TRAP5等效的交叉反应性，这被认为与TRAP 5b(从人血清中分离)相比更类似于天然的TRAP 5a。因此，所述测定中的抗体功能特异性在区别TRAP 5a和5b方面并不显著优于描述于WO1999/050662或EP1598670中的活性测定。
已知的商业测定适于使用在某些临床应用中，因为TRAP 5a的酶促活性比5b(临床应用的形式)低相当多。但是，通过评价公布于诸多研究范围内的数据，可以估计在正常样本中5a的影响可能高达50％。尽管对于某些TRAP 5b水平的变化是显著的临床应用，这并不代表一种显著的困难，但是已知的方法可能缺乏区分TRAP 5b水平中更细微的变化的能力。
应用于已知测定中的底物pNPP及其4-卤-取代衍生物在溶液中是不稳定的。当手工进行测定且其中底物是作为在使用之前立即溶解的固体应用时，这不是问题。但是，底物的不稳定性使这些化合物难以应用于自动化免疫测定平台，所述平台需要底物在溶液中稳定若干周。
专利No.US 3,975,405描述了一种邻甲酚酞的单磷酸酯及其在血清样本中作为测量碱性磷酸酶的底物的用途，并自称具有如下利益：避免由胆红素引起的干扰，并且与百里酚酞单磷酸酯相比对碱性磷酸酶的肠道和胎盘内的同工型更敏感。所述方法不区分碱性磷酸酶或酸性磷酸酶的不同同工型，或描述其作为TRAP 5b的底物的用途。
专利No.US 4,045,290描述了百里酚蓝单磷酸酯作为磷酸酶底物用于在血清中测量总碱性磷酸酶和在血清中适宜pH条件下测量总酸性磷酸酶的制备和用途。所述方法不区分碱性磷酸酶或酸性磷酸酶的不同同工型。
因此，需要用于测定TRAP 5b的方法，其中与现有测定相比TRAP 5a的干扰显著减少，并且其可易于应用于自动化模式中。
发明内容
本发明提供了酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP 5b)的底物的用途。
在本文中，酞类化合物的单磷酸酯定义为下式的化合物：
其中：
A是取代或未经取代的O-磷酰化的对苯酚；
B是取代或未经取代的对苯酚磷酸酯；
X是CO或SO2；
R1选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
R2选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
R3选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；并且
R4选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
其中：
n是0、1或2；
R5和R6各自独立地是氢或R7；并且
R7选自烃基、-(CH2)k-杂环基、-(CH2)k-C(O)-杂环基，其中的任意基团任选地被1、2、3、4或5个独立地选自卤素、氰基、氨基、羟基、-COOH和其酯(例如-C(O)-C1-6烷基)、亚磷酰胺、C1-6烷基和C1-6烷氧基的取代基取代；并且k是0、1、2、3、4、5或6。
优选地，酞类化合物的单磷酸酯定义为下式的化合物：
Figure BPA00001242591300061
其中：
X是CO或SO2；
R1选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
R2选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
R3选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
R4选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
各R8选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
各R9选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
各R10选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；并且
各R11选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-ORw、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
其中：
n是0、1或2；
R5和R6各自独立地是氢或R7；并且
R7选自烃基、-(CH2)k-杂环基、-(CH2)k-C(O)-杂环基，其中的任意基团任选地被1、2、3、4或5个独立选自卤素、氰基、氨基、羟基、-COOH和其酯(例如-C(O)-C1-6烷基)、亚磷酰胺、C1-6烷基和C1-6烷氧基的取代基取代；并且k是0、1、2、3、4、5或6。
优选地，由其衍生出本发明的单磷酸酯的酞类化合物是酚酞或磺酞(sulphophthalein)，优选苯酚磺酞(phenolsulphophthalein)。
本发明也提供了用于测量样本中TRAP 5b的量的方法，所述方法包括使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP 5b的活性。
本发明也提供了用于测量受试者中骨吸收率的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP 5b的活性而测量受试者样本中TRAP 5b的量，其中存在于样本中的TRAP 5b的量反映了骨吸收率。
