CN102002490A

CN102002490A - 9个用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA标志物

Info

Publication number: CN102002490A
Application number: CN2009101948119A
Authority: CN
Inventors: 何祥火; 魏霖; 梁琳慧; 顾健人
Original assignee: Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Shanghai Cancer Institute
Priority date: 2009-08-31
Filing date: 2009-08-31
Publication date: 2011-04-06

Abstract

本发明涉及9个用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA标志物。具体地，本发明涉及一类可用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA标志物。经检验证明，这些特异性的microRNA标志物可非常有效地区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本。本发明还涉及检测所述microRNA标志物的芯片和试剂盒。

Description

9个用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA标志物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及一类可用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA标志物以及用途。本发明还涉及检测所述microRNA标志物的芯片和试剂盒。

背景技术

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，每年新发病例约占全球50％。肝癌的恶性程度高，发展迅速，治疗困难，病死率高。因此，肝癌的尽早诊断就愈发显得迫切。

任何事物的发生发展都处于内外因共同作用之下，内因为主，外因为辅。基因作为生命的遗传介质，在生物体的生、老、病、死中处于基础内因的地位。绝大部分基因通过转录生成核糖核酸，再翻译生成蛋白质而发挥生物学功能。

microRNA(miR或miRNA，微小RNA)是一类在较高等的真核生物体内广泛存在的，长度约18-26个碱基的单链RNA分子。它可以通过碱基配对原则特异性地与一些mRNA上的靶位点相结合，引起靶mRNA降解或翻译抑制，进而在转录后水平对靶基因进行调控。

microRNA来源于长度约为1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60～80nt的具有茎环结构的miRNA前体(Pre-miRNA)。Pre-miRNA转运至胞质后，被Dicer酶进一步切割成长约22nt的双链miRNA。双链miRNA解开后，成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，与互补mRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其表达。

尽管microRNA在细胞总RNA中所占的比重很小，但由于它可以高效地对所有具有靶位点的mRNA产生调控作用，microRNA在生物体的发育乃至肿瘤的发生、发展过程所起的作用仍不可小视。

然而，迄今为止，本领域对于与肿瘤(如肝癌)相关的microRNA了解甚少，因此本领域迫切需要进一步地分离各种microRNA，尤其是与肿瘤的发生、转移、复发或检测有关的microRNA。

发明内容

本发明的目的就是提供一类新的、可用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA标志物。

本发明的另一目的就是提供所述microRNA标志物的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA选自：

(i)序列如SEQ ID NO：n所示的miRNA，其中n为选自1-9的正整数；或

(ii)与SEQ ID NO：n所示序列互补的miRNA。

在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。

在本发明的第二方面，提供了一种miRNA集(set)或组合(combination)，所述的集或组合由序列如SEQ ID NO：1-9所示的9种miRNA所构成。

在本发明的第三方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第一方面中所述的miRNA。

在本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第一方面中所述的miRNA。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I，

式I中，

Seq_正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补，

并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II，

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

在本发明的第五方面，提供了一种载体，它含有本发明第一方面中所述的miRNA，或第四方面中所述的多核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了本发明第一方面中所述的miRNA的用途，用于制备预测原发性肝癌是否复发或区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本的芯片或试剂盒。

在本发明的第七方面，提供了一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO：1-9所示的部分或全部序列。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：

互补结合区；和/或

与固相载体相连的连接区。

在本发明的第八方面，提供了上述miRNA芯片的用途，用于制备预测原发性肝癌是否复发或区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本的试剂盒。

在本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明上述所述的miRNA芯片。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：以MDS算法转换后的有复发样本(红色或浅色)和无复发样本(蓝色或深色)在三维空间内的散点图。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，通过检测原发性肝癌的有复发样本(癌组织和癌旁组织)和无复发样本(癌组织和癌旁组织)的microRNA表达谱水平，用统计学方法，首次从中筛选出9个特异性的microRNA。经检验证明，这些特异性的microRNA标志物可非常有效地区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人采用芯片杂交的方法得到原发肝癌的有复发样本(癌组织和癌旁组织)和无复发样本(癌组织和癌旁组织)的microRNA表达谱，通过比较两种组织的表达谱，得到有复发样本与无复发样本间差异表达的microRNA。以这些差异microRNA作为候选，使用C-SVC或V-SVC分类器算法筛选得到分类准确度为100％的一组分类器(含9个microRNA)。由这9个microRNA组成的分类器，可预测样本是来自有复发样本还是无复发样本，其预测准确度达到100％。基于本发明的这9个microRNA，可以开发成小型microRNA芯片或RT-PCR试剂盒用于肝癌复发的预测。

miRNA及其前体

本发明提供了一类新的从人中发现的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、9个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA具有如SEQ ID NO：n所示的序列，其中n为选自1-9的正整数(也即n选自1，2，3，4，5，6，7，8或9)。

