CN103060312A - 预测原发性肝癌转移潜力的基因标志物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及预测原发性肝癌转移潜力的基因标志物。本发明人通过检测原发性肝癌患者的无转移癌组织样本以及有转移癌组织样本的基因表达谱水平，用统计学方法，首次从中筛选出14个特异性的基因。经检验证明，这些特异性的基因标志物可非常有效地用于预测原发性肝癌患者的肝癌转移情况或转移潜力。

Description

预测原发性肝癌转移潜力的基因标志物

技术领域

本发明属于医药学领域；更具体地，本发明涉及预测原发性肝癌转移潜力的基因标志物。

背景技术

任何事物的发生发展都处于内外因共同作用之下，内因为主，外因为辅。基因作为生命的遗传介质，在生物体的生、老、病、死中处于基础内因的地位。绝大部分基因通过转录生成核糖核酸，再翻译生成蛋白质而发挥生物学功能。基因的功能虽然主要是通过蛋白质来体现，但仍可以通过基因的转录产物mRNA的含量而部分反映。

全基因组表达谱芯片含2万余个探针，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种mRNA的含量，因此可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的基因的转录水平进行检测，进而推测基因功能。

原发性肝癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，发展迅速，治疗困难，病死率高。因此，肝癌的尽早诊断就愈发显得迫切。

然而，迄今为止，本领域对于与原发性肝癌密切相关的基因了解甚少，因此本领域迫切需要进一步地分离各种与原发性肝癌密切相关的基因，找到对于诊断肝癌的发生、转移、复发或检测有关的基因标志物。

发明内容

本发明的目的在于提供预测原发性肝癌转移潜力的基因标志物。

在本发明的第一方面，提供一种多核苷酸集，所述的多核苷酸集包括编码以下蛋白的多核苷酸(较佳地，由编码以下蛋白的多核苷酸组成)：

可溶性运载蛋白家族成员25，脂肪酸去饱和酶，Retbindin，CDK5调节亚基结合蛋白2，谷胱甘肽硫转移酶mu 2，肿瘤蛋白p53诱导的核蛋白2，跨膜蛋白123，谷胱甘肽硫转移酶mu 1，ArfGAP3，与酵母ATG2自噬相关蛋白2同源的蛋白A，与果蝇巨大幼虫致死基因同源的蛋白2，Kruppel样因子13，辅酶脱氢酶1 alpha子基1和KIAA0649蛋白。

在一个优选例中，所述的多核苷酸集包括：序列如SEQ ID NO：1-14所示的14种多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸集的用途，用于制备测定(或预测)原发性肝癌患者的肝癌转移情况或转移潜力的检测试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的试剂是特异性扩增所述的多核苷酸集中各多核苷酸的引物对；或是特异性识别所述的多核苷酸集中各多核苷酸的探针。

在本发明的另一方面，提供一种用于测定(或预测)原发性肝癌患者的肝癌转移情况或转移潜力的试剂，其是特异性识别序列如SEQ ID NO：n所示的多核苷酸的探针，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：n+14所示；其中n为选自1-14的正整数。

在本发明的另一方面，提供一种基因芯片，所述的基因芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的探针，所述的探针特异性地对应于SEQ IDNO：n所示的序列，其中n为选自1-14的正整数。

在另一优选例中，所述的探针是特异性识别序列SEQ ID NO：n所示的多核苷酸的探针，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：n+14所示。

在另一优选例中，所述的探针含有：互补结合区和/或与固相载体相连的连接区。

在本发明的另一方面，提供所述的基因芯片的用途，用于制备测定(或预测)原发性肝癌患者的肝癌转移情况或转移潜力的试剂盒。

在本发明的另一方面，提供一种测定(或预测)原发性肝癌患者的肝癌转移情况或转移潜力的试剂盒，所述的试剂盒中含有所述的基因芯片。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：核酸抽提液、显色液或杂交液。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、以MDS算法转换后的已发生转移肝癌样本(红色点或浅色点)和未发生转移肝癌样本(蓝色点或深色点)在三维空间内的散点图。

具体实施方式

本发明人通过检测两种肝癌患者来源的(分别为肿瘤切除手术后在观察期内肿瘤“已发生转移的”和“未发生转移的”患者)原发性肝癌的癌组织样本的基因表达谱水平，用统计学方法，首次从中筛选出14个特异性的基因。经检验证明，这些特异性的基因标志物可非常有效地用于区分原发性肝癌的高转移潜力样本和低转移潜力样本。

