CN102002513A - 一种高效介导dc基因转移的重组腺病毒 - Google Patents

Abstract

一种高效介导DC基因转移的重组腺病毒，该发明涉及生物技术和基因治疗领域的一种高效介导DC基因转移的重组腺病毒载体系统的建立(摘要附图1)，及其对DC感染效率的验证以及对DC生物学特性影响的检测。该重组腺病毒可以高效感染DC细胞，进而介导示踪基因GFP在DC细胞内高效表达；该重组腺病毒本身不会影响DC的细胞表型、细胞凋亡以及DC对T细胞的刺激活性。

Description

一种高效介导DC基因转移的重组腺病毒

技术领域

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体为一种高效介导DC基因转移的重组腺病毒。

背景技术

自1973年Steinman和Cohn首次报道树突状细胞(Dendritic cell，DC)以来，人们对DC的认识不断深入。目前认为DC是人体内最重要，抗原递呈能力最强，体内唯一能活化静息T淋巴细胞的抗原递呈细胞，是机体免疫应答的始动者，它具有摄取、加工抗原，以主要组织相容性复合物(MHC)I、II类肽复合物的形式递呈抗原，促进T、B淋巴细胞增殖的能力，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着极其重要的作用。

研究表明，肿瘤的发生、发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，特别是晚期肿瘤患者，其体内往往存在体液免疫和细胞免疫功能的普遍低下，且其低下程度与其临床分期密切相关。进一步的研究发现，导致免疫功能低下的根本原因在于机体对成熟DC的功能下调。体外实验证实即使由晚期肿瘤患者体内分离出的淋巴细胞对多种外界刺激仍然保持着很好的反应能力。因此，通过体外培养DC，制备DC瘤苗免疫荷瘤宿主，有望成为肿瘤的理想疗法。

基因修饰免疫细胞是目前肿瘤治疗研究领域的热点之一，其具体策略是通过基因转移技术将目的基因导入免疫细胞，然后将表达目的基因的免疫细胞输入患者体内，从而提高免疫系统对肿瘤细胞的识别或杀伤能力。基因修饰DC介导的肿瘤治疗成为当今肿瘤生物治疗领域中备受关注的焦点之一。

有效的基因治疗依赖于外源基因高效、稳定的表达。肿瘤抗原基因导入DC的方法一般有两大类：一是以腺病毒、逆转录病毒、痘病毒和腺病毒相关病毒等为载体的病毒载体方法；二是DNA脂质体复合物、磷酸钙沉淀、电穿孔等非病毒载体方法。非病毒载体方法转染的优势在于：插入片段大小不受限制；免疫原性低；生产简便。其缺点是外源基因的转染效率一般很低。病毒载体介导方法，以其高转染率和良好的靶向性成为肿瘤基因治疗中应用最广泛的方法。利用病毒载体将带有肿瘤抗原的编码基因转染DC制备的疫苗，由于可以在DC细胞内加工和持续表达相应特异性抗原，诱导产生特异性抗肿瘤免疫应答而备受关注。其中最常用的包括逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)和腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)等载体。

逆转录病毒可将转染的基因整合到染色体上，因此可以保证转基因的长期表达，但这种整合是随机的，可能导致细胞突变而诱发癌症；逆转录病毒只感染分裂细胞；用逆转录病毒载体介导外源基因转染DC的效率只有10％～30％，因此，介导肿瘤基因治疗存在一定的局限性。在法国进行逆转录病毒为载体的人类基因治疗临床研究出现了诱发血液系统恶性肿瘤的严重问题。

腺病毒是众多的病毒载体基因转移方式中最常见的，其优点在于：安全，有效；腺病毒可以通过上调DC细胞表面的MHC及共刺激分子表达来促进其成熟；插入的外源片段大小可达37kb；腺病毒转染后的DC可以保持正常的表型特征和功能；体内回输在肝脏短暂停留后移行到脾脏并持续表达外源基因，血清中不产生抗Ad抗体。美国Genzyme公司和麻省总医院MGH的学者也探索了腺病毒介导的gp100基因转染的小鼠骨髓来源DC的性质，并通过小鼠体内实验证明gp100基因修饰的DC体内免疫后可诱导出gp100特异性CTL。国内章卫平等也报道了腺病毒介导的GM-CSF基因修饰的DC与肿瘤细胞的融合疫苗体内免疫激活效果的研究结果。