为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。

反义寡核苷酸

根据本发明所提供的miRNA序列，可以设计出了它们的反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。

在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleic acid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2’氧原子和4’碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。

作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。

将本发明所述的反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调相关miRNA的表达。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的人miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I，

式I中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II，

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

芯片

microRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种microRNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种microRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的microRNA的转录水平进行检测。

利用本发明所述的miRNA序列，还可以制备相应的miRNA芯片，进而研究其表达谱以及miRNAs的调节方式。

在另一方面，本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本。本发明的所述的miRNA芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO：1-9所示的序列。

具体地，可根据本发明所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on agenomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

另一个方面，本发明还提供了一种通过miRNA芯片检测人组织中miRNA表达谱的方法，包括步骤：

(1)提供分离自人组织的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；

(2)将(1)的RNA与所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；

(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的miRNA的表达谱。

从人组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法。

更优选的，在步骤(1)中，在从人组织组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在10-100之间(小片段RNA)。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获miRNA的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。

对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。

将上述的RNA与miRNA芯片进行杂交时，可以先将miRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。

本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。

然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray 3000等)获取待测信息。

检测试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测miRNA的表达谱；或用于预测或判断(或辅助性判断)原发性肝癌是否复发，或者用于区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本。

更优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明的主要优点在于：

(a)本发明提供了一类可用于预测原发性肝癌是否复发的、新的microRNA标志物。

(b)由本发明新的microRNA标志物所构成的分类器，可非常有效地区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1RNA样本的制备

组织样本：

23对癌和癌旁组织(包括10例有复发样本和13例无复发样本)来自于原发性肝癌(HCC)患者的手术切除标本，这些标本来自于浙江大学第一附属医院和启东肝癌研究所。上述所有标本的取得均通过上海市政府授权的WHO合作组织伦理委员会的同意。组织样本的临床资料包括：性别、年龄、肿瘤大小、病理分级(Edmonson)、肝硬化与否、转移与否、复发与否、HBV和HCV感染情况等。所有患者术前都没有接受化疗，术后随访最长达60个月。

基因芯片：

microRNA表达谱芯片，采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片(单通道芯片)。

组织总RNA提取

1.样品的收集和保存：离体组织切割成小块后立即置于液氮中速冻，然后可以移至-80℃冰箱保存。

2.组织块破碎：组织块放于液氮中研磨成粉，每克组织加入1ml Trizol(Invitrogen公司)。

3.总RNA抽提：按每毫升Trizol加0.2ml的氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育2-3分钟；4℃，10,000g离心15分钟；将无色上清液移入新的离心管中，加0.5ml异丙醇，室温孵育10分钟，10000g 4℃离心10分钟；倒掉上清，0.75ml 75％乙醇洗涤，4℃，7,500g离心5分钟；倒掉上清，室温干燥RNA沉淀5-10分钟(勿使RNA完全干燥)，用DEPC处理后的无RNA酶H2O溶解沉淀。

4.分光光度计法定量RNA，并取少量Total RNA进行电泳，检查RNA是否降解。

实施例2microRNA的提取和标记

用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照相应说明书。样品用T4 RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。简而言之，方法如下：

1.4μg小RNA和500ng 5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶-cy3-3’(Dharmacon，Chicago，USA)及2单位2units T4 RNA ligase(NEB，Ipswich，USA)，于4℃孵育2小时，对miRNA进行标记。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。

2.标记的RNA用0.3M醋酸钠和2.5体积乙醇进行沉淀，再用15μl含3×SSC、0.2％SDS和15％甲酰胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次，杂交用LifterSlip^TM(Erie，PA USA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。

3.将杂交室放在杂交仪BioMixer^TMII上(CapitalBio Corp，Beijing，China)于42℃水浴杂交过夜，之后用洗液洗两遍。

实施例3筛选差异显著的microRNA

10例有复发样本(癌和癌旁)与13例无复发样本(癌和癌旁)分别经荧光染料标记后，与microRNA表达谱芯片上的探针竞争性杂交。杂交后的芯片用晶LuxScan^TM 10K微阵列芯片扫描仪扫描获得结果图像，再通过其随机附带的LuxScan 3.0通用微阵列图像分析软件对杂交结果定量。由此，得到10例有复发样本(Metastasis)microRNA芯片和13例无复发样本(Non-Metastasis)microRNA芯片的表达谱数据。

