CN103930563A

CN103930563A - 用于预测癌症复发的方法和装置

Info

Publication number: CN103930563A
Application number: CN201280038428.4A
Authority: CN
Inventors: S.克努森; W.梅津
Original assignee: Medical Prognosis Institute AS
Current assignee: Allarity Therapeutics AS
Priority date: 2011-06-01
Filing date: 2012-06-01
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2032-06-01
Also published as: CA2836836A1; AU2012265177B2; EP2714927A1; EP2714927B1; JP6039656B2; JP2014516543A; US20140106986A1; WO2012163541A1; CN103930563B

Abstract

本发明涉及作为用于预测癌症患者的癌症复发的生物标志物的微RNA。本发明也涉及用于该目的的方法、装置和试剂盒。

Description

用于预测癌症复发的方法和装置

技术领域

本发明涉及用于预测癌症患者的癌症复发的方法、装置和试剂盒。

背景技术

对得自患者的肿瘤样品进行基因表达分析已经被用于促进癌症预后和诊断。基因表达谱可以揭示患者中癌症的存在，其类型、分期阶段和起源，以及是否涉及基因突变。基因表达甚至可能在预测化学疗法的效力中起作用。

近年来，已经发现了一类新的调节分子，即微 RNA 。确定它们在癌细胞中的浓度或表达已经揭示了其在癌症中的作用。已经证实，微 RNA 的检测可以用于确定癌症的起源部位，且可以用于区分侵袭性癌症和非侵袭性癌症。在基因和微 RNA 的表达水平中所含的信息是互补的，在预测或诊断方法中组合该信息可以产生在临床上更准确的和有用的结果。

肺癌是具有高死亡率的疾病。即使在外科手术以后，大多数肺癌患者经历复发和死亡。如果切除的肿瘤的直径超过 3 cm ，护理标准是给患者提供化学疗法以预防复发。如果肿瘤的直径小于 3 cm 且没有观察到肿瘤的扩散 ( 也被称作 Ia 期 ) ，则不给患者提供进一步治疗。仍然有超过半数的肺癌患者经历复发，并在 5 年内死亡。

需要在一种或多种针对癌症的医学治疗（包括外科手术）以后预测癌症患者的癌症复发的方法。

发明内容

本发明包括用于在一种或多种癌症治疗 ( 例如，外科手术、放射疗法和 / 或化学疗法 ) 之前或之后预测癌症患者的癌症复发的方法，所述方法通过确定至少一种生物标志物 ( 例如，超过一种生物标志物，诸如 2 、 3 或 4 种或更多种生物标志物 ) 的表达水平进行，其中所述生物标志物与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列具有至少 85% ( 例如， 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100%) 序列同一性。在一个实施方案中，所述方法涉及或者单一地或者以 2 种、 3 种或所有 4 种生物标志物的任意组合 ( 同时地或依次地 ) 确定生物标志物的表达水平，所述生物标志物具有 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 中的任一个的序列。

在另一个实施方案中，本发明的方法可以包括：确定 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 或与 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的任一个的序列具有至少 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100% 序列同一性的生物标志物 ) 的配对组合的表达水平。在另一个实施方案中，本发明的方法可以包括：确定 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 或与 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的任一个的序列具有至少 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100% 序列同一性的生物标志物 ) 的三联或四联组合的表达水平。本发明的方法可以包括：同时或依次确定 2 种或更多种生物标志物 ( 例如， 2 、 3 或 4 种生物标志物 ) 的表达水平。

本发明的方法包括：确定得自癌症患者的样品中的生物标志物的表达水平。所述样品可以是血液样品或组织样品，例如，肿瘤样品。本发明的方法可以用于在癌症患者的第一癌症治疗之前或之后预测任意类型的癌症（例如，肺癌，诸如非小细胞肺癌）的复发。在本发明的一个实施方案中，预测癌症患者的癌症复发的方法可以发生在第一癌症治疗之后。可替换地，所述预测可以发生在第一癌症治疗之前。在另一个实施方案中，所述预测可以发生在在第一治疗之后但是在第二治疗之前。可替换地，所述预测可以发生在第二癌症治疗之后。在本发明中描述的癌症治疗可以包括以下的一种或多种：外科手术、放射疗法和化学疗法和 / 或本领域已知的用于治疗癌症的任意其它疗法。在本发明的一个方面，化学治疗剂可以包括以下的一种或多种：药物、抗体和寡核苷酸。

在所述方法的一个方面，至少一种生物标志物 ( 例如，与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列具有至少 85% ( 例如， 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100%) 序列同一性的生物标志物 ) 的表达水平的增加或下降，指示没有癌症复发的良好预后。可替换地，一种或多种生物标志物 ( 例如，与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列具有至少 85% ( 例如， 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100%) 序列同一性的生物标志物 ) 的表达水平的增加或下降指示癌症复发的不良预后。

本发明的方法可以包括：基于癌症患者样品中的至少一种生物标志物 ( 例如，与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列具有至少 85% ( 例如， 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100%) 序列同一性的生物标志物 ) 的表达水平与得自正常患者的样品或得自第一 ( 或后续 ) 癌症治疗以后的患者的样品中的一种或多种生物标志物的表达水平的对比，预测癌症复发。可替换地，一种或多种生物标志物的表达的检测会单独提供足够预测癌症复发的信息。

本发明的方法可以包括：从患者 ( 例如，癌症患者 ) 样品 ( 例如，组织样品，诸如肿瘤样品 ) 收集核酸分子，并任选地使用定量逆转录 - 聚合酶链式反应 (qRT-PCR) 来扩增核酸分子，随后检测样品中的一种或多种生物标志物 ( 例如， 1 、 2 、 3 或 4 种生物标志物 ) ，或确定样品中的至少一种生物标志物 ( 例如， 1 、 2 、 3 或 4 种生物标志物 ) 的表达水平。

本发明涉及装置，其可以用于检测至少一种生物标志物 ( 例如，超过一种生物标志物，诸如 2 、 3 或 4 种或更多种生物标志物 ) 的表达或确定所述生物标志物的表达水平，且可以包括：至少一种 ( 例如，超过一种，诸如 2 、 3 或 4 种或更多种 ) 单链核酸分子 ( 也被称作寡核苷酸探针 ) ，所述单链核酸分子与生物标志物的序列或它的补体序列具有至少 85% ( 例如， 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100%) 序列同一性。所述生物标志物的序列包括 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列的至少 5 个 ( 例如， 5 、 6 、 7 、 8 、 10 、 12 、 15 、 20 或 22 个 ) 连续核苷酸。例如，所述装置可以包括寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针可以用于检测得自患者 ( 例如，癌症患者 ) 的组织样品中的 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 或与这些生物标志物互补的序列中的任一个的表达。

在一个实施方案中，所述装置包括寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的任意一个或多个的序列或它们的补体序列具有至少 100% 序列同一性。所述装置可以包括寡核苷酸探针的配对、三联或四联组合，所述寡核苷酸探针与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列或它们的补体序列具有至少 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100% 序列同一性。

所述装置允许所述装置的单链核酸分子 ( 例如，寡核苷酸探针 ) 与一种或多种生物标志物或它的一个或多个补体序列之间的特异性杂交。所述装置包括至少一种单链核酸分子，所述单链核酸分子具有在 10-100 个核苷酸范围内的长度 ( 例如， 10 、 20 、 25 、 30 、 40 、 60 、 80 或 100 个核苷酸的长度，或在 5-50 、 20-50 或 20-100 个核苷酸范围内的长度 ) 。当使所述装置与从样品制备的不同核酸分子群体在允许杂交的条件下接触时，所述装置中的寡核苷酸探针与它们的靶生物标志物杂交，并且可以检测至少一种生物标志物 ( 例如， 1 、 2 、 3 或 4 种生物标志物 ) 在样品 ( 例如，患者组织样品 ) 中的存在。可替换地，所述装置可以用于确定一种或多种 ( 例如， 1 、 2 、 3 或 4 种 ) 上述生物标志物的表达水平。在本发明的一个实施方案中，所述装置是微阵列装置。

本发明包括用于预测癌症患者的癌症复发的方法，所述方法通过下述进行：使用上述装置来检测患者样品 ( 例如，肿瘤样品 ) 中的至少一种生物标志物 ( 例如，与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列具有至少 85% ( 例如， 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100%) 序列同一性的生物标志物 ) 或确定所述生物标志物的表达水平，使得一种或多种 ( 例如， 1 、 2 、 3 或 4 种 ) 生物标志物的检测或表达水平预示患者中的癌症复发的预后。所述样品可以得自被诊断出本文中描述的任一种癌症 ( 例如，肺癌，更具体地，非小细胞肺癌 ) 的患者。所述装置可以用于在第一癌症治疗之前或之后预测癌症患者的癌症复发。可替换地，所述装置可以用于在第一癌症治疗之后、但是在第二治疗之前预测癌症复发。在本发明的另一个方面，所述装置可以用于在第二癌症治疗之后预测癌症复发。

所述方法的装置可以用于检测至少一种上述生物标志物 ( 例如， 1 、 2 、 3 或 4 种生物标志物 ) 的表达水平的增加或下降，所述增加或下降指示没有癌症复发的良好预后。可替换地，所述装置可以用于检测一种或多种上述生物标志物 ( 例如， 1 、 2 、 3 或 4 种生物标志物 ) 的表达水平的增加或下降，所述增加或下降指示癌症复发的不良预后。

所述装置可以用于预测癌症复发，这基于癌症患者样品中的一种或多种生物标志物的表达水平与得自正常患者的样品或得自第一癌症治疗之后的患者的样品中的表达水平的对比。可替换地，所述装置对一种或多种生物标志物的表达的检测，可以用于预测癌症复发。