本发明也提供了用于诊断受试者中与骨吸收率的变化相关的障碍的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP 5b的活性而测量受试者样本中存在的TRAP 5b的量，其中TRAP 5b的非正常量表明受试者患有该障碍。
本发明也提供了监测用于预防或治疗与骨吸收率的变化相关的障碍的药物在服用该药物的受试者中的效果的方法，所述方法包括(a)通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP 5b的活性而测量受试者样本中存在的TRAP 5b的量；和(b)将TRAP 5b在上述样本中的量与TRAP 5b在对照样本中的量进行比较。
本发明也提供了筛选受试者对与骨吸收率的变化相关的障碍的易感性的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP 5b的活性而测量受试者样本中存在的TRAP 5b的量，其中TRAP 5b的非正常量表明对这类障碍的易感性。
优选地，本发明的方法包括(a)将样本中存在的总TRAP与对总TRAP、TRAP 5a或TRAP 5b具有特异性的抗体结合；(b)洗脱未结合的级分；和(c)通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定与抗体结合的TRAP 5b的活性或在未结合级分中TRAP 5b的量，从而测量样本中TRAP 5b的量。
优选地，测定样本中TRAP 5b活性包括如下连续的步骤：
(a)温育样本和作为底物的酞类化合物的单磷酸酯以使TRAP 5b代谢底物；
(b)停止代谢；
(c)任选地调节样本的pH；
(d)测量由于被TRAP 5b代谢而导致的底物的特征变化。
也提供了实施本发明方法的试剂盒，其包含酞类化合物的单磷酸酯和任选地包含对总TRAP、TRAP 5a或TRAP 5b具有特异性的抗体。
也提供了酞类化合物的单磷酸酯通过作为TRAP 5b的底物而用作骨吸收率的指示物的用途。优选地，通过使受试者样本接触所述单磷酸酯并随后测量所述单磷酸酯的特征的任何变化，将酞类化合物的单磷酸酯用作骨吸收率的指示物。在本发明的方法中，优选提供了酞类化合物的单磷酸酯通过作为TRAP 5b的底物而用作骨吸收率的指示物的用途。
附图简述
图1显示了(a)PTMP被TRAP 5a水解的过程；(b)PTMP被TRAP5b水解的过程；(c)TTMP被TRAP 5a水解的过程；(d)TTMP被TRAP5b水解的过程。每个曲线图的图例显示了每次测定使用的TRAP5的量。
图2显示了在使用PTMP底物的情况下，TRAP 5a和TRAP 5b的pH相对活性曲线。
图3显示了在CM-Sepharose(琼脂糖)上源自人血清的TRAP 5a和TRAP 5b的分离。
图4显示了通过基于pNPP的测定和基于PTMP的测定所测得的血清TRAP5浓度的关系。
图5显示了使用对硝基苯基磷酸酯(pNPP)和酚酞单磷酸酯作为底物的TRAP 5a和TRAP 5b的测定结果。
发明详述
本文中，TRAP意指抗酒石酸酸性磷酸酶，其是酸性磷酸酶5型家族的成员。除另有说明，“TRAP”或总TRAP包括酶的两种同工型，即TRAP 5a和TRAP 5b。TRAP 5b是在其烃链中缺少唾液酸的TRAP酶的同工型，并在pH 5.7到6.1之间对pNPP底物显示最佳酶活性。TRAP 5a是在其烃链中具有唾液酸残基的酶的同工型，并在pH约4.9时对pNPP显示最佳酶活性的酶的形式。术语TRAP、TRAP 5a和TRAP 5b可分别与TRACP、TRACP 5a和TRACP 5b替换使用。
酞类化合物的单磷酸酯定义为如上定义的具有式(I)的化合物或优选具有式(II)的化合物。
在一个实施方案中，各R1至R4和R8至R11独立选自H、F、Cl、Br、-CF3、-OCF3、-C≡N、-OH、-NO2、-SO2H或其酯、-NH2、-COOH或其酯、-CONH2、-C1-4烷基(例如Me、Et、Pr或Bu)或-C1-4烷氧基(例如-OMe、-OEt、-OPr或-OBu)。合适的酯包括例如C1-C4烷基的烷基酯和例如N-羟基琥珀酰亚胺的活化酯。
在一个实施方案中，各R1至R4是H。
根据另一个实施方案，R3是H、Me、Et、Pr、卤素或三氟甲基。
根据另一个实施方案，R3选自H、溴、氯、氟，甲氧基、乙氧基、异丙氧基和叔丁氧基。任选地，R3是H。在本段提及的实施方案的某些化合物中，R1、R2和R4都是H。在某些其它化合物中，它们选自H、卤素和C1-C4烷基。
术语“烃基”包括含有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。该术语包括具有1、2、3、4、5或6个碳原子的无环脂肪族基团、含有3、4、5或6个碳原子的环脂肪族基团和含有6个碳原子的芳香族基团。通常，术语烃基意指含有1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基基团。但是，术语烃基也意欲包括含有2、3、4、5或6个碳原子的烯基和炔基基团。
术语“杂环基”包括含有3、4、5或6个环成员的环的基团，其中至少1个是杂原子(例如N、O或S)。
根据一个实施方案，各R8独立选自H、甲基、乙基、异丙基、溴、氯、氟、甲氧基、乙氧基、异丙氧基或叔丁氧基。任选地，各R8是H、Me、Br、异丙基或Cl。
根据一个实施方案，各R9独立选自H、甲基、乙基、异丙基、溴、氯、氟、甲氧基、乙氧基、异丙氧基和叔丁氧基。任选地，各R9是H、Me或Br。
根据一个实施方案，各R10独立选自H或Me。
根据一个实施方案，各R11独立选自H或Me。
本文中，独立指相同或不同。
