CN101993955A - 一种三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法 - Google Patents
一种三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101993955A CN101993955A CN2010105805780A CN201010580578A CN101993955A CN 101993955 A CN101993955 A CN 101993955A CN 2010105805780 A CN2010105805780 A CN 2010105805780A CN 201010580578 A CN201010580578 A CN 201010580578A CN 101993955 A CN101993955 A CN 101993955A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hydriopsis cumingii
- genotype
- chelex
- dna
- cumingii
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明的一种三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法，包括三角帆蚌基因组DNA的快速提取，三角帆蚌微卫星序列扩增和三角帆蚌基因型鉴定的方法。首先，利用Chelex100能有效除去非核酸有机物的特点，建立了Chelex-100DNA快速提取方法，实现了DNA提取过程中细胞裂解和DNA萃取的同步化；然后根据Chelex100法提取的DNA溶液特点，优化PCR反应体系，建立了三角帆蚌微卫星序列扩增的方法；最后，采用ABI3730核酸分析仪检测，用GeneMapper软件(AppliedBiosystems)进行基因型分析，建立了三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法。此方法具有高效、快速、准确、对人体无害等优点。
Description
技术领域
本发明涉及三角帆蚌优良品种的选育，具体说是一种三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法，属分子生物学技术领域。
背景技术
我国是世界第一产珠大国，目前珍珠总产量高达1800多吨，占世界珍珠总产量的90%以上。而在这1800多吨的总产量中，淡水珍珠占98%以上，其中90%以上是由三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）育出的。当前，已形成了以浙江诸暨山下湖珍珠市场和江苏渭塘珍珠市场为辐射中心的淡水珍珠产业群，2009年全世界珍珠及相关产品销售额约100亿美元，中国只有15亿美元左右。我国珍珠产业正在堕入有“名”无“利”的“高产陷阱”。与骄人的产量相比，质量低劣与“下游”产品开发乏力，使中国珍珠产业链呈现出畸形的“头重脚轻”，中国珍珠的“珍宝”形象难以实至名归。培育高产、优质、抗逆能力强的优良品种已是我国淡水珍珠产业发展的迫切需求。
三角帆蚌是我国特有的优质淡水育珠蚌，主要分布于河北、山东、安徽、江苏、浙江、江西、湖北和湖南等省大、中、小型湖泊及其周围河流内。目前，上海海洋大学通过我国三角帆蚌优异种质筛选工作，发现鄱阳湖、洞庭湖、太湖三角帆蚌种质优异，但这些三角帆蚌是野生蚌，仍需进一步改良和培育。利用不同的育种和生物技术手段，将不同的品系或品种的优良性状进行转移、整合或固定，是培育良种的有效的途径。由于三角帆蚌具有如下两大特点：一是出生时个体非常小，无法进行物理标记，这是难于利用陆生动物已行之有效的家系选育技术的原因之一；二是三角帆蚌的生存介质是水体，各养殖池之间生态差异较大，分池饲养获得的差异有时被环境差异所淹没，得到的差异很难代表遗传差异使育种效率大大降低；三角帆蚌的这两个特点使传统选育方法见效很慢，尤其是对低遗传力的性状选育效率低下。近十年来, 国际上贝类遗传育种的研究趋势是在鉴定经济性状相关的分子标记的基础上，将选择育种与现代育种生物技术特别是分子遗传标记技术结合，形成分子标记辅助育种技术。分子标记辅助育种技术已在罗非鱼、虹鳟等水产动物育种工作中发挥了重要作用。
分子标记辅助育种技术的核心内容之一就是鉴定选育后代基因型，目前三角帆蚌基因型的鉴定仍采用酚氯仿法提取DNA，然后用微卫星标记引物进行PCR鉴定，该方法费时费力，且DNA提取过程对人体有害。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有三角帆蚌基因型鉴定方法所存在的不足而提供一种三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法，具体包括如下：
1、三角帆蚌基因组DNA的抽提步骤
取三角帆蚌组织用Chelex-100溶液，从三角帆蚌组织中抽提出含基因组DNA的上清液，用0.8-1%的琼脂糖胶电泳检测；
2、三角帆蚌SSR序列扩增步骤
采用上述上清液作为DNA模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶检测，EB染色，于凝胶成像系统下观察并拍照记录；
3、三角帆蚌基因型鉴定
凝胶电泳预检测合格的PCR扩增反应产物，采用ABI3730核酸分析仪检测，用GeneMapper软件(Applied Biosystems)进行基因型分析，并由Excel格式输出结果。（请补充如何分析）
所述三角帆蚌基因组DNA的抽提步骤，具体如下：
A．将Chelex-100溶于无菌水中，配制成Chelex-100溶液；