基因标志物及其用途

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。本发明人采用芯片杂交的方法得到原发肝癌患者的已发生转移的肝癌样本和未发生转移的肝癌样本的全基因组表达谱，通过比较两种肝癌组织的表达谱，得到高转移潜力样本与低转移潜力样本间差异表达的基因。在这些差异基因中，使用C-SVC分类器(高斯核函数)算法筛选得到分类准确度为100％的一组分类器(含14个基因)。由这14个基因组成的分类器，可预测肝癌病人原发肝癌是否有转移，其预测准确度达到100％。可以把这14个基因开发成小型基因芯片或RT-PCR试剂盒用于肝癌转移的预测。所述的14个基因如下：KIAA1896，FADS3，RTBDN，FLJ10867，GSTM2，C20orf110，PORIMIN，GSTM1，CENTG3，KIAA0404，LLGL2，KLF13，NDUFA1，KIAA0649。

基于本发明人的新发现，可以以上述14个基因作为检测(确定、鉴定或诊断)肝癌转移情况或转移潜力的标志物(标记物)。通过分析这些基因的表达情况，从而得知受试者的肝癌是否已发生转移，或可早期评估受试者肝癌转移的可能性，为疾病的诊断或预后提供依据。

可采用各种技术来检测上述基因的表达情况，这些技术均包含在本发明中。基因水平上，检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA，或针对mRNA；可用的已有技术如(但不限于)：基因芯片技术、探针杂交技术、聚合酶链反应(PCR)、Southern印迹法、DNA序列分析等。

作为本发明的一种选择方式，通过定量或半定量的聚合酶链反应(PCR)法来分析样品中上述基因的表达情况以及表达量，从而可做出判断。较佳地，通过RT-PCR实现检测。

基因芯片

作为本发明的一种优选方式，采用基因芯片技术来检测上述基因的表达情况。所述的基因芯片上包含针对上述基因的探针；更优选的，所述的基因芯片上包含针对两种或两种以上所述基因的探针；最优选的，所述的基因芯片上包含针对所述14种基因的探针。

本发明所述的基因芯片，包括固相载体和有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针由10-100个(更特别的为20-80个；更特别的为30-70个)连续核苷酸组成。所述探针还可以在其5’端包含一段氨基修饰的1-30聚的聚脱氧胸苷酸(聚dT)。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基、异硫晴酸基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

本发明的基因芯片的制备可采用生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring themetabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

另一个方面，本发明还提供了一种通过基因芯片检测人组织中所述基因表达谱的方法，包括步骤：

(1)提供分离自人组织的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；

(2)将(1)的RNA与所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；

(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的基因的表达谱。

本发明所述的RNA与芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。

然后根据标记信号在芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。

对核酸样本进行标记的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年；马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

将上述核酸样本与基因芯片进行杂交时，可以先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。核酸样本与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。

然后根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。

检测试剂盒

本发明还提供一种用于检测所述基因的表达情况的试剂盒。所述的试剂盒可用于检测受试者肝癌是否发生转移或可用于检测所述基因的表达谱。所述的试剂盒中包括本发明所述的芯片。

更优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。所述的芯片图像分析软件比如：BaiO公司的BaiO ArrayDoctor 2.0，MediaCybernetics公司的Arraypro 4.0。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、RNA样本的制备

组织样本：

49例癌组织(包括28例已发生转移样本和21例未发生转移样本)来自于原发性肝癌患者的手术切除标本，这些标本来自于浙江大学第一附属医院和启东肝癌研究所；10例正常肝来自于意外死亡者。上述所有标本的取得均通过上海市政府授权的WHO合作组织伦理委员会的同意。组织样本的临床资料包括：性别、年龄、肿瘤大小、病理分级(Edmonson)、肝硬化与否、转移与否、复发与否、HBV和HCV感染情况等。所有患者术前都没有接受化疗，术后随访最长达60个月。

基因芯片：

全基因组表达谱芯片，采用博奥生物有限公司(http://www.capitalbio.com)的晶芯

人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片V1.0(双通道芯片)，含22000余个基因探针。

组织总RNA提取：

1.样品的收集和保存：离体组织切割成小块后立即置于液氮中速冻，然后可以移至-80℃冰箱保存。

2.组织块破碎：组织块放于液氮中研磨成粉，每克组织加入1ml Trizol(Invitrogen公司)。

3.总RNA抽提：按每毫升Trizol加0.2ml的氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育2-3分钟；4℃，10,000g离心15分钟；将无色上清液移入新的离心管中，加0.5ml异丙醇，室温孵育10分钟，10000g 4℃离心10分钟；倒掉上清，0.75ml75％(v/v)乙醇洗涤，4℃，7,500g离心5分钟；倒掉上清，室温干燥RNA沉淀5-10分钟(勿使RNA完全干燥)，用DEPC处理后的无RNA酶H₂O溶解沉淀。

