CN101993891A - 表达羧酸转运蛋白基因的植物表达载体及其在改良苜蓿耐铝性状中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改良苜蓿耐铝性状的方法，通过将超量表达启动子调控下的羧酸转运蛋白基因整合到苜蓿基因组中，实现羧酸转运蛋白基因在苜蓿中的超量表达，得到转基因苜蓿。该方法显著增加苜蓿中有机酸的含量，铝胁迫下转基因苜蓿根相对伸长量大于野生型对照，其根尖受到的伤害比野生型小，植株累积的铝含量低，苜蓿耐铝性状得到明显改良。

Description

表达羧酸转运蛋白基因的植物表达载体及其在改良苜蓿耐铝性状中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种植物表达载体及其应用，尤其涉及含有羧酸转运蛋白基因的植物表达载体及其在改良苜蓿耐铝性状中的应用。本发明还涉及基于该植物表达载体的转基因植物的制备方法。

背景技术

在全世界80亿公顷可耕地中，酸性土壤占30％左右，50％以上的耕地为潜在的酸化土壤(von Uexküll and Mutert，1995)。酸性土壤大部分分布在热带和亚热带的发展中国家，该地区酸性土壤约占世界的60％。就我国目前土地资源情况而言，我国南方处热带和亚热带地区，酸性土面积约203.5万km²，占全国总面积的21％。近年由于广泛使用氨肥和半干旱土壤的长期浇水灌溉，也进一步加剧了耕作土壤的酸化进程。铝在地壳中的含量非常丰富，当土壤pH小于5.5时，有毒性的Al³⁺成为主要形式。因此，在酸性土地中常常伴随铝毒害，铝毒成为酸性土壤中限制农作物产量的主要因子(Leon V.Kochian，1995)。

紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)简称苜蓿，是优良的多年生豆科牧草，素有“牧草之王”的美称，是目前世界上最主要的生饲料作物之一。它不仅营养丰富品质好、产草量高、适口性好，是家畜的优质饲料；而且其根系发达，根深可达10米以上，可蓄水保土、防风固沙；此外，苜蓿还可通过根瘤固氮，增加土壤氮素，分解磷酸盐、改善土壤理化性质，起到肥田作用。苜蓿喜温暖半干旱气候，对铝害较敏感。近年来，随着我国农业结构调整和南方具有丰富的水热资源，苜蓿种植已大量南移，但长江流域及其以南等广大地区土壤偏酸性，过多的游离铝和交换性铝离子对苜蓿产生毒害，铝毒成为限制苜蓿在南方酸性土壤中生长最主要的因子，因而提高紫花苜蓿的对铝害的耐受性是解决苜蓿南移的关键。

克服铝毒害的常用方法是通过大量施用石灰，提高土壤pH值，使游离铝沉淀，解除铝毒害，但施用石灰仅对表层土壤发挥作用，深层土壤仍呈酸性，难以彻底解决土壤酸度问题，并且在大量酸性土壤中施用石灰既增加农民经济负担，又存在潜在环境问题。相比之下，培育耐铝毒的苜蓿品种是最为经济有效的方法。