本发明也涉及试剂盒，其可以包括：用于从得自癌症患者的样品收集核酸分子的试剂，用于扩增从样品收集的核酸分子以产生扩增的样品的试剂，和至少一种用于检测扩增的样品中的至少一种生物标志物 ( 例如， 1 、 2 、 3 或 4 种生物标志物 ) 的表达水平的装置，所述生物标志物具有 SEQ ID NO: 1-4 中的任一个的序列。在一个实施方案中，可以使用定量逆转录 - 聚合酶链式反应 (qRT-PCR) 来产生扩增的样品。所述试剂盒可以进一步包括关于基于至少一种生物标志物 ( 例如，具有 SEQ ID NO: 1-4 中的任一个的序列的生物标志物的一种或多种或全部 ) 的表达水平来预测癌症患者的癌症复发的说明书。

在一个实施方案中，所述试剂盒可以包括上述的装置 ( 例如，微阵列装置 ) ，以检测样品中的至少一种 ( 例如， 1 、 2 、 3 或 4 种 ) 生物标志物 ( 例如，具有 SEQ ID NO: 1-4 中的任一个的序列的生物标志物 ) ，或确定样品中的至少一种 ( 例如， 1 、 2 、 3 或 4 种 ) 生物标志物的表达水平。所述试剂盒可以进一步包括关于将从样品收集的核酸分子应用于所述装置的说明书，和 / 或关于检测至少一种寡核苷酸探针与至少一种生物标志物或它的补体序列的杂交以便检测样品中的至少一种生物标志物的表达或确定所述生物标志物的表达水平的说明书。所述试剂盒可以进一步包括关于基于使用所述装置检测的所述至少一种生物标志物的表达水平来预测癌症患者的癌症复发的说明书。

与预测癌症复发有关的生物标志物被鉴别为，在需要（ warranted ）预测的相关组之间差异表达的那些。例如，可以针对本发明的生物标志物测定得自癌症患者的样品，以根据患者在癌症治疗（例如，外科手术、放射疗法和 / 或化学疗法）以后是否经历复发而将患者分组。从样品提取总 RNA （包括 mRNA 和微 RNA ），并根据标准操作进行标记。用一个或多个 DNA 微阵列（其含有与所述 mRNA 和 / 或微 RNA 互补的探针）测量得自每个已知基因的 mRNA 的量，或得自每个已知微 RNA 物种的微 RNA 的量。

该方案可以用于 mRNA 生物标志物以及用于微 RNA 生物标志物。预后是基于 mRNA 生物标志物、微 RNA 生物标志物或它们的组合，其都是使用一个或多个 DNA 微阵列 ( 或 RT-PCR) 针对提取自得自患者肿瘤的样品的标记的 RNA 来进行测量的。

本发明的方法可以用于在治疗之前或之后预测癌症 ( 例如，肺癌 ) 复发。目前没有良好且准确的方法确定癌症会否复发。本文所述的方法可以被例如肿瘤科医生使用，以基于个别肿瘤的基因构成选择对于患者而言最适当的治疗。知晓复发的可能性将允许肿瘤科医生选择一种或多种适当的化学疗法方案，或外科手术、化学疗法和放射疗法的组合。

本文中使用的“癌症患者”表示主体，例如，人类主体，其患有或曾患有癌症，且可能已经或尚未针对该癌症进行治疗。

本文中使用的核酸序列的“补体”或“互补”核酸序列表示这样的寡核苷酸：当它与核酸序列对齐时，处于“反向平行缔合”，使得一个序列的 5' 末端与另一个序列的 3' 末端配对。核苷酸和其它碱基可以具有补体，且可以存在于互补核酸中。可以被包括在本发明的核酸中的天然核酸中不常见的碱基包括，例如，肌苷和 7- 脱氮鸟嘌呤。“互补性”可以是不完美的；互补核酸的稳定双链体可以包含错配碱基对或未配对碱基。核酸技术领域的技术人员可以根据经验考虑许多变量来确定双链体稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸中胞嘧啶和鸟嘌呤碱基的浓度百分比、离子强度和错配碱基对的发生率。

当互补核酸序列形成稳定双链体时，它们被说成“杂交的”或彼此“杂交”，或者说“杂交”已发生。如果核酸包含根据沃森 - 克里克碱基配对规则（例如， G 与 C 、 A 与 T ，或 A 与 U ）可以形成氢键的核苷酸或核苷酸类似物或其它氢键合基序（例如二氨基嘌呤与 T 、 5- 甲基 C 与 G 、 2- 硫胸苷与 A 、肌苷与 C 、假异胞嘧啶与 G 等），则所述核酸被称为“互补的”。反义 RNA 可以与其它寡核苷酸（例如， mRNA ）互补。

本文中使用的“生物标志物”表示基因或主体的遗传材料的其它部分：其以可以测量的形式表达 ( 例如，作为 mRNA 、微 RNA 或蛋白质 ) ，且其表达指示患者中的癌症复发的良好或不良预后。

本文中使用的“标记基因”或“生物标记基因”是指细胞中的基因，所述基因的表达与细胞（且因此与从其获得细胞的患者）对治疗（例如，暴露于化合物）的敏感性或抗性关联。

本文中使用的“微阵列”是指由任何每次定量一种或多种受试寡核苷酸（例如， DNA 或 RNA ，或其类似物）的方法所采用的装置。微阵列的一个示例性种类由附着于玻璃或石英表面的 DNA 探针组成。例如，许多微阵列（包括由 Affymetrix 制备的那些）使用几种探针来确定单一基因的表达。 DNA 微阵列可以包含寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针可以是例如与 RNA 互补的全长 cDNA ，或与 RNA 的一部分杂交的 cDNA 片段。 DNA 微阵列还可以含有修饰形式的 DNA 或 RNA ，诸如锁定核酸或 LNA 。示例性的 RNA 包括 mRNA 、 miRNA 和 miRNA 前体。示例性微阵列还包括具有多个与底物结合的核酸的“核酸微阵列”，与多个被结合的核酸中的每一个的杂交是可分别检测的。底物可以是固体或多孔的、平面或非平面的、归一（ unitary ）或分散的。示例性核酸微阵列包括在下述参考文献中通常描述的所有装置： Schena ( 编 ), DNA Microarrays: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford University Press (1999); Nature Genet. 21(1)( 增刊 ):1-60 (1999); Schena ( 编 ), Microarray Biochip: Tools and Technology, Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000) 。此外，示例性核酸微阵列包括多个与底物结合的核酸，其中多个核酸设置在多个珠上而不是归一的平面底物上，如特别是 Brenner 等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1665-1670 (2000) 中描述的。核酸微阵列的例子可以在下述美国专利号中找到： 6,391,623 、 6,383,754 、 6,383,749 、 6,380,377 、 6,379,897 、 6,376,191 、 6,372,431 、 6,351,712 6,344,316 、 6,316,193 、 6,312,906 、 6,309,828 、 6,309,824 、 6,306,643 、 6,300,063 、 6,287,850 、 6,284,497 、 6,284,465 、 6,280,954 、 6,262,216 、 6,251,601 、 6,245,518 、 6,263,287 、 6,251,601 、 6,238,866 、 6,228,575 、 6,214,587 、 6,203,989 、 6,171,797 、 6,103,474 、 6,083,726 、 6,054,274 、 6,040,138 、 6,083,726 、 6,004,755 、 6,001,309 、 5,958,342 、 5,952,180 、 5,936,731 、 5,843,655 、 5,814,454 、 5,837,196 、 5,436,327 、 5,412,087 、 5,405,783 ，它们的公开内容通过引用整体并入本文。

示例性微阵列还可以包括具有多个与底物结合的多肽的“肽微阵列”或“蛋白质微阵列”，寡核苷酸、肽或蛋白质与多个被结合的多肽中每一个的结合是可分别检测的。可替代地，肽微阵列可以具有多个结合剂，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、噬菌体展示结合剂、酵母双杂交结合剂、适体，其可以特异性地检测特定寡核苷酸、肽或蛋白质的结合。肽阵列的例子可以在 WO 02/31463 、 WO 02/25288 、 WO 01/94946 、 WO 01/88162 、 WO 01/68671 、 WO 01/57259 、 WO 00/61806 、 WO 00/54046 、 WO 00/47774 、 WO 99/40434 、 WO 99/39210 、 WO 97/42507 和美国专利号 6,268,210 、 5,766,960 、 5,143,854 中找到，它们的公开内容通过引用整体并入本文。

本文中使用的“基因表达”是指在细胞、组织、生物体或主体中的基因产物的量，例如 DNA 、 RNA 或蛋白质的量， DNA 、 RNA 或蛋白质的修饰（例如剪接、磷酸化、乙酰化或甲基化）的量，或与给定基因相关的 DNA 、 RNA 或蛋白质的活性的量。

“治疗”或“医学治疗”是指给主体或活生物体施用化合物或使细胞或肿瘤暴露于化合物（例如，药物、蛋白质、抗体、寡核苷酸、化学治疗剂和放射性试剂）或用于治疗或预防癌症 ( 例如，肺癌 ) 或癌症征状的某些其它形式的医学干预 ( 例如，冷冻疗法和放射疗法 ) 。放射疗法包括给患者施用辐射，所述辐射从诸如粒子加速器和相关的医学装置来源产生，所述相关的医学装置发射 X 射线、γ射线或电子（β射线）束。治疗可以进一步包括外科手术，例如从主体或活生物体除去肿瘤。

从以下的详细描述、附图和权利要求书会看到本发明的其它特征和优点。

附图说明

图 1 的图显示了使用 60- 微 RNA 模型在留一法（ leave-one-out ）交叉验证中预测的 78 位非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者的复发的卡普兰 - 迈耶图。

