CN102001985B - 富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物及其制备方法和应用，富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物，是由富勒烯C_2n与叠氮有机化合物通过环加成反应制得的富勒烯亚氨基衍生物，其结构通式为：C_2n[N(CH₂)_mCH₂NH₂]_x或C_2n[N(CH₂)_m-1CH₂COOM]_x，结构通式中，n＝30～50；m＝1～5；x＝8-24；M为H、NH₄、Na或K。本发明所述富勒烯多氮杂桥类衍生物具有良好的水相溶解性，并且其侧链末端存在的具有反应活性的基团-NH₂或-COOH，适于偶合键联各类标记物或者生物大分子，以用于纳米生物标记和检测技术。

Description

富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米生物材料领域，涉及一类富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物及其制备方法和应用，该富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物可偶联生物大分子及各类标记物作为水溶性纳米生物材料用于纳米生物标记与检测。

背景技术

富勒烯是一类分子大小处于纳米量级的笼状碳原子簇的总称。以“明星分子”C₆₀为典型代表的富勒烯类碳纳米材料，因奇特的结构和新颖的性能倍受科技工作者重视。由于富勒烯分子具有强烈的疏水性，仅能溶于对生物体有害的有机溶剂中，对生物体的生物相容性差，不易被直接吸收，而难于在生理介质中直接运用，这限制了其生物活性的发挥，妨碍了其在生物医学领域的应用。

幸运的是，富勒烯分子含大量共轭碳碳双键，具备缺电子芳烃化学性质，能与特定的亲水性亲核试剂经表面功能化修饰生成水溶性衍生物，该类衍生物既具有良好的水相溶解性，又能保留原有富勒烯分子特有性质。目前，富勒烯水溶性衍生物类碳纳米材料在生命科学及医学等相关领域已经展现出了诱人的应用价值。已有文献展示了其抗艾滋病毒活性、抗菌活性、抗氧化和自由基清除能力以及用于光动力疗法杀死癌细胞能力。它可作为纳米生物材料在纳米生物标记和检测技术领域中用于构建纳米探针、纳米生物传感器、治疗恶性肿瘤的纳米靶向药物载体、医学影像检测的造影剂、纳米医疗器件及医用纳米生物材料。

自1985年C₆₀被发现，众多科技工作者通过化学方法改造富勒烯分子，使之成为水溶性纳米材料。迄今为止，有关碳笼表面共价修饰法制备富勒烯水溶性衍生物的研究中，碳笼直接键联羟基生成富勒醇的研究最为广泛。富勒醇制备的主要方法有，富勒烯与HNO₃/H₂SO₄混酸反应法、与RCO₂NO₂亲电加成反应法、与KOH碱性反应法、与相转移催化剂作用下的碱性反应法以及超声波反应法等。利用经典的Bingle-Hirsch反应，富勒烯与丙二酸酯衍生物经环加成反应，制备出的富勒烯丙二酸多加成衍生物也具备水溶性。富勒烯母体在碱性条件下与过量的多种氨基酸反应，可获得相应的富勒烯多加成氨基酸水溶性衍生物。上述富勒烯水溶性衍生物均为富勒烯的多加成产物，这使得富勒烯母体碳笼外接多个连接臂，正是这些连接臂上大量亲水性官能团的存在才保证了整个分子的水溶性。显然，化学修饰法制备富勒烯水溶性衍生物就是要使母体碳笼表面能够修饰一定数量的亲水性官能团。

上述富勒烯水溶性衍生物作为纳米生物材料，用于纳米生物标记和检测技术领域偶联生物大分子或各类标记物时，富勒醇因碳笼表面修饰羟基而不容易发生共价偶联反应；富勒烯丙二酸衍生物侧链末端为羧基官能团，其虽可发生酰胺化偶联反应，但侧链太短，活性基团过于接近碳笼表面，因空间位阻效应太大而不利于偶联反应的进行；富勒烯的氨基酸衍生物，具有氨基和羧基两种官能团，进行酰胺化偶联反应时易产生交叉干扰。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种碳笼外接侧链末端键联亲水性官能团的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物，该衍生物具有良好的水相溶解性，并且其侧链末端存在具有反应活性的基团，适于偶合键联各类标记物或者生物大分子，以用于纳米生物标记和检测技术。

本发明的研究思路为：易于偶联生物大分子或各种标记物的富勒烯衍生物，应保证其侧链碳链长短适度，并且全部侧链碳链上仅只键联同一种活性基团，如：氨基或者羧基或者羧酸盐。