植物可通过根系有机酸的分泌来降低铝离子的毒害程度。在铝毒分子生物学方面的研究中，较多集中于改变植物体内有机酸合成途径相关酶类的活性来获得耐铝的转基因植物，并已取得成功的例子。如Fuente等将假单胞菌细胞质柠檬酸合酶(CS)基因在烟草和番木瓜中超量表达，提高了转基因植株的柠檬酸含量并增加了柠檬酸的分泌，从而极大地提高了烟草和番木瓜对铝的抗性。然而，当Delhaize等对Fuente等研究的同种转基因系烟草及高效表达假单胞菌35S-CSB蛋白活性达100倍的转基因系烟草重新进行研究，却没有发现此两种转基因系根系柠檬酸浓度及柠檬酸的分泌与对照相比有所增加，这两种转基因烟草的抗铝性也没有提高。Koyama等也在拟南芥和胡萝卜细胞内高效表达线粒体柠檬酸合酶基因，观察到转基因植株体内柠檬酸浓度及体外柠檬酸分泌量均明显增加，分别改善了转基因拟南芥在缺磷土壤上的生长及转基因胡萝卜细胞在铝-磷酸盐介质中的生长。Tesfaye等通过提高苜蓿根瘤苹果酸脱氢酶(nodule-enhanced MDH，neMDH)活性，使柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸及醋酸盐在苜蓿根系中的浓度和分泌量提高，并使转基因苜蓿的耐铝性在水培或土培中都得到明显增强。在通过提高植物体内有机酸合成酶基因的表达改善植物对铝毒的耐受性的同时，也可通过降低植物体内有机酸的分解途径提高植物对铝毒的耐受性。如Kihara等研究表明，降低胡萝卜细胞内分解柠檬酸基因NADP-异柠檬酸脱氢酶(NADP-ICDH)的活性，而使此胡萝卜突变体细胞柠檬酸分泌显著增加。说明通过对植物根系有机酸分泌的影响，可以提高植物对铝毒的耐受能力，将有机酸合成酶基因导入受体植株可提高紫花苜蓿对酸性土壤的耐受性(Mesfin等，2001，罗小英等，2004)。

羧酸转运蛋白(DTC，dicarboxylate-tricarboxylate carrier)参与植物中多种羧酸的转运，能将线粒体内的三羧酸和二羧酸运输到胞质中，有可能会增加根系有机酸的分泌，从而提高植物的耐铝能力。本发明人从适应南方酸性土壤环境生长的柑桔类植物中克隆了编码羧酸转运蛋白基因，并转入饲料作物苜蓿中，得到耐铝形状改良的转基因苜蓿。迄今为止还未见有通过利用编码羧酸转运蛋白的基因创造耐铝苜蓿品种的报道。

发明内容

本发明的目的是改良植物的耐铝性状，尤其解决苜蓿南移的瓶颈问题。本发明提供一种表达羧酸转运蛋白基因的植物表达载体，通过构建编码羧酸转运蛋白基因的超量表达载体，并将其整合到苜蓿基因组中，以改良苜蓿的耐铝性状，提高苜蓿对南方酸性土壤中铝毒的耐受能力。

本发明还提供所述植物表达载体在植物耐铝性状改良中的应用。

本发明进一步提供一种含有该植物表达载体的转基因植物的制备方法。

根据本发明的一个方面，本发明的植物表达载体至少含有由羧酸转运蛋白基因和启动子组成的表达羧酸转运蛋白基因的核苷酸，所述核苷酸通过将编码羧酸转运蛋白的基因与编码启动子的基因可操作地连接而构建。

所述羧酸转运蛋白基因可以是由动物、植物或微生物中分离克隆得到的天然基因，也可以是人工改造或设计的基因。优选地，所述编码羧酸转运蛋白基因为负责将有机酸从线粒体中转运到胞质中的相关基因；更优选地，所述羧酸转运蛋白基因来源于在酸性土壤环境中生长较好的香橙(Citrus junos)中的羧酸转运蛋白基因CjDTC(Citrus junos Dicarboxylate/Tricarboxylate Carrier)。

所述启动子可以是由动物、植物或微生物中分离克隆得到的天然启动子，也可以是人工改造或设计合成的启动子。优选地，所述启动子为超量表达启动子，更优选为CaMV35S。

优选的植物表达载体具有如图2所示的结构。

根据本发明的另一方面，提供一种转化体，将本发明的植物表达载体转染宿主而获得转化体，该转化体可用于转化植物而获得转基因植物。

根据本发明的再一方面，提供本发明的植物载体在苜蓿耐铝性状改良中的应用。通过在植物体内超量表达羧酸转运蛋白的相关基因，调节植物体内有机酸含量，从而提高苜蓿对酸性土壤中铝毒的耐受能力。