图 2 的图显示了使用 4- 微 RNA 模型在独立验证中预测的 30 位 NSCLC 患者的总存活率的卡普兰 - 迈耶图。

详细描述

本发明涉及用于在癌症治疗 ( 例如，外科手术和 / 或使用一种或多种，并优选 2 种或更多种化学治疗剂和 / 或辐射的治疗 ) 之前或之后确定得自患者样品的一种或多种生物标志物的表达水平以预测癌症患者的癌症复发的方法。本发明也涉及包括核酸探针的装置 ( 例如，微阵列 ) ，所述核酸探针可以检测来自患者样品的一种或多种生物标志物的表达。所述装置可以用于在治疗之前或之后预测患者中的癌症是否将复发。本发明也涉及试剂盒，其用于确定来自患者样品的一种或多种生物标志物的表达水平以预测癌症患者的癌症复发。根据本发明的方法可以使用在仪器上运行的软件来实现，所述仪器与检测装置（诸如微阵列）结合地用于测量基因表达。被包含在用于处理得自主体的肿瘤样品的试剂盒中的检测装置 ( 例如，微阵列，诸如 DNA 微阵列 ) ，以及用于读出所述装置和将结果转换成主体的预后的仪器，可以用于实现本发明的方法。

癌症

本发明的方法、装置和试剂盒可以用于预测患者的癌症复发，所述患者遭受或被诊断出癌症，例如，乳房、前列腺、肺 ( 例如，非小细胞肺癌 ) 、支气管、结肠、直肠、膀胱、皮肤、肾、胰腺、口腔、咽、卵巢、甲状腺、副甲状腺、胃、脑、食管、肝、肝内胆管、子宫颈、喉、心脏、睾丸、小肠、大肠、肛门、肛管、肛门直肠、外阴、胆囊、胸膜、骨、关节、下咽、眼和 / 或眼眶、鼻、鼻腔、中耳、鼻咽、输尿管、腹膜、网膜、肠系膜和 / 或胃肠的癌症，以及任意形式的癌症，包括，例如，慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、癌、基底细胞癌、恶性间皮瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、视网膜母细胞瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、类癌瘤、急性肿瘤和 / 或软组织肉瘤 ( 例如，优选地，癌症是膀胱、乳房、结肠、直肠、子宫、肾、肺、皮肤 ( 例如，黑素瘤 ) 、胰腺、前列腺、血液和 / 或骨髓 ( 例如，白血病 ) 、淋巴细胞 ( 例如，非霍奇金淋巴瘤 ) 和 / 或甲状腺的癌症 ) 。

癌症治疗

本发明的方法、装置和试剂盒可以用于在第一治疗之前或之后确定癌症患者（例如，肺癌患者）中的癌症的复发潜力。所述第一治疗可以包括，例如，外科手术、放射疗法和 / 或化学疗法中的一种或多种。所述化学疗法可以包括，施用一种或多种 ( 例如， 2 种或更多种 ) 下述药剂：长春新碱、顺铂、依托泊苷、氮杂鸟嘌呤、卡铂、阿霉素、阿柔比星、米托蒽醌、米托蒽醌、丝裂霉素、紫杉醇、吉西他滨、泰索帝、地塞米松、阿糖胞苷、甲泼尼龙、甲氨蝶呤、博来霉素、丙酮双脒腙、贝林司他、卡铂、 5-fu (5- 氟尿嘧啶 ) 、伊达比星、美法仑、 IL4-PR38 、丙戊酸、全反式视黄酸 (ATRA) 、环磷酰胺、托泊替康、辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA ，伏立诺他 ) 、缩酚酸肽 (FR901228) 、硼替佐米、瘤可宁、氟达拉滨、长春碱、白消安、达卡巴嗪、奥沙利铂、羟基脲、替加氟、柔红霉素、雌莫司汀、氮芥、链佐星、卡莫司汀、洛莫司汀、巯嘌呤、替尼泊苷、更生霉素、维 A 酸、异环磷酰胺、他莫昔芬、伊立替康、氟尿苷、硫鸟嘌呤、 PSC 833 、厄洛替尼（ erlotinib ）、赫赛汀、贝伐单抗、塞来考昔、氟维司群、易瑞沙、阿那曲唑、来曲唑、西妥昔单抗、利妥昔单抗、辐射、组蛋白脱乙酰基酶 (HDAC) 抑制剂和 5- 氮杂 -2'- 脱氧胞苷 ( 地西他滨 ) 。

本发明的一个有益方面是，所述方法、装置和试剂盒可以用于在一种 / 次或多种 / 次针对癌症的治疗 ( 例如， 2 、 3 、 4 、 5 、 10 、 20 、 30 种 / 次或更多种 / 次针对癌症的治疗 ) 之前或之后如下所述预测癌症患者的癌症复发：同时或依次测定一种或多种 ( 例如， 2 、 3 或 4 种 ) 选自 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 的生物标志物的表达水平。已经确定，这些生物标志物中的每一种的表达预示患者的癌症复发的预后。可以用于预测患者的癌症复发的其它生物标志物包括在下面表 1 和 2 中列出的生物标志物中的一种或多种。

本发明的方法、装置和试剂盒还可以用于鉴别对一种或多种治疗有应答的患者亚群，所述治疗被认为对于治疗一般群体中的疾病 ( 例如，癌症 ) 是无效的。更一般而言，用一种或多种疗法治疗的癌症患者的癌症复发的预测，可以通过使用生物标志物的表达来实现，不论对患者的先前癌症治疗的认识如何。本发明的方法可以使用在仪器上运行的软件来实现，所述仪器与微阵列结合地用于测量基因表达。本发明的装置 ( 例如，微阵列，诸如 DNA 和 / 或 RNA 微阵列 ) 可以被包含在用于处理得自主体的肿瘤样品 ( 例如，细胞、组织或器官样品，其含有肿瘤或肿瘤细胞 ) 的试剂盒中，以及用于读出所述装置和将结果转换成主体的预后谱（ prognosis profile ）的仪器可以用于实现本发明的方法。

本发明的生物标志物

本发明涉及生物标志物，其与 hsa-miR-513b (5 ’ UUCACAAGGAGGUGUCAUUUAU3 ’； SEQ ID NO:1) 、 hsa-miR-650 (5 ’ AGGAGGCAGCGCUCUCAGGAC3 ’； SEQ ID NO: 2) 、 hsa-miR-324-3p (5 ’ ACUGCCCCAGGUGCUGCUGG3 ’； SEQ ID NO: 3) ，和 hsa-miR-1307 (ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG ； SEQ ID NO 4) 中的任一个的序列具有至少 85% ( 例如， 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100%) 序列同一性。在下面的表 1 和 2 中列出了可以用于本发明的方法、装置和试剂盒中的其它生物标志物。这些其它生物标志物可以单独使用，或者与特定生物标志物联合使用，所述特定生物标志物与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 中的任一个的序列具有 85% 或更多的序列同一性 ( 例如， 100% 序列同一性 ) 。优选地，本发明的生物标志物具有 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 的序列，且可以用在下述的任意组合中 ( 同时或依次 ) 。此外，这 4 种生物标志物的任意组合可以与在表 1 和 2 中列出的一种或多种生物标志物一起使用 ( 同时或依次 ) 。

所述方法的生物标志物可以用在下述的方法、装置和试剂盒中，以在一种或多种针对癌症的治疗（诸如上面列出的癌症治疗）之前或之后确定患者的癌症 ( 例如，肺癌 ) 的复发潜力。

使用本发明的生物标志物预测癌症患者的癌症复发的方法

本发明涉及用于在一种或多种针对癌症的治疗（例如，外科手术、放射疗法和 / 或化学疗法）之前或之后预测患有癌症的患者的癌症复发的方法，所述方法通过测量一种或多种 ( 例如， 1 、 2 、 3 或 4 种 ) 生物标志物的表达水平进行，所述生物标志物与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 中的任一个的序列具有至少 85% ( 例如， 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100%) 序列同一性。优选地，所述方法涉及单独地或以 2 种、 3 种或所有 4 种的任意组合 ( 同时或依次 ) ，确定具有 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列的生物标志物的表达水平。优选地，在至少一种针对癌症的治疗以后在患者中执行所述方法。

例如，本发明的方法可以包括：确定 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 或与 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的任一个的序列具有至少 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100% 序列同一性的生物标志物 ) 的配对组合的表达水平。具体地，可以同时或依次测量下述生物标志物配对组合的表达水平：

1) hsa-miR-513b 和 hsa-miR-650 ；

2) hsa-miR-513b 和 hsa-miR-324-3p ；

3) hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 ；

4) hsa-miR-650 和 hsa-miR-513b ；

5) hsa-miR-650 和 hsa-miR-324-3p ；

6) hsa-miR-650 和 hsa-miR-1307 ；

7) hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-513b ；

8) hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-650 ；

9) hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 ；

10) hsa-miR-1307 和 hsa-miR-513b ；

11) hsa-miR-1307 和 hsa-miR-650 ；和

12) hsa-miR-1307 和 hsa-miR-324-3p 。

本发明的方法也可以包括：确定 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 或与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的任一个的序列具有至少 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100% 序列同一性的生物标志物 ) 的三联组合的表达水平。具体地，可以同时或依次测量下述生物标志物三联组合的表达水平：

1) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p ；

2) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-1307 ；

3) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-650 ；

4) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 ；

5) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-650 ；

6) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-324-3p ；

7) hsa-miR-650 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-324-3p ；

8) hsa-miR-650 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-1307 ；

9) hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513 ；

10) hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 ；

11) hsa-miR-650 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-513b ；

12) hsa-miR-650 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-324-3p ；

13) hsa-miR- 324-3p 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 ；

14) hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-1307 ；

15) hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-513 ；

16) hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-1307 ；

17) hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-513b ；

18) hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-650 ；

19) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 ；

20) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-324-3p ；

21) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-513b ；

22) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p ；

23) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b ；和

24) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-650 。

本发明的方法也可以包括：确定 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 或与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的任一个的序列具有至少 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100% 序列同一性的生物标志物 ) 的四联组合的表达水平。具体地，可以同时或依次确定下述生物标志物四联组合的表达水平：

1) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 ；

2) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-324-3p ；

3) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-1307 ；

4) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-650 ；

5) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p ；

6) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-650 ；

7) hsa-miR-650 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 ；

8) hsa-miR-650 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-324-3p ；

9) hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-1307 ；

10) hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-513b ；

11) hsa-miR-650 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-324-3p ；

12) hsa-miR-650 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b ；

13) hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-1307 ；

14) hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-1307 ；

15) hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-1307 ；

16) hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-513b ；

17) hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 ；

18) hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-513b ；

19) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p ；

20) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-650 ；

21) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-324-3p ；

22) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b ；

23) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 ；和

24) hsa-miR-1307 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-650m 、 hsa-miR-513b 。

本发明的方法可以包括：从样品（例如，组织样品）收集核酸样品。所述样品优选地是得自癌症患者的肿瘤样品。例如，所述样品可以得自肺癌患者，诸如患有非小细胞肺癌的患者。本发明的方法可以任选地包括：使用例如聚合酶链式反应 (PCR) ，扩增核酸分子，以产生扩增的溶液。本发明的方法可以进一步包括：使用从样品收集的核酸分子，或使用上述的扩增的溶液，在热循环仪中执行 qRT-PCR ，以测量样品中的一种或多种生物标志物的表达水平。用于执行 qRT-PCR 的操作描述在例如美国专利号 7,101,663 和美国专利申请号 2006/0177837 和 2006/0088856 中，它们中的每一篇通过引用并入本文。可以在相同反应中同时确定样品中的 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的 2 种或更多种 ( 和任选地，在表 1 和 2 中列出的一种或多种其它生物标志物 ) 的表达水平。可替换地，可以在不同反应中同时确定样品中的 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的 2 种或更多种 ( 和任选地，在表 1 和 2 中列出的一种或多种其它生物标志物，如果需要的话 ) 的表达水平。此外，可以在相同反应或分开的反应中相继地确定 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的 2 种或更多种 ( 以及在表 1 和 2 中列出的一种或多种其它生物标志物，如果需要的话 ) 的表达水平。

本发明的方法还可以包括，在一种或多种癌症治疗（例如，外科手术、放射疗法和 / 或化学疗法）以后，基于样品中的 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的一种或多种 ( 和任选地，在表 1 和 2 中列出的一种或多种其它生物标志物，如果需要的话 ) 的表达水平，预测癌症患者的癌症复发。

例如，一种或多种生物标志物的表达水平的增加可以指示一种或多种癌症治疗（诸如上述的那些治疗）以后没有复发的良好预后。可替换地，一种或多种生物标志物的表达水平的下降可以指示一种或多种癌症治疗（诸如上述的那些治疗）以后没有复发的良好预后。此外，一种或多种生物标志物的表达水平的增加可以指示一种或多种癌症治疗以后癌症复发的不良预后。可替换地，一种或多种生物标志物的表达水平的下降可以指示一种或多种癌症治疗以后癌症复发的不良预后。可替换地，检测任一种生物标志物的表达可以单独地指示癌症治疗以后癌症患者中的癌症复发的预后。

良好预后表示这样的情况：其中患者在第一癌症治疗之后将存活至少 5 年 ( 例如， 4 、 5 、 6 、 7 、 8 、 10 或 12 年或更多年 ) ，而不良预后表示这样的情况：其中患者在第一癌症治疗之后可能不会存活至少 5 年。卡普兰 - 迈耶曲线可以用于对比随时间的存活，如图 1 和 2 所示。

在用于预测癌症复发的方法中，可以相对于正常细胞中的表达水平，或相对于得自已经经历第一疗程的患者的癌细胞中的表达水平，确定一种或多种生物标志物的表达水平。

使用本发明的生物标志物进行癌症预后的装置和方法

本发明涉及包括一种或多种寡核苷酸探针的装置，所述寡核苷酸探针具有的序列与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的一种或多种的序列的至少 5 个 ( 例如， 5 、 6 、 7 、 8 、 10 、 12 、 15 、 20 或 22 个；优选 22 个 ) 连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 相同或互补。所述装置的寡核苷酸探针还可以包括这样的序列：与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列或它们的补体在至少约 5 个 ( 例如， 5 、 6 、 7 、 8 、 10 、 12 、 15 、 20 或 22 个；优选 22 个 ) 连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 内具有至少 85% ( 例如， 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100%) 序列同一性的序列。例如，所述装置可以包括这样的寡核苷酸探针：其可以用于检测得自患者的组织样品中的 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任意一种或多种 ( 例如，任意组合 ) 或与这些生物标志物互补的序列的存在或表达水平。

优选地，本发明的装置包括这样的寡核苷酸探针：其具有的序列与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的一种或多种的序列或它们的补体在至少约 22 个连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 内具有至少 85% 序列同一性。更优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针：其与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的任意一个或多个的序列或它们的补体具有至少 100% 序列同一性。所述装置可以包括这样的探针：其可以用于检测仅一种生物标志物的存在或表达水平，或者它们可以包括这样的探针：其可以用于检测 2 、 3 或 4 种生物标志物的组合的存在或表达水平。

例如，所述装置可以包括寡核苷酸探针的下述配对组合，所述寡核苷酸探针与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列或它们的补体在至少约 5 个 ( 例如， 5 、 6 、 7 、 8 、 10 、 12 、 15 、 20 或 22 个；优选 22 个 ) 连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 内具有至少 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100% 序列同一性：

1) hsa-miR-513b 和 hsa-miR-650 ；

2) hsa-miR-513b 和 hsa-miR-324-3p ；

3) hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 ；

4) hsa-miR-650 和 hsa-miR-324-3p ；

5) hsa-miR-650 和 hsa-miR-1307 ；

6) hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 。

优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针的配对组合，所述寡核苷酸探针与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列或它们的补体在至少约 22 个连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 内具有至少 85% 序列同一性。更优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针的配对组合，所述寡核苷酸探针与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列或它们的补体在至少约 22 个连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 内具有至少 100% 序列同一性。

所述装置还可以包括寡核苷酸探针的下述三联组合，所述寡核苷酸探针与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列或它们的补体在至少约 5 个 ( 例如， 5 、 6 、 7 、 8 、 10 、 12 、 15 、 20 或 22 个 ) 连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 内具有至少 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100% 序列同一性：

1) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p ；

2) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-1307 ；

3) hsa-miR-513b 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 ；和

4) hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-1307 。

优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针的三联组合，所述寡核苷酸探针与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列或它们的补体在至少约 22 个连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 内具有至少 85% 序列同一性。更优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针的三联组合，所述寡核苷酸探针与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列或它们的补体在至少约 22 个连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 内具有至少 100% 序列同一性。

所述装置还可以包括这样的寡核苷酸探针：其与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的每一个的序列或它们的补体在至少约 5 个 ( 例如， 5 、 6 、 7 、 8 、 10 、 12 、 15 、 20 或 22 个 ) 连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 内具有至少 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100% 序列同一性。优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针：其与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的每一个的序列或它们的补体在至少约 22 个连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 内具有至少 85% 序列同一性。更优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针：其与 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物 ( 分别是 SEQ ID NO: 1-4) 中的每一个的序列或它们的补体在至少约 22 个连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 内具有至少 100% 序列同一性。

上述装置的寡核苷酸探针可以具有例如 5-20 、 25 、 5-50 、 5-100 、 25-100 、 50-100 个或超过 100 个核苷酸的长度。所述寡核苷酸探针可以是脱氧核糖核酸 (DNA) 或核糖核酸 (RNA) 。

本发明也涉及使用上述装置检测患者样品中的 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物之一、或者 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的 2 种或更多种的任意组合的表达或者确定其表达水平从而在癌症治疗以后预测癌症复发的方法。

本发明的含有一种或多种寡核苷酸探针的装置可以是微阵列装置。所述微阵列装置可以含有寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针可以是，例如，与 RNA( 例如， mRNA) 或微 RNA 对应或互补的 cDNA ，或者所述寡核苷酸探针可以是与 RNA ( 例如， mRNA) 或微 RNA 的一部分杂交的 cDNA 片段。示例性的 RNA 包括 miRNA 和 miRNA 前体。示例性的微阵列也包括具有多个与底物结合的核酸的“核酸微阵列”，与所述多个结合的核酸中的每一个的杂交是可单独检测的。

本发明的微阵列可以包括一种或多种寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针的核苷酸序列与 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物的例如至少 5 、 8 、 12 、 20 、 22 、 30 、 40 、 60 、 80 、 100 、 150 或 200 个连续核苷酸 ( 或核苷酸类似物 ) 相同或互补，和 / 或与下面表 1 和 2 列出的一种或多种生物标志物相同或互补。所述寡核苷酸探针可以具有在例如 5-20 、 5-50 、 25-50 、 5-100 、 25-100 、 50-100 个或超过 100 个核苷酸范围内的长度。所述寡核苷酸探针可以是脱氧核糖核酸 (DNA) 或核糖核酸 (RNA) 或其类似物，诸如 LNA 。用作对癌症治疗的应答性的生物标志物的寡核苷酸探针内的连续核苷酸 ( 例如， 5-20 、 25 、 5-50 、 50-100 ，或超过 100 个连续核苷酸 ) 也可以作为本文描述的一种或多种基因中的连续核苷酸出现，其始于下面表 1 和 2 中列出的基因的例如第 1 个、第 10 个、第 20 个、第 30 个、第 40 个、第 50 个、第 60 个、第 70 个、第 80 个、第 90 个、第 100 个、第 150 个、第 200 个、第 500 个或第 1000 个核苷酸处或附近。