本发明采用的技术方案为：一种富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物，是由富勒烯C_2n与叠氮有机化合物N₃(CH₂)_mCH₂NH₂或N₃(CH₂)_m-1CH₂COOH通过环加成反应制得，其结构通式如下：

C_2n[N(CH₂)_mCH₂NH₂]_x或C_2n[N(CH₂)_m-1CH₂COOM]_x

上述结构通式中，n＝30～50；m＝1～5；x＝8～24；M为H、NH₄、Na或K。

本发明所述的富勒烯和叠氮化合物的环加成反应以及产物类型为本领域技术人员所公知，所制得的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物分子以富勒烯碳笼为核心，碳笼外至少带有8个亲水性侧链作连接臂，每个连接臂都通过氮原子与碳笼键联，氮原子上连接由数个碳原子构成的短直饱和碳链，碳链的另一末端还键联有亲水性官能团NH₂或者COOM，由此保证整个衍生物分子具备水溶性。连接臂的数目可根据不同的叠氮有机化合物及富勒烯品种确定，当连接臂数目低于8个时，其水溶性极差甚至完全不溶于水；当连接臂的数目高于24个时，产物的碳笼结构不稳定；故连接臂的数目宜在8～24个之间，对于C₆₀衍生物来说，特别优选8～14个。

本发明所述的富勒烯为每个分子由60～100个碳原子组成的具有球状或类球状结构并含有大量共轭碳碳双键的单质中的一种或几种的混合物，富勒烯分子中的碳原子数目优选60、70、76、78、84、90或96个，更优选60或70，并以60个碳原子为最优。

本发明所述的叠氮有机化合物，其分子结构中含有饱和脂肪直碳链且碳链一端必须键联叠氮基官能团(-N₃)而另一端必须键联亲水性的氨基(-NH₂)或羧基(-COOH)官能团，其结构示意图如下图所示，

本发明所述叠氮化合物的碳链含碳原子数目为2～6个(即m的取值为1～5)，优选碳链含碳原子数目为2～4个(即m取值为1～3)，特别优选叠氮化合物为2-叠氮基乙胺、2-叠氮基乙酸、3-叠氮基丙酸或4-叠氮基丁酸。作为本发明原料化合物的叠氮有机化合物的制备方法参见公开文献。其中，2-叠氮基乙胺的制备方法参见文献Inverarity A.I.，et al.，Organic &Biomolecular Chemistry 2007；5：636-643；2-叠氮基乙酸、3-叠氮基丙酸及4-叠氮基丁酸的制备方法参见文献Srinivasan R.，et al.，Organic & Biomolecular Chemistry 2009；7：1821-1828。

富勒烯可与含叠氮基团的有机物发生环加成反应是公知的技术，大量文献公开报道了非水溶性的富勒烯叠氮化单加成、二加成或多加成产物。本发明提供了一种经过改进的以富勒烯叠氮化多加成反应制备富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的方法。

当所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的结构通式为C_2n[N(CH₂)_mCH₂NH₂]_x或C_2n[N(CH₂)_m-1CH₂COOH]_x时，富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的制备方法包括如下步骤：

(1)将富勒烯C_2n与叠氮有机化合物N₃(CH₂)_mCH₂NH₂或N₃(CH₂)_m-1CH₂COOH分别溶于有机溶剂中，惰性气体氛围下，投料于反应器中搅拌；所述富勒烯与叠氮有机化合物的投料摩尔比为1∶20～50；

(2)反应体系首先升温至40～80℃，保温反应1～3天，然后再缓慢升温至110～160℃，保温5～24小时，停止加热，整个反应过程由TLC跟踪监控；

(3)去除溶剂，残余物经洗涤去除未反应的反应物及加成数目较少的非水溶性衍生化产物，加水重新溶解，过滤，滤液去除溶剂，得固状产物即为所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物。

进一步，所述步骤(1)中，所述有机溶剂优选甲苯、氯苯或二氯苯。有机溶剂的用量以富勒烯的投料摩尔数计为100～1000mL/mmol。

进一步，所述步骤(3)中，洗涤可采用常规试剂，如甲苯、甲醇、乙醚等，优选所得残余物依次用甲苯、乙醚、甲醇洗涤去除未反应的反应物及加成数目较少的非水溶性衍生化产物。