根据本发明的再一方面，提供一种转基因植物的制备方法，将上述转化体转化植物，获得转基因植物。所述方法包括下述步骤：

1)将羧酸转运蛋白基因与植物超量表达启动子可操作地连接；

2)构建含有羧酸转运蛋白基因与植物超量表达启动子的植物表达载体；

3)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；

4)用所述转化体转化植物，获得转基因植物。

根据该方法制备的转基因植物中有机酸含量增大，可以螯合更多游离的铝离子，从而改良植物对铝毒的耐受性，尤其可以解决苜蓿在酸性土壤中铝毒害增强的问题。更具体地，改良苜蓿耐铝性状的方法包括下述步骤：1)获得超量表达启动子；2)获得编码羧酸转运蛋白的相关基因；3)将步骤1)中分离克隆到的启动子与步骤2)中分离克隆到的羧酸转运蛋白编码基因进行融合，构建超量表达羧酸转运蛋白基因的植物表达载体；4)将步骤3)得到的植物表达载体整合到苜蓿基因组中；5)将通过步骤4)获得的苜蓿进行进一步的培养、栽培，获得转基因的苜蓿植株。

本发明中，所述的启动子与羧酸转运蛋白编码基因融合以及构建表达载体的方法是本领域的常规方法，使用的载体可以是植物转基因领域所使用的常规载体。将表达载体整合到苜蓿的基因组所使用的方法可以是常用的植物转基因方法，例如根癌农杆菌介导法或基因枪法。

本发明中所指的“苜蓿耐铝性状”是指苜蓿对铝毒表现出的耐受能力提高的性状，包括植株生长状态、根的相对伸长量、有机酸含量、铝含量等。

本发明中所指的“转基因苜蓿”是指通过分子生物学、生物技术手段，将其他生物的基因转移到苜蓿中，从而使其遗传物质得到改造的苜蓿。用于改造的基因可以来源于植物、动物以及微生物或者人工合成改造。

本发明根据植物铝害机制以及有机酸合成转运与耐铝的关系，将来源于适应酸性土壤生长香橙中的羧酸转运蛋白基因在超量启动子的控制下在苜蓿中表达，创造性地采用了负责线粒体中羧酸转运的编码基因为主要元件构建新的基因表达载体，并建立起了与之相适应的改良苜蓿耐铝性状的方法。

本发明方法在选定了启动子和目的基因的情况下，本发明的启动子和目的基因融合成新的基因的方式可以采用本领域常用的方式，并可以将融合成的新的基因转入本领域常用的载体中构建成表达载体再转入苜蓿中。在使用本发明方法改良苜蓿耐铝性状的过程中，既可以只在一个部位表达目的基因，也可以在多个部位和多个发育阶段表达，本发明方法已经提供了技术方案。

本发明改良苜蓿耐铝性状的方法，是通过在苜蓿基因组中超量表达羧酸转运蛋白的相关基因，促进线粒体中所合成有机酸向胞质中的转运，增加苜蓿体内有机酸含量和苜蓿根际有机酸的分泌量，螯合更多游离的铝离子，从而提高对铝毒的耐受性。试验结果证明，经本发明改良苜蓿耐铝性状的方法所改良的苜蓿的根伸长量增加、有机酸含量增加、植株体内铝的含量降低，苜蓿耐铝性状得到明显改良。本发明方法简便易行，效果显著，解决苜蓿南移的瓶颈问题，为南方畜牧业带来高产、抗逆的饲草饲料新品种，促进畜牧业的发展而产生巨大的经济效益。

附图说明

图1：强启动子调控下的羧酸转运蛋白基因表达载体的构建流程图

Km，卡那霉素抗性基因；Amp，氨苄青霉素抗性基因；NPTII，新霉素磷酸转移酶基因；GUS，β-葡萄糖酸苷酶基因；35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；Pnos，冠瘿碱合成酶基因启动子；nos，冠瘿碱合成酶基因终止子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界。用于构建植物表达载体的骨架载体为pBI121基础上改造的p5载体，具有CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行GUS染色的筛选。

图2：本发明构建的植物表达载体结构图

图3：转基因苜蓿的组织化学鉴定与分子验证图

将经过抗生素筛选后的100多个转化植株进行组织化学鉴定，在此基础上提取苜蓿基因组DNA，进行PCR扩增验证。结果有12个转化子中有30多个株系扩增呈阳性。图3A左为转化后在抗生素培养基的筛选，右图为组织化学染色的部分结果。图3B为转基因苜蓿经PCR扩增验证的部分图片。