B．取500uL该Chelex-100树脂溶液于1.5mL的Eppendorf离心管中；
C．取1×1×1mm的三角帆蚌组织放入盛有Chelex-100的离心管中，加入10mg/mL的蛋白酶K15uL；
D．离心管放在摇床上(温度50-60 ℃，转速50rpm)震荡1h,接着将该混合液在100℃下温浴15-30min,然后将蛋白质彻底变性的混合液放在4℃--20℃条件下保存；
E．混合液在振荡器上振荡10sec，然后10,000-15,000rpm离心2-5min，上清中含有DNA；
F．取5uL上清液，用1%的琼脂糖胶电泳检测；
上述步骤A中，在60℃条件下将Chelex-100溶于无菌水中，配置成10%浓度的Chelex-100溶液。
所述步骤D步中，将蛋白质彻底变性后的混合液放在-20℃条件下保存。
所述三角帆蚌SSR序列扩增步骤具体如下：
所述三角帆蚌SSR序列扩增步骤中：微卫星的正向引物采用FAM荧光染料进行标记；PCR反应体系为25μL，含10×Buffer 2.5μL，Mg2+ 2mmol/dm3，dNTP 0.2mmol/dm3，Taq DNA聚合酶1U，上、下游引物各0.2μmol/dm3，模板DNA5uL；PCR反应条件：94℃预变性3min，（94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s）进行38个循环，最后72℃延伸5min； PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶检测，EB染色，于凝胶成像系统下观察并拍照记录。
本发明中基因组DNA抽提方法区别于已有的酚氯仿DNA提取法, 在DNA提取过程中实现了细胞裂解和DNA萃取的同步化，节约了DNA萃取和纯化步骤，省时省力，且对人体无害;其次,本发明中的三角帆蚌微卫星序列扩增的PCR体系是更优化的;另外,本发明采用ABI3730核酸分析仪检测，用GeneMapper软件(Applied Biosystems)进行基因型分析，精确度可达1bp，建立了三角帆蚌微卫星精确分型方法，克服了传统琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测灵敏度低，准确性差的问题。
具体实施方式：
应理解本发明所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。
本具体实施方式的三角帆蚌基因型鉴定
1.三角帆蚌基因组DNA的提取
首先将Chelex-100在60℃条件下溶于无菌水中，配制浓度为10%的Chelex-100溶液，然后取500uL10%的Chelex-100树脂溶液于1.5mL的Eppendorf离心管中，再取少量三角帆蚌组织（约1×1×1mm）放入盛有Chelex-100的离心管中，加入10mg/mL的蛋白酶K15uL,将离心管放在摇床上(温度55 ℃，转速50rpm)震荡1h,接着将该混合液在100℃条件下温浴15min,将蛋白质彻底变性，该混合液可以放在-20℃保存。使用前，混合液在振荡器上振荡10sec，然后13,000rpm离心3min，上清中含有DNA，取5uL上清液，用1%的琼脂糖胶电泳检测。
2.三角帆蚌SSR序列扩增
采用上述上清液作为DNA模板，进行PCR扩增，其中，微卫星的正向引物须采用FAM等荧光染料进行标记， gCAM2-ATGT-F1：FAM-ACAAAATGTTCGCAAATAACTGTA ，gCAM2-ATGT-R1：CACTCGGAATGCCTCCCTGATT。PCR反应体系为25μL，含10×Buffer 2.5μL，Mg2+ 2mmol/dm3，dNTP 0.2mmol/dm3，Taq DNA聚合酶1U，上、下游引物各0.2μmol/dm3，模板DNA5uL。PCR反应条件：先94℃预变性3min， 而后94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共进行38个循环，最后72℃延伸5min。 PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶检测，EB染色，于凝胶成像系统下观察并拍照记录。
3.三角帆蚌基因型鉴定
凝胶电泳预检测合格的PCR扩增反应产物，采用ABI3730核酸分析仪检测，用GeneMapper软件(Applied Biosystems)进行基因型分析，并由Excel格式输出结果。
Claims (4)
1. 三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法，其特征在于，具体包括如下：
1）、三角帆蚌基因组DNA的抽提步骤
取三角帆蚌组织用Chelex-100溶液，从三角帆蚌组织中抽提出含基因组DNA的上清液，用0.8-1%的琼脂糖胶电泳检测；
2）、三角帆蚌SSR序列扩增步骤
采用上述上清液作为DNA模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶检测，EB染色，于凝胶成像系统下观察并拍照记录；
3）、三角帆蚌基因型鉴定
凝胶电泳预检测合格的PCR扩增反应产物，采用ABI3730核酸分析仪检测，用GeneMapper软件(Applied Biosystems)进行基因型分析，并由Excel格式输出结果。
2. 如权利要求1所述的三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法，其特征在于，所述三角帆蚌基因组DNA的抽提步骤，具体如下：
A．将Chelex-100溶于无菌水中，配制成Chelex-100溶液；
B．取500uL该Chelex-100树脂溶液于1.5mL的Eppendorf离心管中；
C．取1×1×1mm的三角帆蚌组织放入盛有Chelex-100的离心管中，加入10mg/mL的蛋白酶K15uL；