当所述富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的结构通式为C_2n[N(CH₂)_m-1CH₂COOM]_x，所述的M为NH₄、Na或K时，富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的制备方法包括如下步骤：

(1)将富勒烯C_2n与叠氮有机化合物N₃(CH₂)_m-1CH₂COOH分别溶于有机溶剂中，惰性气体氛围下，投料于反应器中搅拌；所述富勒烯与叠氮有机化合物的投料摩尔比为1∶20～50；

(2)反应体系首先升温至40～80℃，保温反应1～3天，然后再缓慢升温至110～160℃，保温5～24小时，停止加热，整个反应过程由TLC跟踪监控；

(3)去除溶剂，残余物经洗涤去除未反应的反应物及加成数目较少的非水溶性衍生化产物，加水重新溶解，过滤，滤液去除溶剂，得固状产物C_2n[N(CH₂)_m-1CH₂COOH]_x；

(4)步骤(3)获得的固状产物中加入碱液混合均匀，控制pH值约为12～13，以葡聚糖凝胶色谱柱分离，去离子水作为流动相，收集pH值不大于8的相应洗脱色带，冷冻干燥，即可得到所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物；所述的碱液为氨水、氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，碱液浓度在0.1～2mol/L之间。

进一步，所述步骤(1)中，所述有机溶剂优选甲苯、氯苯或二氯苯。有机溶剂的用量以富勒烯的投料摩尔数计为100～1000mL/mmol。

进一步，所述步骤(3)中，洗涤可采用常规试剂，如甲苯、甲醇、乙醚等，优选残余物依次用甲苯、乙醚、甲醇洗涤去除未反应的反应物及加成数目较少的非水溶性衍生化产物。

本发明所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的大量分子，通过疏水相互作用、氢键等分子间作用力或静电相互作用等非键作用方式，在立体空间形成具有三维纳米尺度的聚集体，该聚集体在水相中可形成水合粒径在纳米量级(数十纳米至数百纳米之间)的水溶性纳米生物材料。

本发明中得到的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物，其碳笼外接侧链末端存在具有反应活性的基团-NH₂或-COOM，使之可通过酰胺化缩合反应进而偶合键联诸如磁标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记等各类标记物以及糖类、核酸、多肽、抗体等生物大分子，以用于纳米生物标记和检测技术。尤其是上述衍生物分子中存在8个以上带末端活性基团的侧链，可同时偶联多个顺磁性标记物，从而实现偶联并富集顺磁标记物以用于磁共振成像(MRI)造影增强成像。例如：侧链末端键联羧基官能团的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物可偶联顺磁性金属锰卟啉化合物(结构如下所示)形成富勒烯-金属卟啉复合的纳米磁性探针，该纳米磁性探针可作为MRI造影剂用于造影增强MRI检测技术。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

A)本发明的化合物通过富勒烯的叠氮化加成反应在富勒烯碳笼上引入亲水性侧链，而且随着多加成反应的完成，使得碳笼修饰多个亲水性官能团，这大大提高了该类富勒烯衍生物在水相中的溶解性，从而实现富勒烯的水溶性改造，此改造的意义在于这类富勒烯氮杂桥多加成衍生化产物的发明大大丰富了富勒烯水溶性衍生物的品种。并且富勒烯水溶液衍生物中连接臂具体数目可由参加反应的叠氮有机化合物的种类、碳链长度、浓度及反应时间决定，通过调节富勒烯与指定叠氮有机化合物的反应计量比及反应时间，可获得指定连接臂数目的相应富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物。

B)本发明提供的制备富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的方法特点：①合成工艺简单、高效，操作方便、便于实现规模化生产；②纯化分离方法简便、大大降低了经济成本；③适应面宽，衍生化产物品种多样，由于叠氮有机化合物的碳链长度及亲水性官能团种类可适度选择，因此可合成一系列母体结构相似但碳笼外接侧链数目和长短不同及侧链末端亲水性官能团不同的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物。

C)本发明所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的碳笼外接侧链末端存在具有反应活性的基团-NH₂或-COOM，可通过酰胺化缩合反应偶合键联诸如磁标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记等各类标记物以及糖类、核酸、多肽、抗体等生物大分子，广泛用于纳米生物标记和检测技术，例如侧链末端键联羧基官能团的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物偶联顺磁性金属锰卟啉形成的富勒烯-金属卟啉复合的纳米磁性探针，用于MRI检测时，造影增强效果非常显著。