图4：超量表达CjDTC基因的转基因苜蓿株系CjDTC的定量PCR分析

对30多个株系的转基因苜蓿提取RNA，反转录后进行普通RT-PCR表达分析，筛选出12个独立转化子，32个株系的目的基因表达量都比野生型高。在普通RT-PCR分析基础上，进行定量PCR分析，筛选出DTC4-4、DTC5-2、DTC9-3、DTC13-4和DTC30-1等表达量高的转基因株系，在这些株系中，DTC30-1株系的表达量最高，其次是DTC4-4、DTC5-2、DTC3-4和DTC9-3。其中：wildtype，野生型；DTC4-4、DTC5-2、DTC9-3、DTC13-4和DTC30-1为不同转基因株系。纵坐标代表目的基因相对表达量(18S为内标基因)。

图5：转基因苜蓿与野生型株系的有机酸含量的对比分析

对上述表达水平高的转基因苜蓿植株，参照Tesfaye(2001)方法提取植株体内有机酸，在HPLC上进行分析，结果显示：转基因苜蓿植株中苹果酸含量均比野生型高，DTC9-3，DTC13-4，DTC30-1等三个转基因株系的苹果酸含量增加最为明显。其中：wildtype，野生型；DTC4-4、DTC5-2、DTC9-3、DTC13-4和DTC30-1为不同转基因株系。纵坐标代表苹果酸含量(mg/g·FW)

图6和图7：转基因苜蓿与野生型株系的耐铝实验的对比分析

图6为转基因苜蓿与野生型株系的根伸长量测定结果。收取转基因苜蓿种子在无菌条件下萌发、生长5d后，将组织化学鉴定为阳性的幼苗置于Al³⁺浓度为50μmol/L的MSB(pH4.3)培养皿中竖直培养，处理2d后统计各株系根的相对伸长量。从统计数据结果可以看出，转基因苜蓿根的相对伸长量均比野生型大，表明在铝胁迫处理环境中，转基因苜蓿对铝毒的耐受能力得到提高。其中：wildtype，野生型；DTC4-4、DTC5-2、DTC9-3、和DTC13-4为不同转基因株系；纵坐标代表根相对伸长量(％)。

图7为超量表达CjDTC的转基因苜蓿与野生型株系在铝胁迫后根生长情况及根相对伸长量统计结果。将生长5d的T₁代苜蓿幼苗置于pH4.3、浓度为50um Al³⁺的MSB培养皿中竖直培养，2d后统计各株系根的相对伸长量。根相对伸长量＝(铝处理的根伸长量/无铝处理的根伸长量)×100％。其中：A，野生型苜蓿未加铝处理；B，野生型苜蓿加铝处理；C，转基因苜蓿未加铝处理；D，转基因苜蓿加铝处理。

图8：转基因苜蓿与野生型株系在铝胁迫处理与非处理后的伤害检测

转基因苜蓿与野生型株在胁迫后取根尖部分在Aniline blue fluorochrome染液中染色进行荧光观察，可以见到染料结合愈创葡聚糖产生荧光。从染色结果来看，野生型与转基因苜蓿在受到铝毒胁迫后，根尖都有荧光产生，均比未处理根尖的荧光强。在转基因株系与野生型之间，转基因苜蓿植株根尖产生的荧光比野生型弱，表明转基因植株根尖积累的愈创葡聚糖比野生型少，其受到铝毒伤害的程度比野生型轻。WT表示野生型苜蓿根尖，DTC表示转基因苜蓿根尖，-Al表示未加铝处理，+Al表示加铝处理。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

实施例一苜蓿基因组的制备

1、DNA的提取

选取苜蓿幼叶0.5～1g，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL 65℃预热的CTAB提取液(100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA(pH8.0)，1.5mol/L NaCl，2％CTAB(W/V)，4％PVP40(W/V)和2％巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入)，快速振荡混匀。65℃水浴30min，然后加入1mL 5mol/L KAc，冰浴20min后，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次(10,000r/min，4℃离心5min)，取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，静置约30min，用玻棒挑出絮状沉淀，用75％的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μL TE中。加入1μL RNaseA(10mg/ml)，37℃处理1h。再用酚(pH8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，4℃离心5min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75％的乙醇漂洗，风干，溶于200μL TE中，-20℃保存备用。