将上述10例有复发芯片结果和13例无复发芯片结果首先用LOWESS(局部加权回归分析)归一化。之后，经归一化后的有复发、无复发的芯片结果取以2为底的对数(log₂X)，使用经两组T检验方法(因为有复发样本和无复发样本来源于不同病人)校正后的随机方差模型(RVM)筛选得到有复发/无复发的显著性差异microRNA。

为验证microRNA差异的显著性不是由巧合引起的，本发明人引入上述T检验方法后再对数据随机重排1000次，检测一个microRNA在通过前述方法筛选后被检定为显著性差异microRNA的假阳性率(FDR，False DiscoveryRate)。

只有在上述统计学方法中，只有p值＜0.05的microRNA才会被筛选为显著性差异microRNA。

分类器(可区分两类组织的microRNA)的筛选与验证

为寻找用于区分两类样本(有复发与无复发)，本发明人使用市售的Matlab软件的Lib-SVM工具包，使用C-SVC(参数C的支持矢量分类器)和V-SVC(参数V的支持矢量分类器)两种方法，并各自采用四种核函数(linear kernel，ploykernel，gauss kernel，tanh kernel)，共计8种方法构建SVM分类器。SVM(support vector mechine，支持矢量机)分类器是两类样本间差异microRNA的差异倍数的对数值的非线性函数，它寻找能最大化两类样本间距离的超平面，因而可以最好地区分两类样本。

为检验分类器的分类准确度，本发明人选用在所有的交叉检验方法中最稳定的10乘10折交叉检验法。10折交叉检验法，是将样本总体分成10个子份，每次选1个子份作为测试数据集，其余9个子份作为训练数据集，重复10次(每次以不同的一个子份作为测试数据集)。如此得到的10个检验结果相结合形成对分类器分类准确度的一个评估值。

再由8种算法中选择分类准确度最高的一种作为最佳分类器。

为直观地显示同组样本间的相似以及不同组样本间的相异，本发明人在3维视效中引入多维标度法(multidimensional scaling，MDS)。MDS算法以被分类器(一组microRNA)定义的样本-样本间相似度矩阵为基础，确定每一个样本在低维空间内的位置，并使之适应于3维视效。在此3维空间中，两样本越接近，则它们越相似；反之，若两样本相距越远，则它们之间越不同。

结果

有复发组织与无复发组织间共筛选到52个差异microRNA。以这些差异microRNA作为分类器候选。套入8种SVM分类器算法并使用前述的10乘10折的交叉检验来验证分类器的分类准确度。

经1000次数据置换的10乘10折交叉验证得到分类器后，为测试该分类器的预测能力，本发明人随机挑选8个样本作为未知样本，以该分类器对每个样本的组织来源(有复发样本或无复发样本)进行预测，观察其预测准确度。综合8种算法，由C-SVC(gauss kernel)和V-SVC(ploy kernel)这两种算法得到的分类准确度最高。这两种算法得到的用于区分有复发样本与无复发样本的9个microRNA组成的分类器(见表1)，其分类准确度可达到100％。对未知样本的预测准确率达到100％。

为便于直观显示分类器的分类效果，本发明人使用MDS算法将各个样本的9个microRNA信号值转换为3维的本征矢量，并将它们在3维空间中定位，绘制成有复发和无复发两类样本的三维散点图(见图1)。由图可判断异组的任意两个样本间的距离是否比同组的任意两个样本间的距离要大。

表1：组成分类器的9个microRNA。

SEQID NO：	MicroRNA名称	p-值	miRBase_ID	序列	复发/无复发倍数
						1	hsa-miR-101	0.017857	MIMAT0000099	UACAGUACUGUGAUAACUGAA	1.44
2	hsa-miR-106a	0.024634	MIMAT0000103	AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG	0.75
						3	hsa-miR-107	0.025895	MIMAT0000104	AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA	0.7
4	hsa-miR-125b	0.018548	MIMAT0000423	UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA	0.67
						5	hsa-miR-130a	0.011592	MIMAT0000425	CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU	0.72
6	hsa-miR-145	0.002101	MIMAT0000437	GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU	0.6
						7	hsa-miR-23b	0.008506	MIMAT0000418	AUCACAUUGCCAGGGAUUACC	0.74
8	hsa-miR-92	0.001238	MIMAT0000092	UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU	0.61
						9	PREDICTED_MIR191	0.017614	-	CGCCGCCCCGCACCTGCTGCTG	0.66