当将从样品（例如，患者样品）制备的不同核酸分子群体应用于上述装置时，样品中的一种或多种靶核酸分子与所述装置上的一种或多种探针杂交。这种杂交允许检测样品中的一种或多种靶核酸分子 ( 例如，本文中描述的一种或多种生物标志物 ) 和 / 或确定所述靶核酸分子的量，并提供一种或多种靶核酸分子的表达水平的读出。所述一种或多种靶核酸分子可以是上述的 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的任一个，以及还可以包括下面表 1 和 2 中描述的任意一种或多种生物标志物。上述装置可以用于同时地 ( 或依次地 ) 检测这些生物标志物中的一种或多种或确定其表达水平。任选地，在使用本发明的装置进行检测之前，可以使用例如 PCR 扩增从样品分离出的核酸分子，以产生扩增的样品。然后可以将扩增的样品应用于本发明的装置。

本发明的装置可以用在这样的方法中，所述方法在一种或多种癌症治疗之前和 / 或之后，确定样品中的 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的一种或多种的表达水平以预测癌症患者的癌症复发。所述装置可以用于同时地 ( 或依次地 ) 确定多种生物标志物（例如， 2 、 3 或 4 种生物标志物）的表达水平，并使用该信息来确定患者的癌症复发预后。

在一个实施例中，在处理之前，将细胞 / 组织样品在液氮中快速冷冻。按照生产商的说明书，使用例如得自 Invitrogen 的 Trizol 试剂，可以提取 RNA 。按照生产商的说明书，使用例如得自 Ambion Inc. 的 MessageAmp 试剂盒，可以扩增 RNA 。使用例如 RecoverAll (Ambion Inc.) ，可以从福尔马林固定的石蜡包埋样品提取微 RNA ，并使用例如 Genisphere HSR (GenisPhere Inc.) 进行标记。使用生产商的说明书，使用例如得自 Affymetrix Inc 的 HG-U133A GeneChip 和相容的仪器（例如，得自 Affymetrix 的 GCS3000Dx ），可以定量扩增的 RNA 。使用 Affymetrix miRNA 1.0 或 2.0 版，可以定量微 RNA 。

可以进一步处理得到的基因表达测量结果，例如，如在实施例 1-3 中所述。使用可从 R-Project 得到的 R 软件，并补充可从 Bioconductor 得到的包，可以实现描述的操作。

就肺癌预后而言， hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的任一个可足以给出准确预测。优选地，使用 hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的 2 种或更多种。另外， 3-50 种 mRNA 或微 RNA 生物标志物（诸如在表 1 和 2 中列出的那些）可以用于提供甚至更准确的预测。鉴于所需的生物标志物的数目相对地小，可以执行诸如定量逆转录酶聚合酶链式反应 (qRT-PCR) 等操作，以更大精确度确定在样品中表达的生物标志物的量。这将提供上述装置的使用的替代或补充。例如，可以单独地或与本文中描述的微阵列联合地执行 qRT-PCR 。

用于在癌症治疗以后预测癌症患者的癌症复发的试剂盒

本发明也涉及用于在一种或多种癌症治疗以后预测癌症患者 ( 例如，肺癌患者 ) 的癌症复发的试剂盒。所述试剂盒可以包括用于从得自患者的样品收集核酸分子的试剂。例如，所述试剂盒可以包括用于裂解患者样品的试剂，和 / 或用于从患者样品分离和纯化 RNA 的试剂。所述试剂盒可以进一步包括用于例如通过 PCR 扩增从患者样品分离出的核酸分子的试剂。所述试剂盒可以包括使用本领域已知的测定（例如， qRT-PCR ）来确定一种或多种生物标志物的表达水平的试剂，所述生物标志物与 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的任一个的序列或它们的补体具有至少 85% ( 例如， 85% 、 90% 、 95% 、 97% 、 99% 或 100%) 序列同一性。所述试剂盒可以包括引物和探针，所述引物和探针用于执行 qRT-PCR 以确定上述生物标志物的表达水平。所述试剂盒可以包括基于使用所述试剂盒确定的一种或多种生物标志物的表达水平而预测癌症复发的说明书。

所述试剂盒可以进一步包括上述装置中的任一种，可以向其应用得自患者的核酸样品或扩增的溶液，使得所述装置上的探针可以与样品中的靶生物标志物杂交，并提供样品中的一种或多种生物标志物 ( 例如， hsa-miR-513b 、 hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物标志物中的一种或多种 ) 的表达水平的读出。所述装置允许同时 ( 或依次 ) 测量样品中的一种或多种生物标志物的表达水平。所述试剂盒中的装置可以是微阵列装置。所述试剂盒可以进一步包括，关于基于使用上述装置确定的一种或多种生物标志物的表达水平而预测癌症患者的癌症复发（例如，良好预后或不良预后）的说明书。另外，所述试剂盒的装置可以与基于 qRT-PCR 的测定联合使用，以确定一种或多种生物标志物的表达水平。此外，所述试剂盒可以包括基于生物标志物的表达水平而预测癌症复发的软件程序。

在一个实施例中，所述试剂盒可以包括用于从肿瘤提取 RNA 的试剂 ( 例如，得自 Invitrogen Inc 的 Trizol) ，用于扩增 RNA 的试剂 ( 例如，得自 Ambion Inc 的 MessageAmp) ，用于确定基因表达的微阵列 ( 例如，得自 Affymetrix Inc 的 HG-U133A GeneChip) ，微阵列杂交站和扫描仪 ( 例如，得自 Affymetrix Inc 的 GeneChip System 3000Dx) ，和用于分析如本文中所述的生物标志物的表达水平的软件 ( 例如，在得自 R-Project 的 R 或得自 Insightful Corp. 的 S-Plus 中实现 ) 。

实施例

实施例 1: 可用于肺癌预后的微 RNA

将得自 79 位具有病理学第 1 期 NSCLC 的患者的福尔马林固定的石蜡包埋的 (FFPE) 组织样本用于分析。从 Roswell Park Cancer Institute 的肿瘤登记收集临床数据，并通过病历审查（ chart review ）进行验证。将组织脱蜡，并提取 miRNA 。在提取的 RNA 的质量控制评估以后，执行与基于锁定核酸 (LNA) 的阵列平台 (Exiqon Inc.) 的杂交，所述平台含有针对 miRBase 11 版中的所有 miRs 的探针。对得自阵列的数据进行背景校正和 Loess 标准化。在留一法交叉验证中，使用多重检验校正（剩下 0.1% 的假发现率），用 t- 检验选择在具有复发的患者和没有复发的患者之间差异表达的 miRNA 。对得到的 miRNA 进行主组分分析，并将 5 个最重要的组分用于训练使用分类算法 K 最近邻、最近形心、神经网络和支持向量机的多变量分类器。通过分类算法中的大多数投票，将留出的样品预测为良好或不良预后。针对良好和不良预后组，制备到复发的时间的卡普兰 - 迈耶图。进行 2 个组之间的差异的统计显著性的对数秩检验。

结果–在 79 个样品中， 78 个样品通过了杂交的质量控制条件。如上详述地进行的数据分析导致 60 种微 RNA 被所有 78 个分类器选择。表 1 显示所述 60 种微 RNA 并连同在所有 78 个样品的分析中统计上显著的共 157 种微 RNA (FDR=1%) ，并为其计算 P- 值和 log2 倍数变化。 60- 基因模型以统计上显著的方式预测出结果 ( 图 1) 。

实施例 2 ：可用于肺癌预后的微 RNA

使用少至 2 或 3 种微 RNA 来得到如在实施例 1 中描述的肺癌样品的分类是可能的。如果所述 2 或 3 种微 RNA 是选自 hsa-miR-141 、 hsa-miR-22 、 hsa-miR-200b* 、 hsa-miR-630 、 hsa-miR-27a 、 hsa-miR-510 、 hsa-miR-30c-1* 的名单，可以实现与图 1 所示的结果类似的分类表现。具有 0 的截止值的第一主要组分可以单独地用于预测复发或非复发。也可以使用基于选自表 1 的 2 或 3 种微 RNA 的表达的其它分类方法。

实施例 3 ：使用具有与微 RNA 互补的 DNA 探针的 Affymetrix 阵列

实施例 1 和 2 涉及使用得自 Exiqon 的锁定核酸平台来鉴别微 RNA ，所述微 RNA 可以用于区分具有良好预后和不良预后的患者。基于 DNA 的平台（诸如 Affymetrix ）具有不同的物理和化学性能，并且将产生用于相同目的的不同的最佳微 RNA 名单。在 Affymetrix GeneChip®miRNA 1.0 阵列上，分析了在实施例 1 中使用的相同的 FFPE 样品。对于每个样品，使用恒定总 RNA 进行标准化。使用支持向量机 svm （得自 www.bioconductor.org 的文库 e1071 ，具有默认参数）来训练预测器。在交叉验证实验中，在 Affy 平台上的下述 3 种微 RNA 探针会最佳地分离不良预后与良好预后的患者： hsa- hsa-miR-650 、 hsa-miR-324-3p 、 hsa-miR-513b 。在这些中， hsa-miR-513b 对预后的贡献最大，其次是 hsa-miR-650 ，再其次是 hsa-miR-324-3p （它的重要性最低）。如果需要第四种 miR ，可以使用 hsa-miR-1307 ，并且可以提高一些数据集的表现。