腺病毒进入细胞主要由纤维顶球与细胞表面受体的相互作用所介导，所以传统的5型腺病毒对DC的感染效率比较低。因此，对其亲嗜性的修饰对于基于DC的基因治疗的发展无疑起着重要作用。AdEasy腺病毒制备系统是实验室普遍使用的腺病毒包装系统，我们基于此系统对5型腺病毒纤维基因进行修饰，将AdEasy-1载体中5型腺病毒的纤维顶球和柄部替换为11p型腺病毒的相应部分。通过这种方法改构腺病毒，不仅可以提高重组腺病毒对DC的感染效率，而且还可以实现纤维基因与目的基因在不同的载体同时进行操作。

综上所述，制备一种能够高效感染DC的重组腺病毒，为肿瘤的基因治疗提供一种特异、高效的方法，具有重大的理论和现实意义。

发明内容

本发明的目的是在于建立一种能够高效介导DC基因转移的腺病毒制备体系，为基于DC的靶向基因治疗提供一种新的策略。

我们的发明是以腺病毒载体系统AdEasy为基础，改造其骨架质粒AdEasy-1中的纤维基因，将其中编码5型腺病毒纤维基因杆部和顶球部的序列替换为11p型腺病毒的相应序列。Ad11p为B族腺病毒，其可以通过高效结合造血细胞表面CD46分子而感染造血系统来源细胞。带有目的基因的穿梭质粒与骨架质粒AdEasy-1/F11p重组最终制备的腺病毒将含有Ad11p的纤维顶球，具有Ad11p的靶向性。选择GFP作为报告基因观察改造的腺病毒载体(AdEasy-1/F11p-GFP)对DC细胞的感染效率，同时还观察了改构腺病毒对DC生物学特性的影响。

具体为：

1、构建携带嵌合基因的腺病毒载体：

本发明重组腺病毒能否高效感染DC细胞，关键在于该病毒与细胞表面受体的结合能力。由于介导AdEasy-1型腺病毒进入细胞的表面受体为CAR，而DC细胞CAR表达较低；介导Ad11p型腺病毒进入细胞的表面受体为CD46，DC细胞CD46表达率非常高，达99％以上。因此，我们将pAdEasy-1的纤维基因替换为Ad5型腺病毒纤维尾部与Ad11p纤维杆部和顶球部的嵌合基因，成功构建pAdEasy-1/F11p。

2、pAdEasy-1/F11p-GFP质粒的构建及鉴定：

为验证本发明重组腺病毒对DC的感染效率，我们选用绿色荧光蛋白作为示踪蛋白，构建携带GFP的pAdEasy-1/F11p-GFP质粒。

3、制备重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP：

重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP，携带GFP基因，方便观察其对DC细胞的感染效率。

4、对照重组腺病毒的制备；

为了评价AdEasy-1/F11p-GFP对DC细胞的感染效率，我们制备了对照腺病毒，为AdEasy-1/GFP。

5、重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP对DC感染效率的检测：

将AdEasy-1/F11p-GFP和对照病毒AdEasy-1/GFP以不同感染滴度感染DC细胞，24h后流式细胞术检测绿色荧光蛋白GFP的表达。

6、重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP对DC细胞表型的影响：

将重组腺病毒感染DC细胞24h后，流式细胞术检测DC细胞表面分子的表达。

7、重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP对DC细胞凋亡的影响：

本发明采用Annexin V-PE或PI染色法，利用流式细胞术检测DC细胞凋亡与死亡。

8、重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP对混合淋巴细胞反应中DC对T细胞的刺激作用的影响：

本发明利用尼龙棉柱法分离人外周血CD3⁺细胞。采用³H-TdR掺入法检测混合淋巴细胞反应。

本发明的创新点在于对5型腺病毒的纤维顶球进行改造，使之能够高效感染DC细胞，操作简单。

附图说明

附图1pAdEasy-1/F11p的构建示意图

PCR扩增合成嵌合基因中AgeI和MfeI位点之间的DNA序列，替换pFiber5中AgeI与MfeI之间编码AdEasy-1纤维基因的片段，得到含有嵌合基因的新质粒pAdEasy-1/F11p。

附图2骨架质粒pAdEasy-1/F 11p的酶切鉴定

M为λ/HindIII Marker；1-6为不同克隆的Xbal I和HindIII双酶切产物。骨架质粒全长为8872bp，酶切产物长度为2399bp和6463bp，其中克隆5为非目的克隆。

附图3AdEasy-1/F11p-GFP的构建示意图

1表示pShuttle-cmv经PmeI酶切，并电转BJ5183感受态细胞，与AdEasy-1/F11p-GFP同源重组，得到AdEasy-1/F11p-GFP；2表示AdEasy-1/F11p-GFP经PacI酶切线性化；3表示线性化AdEasy-1/F11p-GFP转染HEK293细胞，包装产生重组腺病毒。