2、RNA的提取

选取约0.5～1g新鲜苜蓿叶片材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入10mL离心管，加入5mL 65℃预热的RNA提取液(2％CTAB(W/V)，2％PVP(W/V)，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5g/L Spermidine，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀。65℃水浴～3min，期间混匀2～3次。氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次(10,000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积10mol/L LiCl溶液，4℃放置6h，以氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用200μL的DEPC处理水溶解。酚(pH4.5)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加1/10体积3mol/L NaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用70％的酒精漂洗一次，风干。加20μL的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。

3、基因组序列的PCR扩增

10×Ex PCR buffer(Mg²⁺free)         2.5μL

2.5mmol/L dNTPs                     2μL

25mmol/L MgCl₂                      2μL

引物1(5μmol/L)                     1μL

引物2(5μmol/L)                     1μL

Ex Taq DNA聚合酶                    1U

基因组DNA                           约60ng

                                              

25μL的扩增体系

扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，57℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

实施例二表达羧酸转运蛋白基因的核苷酸和植物表达载体的制备

将含有CjDTC编码基因序列的pUC-CjDTC克隆载体和植物表达载体p5(～500ng)的细菌菌株在5mL LB液体培养基(含相应抗生素)中，37℃振荡培养12～16小时。载体构建流程见图1。构建的植物表达载体结构如图2所示，其包括表达羧酸转运蛋白基因的核苷酸(SEQ ID NO.1)以及表达筛选所需的各元件。pUC-CjDTC为含有目的基因的普通克隆载体，p5是用于构建植物表达载体的骨架载体为pBI121基础上改造的p5载体，具有CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行GUS染色的筛选。用质粒DNA提取试剂盒(Omega公司产品)提取其质粒DNA，电泳检测DNA质量。取质粒pUC-CjDTC(～300ng)和p5(～500ng)DNA，经XbaI和SmaI(Roche公司产品)在酶切Buffer A中，置于37℃水浴2小时。在1.0％的琼脂糖凝胶上，100V电压电泳10～20分钟，按如下方法回收、连接和转化。

长度在2.0kb以下的片段采用离心法回收。紫外灯下，用洁净的刀片切下含有目的片段的琼脂糖凝胶块。用5号缝衣针在0.5mL的离心管底部钻一小孔并填入大小合适的玻璃棉。将含有目的片段的琼脂糖块放入填有玻璃棉的0.5mL离心管中，液N₂速冻，将速冻的0.5mL离心管套入到一1.5mL的离心管中，13,000r/min离心3min。向流出液(含DNA)中加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH5.2)，3倍体积的无水乙醇，混匀后于-70℃放置30min。13,000r/min、4℃离心15min收集DNA沉淀，用预冷的75％的乙醇洗涤沉淀。室温干燥，用适量的TE溶解沉淀即得到目的片段。p5载体回收用GE公司产品进行回收。回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。回收的片段与p5载体建立如下连接体系：

10×T4DNA连接缓冲液      1μL

p5载体DNA片段            50～100ng

外源连接产物DNA片段      ～50ng

T4DNA连接酶               1μL

                                  

用双蒸水补足体积至10μL的连接体系

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1∶3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。

实施例三转化体和转基因植物的制备

1、用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

2、超量表达CjDTC基因的载体整合到苜蓿基因组

通过根癌农杆菌介导的方法进行苜蓿的遗传转化。

表1根癌农杆菌介导的苜蓿遗传转化用培养基配方

MS：Murashige & Skoog，1962；Gelrite：Sigma，货号：G1910；SH：Schenk&Hildebrandt，1972

3、表达载体通过农杆菌介导胚性愈创的方法导入苜蓿，具体方法如下：

(1)无菌实生苗的产生

种子先用75％酒精浸泡10min，再用0.1％HgCL₂消毒10～15min，无菌水冲洗3～4次，用少量无菌水浸种，置于摇床上，120rpm振荡，27℃催芽16～18h，将露白种子接种到1/2MS培养基上，23±2℃光照培养，培养5～7d。