4.分光光度计法定量RNA，并取少量Total RNA进行电泳，检查RNA是否降解。

实施例2、筛选差异显著的基因

28例已发生转移的癌样本与正常肝样本(10例混合)、21例未发生转移的癌样本与正常肝样本(10例混合)分别用cy3和cy5两种荧光染料标记，与全基因组表达谱芯片上的探针竞争性杂交。杂交后的芯片用晶芯

LuxScan^TM 10K微阵列芯片扫描仪扫描获得结果图像，再通过其随机附带的LuxScan 3.0通用微阵列图像分析软件对杂交结果定量。由此，得到28例有转移样本对正常样本(有转移/正常，Metastasis/Normal)mRNA芯片和21例无转移样本对正常样本(无转移/正常，Non-Metastasis/Normal)mRNA芯片的表达谱数据。

将上述28例有转移/正常和10例无转移/正常的芯片结果首先用LOWESS(局部加权回归分析)归一化。之后，经归一化后的有转移/正常(Metastasis/Normal)、无转移/正常(Non-Metastasis/Normal)的芯片结果取以2为底的对数(log₂X)，使用经两组T检验方法(因为有转移样本和无转移样本来源于不同病人)校正后的随机方差模型(RVM)筛选得到有转移/无转移(Metastasis/Non-Metastasis)的显著差异基因。

为验证基因差异的显著性不是由巧合引起的，本发明人引入上述T检验方法后再对数据随机重排1000次，检测一个基因在通过前述方法筛选后被检定为显著性差异基因的假阳性率(FDR，False Discovery Rate)。

在上述统计学方法中，只有p值＜0.05的基因才会被筛选为显著性差异基因。

分类器(可区分两类组织的基因)的筛选与验证

为寻找用于区分两类样本(有转移与无转移)，本发明人使用Matlab软件的Lib-SVM工具包，使用C-SVC(参数C的支持矢量分类器)和V-SVC(参数V的支持矢量分类器)两种方法，并各自采用四种核函数(linear kernel，ploykernel，gauss kernel，tanh kernel)，共计8种方法构建SVM分类器。SVM(supportvector machine，支持矢量机)分类器是两类样本间差异基因的差异倍数的对数值的非线性函数，它寻找能最大化两类样本间距离的超平面，因而可以最好地区分两类样本。

为检验分类器的分类准确度，本发明人选用在所有的交叉检验方法中最稳定的10乘10折交叉检验法。10折交叉检验法，是将样本总体分成10个子份，每次选1个子份作为测试数据集，其余9个子份作为训练数据集，重复10次(每次以不同的一个子份作为测试数据集)。如此得到的10个检验结果相结合形成对分类器分类准确度的一个评估值。

再由8种算法中选择分类准确度最高的一种作为最佳分类器。

为直观地显示同组样本间的相似以及不同组样本间的相异，本发明人在3维视效中引入多维标度法(multidimensional scaling，MDS)。MDS算法以被分类器(一组基因)定义的样本-样本间相似度矩阵为基础，确定每一个样本在低维空间内的位置，并使之适应于三维视效。在此三维空间中，两样本越接近，则它们越相似；反之，若两样本相距越远，则它们之间越不同。

结果

筛选差异基因时以p值＜0.05为界。有转移样本与无转移旁样本(有转移/无转移，Metastasis/Non-Metastasis)之间，共有90个显著差异基因。以这些差异基因作为分类器候选基因。套入8种SVM分类器算法并使用前述的10乘10折的交叉检验来验证分类器的分类准确度。经1000次数据置换的10乘10折交叉验证得到分类器后，为测试该分类器的预测能力，本发明人随机挑选10个样本作为未知样本，以该分类器对每个样本的组织来源(有转移或无转移)进行预测，观察其预测准确度。综合8种算法，由C-SVC(gauss kernel，高斯核函数)这一算法得到的分类准确度最高。这一算法得到的用于区分有转移与无转移样本的14个基因组成的分类器，见表1，其分类准确度可达到100％，对未知样本的预测准确率达到100％。