附图4重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP的鉴定

采用PCR法鉴定；1、质粒AdEasy-1/F11p为模板扩增Ad11p纤维基因阳性对照；2、AdEasy-1/F11p-GFP基因组DNA为模板扩增Ad11p纤维基因；3、AdEasy-1/GFP基因组DNA为模板扩增Ad11p纤维基因；4、质粒AdEasy-1为模板扩增Ad5纤维基因阳性对照；5、AdEasy-1/GFP基因组DNA为模板扩增Ad5纤维基因；6、AdEasy-1/F11p-GFP基因组DNA为模板扩增Ad5纤维基因；7、AdEasy-1/GFP基因组DNA为模板扩增GFP；8、AdEasy-1/F11p-GFP基因组DNA为模板扩增GFP；M、DL2000Marker

附图5经GM-CSF和IL-4诱导的成熟DC细胞

附图6重组腺病毒Ad5-GFP和Ad5F11p-GFP对DC感染效率的检测

重组腺病毒感染DC细胞后，流式细胞术检测GFP蛋白的表达情况。横坐标代表重组腺病毒的不同感染滴度，纵坐标代表GFP+细胞的比例。1代表0MOI，2代表50MOI感染，3代表100MOI感染，4代表200MOI感染，5代表300MOI感染，6代表400MOI感染。

附图7DC细胞表面CD46表达情况流式检测结果

附图8重组腺病毒对DC细胞表型的影响

利用流式细胞术检测重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP感染后DC细胞表面标志的改变。Con代表对照组；G200M代表AdEasy-1/GFP200MOI感染细胞；P200M代表AdEasy-1/F11p-GFP 200MOI感染细胞。1代表CD14，2代表CD80，3代表CD86，4代表HLA-DR，5代表CD1a，6代表CD83。

附图9重组腺病毒对DC细胞凋亡的影响

通过Annexin V-PE或PI染色法，利用流式细胞术检测DC细胞凋亡与死亡。Con代表对照组；G200M代表AdEasy-1/GFP 200MOI感染细胞；P200M代表AdEasy-1/F11p-GFP 200MOI感染细胞。1代表Annexin V，2代表PI。

附图10重组腺病毒对混合淋巴细胞反应中DC对T细胞的刺激作用的影响

采用³H-TdR掺入法检测混合淋巴细胞反应。Con代表对照组；G200M代表AdEasy-1/GFP 200MOI感染细胞；P200M代表AdEasy-1/F11p-GFP 200MOI感染细胞。横坐标代表DC与同种异体T细胞的比例，纵坐标代表每分钟脉冲值(CPM值)。

具体实施方式

实施例1经纤维基因改造的骨架质粒AdEasy-1/F11p的构建

采用EcoRI酶切AdEasy-1骨架质粒，得到大片段和小片段，小片段环化形成质粒pFiber5。PCR方式人工合成分F 11p，取代pFiber5中的部分序列，得到重组质粒pFiber5/11p。EcoRI线性化pFiber5/11p后，与EcoRI酶切AdEasy-1得到的大片段连接，得到改造的骨架质粒AdEasy-1/F11p(如附图1所示)。具体为：

(1)pFiber5质粒的构建

限制性内切酶EcoRI酶切pAdEasy-1，得到长度分别为23825bp和9625bp的两个片段。其中小片段(9625bp)序列中包含纤维基因、AdEasy-1左臂同源区、pBR322复制起始区和氨苄抗性基因的开放读码框，将其自连制备成小质粒，经酶切鉴定正确，该质粒命名为pFiber5。

(2)F11p相关序列的合成

根据GeneBank中Ad11p-fiber的基因序列(GI：33465830)自行设计的22条引物，见序列表序列1～序列22，采用重叠延伸PCR方法，人工合成f11p基因序列。具体为：第一轮分别扩增得到222bp，255bp，122bp，127bp，121bp和288bp，共6条条带；第二轮将1～3号产物合成得到527bp条带，将4～6号产物合成得到443bp条带；第三轮最终得到全长F 11p序列，其大小为984bp。F11p的全序列见序列表序列23。

(3)质粒pFiber5/11p的构建

将合成的F11p的DNA序列，经酶切连接替换pFiber5中的部分序列。具体为：AgeI和MfeI双酶切pFiber5质粒，回收大片段，并将其与F11p片段连接得到目的质粒，经酶切、PCR和测序鉴定正确，将该质粒命名为pFiber5/11p。该质粒的全序列见序列表序列24。