附图说明

图1.实施例1中化合物1水溶液的MALDI-TOF MS谱图。

图2.实施例1中化合物1在重水中的¹HNMR谱图。

图3.实施例1中化合物1粉末的FT-IR谱图。

图4.实施例1中化合物1的C1s XPS结合能实验曲线和拟合曲线。

图5.实施例6中化合物6、化合物10及纳米磁性探针1的UV谱图。

图6.实施例6中纳米磁性探针1、化合物10及Gd-DTPA的质子纵向弛豫率。

具体实施方式

以下实施例有助于进一步理解本发明，但本发明保护范围并不限于列举的实施例。

实施例1：C₆₀与2-叠氮基乙胺的多加成产物C₆₀(NCH₂CH₂NH₂)_x(化合物1)的制备

称取0.10mmol的C₆₀溶于15ml氯苯，常温下惰性气体保护，磁子搅拌，在30分钟内缓慢滴加2-叠氮基乙胺溶液(5.0mmol的2-叠氮基乙胺溶解于5ml氯苯中)，滴加完毕，缓慢升温至80℃，加热反应3天，升温至回流1天，停止反应。在加热过程中，亮紫色C₆₀溶液逐渐变成橙红色，并继续加深变成棕色。待反应液冷却至室温，减压蒸馏去除溶剂，残余物依次用甲苯、乙醚、甲醇洗涤，得棕黑色固体，即为化合物1，产率58％。

如图1.所示，MALDI-TOF MS中m/z为720处离子峰归属于C₆₀碎片，这与文献报道结果一致。一般认为，富勒烯水溶性衍生物碳笼外接官能团在MALDI-TOF MS实验过程中因激光解吸附作用从碳笼上被剥离，导致质谱中出现富勒烯碎片的离子峰而不出现衍生物的分子离子峰。由于C₆₀本身并不溶于水相，可判断化合物1为C₆₀的水溶性衍生物。此外，我们在N₃CH₂CH₂NH₂与C₆₀多加成反应的甲苯相副产物质谱中可观察到一系列m/z为720+58n(n＝1-6)的分子离子峰，可归属为C₆₀外接NCH₂CH₂NH₂基团数目为1-6个的衍生物，表明C₆₀(NCH₂CH₂NH₂)_n(n≤6)不溶于水。据此，间接证明化合物1是C₆₀的多加成氮杂桥水溶性衍生物，C₆₀(NCH₂CH₂NH₂)_x且x＞6。

如图2.所示，¹H NMR谱表明，侧链上的氢由于受富勒烯碳笼的影响向低场位移。3.758～3.786ppm之间多重峰归属于与伯胺基相邻的亚甲基氢(-CH₂-NH₂)，以3.236ppm为中心的三重峰归属于与叔胺基相邻的亚甲基氢。

如图3.所示，红外光谱在3420cm^-1处的强吸收峰归属为N-H伸缩振动，在2970、2930cm^-1处的弱吸收峰归属于C-H伸缩振动，在1626cm^-1处的尖吸收峰归属于C＝C伸缩振动，在500-600cm^-1之间的弱吸收峰为C₆₀的骨架振动吸收。

图4所示C_1s的XPS谱拟合曲线的拟合参数列于下表1：

表1

由拟合结果可知化合物1的C_1sXPS谱图具有二峰结构，表明其存在二种价态形式的碳。其中，结合能为285.04eV处的拟合峰归属于无氧碳，即碳笼上未键联侧链的sp²杂化碳原子(C＝C)，相对峰面积为52.3％；结合能为286.32eV的拟合峰归属于碳笼上与侧链中N原子相邻的碳(C-N)及侧链中与氨基相邻的碳(C-NH₂)，相对峰面积为47.7％。拟合所得两组峰的相对面积代表化合物1中两类碳的相对含量，由于化合物1分子中碳笼及侧链碳原子之和是60+2x，据此，我们可给出两类碳的数目，并推算出x值为10，最终认定化合物1的平均分子式为C₆₀(NCH₂CH₂NH₂)₁₀。