(2)胚性愈伤悬浮系的建立

切取子叶接种于胚性愈伤诱导培养基UM^[18]，23±2℃，光照16h/d，培养3～4周，取带绿点胚性愈伤，按2g/20mL接种量接种于UM液体培养基上，置于摇床上，100r/min转速，23±2℃，振荡培养，每周继代一次。取继代两次的悬浮胚性愈伤作为转化受体材料。

(3)农杆菌及其质粒和菌液制备

本实验所用根癌农杆菌(Agrobacterium tumerfacien)菌株LBA4404为本实验室自己保存，质粒载体pSGhAlin，含gus和npt II基因及一个铝诱导蛋白基因GhAlin，由CaMV35S启动子启动。将保存于-80℃的根癌农杆菌菌株，转接到含卡那霉素50mg/L，链霉素125mg/L的YEB琼脂平板上，28℃暗培养48h。挑取单菌落接种于10mlYEB液体培养基(含相应抗生素)，在180rpm、28℃培养OD₆₀₀值达0.6～0.8。

(4)胚性愈伤转化

将苜蓿悬浮胚性愈伤，用60目筛过滤，取出部分筛上愈伤继续悬浮，其余浸入装有10ml含AS400μmol/L的SH^[19]液体培养基中，加入2ml菌液，振荡5～10min后，用60目筛过滤胚性愈伤，用无菌吸水纸吸干愈伤表面菌液，接种于共培养培养基CM上，24℃暗培养3d。

(5)抗性体胚的筛选与植株的再生

挑取共培养后的胚性愈伤，接种于脱菌液体培养基中，置于120r/min转速摇床上，脱菌3-4h，用60目筛过滤胚性愈伤，将胚性愈伤接种于铺有纱布的体胚发育筛选培养基ECM上，23±2℃，光照16h/d，每两周继代1次。培养4～5周，将长出的成熟抗性体胚接种于成苗培养基PM上，23℃，1个月左右成苗。将经组织化学染色鉴定及PCR扩增鉴定的转基因植株，在室温下炼苗1～2周后，移栽于室外花钵中。结果见图3。

实施例四用RT-PCR的方法检测导入的CjDTC基因在苜蓿中的表达

用cDNA一链合成试剂盒(MBI公司)合成各种RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。取1μL一链产物为模板进行PCR扩增，25μL体系中包括1×PCR缓冲液，0.2mmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCl₂，CjDTC基因的上下游引物序列为：P1：5′-GCCTCCTACGATCAAAGTG-3′(SEQ ID NO.2)，P2：5′-CTACAACCCCACTTTCTTC-3′(SEQ ID NO.3)各0.2μmol/L，1U TaqDNA聚合酶(Promega)。温度循环参数为94℃预变性5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min，30循环；72℃延伸5min。用核糖体基因18S作内标。核糖体基因18S的引物序列为：P3：5′-AAGGAATTGACGGAAGGGCACCA-3′(SEQ ID NO.4)和P4：5′-TAAGAACGGCCATGCACCACC-3′(SEQ ID NO.5)。定量PCR分析结果见图4。

实施例五用Real-time PCR的方法检测导入的CjDTC基因在苜蓿中的表达

提取对照和转基因苜蓿叶片总RNA，通过逆转录合成cDNA一链。以此为模板进行quantitative real-time PCR扩增。具体操作步骤为：用DNA一链合成试剂盒(MBI公司)合成各种RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。PCR在quantitative real-time PCR仪上进行，在25μL的反应体系中包括12.5μL MIX buffer(Bio-Rad公司，包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，上下游引物各0.2μmol/L和1μL一链产物。温度循环参数为94℃预变性3mins；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，0.5min，预设循环数为35。用核糖体基因18S作内标，上、下游引物序列同上。扩增CjDTC基因的上、下游引物同上。在运行quantitative real-time PCR前，用相同引物和模板在相同的温度调控程序中扩增一次，通过琼脂糖电泳，检查并确保扩增产物是单带。