实施例 4 ：得自实施例 3 的 4- 微 RNA 谱的独立验证

在 31 位处于 Ia 期的 NSCLC 患者的组群中，独立地验证了得自实施例 3 的 3- 微 RNA 谱 ( 图 2) 。以与实施例 3 中的组群相同的方式将该组群标准化。使用在得自实施例 3 的组群上训练过的支持向量机，预测患者具有良好预后或不良预后。在图 2 中的卡普兰 - 迈耶曲线显示了 2 个预测组的总存活率。在良好和不良预后组之间存在存活率的统计上显著的差异 ( 在对数秩检验中， P=0.0001) 。

表 1. 表示在 miRCURY LNA 阵列 (v.10.0, Exiqon) 上的 miRNA 的探针 ID 的名单。 60- 基因表示在留一法交叉验证中该 miRNA 是否被所有分类器选择。“是”的值指示该 miRNA 是更可靠和重要的。

ID 名称 log2(FC) P-值 60-基因

17327 hsa-miR-630 -0.421 2.74e-09 是

17859 hsa-miR-200b* -0.438 8.78e-09 是

42834 hsa-miR-219-2-3p -0.606 1.11e-07 否

42682 hsa-miR-25 0.979 1.47e-07 否

42957 hsa-miR-323-3p -0.536 2.99e-07 否

42702 hsa-miR-30c-1* -0.426 3.22e-07 是

42593 hsa-miR-623 -0.551 3.23e-07 是

5250 hsa-miR-105 1.14 3.75e-07 否

42524 hsa-miR-21* 0.77 1.46e-06 否

17752 hsa-let-7f 1.13 1.5e-06 否

10986 hsa-miR-193a-3p 1.1 2.03e-06 否

42811 hsa-miR-542-5p -0.539 2.45e-06 是

33596 hsa-miR-126* 1.17 2.48e-06 否

19593 hsa-miR-27a 1.28 2.51e-06 是

27720 hsa-miR-15a 1.23 2.82e-06 否

30687 hsa-miR-93 1.14 2.85e-06 否

11065 hsa-miR-335 1.17 3.29e-06 否

11142 hsa-miR-510 -0.325 3.36e-06 是

42458 hcmv-miR-US25-1* -0.51 3.59e-06 是

14302 hsa-miR-374b 1.01 4.21e-06 否

27537 ebv-miR-BART13 -0.432 4.5e-06 是

13132 hsa-miR-519e* -0.325 5.12e-06 是

27378 hsa-miR-374a 1.23 5.17e-06 否

10985 hsa-miR-191 1.16 5.35e-06 是

10995 hsa-miR-199a-3p/

hsa-miR-199b-3p 1.26 5.37e-06 否

10138 hsa-miR-130a 1.13 5.92e-06 否

11078 hsa-miR-365 0.661 6.44e-06 否

27551 hsa-miR-612 -0.325 6.58e-06 是

13143 hsa-miR-301a 1.11 7.03e-06 否

17552 hsa-miR-617 -0.433 7.07e-06 是

11022 hsa-miR-221 0.931 8.4e-06 否

17836 hsa-miR-30b* -0.392 8.52e-06 是

10972 hsa-miR-181b 0.596 9.57e-06 否

42513 hsa-miR-300 -0.339 1.16e-05 是

42533 hiv1-miR-H1 -0.408 1.16e-05 否

29562 hsa-miR-199a-5p 1.22 1.18e-05 是

27541 hcmv-miR-UL70-3p -0.517 1.18e-05 否

13175 hsa-miR-27b 1.26 1.2e-05 是

42838 miRPlus_42838 -0.387 1.28e-05 是

10998 hsa-miR-19b 1.34 1.42e-05 否

10967 hsa-miR-16 1.35 1.62e-05 是

11020 hsa-miR-22 1.03 1.74e-05 是

10306 hsa-miR-146b-5p 1.02 1.75e-05 否

42467 hsa-miR-129-5p -0.485 1.88e-05 是

42843 hsa-miR-654-5p -0.411 2.11e-05 是

42865 hsa-miR-181a 0.795 2.11e-05 是

4610 hsa-miR-126 1.08 2.11e-05 是

4700 hsa-miR-140-5p 0.923 2.17e-05 否

11023 hsa-miR-222 0.881 2.21e-05 是

19011 hsa_SNORD10 0.903 2.22e-05 是

17541 ebv-miR-BART1-5p-0.268 2.84e-05 否

5740 hsa-miR-21 1.5 2.91e-05 是

19015 hsa-miR-142-5p 1.14 3.03e-05 否

11182 hsa-miR-98 0.837 3.12e-05 否

11151 hsa-miR-516b -0.265 3.17e-05 是

17608 hsa-miR-425 0.753 3.35e-05 否

17460 hsa-miR-657 -0.359 3.48e-05 是

19580 hsa-let-7i 1.03 3.63e-05 是

10997 hsa-miR-19a 1.35 3.67e-05 否

28191 hsa-miR-30e 1.13 3.71e-05 否

11104 hsa-miR-422a 0.423 3.78e-05 否

42717 hsa-miR-92b* -0.447 3.94e-05 是

27565 hsa-miR-423-5p -0.238 4.03e-05 是

42929 hsa-miR-25* -0.279 4.33e-05 是

17445 hsa-miR-610 -0.352 4.94e-05 是

11279 U6-snRNA-2 0.587 5.54e-05 是

42532 hsa-miR-22* 0.455 5.73e-05 否

19005 hsa_SNORD118 0.665 5.91e-05 是

42738 hsa-miR-340* -0.397 6.04e-05 是

19602 hsa-let-7g 0.859 6.81e-05 否

42831 hsa-miR-28-5p 0.953 7.32e-05 否

31026 hsa-miR-101 1.01 7.48e-05 否

19591 hsa-miR-199b-5p 1.04 7.51e-05 否

42758 hsa-miR-640 -0.389 7.78e-05 是

29460 hsa-miR-553 -0.249 7.94e-05 否

17328 ebv-miR-BART8* -0.465 7.99e-05 是

42744 hsa-miR-23a 1.25 8.62e-05 是

11040 hsa-miR-29b 1.17 8.91e-05 否

42832 hsa-miR-638 -0.381 9.56e-05 是

42570 hsa-miR-194* -0.448 9.65e-05 是

19604 hsa_SNORD4A 0.728 0.000105 是

42795 kshv-miR-K12-3 -0.326 0.000108 是

10962 hsa-miR-154 0.719 0.000127 否

42902 hsa-miR-185 0.375 0.000129 是

42754 hsa-miR-586 -0.31 0.000135 是

42887 hsa-miR-331-3p 0.473 0.000139 是

17561 ebv-miR-BART6-3p -0.452 0.00014 是

19585 hsa-miR-148b 0.757 0.000146 否

17567 kshv-miR-K12-1 -0.206 0.00015 否

42650 hsa-miR-17 1.13 0.000153 是

32884 hsa-miR-342-3p 0.974 0.000162 否

17358 ebv-miR-BART16 -0.345 0.000164 是

19582 hsa-miR-106b 0.96 0.000167 是

42652 hsa-miR-584 -0.438 0.000178 是

42802 hsa-miR-150 -0.236 0.000187 是

10928 hsa-miR-125a-5p 0.531 0.000189 是

33430 hsa-miR-548b-3p -0.307 0.000191 是

42739 hsa-miR-339-5p 0.533 0.000192 是

13485 hsa-miR-10a 0.882 0.000195 否

13148 hsa-miR-195 0.892 2e-04 否

11030 hsa-miR-26a 1.19 0.000203 否

42693 hsa-miR-326 -0.414 0.000209 是

10946 hsa-miR-141 1.08 0.000209 是

17646 ebv-miR-BHRF1-3 -0.222 0.000211 是

42648 hsa-miR-106a 1.16 0.000213 是

42564 hsa-miR-26b 1.18 0.000237 否

10925 hsa-miR-10b 0.781 0.00025 否

42700 hsa-miR-631 -0.532 0.000254 否

11024 hsa-miR-223 0.727 0.000273 否

19581 hsa-miR-100 0.796 0.000273 否

17280 hsa-miR-15b 1.06 0.000291 否

42442 hsa-miR-498 -0.252 0.000325 否

19008 hsa_SNORD2 0.48 0.000357 否

27533 hsa-miR-320a 0.543 0.00036 否

10919 hsa-miR-103 0.427 0.000361 否

42528 hsa-miR-296-3p -0.335 0.000372 否

42609 hsa-miR-135a* -0.295 0.000373 否

42951 ebv-miR-BHRF1-2 -0.345 0.000398 否

17506 hsa-miR-24 1.26 0.000411 否

17718 hsa-miR-92b 0.547 0.000425 否

29872 hsa-miR-340 0.338 0.000431 否

28431 miRPlus_28431 -0.167 0.000436 否

11053 hsa-miR-32 0.881 0.000448 否

42603 hsa-miR-424* -0.291 0.00045 否

42965 hsa-miR-424 0.629 0.000518 否

42529 hsa-miR-939 -0.229 0.00053 否

19606 hsa_SNORD12 0.264 0.000534 否

17952 miRPlus_17952 -0.231 0.000534 否

42630 hsa-miR-140-3p 0.744 0.00056 否

11027 hsa-miR-23b 1.14 0.000573 否

42640 hsa-miR-20b 1.01 0.000582 否

42649 hsa-miR-20a 0.995 0.000596 否

11048 hsa-miR-30a 0.83 0.000605 否

42679 hsa-miR-642 -0.29 0.000615 否

42527 hsa-miR-935 -0.447 0.000622 否

11134 hsa-miR-502-5p -0.152 0.000651 否

17613 hsa-miR-645 -0.346 0.000655 否

42751 hsa-miR-720 0.501 0.000717 否

11224 hsa-miR-30e* 0.687 0.000725 否

17822 hsa-miR-490-5p -0.363 0.000729 否

42695 hsa-miR-596 -0.36 0.000743 否

42486 hsa-miR-149* -0.238 0.000744 否

10978 hsa-miR-184 -0.21 0.000749 否

11041 hsa-miR-29c 0.858 0.000763 否

42782 hcmv-miR-UL148D -0.303 0.00078 否

10947 hsa-miR-142-3p 0.962 0.000794 否

28302 miRPlus_28302 0.387 0.000857 否

42573 hsa-miR-1 0.323 0.000871 否

42899 hsa-miR-377* -0.233 0.000896 否

42845 hsa-miR-125b-2* -0.206 0.00091 否

17463 hsa-miR-151-3p 0.597 0.000956 否

30787 hsa-miR-125b 0.753 0.000967 否

17470 kshv-miR-K12-2 -0.399 0.001 否

42812 hsa-miR-508-5p -0.272 0.00106 否

17493 hsa-miR-622 -0.358 0.0011 否

42853 hsa-miR-433 -0.358 0.00116 否

11175 hsa-miR-525-5p -0.188 0.00116 否

表 2. 在表 1 中列出的成熟微 RNA 的序列

hsa-let-7f UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU

hsa-miR-15a UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG

hsa-miR-16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG

hsa-miR-17 CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG

hsa-miR-19a UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA

hsa-miR-19b UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA

hsa-miR-20a UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG

hsa-miR-21 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA

hsa-miR-22 AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU

hsa-miR-23a AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC

hsa-miR-24 UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG

hsa-miR-25 CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA

hsa-miR-26a UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU

hsa-miR-26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU

hsa-miR-27a UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC

hsa-miR-28-5p AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG

hsa-miR-30a UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG

hsa-miR-32 UAUUGCACAUUACUAAGUUGCA

hsa-miR-93 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG

hsa-miR-98 UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU

hsa-miR-100 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG

hsa-miR-101 UACAGUACUGUGAUAACUGAA

hsa-miR-29b UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU

hsa-miR-103 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA

hsa-miR-105 UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU

hsa-miR-106a AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG

hsa-miR-199a-5p CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC

hsa-miR-129-5p CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC

hsa-miR-10a UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG

hsa-miR-10b UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG

hsa-miR-181a AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU

hsa-miR-181b AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU

hsa-miR-199b-5p CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC

hsa-miR-221 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC

hsa-miR-222 AGCUACAUCUGGCUACUGGGU

hsa-miR-223 UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA

hsa-let-7g UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU

hsa-let-7i UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU

hsa-miR-1 UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU

hsa-miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA

hsa-miR-23b AUCACAUUGCCAGGGAUUACC

hsa-miR-27b UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC

hsa-miR-125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA

hsa-miR-130a CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU

hsa-miR-140-5p CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG

hsa-miR-140-3p UACCACAGGGUAGAACCACGG

hsa-miR-141 UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG

hsa-miR-142-5p CAUAAAGUAGAAAGCACUACU

hsa-miR-142-3p UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA

hsa-miR-191 CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG

hsa-miR-125a-5p UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA

hsa-miR-126 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG

hsa-miR-150 UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG

hsa-miR-154 UAGGUUAUCCGUGUUGCCUUCG

hsa-miR-184 UGGACGGAGAACUGAUAAGGGU

hsa-miR-185 UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA

hsa-miR-193a-3p AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU

hsa-miR-195 UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC

hsa-miR-320a AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA

hsa-miR-106b UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU

hsa-miR-29c UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA

hsa-miR-219-2-3p AGAAUUGUGGCUGGACAUCUGU

hsa-miR-301a CAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGC

hsa-miR-296-3p GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC

hsa-miR-30e UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG

hsa-miR-365 UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU

hsa-miR-374a UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG

hsa-miR-340 UUAUAAAGCAAUGAGACUGAUU

hsa-miR-342-3p UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU

hsa-miR-323-3p CACAUUACACGGUCGACCUCU

hsa-miR-326 CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG

hsa-miR-151-3p CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG

hsa-miR-148b UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU

hsa-miR-331-3p GCCCCUGGGCCUAUCCUAGAA

hsa-miR-339-5p UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACG

hsa-miR-335 UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU

ebv-miR-BHRF1-2 UAUCUUUUGCGGCAGAAAUUGA

ebv-miR-BHRF1-3 UAACGGGAAGUGUGUAAGCACA

ebv-miR-BART1-5p UCUUAGUGGAAGUGACGUGCUGUG

hsa-miR-422a ACUGGACUUAGGGUCAGAAGGC

hsa-miR-423-5p UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU

hsa-miR-424 CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA

hsa-miR-425 AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA

hsa-miR-20b CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG

hcmv-miR-UL148D UCGUCCUCCCCUUCUUCACCG

hsa-miR-433 AUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGU

kshv-miR-K12-1 AUUACAGGAAACUGGGUGUAAGC

kshv-miR-K12-2 AACUGUAGUCCGGGUCGAUCUG

kshv-miR-K12-3 UCACAUUCUGAGGACGGCAGCGA

hsa-miR-490-5p CCAUGGAUCUCCAGGUGGGU

hsa-miR-146b-5p UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU

hsa-miR-498 UUUCAAGCCAGGGGGCGUUUUUC

hsa-miR-525-5p CUCCAGAGGGAUGCACUUUCU

hsa-miR-516b AUCUGGAGGUAAGAAGCACUUU

hsa-miR-502-5p AUCCUUGCUAUCUGGGUGCUA

hsa-miR-508-5p UACUCCAGAGGGCGUCACUCAUG

hsa-miR-510 UACUCAGGAGAGUGGCAAUCAC

hsa-miR-553 AAAACGGUGAGAUUUUGUUUU

hsa-miR-92b UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC

hsa-miR-584 UUAUGGUUUGCCUGGGACUGAG

hsa-miR-586 UAUGCAUUGUAUUUUUAGGUCC

hsa-miR-548b-3p CAAGAACCUCAGUUGCUUUUGU

hsa-miR-596 AAGCCUGCCCGGCUCCUCGGG

hsa-miR-610 UGAGCUAAAUGUGUGCUGGGA

hsa-miR-612 GCUGGGCAGGGCUUCUGAGCUCCUU

hsa-miR-617 AGACUUCCCAUUUGAAGGUGGC

hsa-miR-622 ACAGUCUGCUGAGGUUGGAGC

hsa-miR-623 AUCCCUUGCAGGGGCUGUUGGGU

hsa-miR-630 AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU

hsa-miR-631 AGACCUGGCCCAGACCUCAGC

hsa-miR-638 AGGGAUCGCGGGCGGGUGGCGGCCU

hsa-miR-640 AUGAUCCAGGAACCUGCCUCU

hsa-miR-642 GUCCCUCUCCAAAUGUGUCUUG

hsa-miR-645 UCUAGGCUGGUACUGCUGA

hsa-miR-654-5p UGGUGGGCCGCAGAACAUGUGC

hsa-miR-657 GGCAGGUUCUCACCCUCUCUAGG

hsa-miR-542-5p UCGGGGAUCAUCAUGUCACGAGA

hcmv-miR-UL70-3p GGGGAUGGGCUGGCGCGCGG

ebv-miR-BART6-3p CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA

ebv-miR-BART13 UGUAACUUGCCAGGGACGGCUGA

ebv-miR-BART16 UUAGAUAGAGUGGGUGUGUGCUCU

hsa-miR-300 UAUACAAGGGCAGACUCUCUCU

hsa-miR-374b AUAUAAUACAACCUGCUAAGUG

hsa-miR-935 CCAGUUACCGCUUCCGCUACCGC

hsa-miR-939 UGGGGAGCUGAGGCUCUGGGGGUG

hiv1-miR-H1 CCAGGGAGGCGUGCCUGGGC

hsa-miR-720 UCUCGCUGGGGCCUCCA

hsa-miR-21* CAACACCAGUCGAUGGGCUGU

hsa-miR-22* AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA

hsa-miR-25* AGGCGGAGACUUGGGCAAUUG

hsa-miR-200b* CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA

hsa-miR-30b* CUGGGAGGUGGAUGUUUACUUC

hsa-miR-135a* UAUAGGGAUUGGAGCCGUGGCG

hsa-miR-125b-2* UCACAAGUCAGGCUCUUGGGAC

hsa-miR-126* CAUUAUUACUUUUGGUACGCG

hsa-miR-149* AGGGAGGGACGGGGGCUGUGC

hsa-miR-194* CCAGUGGGGCUGCUGUUAUCUG

hsa-miR-30c-1* CUGGGAGAGGGUUGUUUACUCC

hsa-miR-30e* CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC

hsa-miR-377* AGAGGUUGCCCUUGGUGAAUUC

hsa-miR-340* UCCGUCUCAGUUACUUUAUAGC

hsa-miR-424* CAAAACGUGAGGCGCUGCUAU

hcmv-miR-US25-1* UCCGAACGCUAGGUCGGUUCUC

hsa-miR-519e* UUCUCCAAAAGGGAGCACUUUC

hsa-miR-92b* AGGGACGGGACGCGGUGCAGUG

ebv-miR-BART8* GUCACAAUCUAUGGGGUCGUAGA

其它实施方案

尽管在附上的权利要求书中指出了显示和描述的本发明的某些新颖特征，但本发明无意被限于详细说明的细节，因为相关领域的普通技术人员会理解，可以对举例说明的发明的形式和细节及其操作做出不同的省略、修改、置换和改变，而不以任何方式背离本发明的精神。除非明确地描述为“关键的”或“必需的”，否则本发明的特征不是关键的或必需的。