D．离心管放在摇床上(温度50-60 ℃，转速50rpm)震荡1h,接着将该混合液在100℃下温浴15-30min,然后将蛋白质彻底变性的混合液放在4℃--20℃条件下保存；
E．混合液在振荡器上振荡10sec，然后10,000-15,000rpm离心2-5min，上清中含有DNA；
F．取5uL上清液，用1%的琼脂糖胶电泳检测；
如权利要求2所述的三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法，其特征在于，所述步骤A中，在60℃条件下将Chelex-100溶于无菌水中，配置成10%浓度的Chelex-100溶液。
3. 如权利要求2所述的三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法，其特征在于，所述步骤D步中，将蛋白质彻底变性后的混合液放在-20℃条件下保存。
4. 如权利要求1所述的三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法，其特征在于，所述三角帆蚌SSR序列扩增步骤具体如下：
所述三角帆蚌SSR序列扩增步骤中：微卫星的正向引物采用FAM荧光染料进行标记；PCR反应体系为25μL，含10×Buffer 2.5μL，Mg2+ 2mmol/dm3，dNTP 0.2mmol/dm3，Taq DNA聚合酶1U，上、下游引物各0.2μmol/dm3，模板DNA5uL；PCR反应条件：94℃预变性3min，（94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s）进行38个循环，最后72℃延伸5min； PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶检测，EB染色，于凝胶成像系统下观察并拍照记录。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105805780A CN101993955A (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 一种三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105805780A CN101993955A (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 一种三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101993955A true CN101993955A (zh) | 2011-03-30 |
Family
ID=43784704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010105805780A Pending CN101993955A (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 一种三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101993955A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105420234A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-03-23 | 浙江师范大学 | 三角帆蚌微卫星标记及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101565705A (zh) * | 2008-04-22 | 2009-10-28 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 日本血吸虫微卫星位点及其应用 |
-
2010
- 2010-12-09 CN CN2010105805780A patent/CN101993955A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101565705A (zh) * | 2008-04-22 | 2009-10-28 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 日本血吸虫微卫星位点及其应用 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| 《Acta Otorrinolaringol Esp》 20041231 L.A.GARC�A GONZ�LEZ et al. DNA extraction using chelex resin for the oncogenic amplification analysis in head and neck tumours 139-144 第55卷, * |
| 《Journal of fisheries of China》 20060228 Wang gui ling et al. Preliminary study on applicability of microsatellite primers developed from 15-20 第30卷, 第1期 * |
| 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 20080215 肖蓉 洞庭湖区三角帆蚌微卫星分子标记研究 D052-1 , 第2008年第02期 * |