实施例六转基因苜蓿株与野生型的有机酸含量对比分析

液氮研磨铝毒处理转基因株和野生型根组织、经80％乙醇抽提、离心收集上清液，然后旋转蒸发浓缩、用4.0mmol/L H₂SO₄500ul溶解浓缩残留物，然后上HPLC进行分析测定。标样4.0mmol/L H₂SO₄稀释溶解，配制。有机酸分析用岛津公司(shimazu)高压液相色谱(HPLC)，有机酸分析柱为BIO-RAD公司的AminexHPX-87X(BIO-RAD Catalog#：125-0140)，流动相为4.0mmol/LH₂SO₄。流速：0.6ml/min，检测波长：210nm。分析结果见表2和图5，结果显示，转基因苜蓿植株中苹果酸含量均比野生型高，其中DTC9-3，DTC13-4，DTC30-1等三个转基因株系的苹果酸含量增加最为明显。

表2转基因苜蓿与野生型体内苹果酸含量(mg/g·FW)

实施例七转基因苜蓿与野生型的根伸长量对比分析

收取转基因苜蓿种子在无菌条件下萌发、生长5d后，将组织化学鉴定为阳性的幼苗置于Al3+浓度为50μmol/L的MSB(pH4.3)培养皿中竖直培养，处理2d后统计各株系根的相对伸长量。统计结果见图6和图7。结果显示，转基因苜蓿根的相对伸长量均比野生型大，表明在铝胁迫处理环境中，转基因苜蓿对铝毒的耐受能力得到提高。

实施例八转基因苜蓿与野生型的伤害检测对比分析

铝害胁迫植物后，其根尖细胞受到损伤会产生愈创葡聚糖(callose)的沉积，愈创葡聚糖是植物受到铝害的指示物。Aniline blue fluorochrome是对愈创葡聚糖特异检测的一种荧光指示剂。根尖积累的愈创葡聚糖多，所产生的荧光基因越强。取经过铝胁迫处理及其对照材料的根尖约5mm，用蒸馏水漂洗3次，然后加入蒸馏水溶解浓度为0.025mg/ml的Aniline blue fluorochrome(Biosupplies Catalog#：100-1)完全淹埋样品，在20℃，染色30min。用蒸馏水清洗3次，在荧光显微镜(波长480nm)观察照相记录。结果见图8。

实施例九转基因苜蓿与野生型的铝含量对比分析

取CjDTC基因表达量高以及苹果酸含量都比野生型高的转基因苜蓿株系，分别取叶和根等样品约5g，在烘箱中烘干、研磨成粉，加强酸消煮、定容，运用石墨炉加热，进行铝元素的原子吸收光谱法分析。原子吸收光谱仪为日立公司Z-5000(HITACHI Z-5000)。铝元素含量的测定结果见表3。

表3转基因苜蓿与野生型的叶、根的铝含量

从测定结果可以看出，与野生型相比，所有转基因苜蓿叶片和根中铝含量均比野生型低。在叶片中，以DTC4-4转基因株系铝含量最低。在根中DTC9-3转基因株系铝含量最低。超量表达DTC基因促成植株胞质有机酸含量增加，排铝毒能力增强，从而减少了铝在根、叶片中的积累。

Claims (5)

1.一种表达羧酸转运蛋白基因的植物表达载体，其至少含有由羧酸转运蛋白基因和启动子组成的表达羧酸转运蛋白基因的核苷酸。

2.权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体具有如图2所示的结构。

3.一种转化体，以权利要求1所述的植物表达载体转化宿主获得。

4.权利要求1-3任一项所述的植物表达载体在苜蓿耐铝性状改良中的应用。

5.一种含有权利要求1所述的植物表达载体的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：

1)将羧酸转运蛋白基因与植物超量表达启动子可操作地连接；

2)构建含有羧酸转运蛋白基因与植物超量表达启动子的植物表达载体；

3)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；

4)用所述转化体转化植物，获得转基因植物。

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