当A是经取代的O-磷酰化的对苯酚时，合适的取代基包括F、Cl、Br、CH3、CF3、OCF3、-C≡N、-OH、-NO2、-SO2H、-NH2、-COOH、-CONH2、-C1-4烷基(例如Me、Et、Pr或Bu)或-C1-4烷氧基(例如-OMe、-OEt、-OPr或-OBu)或类似基团。
当B是经取代的对苯酚磷酸酯时，合适的取代基包括F、Cl、Br、CH3、CF3、OCF3、-C≡N、-OH、-NO2、-SO2H、-NH2、-COOH、-CONH2、-C1-4烷基(例如Me、Et、Pr或Bu)或-C1-4烷氧基(例如-OMe、-OEt、-OPr或-OBu)或类似基团。
在一种类型的实施方案中，化合物包含至少1个选自R1至R11的取代基，所述取代基含有直接或间接与例如生物分子、蛋白质或多肽的其他分子链接的反应官能团。
在一个实施方案中，R1至R4各自是H，X是CO，R8、R9、R10和R11如表1中所定义。在另一个实施方案中，R1至R4各自是H，X是SO2，R8、R9、R10和R11如表2中所定义。
在一个实施方案中，各R8基团独立地是溴、氯或氟，各R9基团独立地是甲基、乙基、异丙基或叔丁基。任选地，各R8基团独立地是溴或氯，各R9基团独立地是甲基、乙基或异丙基。
在一个实施方案中，仅仅R1至R11中的1、2或3个不是H。
在一个实施方案中，各R8基团独立地是溴、氯或氟，各R9基团独立地是溴、氯或氟。任选地，各R8基团独立地是溴或氯，各R9基团独立地是溴或氯。
在一个实施方案中，各R8基团独立地是甲基、乙基、异丙基或叔丁基，各R10基团为甲基、乙基、异丙基或叔丁基。任选地，各R8基团独立地是甲基、乙基或异丙基，各R10基团为甲基、乙基或异丙基。
本发明中优选的酞类化合物的单磷酸酯包括酚酞单磷酸酯、甲酚酞单磷酸酯、百里酚酞单磷酸酯、邻氯酚酞单磷酸酯、苯酚磺酞单磷酸酯、邻甲酚磺酞单磷酸酯单磷酸酯、间甲酚紫单磷酸酯、溴甲酚紫单磷酸酯、溴甲酚绿单磷酸酯、溴酚蓝单磷酸酯、百里酚蓝单磷酸酯、溴百里酚蓝单磷酸酯、二甲苯酚蓝单磷酸酯和氯酚红单磷酸酯。
也包括在本发明中的底物是本发明的酞类化合物的单磷酸酯的功能衍生物或盐，其在TRAP 5b代谢后显示特征的变化。
可以通过式I的羟基基团的酯化制备酞类化合物的单磷酸酯。可通过本领域已知的和描述于例如US 3,975,405和US 4,045,290中的方法制备酞类化合物的单磷酸酯。
受试者可以是任何脊椎动物，优选哺乳动物，且最优选人。在实施方案中，受试者是女性。
受试者的样本可以是源自受试者的任何体液样本，优选血样，例如血浆或血清。其它合适的体液样本包括滑液、唾液和尿液。
在本发明中使用的针对TRAP的抗体包括结合总TRAP且对任一种同工型不具有特异性的抗体，以及显示优选结合一种TRAP的同工型并因此被称为对TRAP 5a或TRAP 5b具有特异性的抗体。用于测定抗TRAP抗体的特异性的方法描述于本领域，例如Halleen et al JBMR vol 15 1335-1434(2000)中。在本发明中使用的抗体可以是多克隆或单克隆的，但优选后者。可以在任何物种中产生针对TRAP 5b的抗体，但优选小鼠、大鼠或人。优选地，使用本领域可获得的方法，使用天然的TRAP 5b作为免疫源，从任何合适的动物来源，例如小鼠、兔、绵羊、山羊衍生抗体(Tissjen，(ed)Practice and Theory of Enzyme Immunoassay.Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，vol 15 chapter 5)。在本发明中使用的优选的单克隆抗体包括4E6、01A和J1B(Halleen et al JMBR 14(464-9(1999))，14G6和9C5(Janckilla et al Hybridoma 16，175-82.(1997))。
本发明基于使用酞类化合物的单磷酸酯作为TRAP 5b的底物，以测量样本中TRAP的量，其作为受试者中骨吸收率的指示。这基于如下观察：酞类化合物的单磷酸酯优选被TRAP 5b而非TRAP 5a代谢，这可用于特异性测量样本中TRAP 5b活性。TRAP 5b对底物的活性也被称为TRAP 5b引起的底物的代谢，其改变底物的特征性，该变化用作TRAP 5b的活性的度量，因此用作样本中TRAP 5b的量的度量。该特征性可以是任何可测量的特征性，例如结构或功能的变化。优选地，该变化是结构变化，且优选是通过TRAP 5b从底物移除磷酸酯基团，优选移除式(I)中的A或B的磷酸酯，更特别优选移除式(II)的磷酸酯基团。这种结构变化导致底物的颜色变化，其可被测量以表明所存在的TRAP 5b的量。
因此，测量TRAP 5b的量包括测定TRAP 5b对底物的活性。该测定包括温育受试者的样本和本发明的底物。
优选地，该测定包括首先将样本中的TRAP结合到抗体上，以从样本中分离TRAP。根据所用抗体的特异性，可以分离总TRAP、TRAP5a或TRAP 5b。然后可以根据所用抗体的特异性，通过将底物加入至样本的未结合级分或结合级分而测量TRAP 5b的活性。当使用非同工型特异性抗体时，还可以采用其它方法特异性测定TRAP 5b的活性，例如在利于TRAP 5b活性的情况下实施活性测定。因此，优选地，TRAP 5b的活性测定步骤包括i)结合至TRAP 5a特异性抗体并测定含有TRAP 5b的非结合级分对底物的活性；(ii)结合至TRAP 5b特异性抗体并测定含有TRAP 5b的结合级分对底物的活性；或(iii)结合至非同工型特异性TRAP抗体；在利于TRAP 5b活性的情况下测定含有TRAP 5a和TRAP 5b的结合级分对底物的活性。在进一步增加TRAP 5b活性测定的特异性的优选的实施方案中，上述(i)和/或(ii)也可以在利于TRAP 5b活性的情况下进行。