实施例2：C₆₀与2-叠氮基乙酸的多加成产物C₆₀(NCH₂COOH)_x(化合物2)及C₆₀(NCH₂COONa)_x(化合物3)的制备

称取0.10mmol的C₆₀溶于15ml氯苯，常温下惰性气体保护，磁子搅拌，在30分钟内缓慢滴加2-叠氮基乙酸溶液(2.0mmol的2-叠氮基乙酸溶解于5ml氯苯中)，滴加完毕，缓慢升温至50℃，加热反应24小时，继续升温回流5小时。去除溶剂，残余物依次用甲苯、乙醚、甲醇洗涤，得棕褐色固体，即为化合物2，产率95％。

称取化合物2固体粉末10mg，溶解于适量的1mol/L NaOH中，混合均匀，控制pH值在12～13，以葡聚糖凝胶(Sephadex G-15)色谱柱分离，中性的去离子水作为流动相，收集pH值不大于8的洗脱液，冷冻干燥，得到纯化的化合物3粉末，产率100％。

化合物2的表征数据，MS(MALDI-TOF)：m/z 720.¹H NMR(500MHz，D₂O，ppm)：δ2.776(s，-CH₂COOH).IR(KBr，cm^-1)：3422，2966，2928，1730，1637，1387，520，461.C1s XPS拟合值：285.04eV(C＝C)、286.34eV(C-N)、289.14eV(O＝C-OH)，相对面积依次为39.00％、45.75％、15.25％，推算出x值为13，认定化合物2的平均分子式为：C₆₀(NCH₂COOH)₁₃。

化合物3与化合物2的MALDI-TOF MS、¹H NMR及C1s XPS谱表征结果一致。二者的IR谱区别仅在于化合物3中不存在1730cm^-1的羰基伸缩振动峰。认定化合物3的平均分子式为：C₆₀(NCH₂COONa)₁₃。

实施例3：C₆₀与3-叠氮基丙酸的多加成产物C₆₀(NCH₂CH₂COOH)_x(化合物4)及C₆₀(NCH₂CH₂COONa)_x(化合物5)的制备

称取0.10mmol的C₆₀溶于15ml氯苯，常温下惰性气体保护，磁子搅拌，在30分钟内缓慢滴加3-叠氮基丙酸溶液(2.0mmol 3-叠氮基丙酸溶解于5ml氯苯中)，滴加完毕，缓慢升温至60℃，加热反应24小时，继续升温回流10小时。去除溶剂，残余物依次用甲苯、乙酸乙酯洗涤，得棕黄色固体，即为化合物4，产率92％。

化合物5的制备方法与实施例2中化合物3的制备方法相同，所不同的是将化合物2换作化合物4，得到纯化的化合物5粉末，产率100％。

化合物4的表征数据，MS(MALDI-TOF)：m/z 720.¹H NMR(500MHz，D₂O，ppm)：δ3.704(t，J＝2.5Hz，2H)，3.224(t，J＝3.5Hz，2H).IR(KBr，cm^-1)：3421，2968，2927，1710，1637，1399，605，519.C1s XPS拟合值：285.04eV(C＝C，C-C)、286.34eV(C-N)、289.14eV(O＝C-OH)，相对面积依次为60.52％、29.61％、9.87％，推算出x值为9，认定化合物4的平均分子式为：C₆₀(NCH₂CH₂COOH)₉。

化合物5与化合物4的MALDI-TOF MS、¹H NMR及C1s XPS谱表征结果一致。二者的IR谱区别仅在于化合物5中不存在1710cm^-1的羰基伸缩振动峰。认定化合物5的平均分子式为：C₆₀(NCH₂CH₂COONa)₉。

实施例4：C₆₀与4-叠氮基丁酸的多加成产物C₆₀(NCH₂CH₂CH₂COOH)_x(化合物6)及C₆₀(NCH₂CH₂CH₂COONa)_x(化合物7)的制备

称取0.10mmol的C₆₀溶于15ml氯苯，常温下惰性气体保护，磁子搅拌，在30分钟内缓慢滴加3-叠氮基丁酸溶液(2.0mmol 4-叠氮基丁酸溶解于5ml氯苯中)，滴加完毕，缓慢升温至60℃，加热反应24小时，继续升温回流10小时。旋出溶剂，残余物依次用甲苯、乙酸乙酯洗涤，得棕黄色固体，即为化合物6，产率83％。