(4)经纤维基因改造的骨架质粒AdEasy-1/F11p的构建

用EcoRI酶切pFiber5/11p，去磷酸化，与AdEasy-1的长度为23825bp片段相连，经氨苄青霉素筛选得到骨架质粒AdEasy-1/F11p。经酶切鉴定正确(如附图2所示)。

实施例2穿梭质粒pShuttle-cmv-GFP的构建

其方法是以pEGFP-C1质粒为模板，扩增得到GFP基因，将其通过酶切、连接的方法克隆到穿梭质粒pShuttle-cmv上。具体为：

(1)目的基因GFP的扩增

根据pEGFP-C1的序列(B.D.Clontech，Palo Alto，CA，USA)设计引物，见序列表序列25～序列26。以pEGFP-C1为模板，PCR扩增得到GFP基因。

(2)pShuttle-cmv-GFP的构建

BglII和EcoRV分别酶切穿梭质粒pShuttle-cmv和目的基因GFP，连接，并采用Kana⁺筛选得到携带GFP的穿梭质粒pShuttle-cmv-GFP，经酶切、PCR和测序鉴定正确。

实施例3重组腺病毒Ad5F11p-GFP和Ad5-GFP的制备

其方法是PmeI酶切穿梭质粒pshuttle-cmv-GFP，电转BJ5183感受态细胞，与Ad5F11p或AdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒Ad5F11p-GFP和Ad5-GFP(如附图3所示)。PacI酶切重组腺病毒质粒，并将其转染HEK293细胞制备病毒。鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定(如附图4所示)。

(1)重组腺病毒质粒的产生：

将穿梭质粒pshuttle-cmv-GFP进行PmeI酶切，并去磷酸化，以“200Ω，2.5KV，25μF”的条件电击转化BJ5183-AdEasy-1(购自Stratagene公司)或者BJ5183-AdEasy-1/F11p感受态细胞(自行制备)同源重组，Kana⁺筛选得到腺病毒质粒AdEasy-1/F11p-GFP和AdEasy-1/GFP。PacI酶切鉴定正确后进行重组腺病毒的制备。

(2)重组腺病毒的制备：

鉴定正确的重组腺病毒质粒pAdEasy-1/F11p-GFP和pAdEasy-1/GFP，经PacI酶切和酚氯仿抽提纯化，转染包装细胞HEK293(保藏号：C12-7-14)，8天噬斑形成，11d细胞完全病变。收集细胞及上清，反复冻溶3次后离心收集上清。制备得到的重组腺病毒能够表达GFP蛋白。

(3)重组腺病毒的鉴定：

病毒上清感染HEK293细胞，48～72h出现细胞病变。收集细胞，荧光显微镜观察或者流式细胞仪检测，可以观察到绿色荧光蛋白的表达。以上结果表明我们成功制备了重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP及对照腺病毒AdEasy-1/GFP。

(4)重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定：

重组腺病毒感染HEK293细胞后进行病毒扩增，收集病变细胞。氯化铯密度梯度法纯化后于-80℃保存在含10％甘油的Hank’s液中备用。用紫外分光光度计法和有限稀释法分别测定重组腺病毒AdEasy-1/GFP和AdEasy-1/F11p-GFP的颗粒滴度(viral particle units permilliliter，vp/ml)，纯度(OD260nm/280nm)和感染滴度(infection unitsper milliliter，IU/ml)，这些指标均符合实验需要，结果见表1。

表1重组腺病毒AdEasy-1/GFP和AdEasy-1/F11p-GFP滴度测定结果

实施例5重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP和AdEasy-1/GFP对DC感染效率的检测：

其方法是构建并制备纤维基因修饰的携带GFP表达的重组腺病毒，同时构建并制备携带GFP的对照腺病毒。将其以不同的MOI感染原代分离的DC细胞，荧光显微镜和流式细胞术观察GFP表达效率，评价AdEasy-1/F11p-GFP对DC的靶向性与感染效率。

(1)DC的分离、培养：

供者连续5天静脉输注GM-CSF，之后1天采外周血。首先通过血细胞分离器分离外周血白细胞，之后，再利用Ficoll-Paque进行密度梯度离心分离外周血单个核细胞。以5×10⁷细胞/75cm²皿培养在含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺的1640培养基中。细胞贴壁生长1-2小时后，轻轻将未贴壁的细胞和贴壁不牢细胞去掉，贴壁细胞继续在培养皿中培养，加入诱导培养基，即含2mM谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10％FBS，200ng/ml GM-CSF，500U/mlIL-4的RPMI 1640。每2-3天更换一次诱导培养基，6天后，细胞表现为典型的DC形态(图5)。