影响相对TRAP 5a活性的TRAP 5b活性的条件包括pH。例如可以在优选TRAP 5b的活性而不是TRAP 5a的活性的pH下实施测定。因此，优选地，TRAP 5b的活性测定步骤在pH 6.8至7.6进行，优选pH 6.8至7.4，且最优选pH 7至7.2。
优选地，底物的代谢通过改变反应条件而停止，例如通过添加例如氢氧化钠、盐酸、正磷酸氢二钠、正磷酸二氢钠或1 M pH 11的甘氨酸/NaOH的试剂。
可以使用任何合适的方法测量由TRAP 5b的代谢导致的底物的特征性变化。当变化导致颜色改变时，优选使用分光光度计测量。所得值可以作为TRAP 5b的活性的量的指示，因此可以用作样本中TRAP 5b的量的度量。该值可以通过与校正标准或曲线比较转化为TRAP 5b的量。
当用分光光度计测量底物的颜色变化时，在酞类化合物具有最大吸光度的波长下测量吸光度。优选地，在450nm、540nm、550nm、592nm或595nm下测量吸光度。
为观察到样本中任意颜色变化，某些底物可能需要调节pH。因此，本发明的方法可包括在测量样本中任何颜色变化之前调节样本的pH。可以通过添加适当量的酸或碱调节pH以使样本的pH调节至观察到特定底物的任意颜色变化的pH。在“Data for Biochemical Research 3rd Edition，RMC Dawson et al，Clarendon Press，Oxford 1989”中提供了观察到底物颜色变化的pH。
因此，本发明的方法还可进一步提供通过将所得TRAP 5b的测量值与校正标准或曲线比较得到存在的TRAP 5b的量的绝对值。绝对值是测得的每分钟水解的底物小分子单位中TRAP 5b的量。
优选地，可同时测定多个样本，例如在阵列、芯片或多孔板上。本发明的测定优选在自动化平台的固定基质上进行。优选地，固定基质是被抗体包被的。最优选地，当使用基质时，其包含磁珠，所述磁珠被抗体包被，以通过例如机器人或其它自动化仪器实现样本的高通量分析。
涉及骨吸收率变化的障碍包括任何骨吸收率非正常的障碍，其通常导致非正常的骨密度。这种障碍可包括骨质疏松、畸形性骨炎、多发性骨髓瘤、骨代谢性疾病、转移瘤、骨损害、骨关节炎、类风湿性关节炎和心血管障碍，特别是那些与动脉粥样硬化斑块形成相关的障碍。骨吸收率的变化意味着骨被破坏或吸收程度的变化，其可以因此影响骨密度。
可以通过将样本中TRAP 5b的量或TRAP 5b的活性与骨吸收率的校正标准或曲线比较而确定骨吸收率。所得骨吸收率可以用于诊断与骨吸收率变化相关的障碍或测定对这类障碍的易感性。在优选的实施方案中，本发明的方法包括将样本中TRAP的测量值与曲线比较以直接将所述测量值与特定障碍的易感性或存在关联起来。
“诊断障碍”意指通过评价受试者中的骨吸收率确定障碍的存在。该方法也可以包括鉴定其它已知与特定障碍或骨吸收率相关的症状存在或不存在。
“测定障碍的易感性”意指通过评价骨吸收率而确定受试者中障碍发病的可能。该方法还可以比较鉴定所述障碍可能发病的任何其它指示。
涉及监测用于治疗或预防与非正常骨吸收率相关障碍的药物效果的本发明方法包括将已施用该药物的受试者样本中TRAP 5b活性的量与不接受该药物的受试者的对照样本进行比较。因此，对照样本可以定义为来自不接受待测药物的受试者，优选其TRAP 5b的活性是非正常的受试者，且更优选与接受待测药物的受试者患有相同障碍的受试者。已经给予药物的受试者可以是相同的或不同的，但优选相同的。当受试者相同时，对照样本优选在任何给药之前取自受试者。在监测药物效果的方法中，优选以合适的时间间隔，可以将对照样本与一个或多个来自给药之后的受试者的样本比较。通过评价给药后受试者的样本中任何骨吸收率的变化测定药物效果。
根据本发明的试剂盒含有酞类化合物的单磷酸酯和任选地含有与TRAP、TRAP 5a和/或TRAP 5b结合的抗体。优选地，提供了在本发明的测定中使用的单独的试剂。试剂盒也可以提供在本发明方法中使用的试剂，包括那些本文中所述的使用说明、校正曲线、进行测定所针对的底物、移液器、分配器和/或杯。
本文中所述与本发明的第一方面相关的实施方案可作必要的修正而适用于其它方面。
本申请文件的说明书和权利要求中，词语“含有”、“包括”和其变体，例如“含有的”和“包含”，意指“包括但不限于”，而不意欲(且不)排除其它部分、添加剂、成分、整数或步骤。
本申请文件的说明书和权利要求中，除非上下文另有要求，单数包括复数。具体地说，当使用不定冠词时，除非上下文另有要求，将申请文件理解为考虑复数以及单数。
将与本发明的具体方面、实施方案或实施例结合描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团理解为适用于本文所述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与其不兼容。
实施例
下式的经取代的酚酞单磷酸酯或盐
Figure BPA00001242591300151
其中X是CO或SO2；
R8选自H、烷基(甲基、乙基、异丙基)、卤素(溴、氯、氟)或烷氧基(甲氧基、乙氧基、异丙氧基、叔丁氧基)；
R9选自H、烷基(甲基、乙基、异丙基)、卤素(溴、氯、氟)或烷氧基(甲氧基、乙氧基、异丙氧基、叔丁氧基)；
R10选自H或甲基；
R11选自H或甲基；
R3选自H、卤素(溴、氯、氟)或烷氧基(甲氧基、乙氧基、异丙氧基、叔丁氧基)；
R1、R2和R4是H。
实施例包括经取代的“类酚酞”单磷酸酯或盐，其中X是C＝O，R1、R2、R4是H，R3、R8-R11定义在表3中；
表3.