如上表所示，hsa-miR-101在复发样本中上调，因此可以将上调倍数(即与阴性对照相比的表达量比值)大于或等于1.44定为hsa-miR-101上调。hsa-miR-106a在复发样本中下调，因此可以将下调倍数(即与阴性对照相比的表达量比值)小于或等于0.75定为hsa-miR-106a下调。其他microRNA依此类推。

实施例4制备miRNA芯片

将表1提供的miRNA序列(SEQ ID NO：1-9)转换成互补序列，根据产生序列的GC比等特征在序列两端加上10-20nt的连接序列；核心序列不同，连接序列也不同。连接序列可以由程序随机产生，连接序列和核心序列形成的探针满足以下条件：

1)探针序列中，同一种核苷酸(A、C、G、T)的数量不能超过序列总数的50％；

2)任何连续的A、T或C、G的数量不能超过序列总数的25％；

3)G、C含量占序列总数的40％-60％；

4)探针序列不能自杂交，即探针序列中互补片段的长度不能超过探针长度的30％。

为使合成的探针稳定的结合在玻片上，采用常规的方法在合成后探针的5’端进行糖基修饰。

芯片的点制：先将玻片的表面进行烷基化修饰，以提高结合能力。采用常规的芯片点样方法进行点样，为了检测杂交试验的可重复性，每个探针在玻片上点3-6个杂交点。

实施例5试剂盒制备

将实施例4中制备的芯片封装好，与使用说明书一起置于一盒中，构成试剂盒。

实施例6芯片的检测

对从医院获得多个原发性肝癌样本(包括10例复发样本和8例无复发样本)，按实施例1和2方法制备和标记microRNA，然后用实施例4中制备的芯片，用双盲法进行检测。根据表1中所示的9种microRNA标志物的存在与否以及上调和下调情况来判断样本存在复发情况。其中，阳性对照和阴性对照分别为已知的复发样本和已知的无复发样本。

结果表明，由9种特异性的microRNA构成的分类器，其正确性为100％(与医院标明的复发情况完全相同)，可非常有效地区分原发性肝癌的样本是否有复发或无复发。10例复发样本的9种microRNA的表达模式都符合表1的情况，即除了hsa-miR-101上调外，其他都下调。与之相反，8例无复发样本的表达模式正好完全相反，都不符合表1的情况。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海市肿瘤研究所

<120>9个用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA标志物

<130>092874

<160>9

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

uacaguacug ugauaacuga a 21

<210>2

<211>23

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

aaaagugcuu acagugcagg uag 23

<210>3

<211>23

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

agcagcauug uacagggcua uca 23

<210>4

<211>22

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

ucccugagac ccuaacuugu ga 22

<210>5

<211>22

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

cagugcaaug uuaaaagggc au 22

<210>6

<211>23

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

guccaguuuu cccaggaauc ccu 23

<210>7

<211>21

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

aucacauugc cagggauuac c 21

<210>8

<211>22

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

uauugcacuu gucccggccu gu 22

<210>9

<211>22

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>9

cgccgccccg caccugcugc ug 22

Claims

1.一种分离的miRNA，其特征在于，所述的miRNA选自：

(i)序列如SEQ ID NO：n所示的miRNA，其中n为选自1-9的正整数；或

(ii)与SEQ ID NO：n所示序列互补的miRNA。

2.一种miRNA集，其特征在于，所述的集由序列如SEQ ID NO：1-9所示的9种miRNA所构成。

3.一种分离的或人工构建的前体miRNA，其特征在于，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成权利要求1所述的miRNA。

4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成权利要求1所述的miRNA。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I，

式I中，

Seq_正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

式II，

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的miRNA，或权利要求4所述的多核苷酸。

7.权利要求1所述的miRNA的用途，其特征在于，用于制备预测原发性肝癌是否复发或区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本的芯片或试剂盒。

8.一种miRNA芯片，其特征在于，所述的miRNA芯片包括：

固相载体；以及

9.如权利要求8所述的miRNA芯片的用途，其特征在于，用于制备预测原发性肝癌是否复发或区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本的试剂盒。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求8所述的miRNA芯片。