表1、组成分类器的14个基因

为便于直观显示分类器的分类效果，本发明人使用MDS算法将各个样本的14个基因信号值转换为3维的本征矢量，并将它们在3维空间中定位，绘制成有转移和无转移两类样本的三维散点图。由图可判断异组的任意两个样本间的距离是否比同组的任意两个样本间的距离要大。

以MDS算法转换后的有转移样本和无转移样本在三维空间内的散点图如图1。

实施例3、制备基因检测芯片

根据表1提供的14个基因序列(SEQ ID NO：1-14)，设计多核苷酸探针，根据产生序列的GC比等特征在序列两端加上0-20nt的连接序列；核心序列不同，连接序列也不同。连接序列可以由程序随机产生，连接序列和核心序列形成的探针满足以下条件：

1)探针序列中，同一种核苷酸(A、C、G、T)的数量不能超过序列总数的50％；

2)任何连续的A、T或C、G的数量不能超过序列总数的25％；

3)G、C含量占序列总数的40％-60％；

4)探针序列不能自杂交，即探针序列中互补片段的长度不能超过探针长度的30％。

设计的探针序列见表2。

表2

为使合成的探针稳定的结合在玻片上，采用常规的方法在合成后探针的5’端进行糖基修饰。

芯片的点制：先将玻片的表面进行烷基化修饰，以提高结合能力。采用常规的芯片点样方法进行点样，为了检测杂交试验的可重复性，每个探针在玻片上点3-6个杂交点。

实施例4、试剂盒制备

将实施例3中制备的芯片封装好，与使用说明书一起置于一盒中，构成试剂盒。

实施例5、芯片的检测

对从医院获得多个原发性肝癌的样本(包括20例有转移样本和20例无转移样本)，按实施例1方法制备供检测用的RNA样品，然后用实施例3中制备的芯片(芯片上包含有表2中SEQ ID NO：15-28所示的探针)，用双盲法进行检测。根据表1中所示的14种基因的存在与否以及上调和下调情况来判断待测样本。其中，阳性对照和阴性对照分别为已知的原发性肝癌有转移样本和无转移样本。

结果表明，由14种特异性的基因构成的分类器，其正确性为100％(与医院标明的组织类型完全相同)，可非常有效地区分原发性肝癌有转移样本和无转移患者。20例有转移样本的14种基因的表达模式都符合表1的情况；与之相反，20无转移样本的表达模式正好完全相反，都不符合表1的情况。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种多核苷酸集，其特征在于，所述的多核苷酸集包括编码以下蛋白的多核苷酸：

可溶性运载蛋白家族成员25，脂肪酸去饱和酶，Retbindin，CDK5调节亚基结合蛋白2，谷胱甘肽硫转移酶mu 2，肿瘤蛋白p53诱导的核蛋白2，跨膜蛋白123，谷胱甘肽硫转移酶mu 1，ArfGAP3，与酵母ATG2自噬相关蛋白2同源的蛋白A，与果蝇巨大幼虫致死基因同源的蛋白2，Kruppel样因子13，辅酶脱氢酶1alpha子基1和KIAA0649蛋白。

2.如权利要求1所述的多核苷酸集，其特征在于，所述的多核苷酸集包括：序列如SEQ ID NO：1-14所示的14种多核苷酸。

3.权利要求1或2所述的多核苷酸集的用途，其特征在于，用于制备测定原发性肝癌患者的肝癌转移情况或转移潜力的检测试剂或试剂盒。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的试剂是特异性扩增权利要求1或2所述的多核苷酸集中各多核苷酸的引物对；或是特异性识别权利要求1或2所述的多核苷酸集中各多核苷酸的探针。

5.一种用于测定原发性肝癌患者的肝癌转移情况或转移潜力的试剂，其是特异性识别序列如SEQ ID NO：n所示的多核苷酸的探针，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：n+14所示；其中n为选自1-14的正整数。

6.一种基因芯片，其特征在于，所述的基因芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的探针，所述的探针特异性地对应于SEQ IDNO：n所示的序列，其中n为选自1-14的正整数。

7.如权利要求6所述的基因芯片，其特征在于，所述的探针是特异性识别序列SEQ ID NO：n所示的多核苷酸的探针，所述的探针的核苷酸序列如SEQ IDNO：n+14所示。

8.权利要求6或7所述的基因芯片的用途，用于制备测定原发性肝癌患者的肝癌转移情况或转移潜力的试剂盒。

9.一种测定原发性肝癌患者的肝癌转移情况或转移潜力的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求6或7所述的基因芯片。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：核酸抽提液、显色液或杂交液。