  R8   R9   R10   R11   R3
  H   H   H   H   H   酚酞单磷酸酯
  Me   H   H   H   H   邻甲酚酞单磷酸酯
  异丙基   H   Me   H   H   百里酚酞单磷酸酯
  Cl   H   H   H   H   邻氯酚酞单磷酸酯
实施例包括经取代的“类苯酚磺酞”单磷酸酯或盐，其中X是SO2，R1、R2、R4是H，R3、R8-R11定义在表4中；
表4.
  R8   R9   R10   R11   R3
  H   H   H   H   H   苯酚磺酞单磷酸酯
  Me   H   H   H   H   邻甲酚磺酞单磷酸酯单磷酸酯
  H   H   H   Me   H   间甲酚紫单磷酸酯
  Br   Me   H   H   H   溴甲酚紫单磷酸酯
  Br   Br   Me   H   H   溴甲酚绿单磷酸酯
  Br   Br   H   H   H   溴酚蓝单磷酸酯
  异丙基   H   Me   H   H   百里酚蓝单磷酸酯
  异丙基   Br   Me   H   H   溴百里酚蓝单磷酸酯
  Me   H   Me   H   H   二甲苯酚蓝单磷酸酯
  Cl   H   H   H   H   氯酚红单磷酸酯
用于本发明的单磷酸酯可以通过例如描述于US 3,975,405和US4,045,290中的方法制备。酚酞单磷酸酯购自Sigma-Aldrich(part P5758)，百里酚酞单磷酸酯购自TCI(part T0863)。
实施例1酚酞单磷酸酯和百里酚酞单磷酸酯是TRAP 5a和TRAP 5b的底物的证明。
将微量滴定板(Nunc Maxisorp)用来自3.0mg/L纯化的Mab IgG在10mM磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的溶液的小鼠抗TRAP5(克隆O1A)包被，每孔100μl，且在室温温育过夜。包被的板用10mM磷酸缓冲盐溶液和0.05％吐温20洗涤三次。将每孔加入250μl 0.5％BSA、5％的乳糖的稳定剂，温育至少10分钟，然后吸出液体。将包被的板在35℃干燥过夜，然后在防潮的情况下储存于2-8℃。
使用描述于Lam et al，Clin.Chem.24(7)：1105-1108，1978的方法的改进，通过离子交换色谱将源自血清的TRAP 5a和TRAP 5b分离。用100％乙酸将100-500ml人血清调节至pH 5.0左右，任选地用等体积的10mM pH4.9的磷酸钠缓冲液稀释。在通过离心和过滤澄清后，将酸化的血清应用于1cm x 100-150cm的CM-Sepharose柱(Sigma，part No CCF 100)，柱子用150-800mM的线性NaCl梯度洗脱。使用基本上描述于Lam et al Clin.Chem.24(7)：1105-1108，1978的非捕获性测定鉴定含有TRAP 5a和TRAP 5b活性的级分。在某些实例中进一步通过下文所述的免疫测定测定级分的TRAP5。将含有峰水平的TRAP 5a或TRAP 5b的级分分别收集用于进一步分析。
通过三明治免疫测定法(sandwich immunoassay)测定TRAP 5a和TRAP 5b制品中的TRAP5的蛋白浓度。将每孔100-200μl的样本加入到OIA包被的微量滴定板中，在4℃温育过夜。将板用10mM磷酸缓冲盐溶液和0.05％吐温20洗涤三次，并将100-200μl含有按1∶4000稀释的兔抗TRAP5抗体的溶液加入到每孔中。在室温温育60min后将板按上述洗涤，加入100-200μl按照1∶5000稀释的含有抗兔IgG-辣根过氧化物酶缀合物的溶液，在室温温育30min。按照上述进一步洗涤之后，加入200μl TMB(BioFx Inc，part TMBW-0100-01)，在室温温育30min。通过加入100μl 0.5M HCl停止反应，在450nm测量吸光度。通过参照由源自杆状病毒的重组人TRAP5制作的校准曲线计算TRAP5蛋白质浓度。