(2)流式细胞术测定GFP在DC细胞中的表达效率：

将DC细胞以2×10⁵细胞/孔接种24孔板，第2天分别以0MOI、50MOI、100MOI、200MOI、300MOI和400MOI重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP和AdEasy-1/GFP感染细胞，感染后4h换液。于感染后24h流式检测GFP的表达(如图6所示)。

以300MOI组为例，DC细胞感染后24h，对照组GFP的表达效率30％，而实验组的表达效率为80％。表明修饰后的腺病毒可以高效感染DC细胞。

(3)DC细胞表面CD46分子表达检测：

将诱导培养基培养5天的DC细胞以2×10⁵细胞/孔接种24孔板。以200MOI/细胞于37℃感染2小时后，弃上清，加入1.5ml诱导培养基继续培养22小时。首先将DC与鼠抗人CD46单抗室温孵育30分钟，PBS洗细胞2次后加入APC-羊抗鼠IgG，室温孵育30分钟，流式细胞仪检测CD46分子的表达情况。结果显示DC细胞表面CD46分子的表达比例为99％以上(如图7所示)。

实施例6重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP对DC细胞表型的影响

其方法是将诱导培养基培养5天的DC细胞以2×10⁵细胞/孔接种24孔板。以200MOI/细胞于37℃感染2小时后，弃上清，加入1.5ml诱导培养基继续培养22小时。然后，将DC分别与PE-anti-CD1a，PE-anti-CD80，PE-anti-CD83，APC-anti-CD 14，APC-anti-CD86，APC-anti-HLA-DR孵育，以PE-和APC-标记的同型抗体作为对照。流式细胞仪检测结果显示重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP对DC细胞的表型没有影响(如图8所示)。

实施例7重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP对DC细胞凋亡的影响

将诱导培养基培养5天的DC细胞以2×10⁵细胞/孔接种24孔板。以200MOI/细胞于37℃感染2小时后，弃上清，加入1.5ml诱导培养基继续培养22小时。然后，将DC分别与Annexin V-PE或PI孵育，。流式细胞仪检测重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP对DC细胞凋亡的影响。(如图9所示)结果显示，重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP不会影响DC细胞的凋亡。

实施例8重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP对混合淋巴细胞反应中DC对T细胞的刺激作用的影响：

(1)人外周血T细胞的分离与鉴定：利用Ficoll-Paque Plus试剂通过密度梯度离心法分离健康献血者外周血单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cells，PBMCs)。PBMCs悬于含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素的1640培养基中。细胞贴壁生长1小时后，轻轻收集未贴壁的细胞，利用尼龙毛分离法纯化T细胞。将纯化所得细胞与PE-anti-CD3孵育，通过流式细胞仪检测T细胞的纯度。

(2)同种混合淋巴细胞反应：以200MOI重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP感染DC细胞，经GM-CSF和IL-4诱导6天后，⁶⁰Co 30Gy照射细胞。将细胞分别以1×10³/200μl/孔，5×10³/200μl/孔，1×10⁴/200μl/孔或2×10⁴/200μl/孔的密度接种96孔板，与1×10⁵同种异体T细胞孵育(每组设3复孔)。共培养4天后，在实验终止前16小时每孔加入加1μCi³H-TdR。通过液闪仪检测其放射性，结果以平均脉冲值表示。结果显示在同种混合淋巴细胞反应中，重组腺病毒AdEasy-1/F11p-GFP不会影响DC对T细胞的刺激活性(如图10所示)。

综上所述，我们成功构建了可以高效感染DC细胞的重组腺病毒，该腺病毒本身不会影响DC的生物学特性。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

 

<120>一种高效介导DC基因转移的腺病毒

 

<130>

 

<160>27

 

<170>PatentIn version 3.2

 