本领域技术人员将认识到或使用不多于常规实验就能够确定本文中描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案意图被包括在本发明的范围内。

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，达到与明确地且单独地指出每篇独立的出版物、专利或专利申请通过引用并入相同的程度。

序列表

<110> Medical Prognosis Institute

<120> 用于预测癌症复发的方法和装置

<130> 50495-004WO1

<150> PA 2011 00416

<151> 2011-06-01

<160> 4

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-513b

<400> 1

uucacaagga ggugucauuu au 22

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-650

<400> 2

aggaggcagc gcucucagga c 21

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-324-3p

<400> 3

acugccccag gugcugcugg 20

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-1307

<400> 4

acucggcgug gcgucggucg ug 22

Claims

1.一种用于预测癌症患者的癌症复发的方法，该方法包括确定得自患者的样品中的生物标志物的表达水平，该生物标志物与SEQ ID NO: 1的序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物标志物的表达水平预示所述患者中的癌症复发的预后。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物包含SEQ ID NO: 1的序列。

3.一种用于预测癌症患者的癌症复发的方法，该方法包括确定得自患者的样品中的生物标志物的表达水平，该生物标志物与SEQ ID NO: 2的序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物标志物的表达水平预示所述患者中的癌症复发的预后。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物标志物包含SEQ ID NO: 2的序列。

5.一种用于预测癌症患者的癌症复发的方法，该方法包括确定得自患者的样品中的生物标志物的表达水平，该生物标志物与SEQ ID NO: 3的序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物标志物的表达水平预示所述患者中的癌症复发的预后。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物标志物包含SEQ ID NO: 3的序列。

7.一种用于预测癌症患者的癌症复发的方法，该方法包括确定得自患者的样品中至少一种生物标志物的表达水平，该生物标志物与SEQ ID NO: 1-3中的任一个的序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物标志物的表达水平预示所述患者中的癌症复发的预后。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述生物标志物包含SEQ ID NO: 1-3中的任一个的序列。

9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，该方法进一步包括确定生物标志物的表达水平，该生物标志物与SEQ ID NO: 4的序列具有至少85%序列同一性。

10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，该方法进一步包括确定生物标志物的表达水平，该生物标志物具有SEQ ID NO: 4的序列。

11.根据权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中该样品是组织样品。

12.根据权利要求11所述的方法，其中该样品是肿瘤样品。

13.根据权利要求1-12中的任一项所述的方法，其中该癌症是肺癌。

14.根据权利要求13所述的方法，其中该肺癌是非小细胞肺癌。

15.根据权利要求1-14中的任一项所述的方法，其中该预测在第一癌症治疗之后，在所述患者中发生。

16.根据权利要求1-14中的任一项所述的方法，其中该预测在第一癌症治疗之前，在所述患者中发生。

17.根据权利要求1-14中的任一项所述的方法，其中该预测在第一癌症治疗之后，但是在第二癌症治疗之前，在所述患者中发生。

18.根据权利要求1-14中的任一项所述的方法，其中该预测在第二癌症治疗之后，在所述患者中发生。

19.根据权利要求15-18中的任一项所述的方法，其中所述治疗包括外科手术、放射疗法和化学疗法中的一种或多种。

20.根据权利要求1-19中的任一项所述的方法，其中所述生物标志物的表达水平的增加指示没有癌症复发的良好预后，或者其中所述一种或多种生物标志物的表达水平的下降指示没有癌症复发的良好预后。

21.根据权利要求1-19中的任一项所述的方法，其中所述生物标志物的表达水平的增加指示癌症复发的不良预后，或者其中所述一种或多种生物标志物的表达水平的下降指示癌症复发的不良预后。

22.根据权利要求1-21中的任一项所述的方法，其中如下确定所述样品中的所述生物标志物的表达水平：从所述样品收集核酸分子，并任选地，使用定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR) 来扩增所述核酸分子。

23.一种用于检测至少一种生物标志物的表达水平的装置，该装置包含至少一种单链核酸分子，该单链核酸分子与所述生物标志物的序列或它的补体序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物标志物的序列包含SEQ ID NO: 1的序列的至少5个连续核苷酸，且其中该装置分别允许所述单链核酸分子和所述生物标志物或它的补体序列之间的特异性杂交。

24.根据权利要求23所述的装置，其中该至少一种单链核酸分子包含SEQ ID NO: 1的序列或它的补体序列的至少5个连续核苷酸。

25.一种用于检测至少一种生物标志物的表达水平的装置，该装置包含至少一种单链核酸分子，该单链核酸分子与所述生物标志物的序列或它的补体序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物标志物的序列包含SEQ ID NO: 2的序列的至少5个连续核苷酸，且其中该装置分别允许所述单链核酸分子和所述生物标志物或它的补体序列之间的特异性杂交。

26.根据权利要求25所述的装置，其中该至少一种单链核酸分子包含SEQ ID NO: 2的序列或它的补体序列的至少5个连续核苷酸。

27.用于检测至少一种生物标志物的表达水平的装置，该装置包含至少一种单链核酸分子，该单链核酸分子与所述生物标志物的序列或它的补体序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物标志物的序列包含SEQ ID NO: 3的序列的至少5个连续核苷酸，且其中该装置分别允许所述单链核酸分子和所述生物标志物或它的补体序列之间的特异性杂交。

28.根据权利要求27所述的装置，其中该至少一种单链核酸分子包含SEQ ID NO: 3的序列或它的补体序列的至少5个连续核苷酸。

29.一种用于检测至少一种生物标志物的表达水平的装置，该装置包含至少一种单链核酸分子，该单链核酸分子与所述生物标志物的序列或它的补体序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物标志物的序列包含SEQ ID NO:1-3中的任一个的序列的至少5个连续核苷酸，且其中该装置分别允许所述单链核酸分子和所述生物标志物或它的补体序列之间的特异性杂交。

30.根据权利要求27所述的装置，其中该至少一种单链核酸分子包含SEQ ID NO: 1-3中的任一个的序列或它的补体序列的至少5个连续核苷酸。

31.根据权利要求23-30中的任一项所述的装置，该装置进一步包括至少一种单链核酸分子，该单链核酸分子与所述生物标志物的序列或它的补体序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物标志物的序列包含SEQ ID NO: 4的序列的至少5个连续核苷酸，且其中该装置分别允许所述单链核酸分子和所述生物标志物或它的补体序列之间的特异性杂交。

32.根据权利要求31所述的装置，其中该至少一种单链核酸分子包含SEQ ID NO: 4的序列或它的补体序列的至少5个连续核苷酸。

33.根据权利要求23-32中的任一项所述的装置，其中所述至少一种单链核酸分子具有在10-100个核苷酸范围内的长度。

34.根据权利要求23-33中的任一项所述的装置，所述装置当在允许发生杂交的条件下与从样品制备的不同核酸分子群体接触时，允许确定所述至少一种生物标志物的表达水平。

35.根据权利要求23-34中的任一项所述的装置，其中该装置是微阵列装置。

36.一种用于预测癌症患者的癌症复发的方法，该方法包括使用权利要求23-35中的任一项所述的装置，确定患者样品中的至少一种生物标志物的表达水平，其中所述生物标志物的表达水平预示所述患者中的癌症复发的预后。

37.根据权利要求36所述的方法，其中该样品是组织样品。

38.根据权利要求37所述的方法，其中该样品是肿瘤样品。

39.根据权利要求36所述的方法，其中该癌症是肺癌。

40.根据权利要求39所述的方法，其中该癌症是非小细胞肺癌。

41.根据权利要求36-40中的任一项所述的方法，其中该预测在第一癌症治疗之后，在所述患者中发生。

42.根据权利要求36-40中的任一项所述的方法，其中该预测在第一癌症治疗之前，在所述患者中发生。

43.根据权利要求36-40中的任一项所述的方法，其中该预测在第一癌症治疗之后，但是在第二治疗之前，在所述患者中发生。

44.根据权利要求36-40中的任一项所述的方法，其中该预测在第二癌症治疗之后，在所述患者中发生。

45.根据权利要求41-44中的任一项所述的方法，其中所述治疗包括外科手术、放射疗法和化学疗法中的一种或多种的任意组合。

46.根据权利要求36-45中的任一项所述的方法，其中所述至少一种生物标志物的表达水平的增加指示没有癌症复发的良好预后，或者其中所述至少一种生物标志物的表达水平的下降指示没有癌症复发的良好预后。

47.根据权利要求36-45中的任一项所述的方法，其中所述至少一种生物标志物的表达水平的增加指示癌症复发的不良预后，或者其中所述至少一种生物标志物的表达水平的下降指示癌症复发的不良预后。

48.一种试剂盒，其包含用于从得自患者的样品收集核酸分子的试剂、用于扩增从所述样品收集的所述核酸分子以产生扩增的样品的试剂，和至少一种用于检测所述扩增的样品中的至少一种生物标志物的表达水平的装置，该生物标志物具有SEQ ID NO: 1-4中的任一个的序列。

49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中使用定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR) 来产生所述扩增的样品。

50.根据权利要求48-49中的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括关于基于所述至少一种生物标志物的表达水平而预测所述癌症患者的癌症复发的说明书。

51.根据权利要求48-50中的任一项所述的试剂盒，其中所述装置是权利要求23-47中的任一项所述的装置。

52.根据权利要求51所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括关于将从样品收集的核酸分子应用于所述装置的说明书，和/或关于通过检测所述至少一种单链核酸分子与所述生物标志物或它的补体序列的杂交来确定所述至少一种生物标志物的表达水平的说明书。

53.根据权利要求52所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括关于基于使用所述装置检测出的所述至少一种生物标志物的表达水平来预测癌症患者的癌症复发的说明书。