如下证明TRAP 5a和TRAP 5b使用酚酞单磷酸酯(PTMP)和百里酚酞单磷酸酯(TTMP)作为底物的能力：将100μl样本加入到O1A包被的微量滴定板的每孔中，在室温温育60min，然后用10mM磷酸盐缓冲液和0.05％吐温20洗涤三次。为测定对PTMP的活性，将100μl含有6mg/mL溶解于125mM pH 7.0的MOPS缓冲液中的PTMP溶液加入到每孔中，在37℃温育0-40min。通过每孔加入50μl 1M pH11的甘氨酸/NaOH在指示的时刻停止反应，测量550mm处的吸光度。为测定对TTMP的活性，每孔加入100μl含有5mg/mL溶解于80mMpH 7.0的MOPS缓冲液、10％乙醇的TTMP的溶液，在37℃温育0-40min。通过每孔加入50μl 0.25M NaOH在指示的时刻停止反应，测量592mm处的吸光度。结果在图1中显示。
因为酶活性测量在pH 7.0进行，令人意想不到地发现，酸性磷酸酶的同工型TRAP 5a和TRAP 5b，均可在中性pH下容易地水解PTMP和TTMP底物，分别通过吸光度在550nm和592nm的时间依赖性升高而判别。在所有情况下，在测定中反应率随着TRAP 5a或TRAP 5b的量的增加而增加。此外，通过比较图1a和图1b的数据，明显的是通过在pH 7.0使用PTMP作为底物，TRAP 5b的特异性活性(specific activity)约是TRAP 5a的50倍。类似地，通过比较图1c和图1d的数据，明显的是通过在pH 7.0使用TTMP作为底物，TRAP5b的特异性活性约是TRAP 5a的70倍。
实施例2.使用PTMP作为底物的TRAP 5a和TRAP 5b的pH曲线。
因为TRAP5是酸性磷酸酶，其通常仅仅在酸性条件下有活性，研究了TRAP 5a和TRAP 5b的酶活性与使用PTMP作为底物在一定pH值范围内底物pH之间的关系。基本上按照实施例1的描述进行TRAP5测定，除了将PTMP底物以6mg/mL溶解于一系列100mMMES或100mM MOPS缓冲液中以获得所指示的pH值。结果显示在图2中。
令人意想不到地发现，用PTMP作为底物，在pH 7.0左右，TRAP5b显示最大活性，而TRAP 5a的相应值在pH 6.0左右。这些数据与本领域所有先前的工作者的结果形成显著对比，所述工作者报告了一致报告的两种TRAP5同工型的最佳酸性pH。例如，公开于WO1999/050662中的数据显示使用pNPP时TRAP 5a和TRAP 5b的最佳pH分别是4.9和5.9左右。类似的，公开于EP1598670的数据显示使用2-氯-4-硝基苯基磷酸酯时TRAP 5b的最佳pH是6.4。
实施例3.基于酞类单磷酸酯对TRAP 5b的测定与现有的商业TRAPb测定的比较。
参照描述于实施例3的TRAP5的量对TRAP 5a和TRAP 5b制品进行制备和定量。如下制备一组TRAP5标准品：将225μg源自杆状病毒的重组人TRAP与12U糜蛋白酶在室温温育6h，由该材料制备一组稀释液，使用基于WO1999/050662的商业TRAP 5b免疫测定将TRAP5的浓度(U/L)分配给这些稀释液。通过基于W01999/050662的在pH 6.1使用pNPP作为底物的商业TRAP 5b免疫测定进行TRAP5a和TRAP 5b制品的测定，所述测定进行了如下改进：上述糜蛋白酶处理的标准品被制造者所提供的那些所代替。使用描述于实施例3的基于PTMP和TTMP的免疫测定对TRAP 5a和TRAP 5b制品也进行了测定，所述测定还进行了如下改进：通过参照由上述糜蛋白酶处理的标准品制作的标准曲线计算TRAP5的浓度(U/L)。计算TRAP5a和TRAP 5b制品与各底物的特异性活性(U/μg)并将其列于表1中。
表1：
使用pNPP、PTMP或TTMP作为底物时TRAP 5a和TRAP 5b的特异性活性
                 TRAP5的特异性活性U/μg
                       5A    5B    5B∶5A的比例
                 pNPP  0.177 1.60  9.04
                 PTMP  0.035 1.68  47.5
                 TTMP  0.035 2.3   65.3
pNPP底物的结果与公开于WO1999/050662中的数据一致，TRAP5b的特异性活性比TRAP 5a的特异性活性大9倍，该结果也显示基于PTMP和TTMP的测定的相应值分别是47.5倍和65.3倍。因此，基于PTMP和TTMP的TRAP 5b相对TRAP 5a的特异性比基于pNPP的商业测定高约4.75倍和6.5倍。表1的结果也显示特异性的改善是由于通过基于PTMP和TTMP的测定测得的TRAP 5a的量减少而不是它们检测到TRAP 5b的量增加。
实施例4.基于PTMP的测定的特异性的证明.