化合物7的制备方法与实施例2中化合物3的制备方法相同，所不同的是将化合物2换作化合物6，得到纯化的化合物7粉末，产率100％。

化合物6的表征数据，MS(MALDI-TOF)：m/z 720.¹H NMR(500MHz，D₂O，ppm)：δ3.636(t，J＝8.0Hz，2H)，2.269(t，J＝9.5Hz，2H)，1.798-1.869(m，2H).IR(KBr，cm^-1)：3424，2960，2936，1710，1637，1402，605，527，462.C1s XPS拟合值：285.04eV(C＝C，C-C)、286.34eV(C-N)、289.24eV(O＝C-OH)，相对面积依次为64.98％、26.27％、8.75％，推算出x值为8，认定化合物6的平均分子式为：C₆₀(NCH₂CH₂CH₂COOH)₈。

化合物7与化合物6的MALDI-TOF MS、¹H NMR及C1s XPS谱表征结果一致。二者的IR谱区别仅在于化合物7中不存在1710cm^-1的羰基伸缩振动峰。认定化合物7的平均分子式为：C₆₀(NCH₂CH₂CH₂COONa)₈。

实施例5：C₇₀与2-叠氮基乙酸的多加成产物C₇₀(NCH₂COOH)_x(化合物8)及C₇₀(NCH₂COONa)_x(化合物9)的制备

称取0.05mmol的C₇₀溶于10ml氯苯，常温下惰性气体保护，磁子搅拌，在20分钟内缓慢滴加2-叠氮基乙酸溶液(1.0mmol的2-叠氮基乙酸溶解于3ml氯苯中)，滴加完毕，缓慢升温至60℃，加热反应48小时，继续升温回流24小时。去除溶剂，残余物依次用甲苯、乙醚、甲醇洗涤，得棕色固体，即为C₇₀(NCH₂COOH)_x(化合物8)，产率86％。

化合物9的制备方法与实施例2中化合物3的制备方法相同，所不同的是将化合物2换作化合物8，得到纯化的化合物9粉末，产率100％。

化合物8的表征数据，MS(MALDI-TOF)：m/z 840.¹H NMR(500MHz，D₂O，ppm)：δ2.750(s，-CH₂COOH).IR(KBr，cm^-1)：3422，2958，2926，1730，1607，1388，584，472.C1s XPS拟合值：285.04eV(C＝C)、286.34eV(C-N)、289.24eV(O＝C-OH)，相对面积依次为50.35％、37.24％、12.41％，推算出x值为12，认定化合物8的平均分子式为：C₇₀(NCH₂COOH)₁₂。

化合物9与化合物8的MALDI-TOF MS、¹H NMR及C1s XPS谱表征结果一致。二者的IR谱区别仅在于化合物9中不存在1730cm^-1的羰基伸缩振动峰。认定化合物9的平均分子式为：C₇₀(NCH₂COONa)₁₂。

实施例6：富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物与顺磁性标记物偶合的纳米磁性探针制备及弛豫性能测试的具体实施方式

本实施例述及的富勒烯-金属卟啉复合的纳米磁性探针1，是将化合物6采用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)与N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)活化后再直接与化合物10偶联制得，具体可用如下步骤制备：

(1)以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作溶剂，将C₆₀(NCH₂CH₂CH₂COOH)₈(化合物6)用新鲜的DCC与NHS活化，优选15～30分钟，DCC：NHS的摩尔比优选为2∶1，NHS与C₆₀(NCH₂CH₂CH₂COOH)₈的摩尔比优选为15∶1。

(2)将化合物10以10倍于化合物6的投料摩尔数加入到步骤(1)所得溶液中，反应6小时。

(3)将步骤(2)得到的混合物溶于水，过滤，透析，浓缩，葡聚糖凝胶柱层析分离，去离子水做流动相，收集pH 6～7的保留时间最短流出色带，即可得到目标产物富勒烯-金属卟啉复合的纳米磁性探针1。

所述的化合物10的制备方法参考文献：Zhang，Z.，et al.，Bioorganic and MedicinalChemistry Letters.2009；19(23)：6675-6678.，结构如下所示：

化合物6、化合物10及纳米磁性探针1的UV图谱示于图5，由谱图可知纳米磁性探针1的UV图谱中同时包含化合物6和化合物10的主要UV图谱信息，表明纳米磁性探针1就是化合物6与化合物10的复合物。