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<213>

<400>23

cgggaccggt cctccaactg tgccttttct tactcctccc tttgtatccc ccaatgggtt   60

tcaagagagt ccccctggag ttcttacttt aaaatgttta accccactaa caaccacagg  120

cggatctcta cagctaaaag tgggaggggg acttacagtg gatgacacca acggtttttt  180

gaaagaaaac ataagtgcca ccacaccact cgttaagact ggtcactcta taggtttacc  240

actaggagcc ggattgggaa cgaatgaaaa taaactttgt atcaaattag gacaaggact  300

tacattcaat tcaaacaaca tttgcattga tgacaatatt aacaccttat ggacaggagt  360

caaccccacc gaagccaact gtcaaatcat gaactccagt gaatctaatg attgcaaatt  420

aattctaaca ctagttaaaa ctggagcact agtcactgca tttgtttatg ttataggagt  480

atctaacaat tttaatatgc taactacaca cagaaatata aattttactg cagagctgtt  540

tttcgattct actggtaatt tactaactag actctcatcc ctcaaaactc cacttaatca  600

taaatcagga caaaacatgg ctactggtgc cattactaat gctaaaggtt tcatgcccag  660

cacgactgcc tatcctttca atgataattc tagagaaaaa gaaaactaca tttacggaac  720

ttgttactac acagctagtg atcgcactgc ttttcccatt gacatatctg tcatgcttaa  780

ccgaagagca ataaatgacg agacatcata ttgtattcgt ataacttggt cctggaacac  840

aggagatgcc ccagaggtgc aaacctctgc tacaacccta gtcacctccc catttacctt  900

ttactacatc agagaagacg actgagccca agaataaaga atcgtttgtg ttatgtttca  960

acgtgtttat ttttcaattg cccg 984

 