将源自正常人血清的TRAP 5a和TRAP 5b用CM-Sepharose柱分离，使用描述于实施例3的基于pNPP和PTMP的测定评价级分的TRAP 5b。结果显示于图3中。
结果显示基于pNPP的测定检测到2种不同的TRAP5群体。第一种具有级分53的峰的是TRAP 5a，而第二种具有级分61的峰的是TRAP 5b。该数据集清晰地表明了现有商业TRAP 5b免疫测定的主要缺陷，即它们检测到显著量的TRAP 5a，在该实施例中所测得的TRAP5b的量的大约40％实际是TRAP 5a。然而可以清晰地看到，基于PTMP的测定比基于pNPP的测定测得显著更少的TRAP 5a。实际上，通过测得的级分53的TRAP 5a峰的量判断，该实施例中基于PTMP的测定仅仅测得基于pNPP的测定测得的TRAP 5a的16％。也明显的是基于PTMP和pNPP的测定测得类似量的TRAP 5b。
实施例5.使用基于pNPP和基于PTMP的测定所测得的血清TRAP 5b水平的相关性
使用一组32份血清样本比较通过基于pNPP的商业测定和通过基于PTMP的测定测得的血清TRAP 5b的量。使用由制造商准确提供的基于pNPP的商业测定和使用描述于实施例4的基于PTMP的测定对样本进行测定。这2种测定的相关性显示于图4中。
结果显示基于PTMP和pNPP的测定之间存在明显相关性(r2＝0.96)。这2种数据集之间的关系是：
(基于PTMP的测定)＝1.09x(基于pNPP的测定)-0.62。
这显示基于PTMP的测定得到的值比那些使用基于pNPP的测定得到的值稍低约0.62U/L。这种不同可以通过基于PTMP的测定比基于pNPP的测定测得的TRAP 5a少来解释。因此该数据证明基于PTMP的测定在测定临床相关样本中TRAP 5b浓度中的实用性。
实施例6
抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP 5b)仅由破骨细胞分泌。血清中的TRAP 5b水平是破骨细胞丰度的度量，因此是骨吸收的间接指示。血清中TRAP 5b的测量由于主要由巨噬细胞和树突细胞产生的约10倍过量(质量)的TRAP 5a的存在而变得复杂。现有的TRAP 5b的商业免疫测定包括通过固定抗体捕获TRAP5，接着在TRAP 5b的特异性活性是TRAP 5a的10-17倍的pH进行活性测量。在寻求将BoneTRAPTM测定转移至3x3自动化平台时，我们遇到了与底物pNPP在液相中的稳定性相关的问题。
这引导我们检测作为TRAP 5b底物的酞类单磷酸酯的实用性。我们检测了来源于血清的TRAP 5a和TRAP 5b(通过CM-Sepharose色谱分离)和来源于杆状病毒的重组TRAP5水解酞类单磷酸酯的能力。所有TRAP5制品均水解酚酞单磷酸酯(PTMP)和百里酚酞单磷酸酯(TTMP)。我们观察到在采用酞类单磷酸酯底物的这些制品的最佳pH与用pNPP测定的那些最佳pH之间存在显著和意想不到的差异。例如，在使用PTMP时，TRAP 5a和TRAP 5b的最佳pH分别是6.0和7.0。这些值与那些使用pNPP得到的值(分别是4.9和5.9)相比显著更高。
接着我们建立了TRAP 5b的免疫测定法，其中使用PTMP在pH7.0测量酶活性并和使用pNPP在pH 6.1进行的免疫测定比较。通常得到的天然TRAP5形式的特异性活性是：TRAP 5a(PTMP)；0.035U/μg：TRAP 5a(pNPP)；0.177U/μg：TRAP 5b(PTMP)；1.68U/μg：TRAP 5b(pNPP)；1.60U/μg。这些数据表明尽管基于PTMP和pNPP的测定测得相似量的TRAP 5b，但是基于PTMP的测定仅仅测得基于pNPP的测定测得的TRAP 5a的20％。对于34个患者样本，基于PTMP和pNPP的测定存在显著相关性，R2＝0.96。此外，基于PTMP的测定得到的值比那些基于pNPP的测定得到的值稍低(y＝1.09x-0.62)，这与该测定检测到更少TRAP 5a一致。
通过提供TRAP 5b的特异性活性是TRAP 5a的47.5倍的测定，我们的结果表明与pNPP和相关化合物相比，酞类单磷酸酯是TRAP5b的更具特异性的底物。它们也显示TRAP5实质上不是酸性磷酸酶，至少部分通过底物的性质确定该酶的最佳pH。
实施例7
当酞类单磷酸酯不可商购时，通过Bulbenko&Woodbridge(美国专利No 4,045,290)的方法制备单磷酸酯，所述方法为：通过合适的酞类化合物(来自Sigma-Aldrich)与磷酰氯(phophorus oxychloride)(CAS 10025-87-3)反应，接着进行水解和纯化。在使用前进一步用HPLC色谱法除去未反应的酞类染料以纯化单磷酸酯。HPLC柱10mm x 150mm ACE 5 C18(Advance Chromatography Technologies，UK)，装载溶剂组合物，30％甲醇和含有0.1％三氟乙酸(TFA)的70％水；将产物按照30％甲醇0.1％TFA至100％甲醇0.1％TFA的梯度以3mL/分钟洗脱45分钟。
实施例8
将实施例7中制备的酞类单磷酸酯在100mM pH 7.4的MES缓冲液中稀释至0.47mg/ml，并用于实施例1中的测定。
单磷酸酯    检测波长       5a       5b      5b∶5a
(0.47mg/mL)                活性     活性    活性的比
溴甲酚绿       590nm       0.0036   0.2636      73.2
溴甲酚紫       590nm       0.0074   0.4755      64.3
氯酚红         572nm       0.0067   0.3558      53.1
苯酚磺酞       550nm       0.0067   0.3558      53.1
酚酞           550nm       0.0110   0.3664      33.3

Claims (23)

1.酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP 5b)的底物的用途。
2.用于测量样本中TRAP 5b的量的方法，所述方法包括使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP 5b的活性。
3.用于测量受试者中骨吸收率的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP 5b的活性而测量受试者样本中TRAP 5b的量，其中存在于样本中的TRAP 5b的量反映了骨吸收率。
4.诊断受试者中与骨吸收率的变化相关的障碍的易感性的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5b的活性而测量受试者样本中存在的TRAP 5b的量，其中TRAP 5b的非正常量是患者患有该障碍的指示。