弛豫性能实验在200兆动物MRI仪上进行。分别配置纳米磁性探针1、及作为对照的化合物10和临床常用的Gd-DTPA的一系列不同浓度样品。为测量每个样品的水质子纵向弛豫时间T₁(纵向弛豫速率为1/T₁)，一系列样品充入核磁试管捆扎成束，采用反转恢复自旋回波成像序列扫描，序列参数为：重复时间10s，回波时间13.5ms，成像面积3.5×3.5cm²，片厚1.0mm，数据矩阵64×64，在0.05～15s之间选择一系列合适的TI值。通过三参数单指数函数拟合，获得所有待测样品的T₁。通过某样品一系列不同浓度时的T₁值进一步拟合该样品的质子纵向弛豫率即R₁值。图6为各样品纵向弛豫速率1/T₁相对于其浓度变化趋势图，此变化趋势的斜率即为其R₁值，结果示于表2。化合物10与化合物6复合后R₁值提高40％以上，比Gd-DTPA的高一倍以上，这表明富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物偶合顺磁标记物有助于体系R₁值的提高，而R₁值越高即表明该产品用于MRI检测时造影增强效果越显著。

表2

样品名	R1(mM-1S-1)
		纳米磁性探针1	10.34
化合物10	7.36
		Gd-DTPA	5.12

Claims (10)

1.一种富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物，是由富勒烯C_2n与叠氮有机化合物N₃(CH₂)_mCH₂NH₂或N₃(CH₂)_m-1CH₂COOH通过环加成反应制得，其结构通式如下：

C_2n[N(CH₂)_mCH₂NH₂]_x或C_2n[N(CH₂)_m-1CH₂COOM]_x

上述结构通式中，n＝30～50；m＝1～5；x＝8～24；M为H、NH₄、Na或K。

2.根据权利要求1所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物，其特征在于所述的n为30、35、38、39、42、45或48。

3.根据权利要求1所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物，其特征在于所述的n为30或35。

4.根据权利要求1所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物，其特征在于所述的m选自1～3。

5.根据权利要求1～4之一所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的制备方法，其特征在于所述的M为H，所述的制备方法包括如下步骤：

(1)将富勒烯C_2n与叠氮有机化合物N₃(CH₂)_mCH₂NH₂或N₃(CH₂)_m-1CH₂COOH分别溶于有机溶剂中，惰性气体氛围下，投料于反应器中搅拌；所述富勒烯与叠氮有机化合物的投料摩尔比为1∶20-50；

(2)反应体系首先升温至40～80℃，保温反应1～3天，然后再缓慢升温至110～160℃，保温5～24小时，停止加热，整个反应过程由TLC跟踪监控；

(3)去除溶剂，残余物经洗涤去除未反应的反应物及加成数目较少的非水溶性衍生化产物，加水重新溶解，过滤，滤液去除溶剂，得固状产物即为所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物。

6.根据权利要求5所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述有机溶剂为甲苯、氯苯或二氯苯。

7.根据权利要求1～4之一所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的制备方法，其特征在于所述富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的结构通式为C_2n[N(CH₂)_m-1CH₂COOM]_x，所述的M为NH₄、Na或K，所述的制备方法包括如下步骤：

(1)将富勒烯C_2n与叠氮有机化合物N₃(CH₂)_m-1CH₂COOH分别溶于有机溶剂中，惰性气体氛围下，投料于反应器中搅拌；所述富勒烯与叠氮有机化合物的投料摩尔比为1∶20～50；

(2)反应体系首先升温至40～80℃，保温反应1～3天，然后再缓慢升温至110～160℃，保温5～24小时，停止加热，整个反应过程由TLC跟踪监控；

(3)去除溶剂，残余物经洗涤去除未反应的反应物及加成数目较少的非水溶性衍生化产物，加水重新溶解，过滤，滤液去除溶剂，得固状产物C_2n[N(CH₂)_m-1CH₂COOH]_x；

(4)步骤(3)获得的固状产物中加入碱液混合均匀，控制pH值约为12～13，以葡聚糖凝胶色谱柱分离，去离子水作为流动相，收集pH值不大于8的相应洗脱色带，冷冻干燥，即可得到所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物；所述的碱液为氨水、氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，碱液浓度在0.1～2mol/L之间。

8.根据权利要求7所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述有机溶剂为甲苯、氯苯或二氯苯。

9.根据权利要求1所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物在制备磁共振成像造影剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物的结构通式为：C_2n[N(CH₂)_m-1CH₂COOM]_x，其中M为H、Na、K或NH₄，所述的富勒烯多氮杂桥类水溶性衍生物与结构式如下所示的金属锰卟啉化合物复合制得纳米磁性探针，该纳米磁性探针即可作为磁共振成像造影剂，

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