<210>24

<211>50

<212>DNA

<213>

<400>24

gaattctctt ggaacaggcg gctattacca ccacacctcg taataacctt aatccccgta  60

gttggcccgc tgccctggtg taccaggaaa gtcccgctcc caccactgtg gtacttccca 120

gagacgccca ggccgaagtt cagatgacta actcaggggc gcagcttgcg ggcggctttc 180

gtcacagggt gcggtcgccc gggcagggta taactcacct gacaatcaga gggcgaggta 240

ttcagctcaa cgacgagtcg gtgagctcct cgcttggtct ccgtccggac gggacatttc  300

agatcggcgg cgccggccgt ccttcattca cgcctcgtca ggcaatccta actctgcaga  360

cctcgtcctc tgagccgcgc tctggaggca ttggaactct gcaatttatt gaggagtttg  420

tgccatcggt ctactttaac cccttctcgg gacctcccgg ccactatccg gatcaattta  480

ttcctaactt tgacgcggta aaggactcgg cggacggcta cgactgaatg ttaagtggag  540

aggcagagca actgcgcctg aaacacctgg tccactgtcg ccgccacaag tgctttgccc  600

gcgactccgg tgagttttgc tactttgaat tgcccgagga tcatatcgag ggcccggcgc  660

acggcgtccg gcttaccgcc cagggagagc ttgcccgtag cctgattcgg gagtttaccc  720

agcgccccct gctagttgag cgggacaggg gaccctgtgt tctcactgtg atttgcaact  780

gtcctaacct tggattacat caagatcctc tagttataac tagagtaccc ggggatctta  840

ttccctttaa ctaataaaaa aaaataataa agcatcactt acttaaaatc agttagcaaa  900

tttctgtcca gtttattcag cagcacctcc ttgccctcct cccagctctg gtattgcagc  960

ttcctcctgg ctgcaaactt tctccacaat ctaaatggaa tgtcagtttc ctcctgttcc 1020

tgtccatccg cacccactat cttcatgttg ttgcagatga agcgcgcaag accgtctgaa 1080

gataccttca accccgtgta tccatatgac acggaaaccg gtcctccaac tgtgcctttt 1140

cttactcctc cctttgtatc ccccaatggg tttcaagaga gtccccctgg agttcttact 1200

ttaaaatgtt taaccccact aacaaccaca ggcggatctc tacagctaaa agtgggaggg 1260

ggacttacag tggatgacac caacggtttt ttgaaagaaa acataagtgc caccacacca 1320

ctcgttaaga ctggtcactc tataggttta ccactaggag ccggattggg aacgaatgaa 1380

aataaacttt gtatcaaatt aggacaagga cttacattca attcaaacaa catttgcatt 1440

gatgacaata ttaacacctt atggacagga gtcaacccca ccgaagccaa ctgtcaaatc 1500

atgaactcca gtgaatctaa tgattgcaaa ttaattctaa cactagttaa aactggagca 1560

ctagtcactg catttgttta tgttatagga gtatctaaca attttaatat gctaactaca 1620

cacagaaata taaattttac tgcagagctg tttttcgatt ctactggtaa tttactaact 1680

agactctcat ccctcaaaac tccacttaat cataaatcag gacaaaacat ggctactggt 1740

gccattacta atgctaaagg tttcatgccc agcacgactg cctatccttt caatgataat 1800

tctagagaaa aagaaaacta catttacgga acttgttact acacagctag tgatcgcact 1860

gcttttccca ttgacatatc tgtcatgctt aaccgaagag caataaatga cgagacatca 1920

tattgtattc gtataacttg gtcctggaac acaggagatg ccccagaggt gcaaacctct 1980

gctacaaccc tagtcacctc cccatttacc ttttactaca tcagagaaga cgactgagcc  2040

caagaataaa gaatcgtttg tgttatgttt caacgtgttt atttttcaat tgcagaaaat  2100

ttcaagtcat ttttcattca gtagtatagc cccaccacca catagcttat acagatcacc  2160

gtaccttaat caaactcaca gaaccctagt attcaacctg ccacctccct cccaacacac  2220

agagtacaca gtcctttctc cccggctggc cttaaaaagc atcatatcat gggtaacaga  2280

catattctta ggtgttatat tccacacggt ttcctgtcga gccaaacgct catcaagtga  2340

tattaataaa ctccccgggc agctcactta agttcatgtc gctgtccagc tgctgagcca  2400

caggctgctg tccaacttgc ggttgcttaa cgggcggcga aggagaagtc cacgcctaca  2460

tggggggaga gtcataatcg tgcatcagga tagggcggtg gtgctgcagc agcgcgcgaa  2520

taaactgctg ccgccgccgc tccgtcctgc aggaatacaa catggcagtg gtctcctcag  2580

cgatgattcg caccgcccgc agcataaggc gcttgtcctc cgggcacagc agcgcaccct  2640

gatctcactt aaatcagcac agtaactgca gcacagcacc acaatattgt tcaaaatccc  2700

acagtgcaag gcgctgtatc caaagctcat ggcggggacc acagaaccca cgtggccatc  2760

ataccacaag cgcaggtaga ttaagtggcg acccctcata aacacgctgg acataaacat  2820

tacctctttt ggcatgttgt aattcaccac ctcccggtac catataaacc tctgattaaa  2880

catggcgcca tccaccacca tcctaaacca gctggccaaa acctgccccg ccgggntata  2940

cactgcaggg aaccgggact tggacaatga caagtgggag agcccaggac tcgtaaccat  3000

ggatcatcat gctcgtcatg atatcaatgt tggcacaaca caggcacacg tgcatacact  3060

tcctcaggat tacaagctcc tcccgcgtta gaaccatatc ccagggaaca acccattcct  3120

gaatcagcgt aaatcccaca ctgcagggaa gacctcgcac gtaactcacg ttgtgcattg  3180

tcaaagtgtt acattcgggc agcagcggat gatcctccag tatggtagcg cgggtttctg  3240

tctcaaaagg aggtagacga tccctactgt acggagtgcg ccgagacaac cgagatcgtg  3300

ttggtcgtag tgtcatgcca aatggaacgc cggacgtagt catatttcct gaagcaaaac  3360

caggtgcggg cgtgacaaac agatctgcgt ctccggtctc gccgcttaga tcgctctgtg  3420

tagtagttgt agtatatcca ctctctcaaa gcatccaggc gccccctggc ttcgggttct  3480

atgtaaactc cttcatgcgc cgctgccctg ataacatcca ccaccgcaga ataagccaca  3540

cccagccaac ctacacattc gttctgcgag tcacacacgg gaggagcggg aagagctgga  3600

agaaccatgt tttttttttt attccaaaag attatccaaa acctcaaaat gaagatctat  3660

taagtgaacg cgctcccctc cggtggcgtg gtcaaactct acagccaaag aacagataat  3720

ggcatttgta agatgttgca caatggcttc caaaaggcaa acggccctca cgtccaagtg 3780

gacgtaaagg ctaaaccctt cagggtgaat ctcctctata aacattccag caccttcaac 3840

catgcccaaa taattctcat ctcgccacct tctcaatata tctctaagca aatcccgaat 3900

atttaagtcc gggccattgt aaaaaatttg gctccagagc gccctccacc ttcagcctca 3960

agcagcgaat catgattgca aaaattcagg ttcctcacag acctgtataa gattcaaaag 4020

cggaacatta acaaaaatac cgcgatcccg taggtccctt cgcagggcca gctgaacata 4080

atcgtgcagg tctgcacgga ccagcgcggc cacttccccg ccaggaacca tgacaaaaga 4140

acccacactg attatgacac gcatactcgg agctatgcta accagcgtag ccccgatgta 4200

agcttgttgc atgggcggcg atataaaatg caaggtgctg ctcaaaaaat caggcaaagc 4260

ctcgcgcaaa aaagaaagca catcgtagtc atgctcatgc agataaaggc aggtaagctc 4320

cggaaccacc acagaaaaag acaccatttt tctctcaaac atgtctgcgg gtttctgcat 4380

aaacacaaaa taaaataaca aaaaaacatt taaacattag aagcctgtct tacaacagga 4440

aaaacaaccc ttataagcat aagacggact acggccatgc cggcgtgacc gtaaaaaaac 4500

tggtcaccgt gattaaaaag caccaccgac agctcctcgg tcagtccgga gtcataatgt 4560

aagactcggt aaacacatca ggttgattca catcggtcag tgttaaaaag cgaccgaaat 4620