5.监测用于预防或治疗与骨吸收率的变化相关的障碍的药物在服用该药物的受试者中的效果的方法，所述方法包括(a)通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP 5b的活性而测量受试者样本中存在的TRAP 5b的量；和(b)将TRAP 5b在上述样本中的量与TRAP5b在对照样本中的量进行比较。
6.筛选受试者对与骨吸收率的变化相关的障碍的易感性的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5b的活性而测量受试者样本中存在的TRAP 5b的量，其中TRAP 5b的非正常量表明对这类障碍的易感性。
7.根据权利要求2至6任一项的方法，所述方法包括(a)将样本中存在的TRAP与结合总TRAP(TRAP 5a和TRAP 5b)的抗体结合；和(b)通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定与所述抗体结合的TRAP 5b的活性而测量样本中TRAP 5b的量。
8.根据权利要求2至7任一项的方法，其中TRAP 5b活性的测定步骤在pH 6.8至7.6，优选pH 6.8至7.4，最优选pH 7进行。
9.根据权利要求2至8任一项的方法，其中通过测量TRAP 5b活性后样本颜色而测量TRAP 5b的量。
10.根据权利要求1至9任一项的方法，其中测定样本中TRAP5b的活性的步骤包括如下连续的步骤：
(e)温育酞类化合物的单磷酸酯和样本以使TRAP 5b代谢底物；
(f)停止代谢；
(g)任选地调节样本的pH；
(h)测量由于被TRAP 5b代谢而导致的底物的特征变化。
11.根据权利要求9或10的方法，其中使用分光光度计测量样本的颜色。
12.根据权利要求2至10任一项的方法，所述方法还包括通过将任一项权利要求中所得的TRAP 5b的测量值与校正标准或曲线比较而得到存在于样本中的TRAP 5b的量的绝对值。
13.根据权利要求2至11任一项的方法，其中TRAP 5b活性的测定步骤在固体基质上进行，优选平台、多孔板或阵列。
14.根据权利要求13的方法，其中所述平台是自动化的。
15.根据权利要求13或14的方法，其中所述自动化平台包括磁珠。
16.用于实施根据任一项权利要求的方法的试剂盒，所述试剂盒包含酞类化合物的单磷酸酯和任选地包含结合总TRAP的抗体。
17.酞类化合物的单磷酸酯通过作为TRAP 5b的底物而用作骨吸收的指示物的用途。
18.根据权利要求17的用途，其用于根据权利要求1至15任一项的方法中。
19.根据权利要求16的用途，所述用途包括将所述单磷酸酯与受试者的样本接触，随后测量样本的颜色。
20.根据前述权利要求任一项的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物是酚酞或磺酞。
21.根据权利要求19的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物是苯酚磺酞。
22.根据前述权利要求任一项的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物是具有式I的化合物：
Figure FPA00001242591200031
其中：
A是取代或未经取代的O-磷酰化的对苯酚；
B是取代或未经取代的对苯酚磷酸酯；
X是CO或SO2；
R1选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
R2选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
R3选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；并且
R4选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
其中：
n是0、1或2；
R5和R6各自独立地是氢或R7；并且
R7选自烃基、-(CH2)k-杂环基、-(CH2)k-C(O)-杂环基，其中的任意基团任选地被1、2、3、4或5个独立选自卤素、氰基、氨基、羟基、-COOH和其酯(例如-C(O)-C1-6烷基)、亚磷酰胺、C1-6烷基和C1-6烷氧基的取代基取代；并且k是0、1、2、3、4、5或6；
或者
Figure FPA00001242591200041
其中：
X是CO或SO2；
R1选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
R2选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
R3选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
R4选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
各R8选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
各R9选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
各R10选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；并且
各R11选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5、-C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O)nR5、-N(R5)R6、-C(O)N(R5)R6和R7；
其中：
n是0、1或2；
R5和R6各自独立地是氢或R7；并且
R7选自烃基、-(CH2)k-杂环基、-(CH2)k-C(O)-杂环基，其中的任意基团任选被1、2、3、4或5个独立选自卤素、氰基、氨基、羟基、-COOH和其酯(例如-C(O)-C1-6烷基)、亚磷酰胺、C1-6烷基和C1-6烷氧基的取代基取代；并且k是0、1、2、3、4、5或6。
23.根据前述权利要求任一项的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物的单磷酸酯选自酚酞单磷酸酯、甲酚酞单磷酸酯、百里酚酞单磷酸酯、邻氯酚酞单磷酸酯、苯酚磺酞单磷酸酯、邻甲酚磺酞单磷酸酯、间甲酚紫单磷酸酯、溴甲酚紫单磷酸酯、溴甲酚绿单磷酸酯、溴酚蓝单磷酸酯、百里酚蓝单磷酸酯、溴百里酚蓝单磷酸酯、二甲苯酚蓝单磷酸酯和氯酚红单磷酸酯。
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