| 《水产学报》 20070331 汪桂玲，袁一鸣，李家乐 中国五大湖三角帆蚌群体遗传多样性及亲缘关系的SSR分析 152-158 第31卷, 第2期 * |
| L.A.GARCíA GONZáLEZ ET AL.: "DNA extraction using chelex resin for the oncogenic amplification analysis in head and neck tumours", 《ACTA OTORRINOLARINGOL ESP》, vol. 55, 31 December 2004 (2004-12-31), pages 139 - 144 * |
| 汪桂玲，袁一鸣，李家乐: "中国五大湖三角帆蚌群体遗传多样性及亲缘关系的SSR分析", 《水产学报》, vol. 31, no. 2, 31 March 2007 (2007-03-31), pages 152 - 158 * |
| 白志毅: "三角帆蚌表达序列标签及珍珠形成相关基因的克隆和多态性研究", 《上海海洋大学博士学位论文》, 28 June 2010 (2010-06-28) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105420234A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-03-23 | 浙江师范大学 | 三角帆蚌微卫星标记及其应用 |
| CN105420234B (zh) * | 2015-12-15 | 2017-12-22 | 浙江师范大学 | 三角帆蚌微卫星标记及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101619357B (zh) | 一种获得est-ssr标记的方法 | |
| CN112048572B (zh) | 基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒 | |
| CN101845495B (zh) | 检测检疫性实蝇的基因芯片 | |
| Chen et al. | Development of a PNA probe for fluorescence in situ hybridization detection of Prorocentrum donghaiense | |
| CN108179200B (zh) | 一种与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用 | |
| CN112176074A (zh) | 一种检测虾夷扇贝的实时荧光pcr引物探针及方法 | |
| CN103866043A (zh) | 一种鉴定鲢、鳙杂交和遗传渐渗个体的微卫星标记与特异性引物和应用 | |
| Ma et al. | Parentage assignment of the mud crab (Scylla paramamosain) based on microsatellite markers | |
| CN110592268A (zh) | 罗湖病毒（TiLV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN106701948A (zh) | 紫扇贝、海湾扇贝与杂交后代母本来源的鉴定方法 | |
| CN104789691B (zh) | 一种基于一步pcr技术进行凡纳滨对虾遗传性别鉴定的方法 | |
| US20210332433A1 (en) | Method for identifying genetic sex of Portunus trituberculatus | |
| CN103436618A (zh) | 棉蚜特异性ss-coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法 | |
| CN108456734A (zh) | 一种与凡纳滨对虾高碱度抗性相关的snp标记、检测引物及其应用 | |
| CN102321750A (zh) | 一种用分子标记快速筛选边鸡体重增长程度的方法 | |
| CN103525933B (zh) | 一种区分草鱼和青鱼的pcr-rflp方法 | |
| CN109536624B (zh) | 用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和检测方法 | |
| CN101993955A (zh) | 一种三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法 | |
| CN106498086A (zh) | 紫扇贝与海湾扇贝及其回交后代母本来源的鉴定方法 | |
| CN104789666A (zh) | 基于dna条形码登革热传播媒介白纹伊蚊标准基因及应用 | |
| CN107841563A (zh) | 鉴别鲶鱼的分子特异性标记引物及方法 | |
| CN101597648A (zh) | 大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法 | |
| CN104313164A (zh) | 鉴别棉花D genome和D sub-genome全套染色体的方法 | |
| CN107841565A (zh) | 鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法 | |
| CN102732624A (zh) | 一种刺参速生性状相关srap标记的筛选方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110330 |