agccnggggg aatacaatac ccgcaggcgt agagacaaca ttacagcccc cataggaggt 4680

ataacaaaat taataggaga gaaaaacaca taaacacctg aaaaaccctc ctgcctaggc 4740

aaaatagcac cctcccgctc cagaacaaca tacagcgctt ccacagcggc agccataaca 4800

gtcagcctta ccagtaaaaa agaaaaccta ttaaaaaaac accactcgac acggcaccag 4860

ctcaatcagt cacagtgtaa aaaagggcca agtgcagagc gagtatatat aggactaaaa 4920

aatgacggta acggttaaag tccacaaaaa acacccagaa aaccgcacgc gaacctacgc 4980

ccagaaacga aagccaaaaa acccacaact tcctcaaatc gtcacttccg ttttcccacg 5040

ttacgtcact tcccatttta agaaaactac aattcccaac acatacaagt tactccgccc 5100

taaaacctac gtcacccgcc ccgttcccac gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc 5160

tcattatcat attggcttca atccaaaata aggtatatta ttgatgatgt taattaacat 5220

gcatggatcc tcgtctcgac gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg 5280

tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc 5340

gtaggacagg tgccggcagc gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc 5400

gcgacgatga tcggcctgtc gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc 5460

ttcgtcactg gtcccgccac caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg 5520

gcggccgacg cgctgggcta cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc 5580

cccattatga ttcttctcgc ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg 5640

tccaggcagg tagatgacga ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc 5700

agcctaactt cgatcactgg accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc 5760

acatggaacg ggttggcatg gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg 5820

ttgcgtcgcg gtgcatggag ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg 5880

ctaacggatt caccactcca agaattggag ccaatcaatt cttgcggaga actgtgaatg 5940

cgcaaaccaa cccttggcag aacatatcca tcgcgtccgc catctccagc agccgcacgc 6000

ggcgcatctc gggcagcgtt gggtcctggc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt 6060

tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac 6120

gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa 6180

tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca 6240

ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg 6300

tattaacgaa gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata 6360

ccgccagttg tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc 6420

gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaattccc 6480

ccttacacgg aggcatcaag tgaccaaaca ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt 6540

tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca 6600

ggcagacatc tgtgaatcgc ttcacgacca cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc 6660

gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc 6720

ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg 6780

cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt 6840

aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg 6900

cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 6960

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 7020

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 7080

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 7140

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 7200

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg  7260

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca  7320

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa  7380

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg  7440

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg  7500

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg  7560

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc  7620

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag  7680

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac  7740

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc  7800

ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag  7860

taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt  7920

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag  7980

ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca  8040

gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact  8100

ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca  8160

gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg  8220

tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc  8280

atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg  8340

gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca  8400

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt  8460

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaacacggg ataataccgc gccacatagc  8520

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc  8580

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca  8640

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa  8700

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat  8760

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa  8820

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctgn nn 8872

<210>25

<211>26

<212>DNA

<213>

<400>25

ggggagatct atggtgagca agggcg  26

 

<210>26

<211>27

<212>DNA

<213>

<400>26

gggggatatc tacttgtaca gctcgtc 27

Claims (6)

1.一种用于DC高效基因转移的重组腺病毒载体，其特征在于以AdEasy-1载体系统为基础，将AdEasy-1载体中编码5型腺病毒纤维顶球和柄部的DNA序列替换为11p型腺病毒的相应部分。

2.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于F11p具有序列表中序列23所述的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于其包括序列表中序列24所述的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于该腺病毒载体的构建方法是将携带目的基因的穿梭质粒和改构的腺病毒骨架质粒AdEasy-1/F11P在细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒；PacI线性化后转染到293细胞制备得到重组腺病毒。

5.一种重组腺病毒，其特征在于蛋白序列由权利要求1-4所述的腺病毒载体所编码。

6.权利要求1-5任一项所述的重组腺病毒在DC生物治疗中的应用。

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