CN101983724B - 一种快速高通量抗病毒药物筛选模型 - Google Patents

Abstract

针对普通体外高通量筛选的不确定性和不对应性等缺陷，本发明提供了一种新型的高通量筛选模型的建立方法，最大限度的模拟动物体内生理环境，增加了药物筛选的准确性，使体外筛选的结果更接近临床应用效果。本发明的技术方案为：通过动物体内循环对药物吸收分离药物有效成分的方法提取动物含药血清，使药物经过体内代谢过程后再加到细胞培养液或维持液中，结合微量细胞培养法、细胞病变(CPE)测定和MTT法计算细胞活性。

Description

一种快速高通量抗病毒药物筛选模型

技术领域

本发明涉及药物筛选模型领域，具体涉及一种抗病毒药物的快速高通量筛选模型的建立方法，可应用于药物的筛选。

背景技术

药物筛选模型(drug screening model，drugscreening assay method)是用于证明某种物质具有药理活性(生物活性、治疗作用)的实验方法，这些实验方法是寻找和发现药物的重要条件之一。人们在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，大致分为经典的动物实验法、分子生物学筛选法、高通量药物筛选法和高内涵药物筛选技术。

所谓动物筛选法就是以动物作药物筛选的观察对象，以动物对药物的反应，证明某些物质的药理作用，评价其药用价值。单纯从新药筛选的角度看，动物筛选模型的最大优点是可以从动物身上直观地反应出药物的治疗效果、不良反应以及毒副作用。由动物模型获得的筛选结果，对预测被筛选样品的临床效果、毒副作用和应用前景具有十分重要的价值。但动物筛选法也存在缺点：采用动物模型进行药物筛选时，由于动物的特殊性，决定了药物筛选过程主要依赖于手工操作，而且只能对有限的样品进行筛选，使整体动物模型筛选新药具有明显的局限性，效率低、成本高、动物实验需要时间长、劳动强度大、操作技术要求高、受试样品需要量大(约5g)。

分子生物学筛选方法：近20年来，许多药物作用的受体已被分离、纯化，一些基因的功能及相关调控物质被相继阐明，为药物筛选提供了许多新的靶点，这就使得药物筛选模型从传统的整体动物、器官和组织水平发展到细胞和分子水平。分子生物学为药物筛选提供了新型靶蛋白，对人工合成的组合化学库和小分子肽库进行目的性药物筛选。通过比较健康人群与患者间在机体组织细胞分子上的差异以及阐明模型组织中相应蛋白质的功能，从而正确地选择、描述并确认某些靶蛋白，这有助于更加理性和有目的性地进行药物筛选。生化水平的药物筛选拟用开发药物作用的靶点设计实验，一般而言这种作用靶点是具有某种特定生理功能的蛋白质，如酶和受体等，此外一些编码功能明确的DNA也越来越多地成为药物作用的新靶点。候选化合物与靶点混合后，可以通过酶联免疫、荧光显色、核磁共振等方法定量测定化合物与靶点的相互作用，从而成为筛选化合物的依据。生化水平的药物筛选操作相对简单，成本较低，但是由于药物在体内的作用并不仅仅取决于其与靶酶的作用程度，吸收、分布、代谢、排泄均会对药物的作用产生极大的影响，仅仅一道薄薄的细胞膜就能够阻挡住许多候选化合物，因而生化水平的药物筛选不确定因素更多，误筛率较高。此外，该筛选方法手段单一、费时耗财也成为其无法深入发展的缺陷。

高通量药物筛选(high throughput screening，HTS)是20世纪80年代后期形成的寻找新药的高新技术。采用的筛选方法一般是以药物作用靶点为主要对象的细胞和分子水平的筛选模型，根据样品与靶点结合的表现，判断化合物的生物活性。由于这些筛选方法在微量条件下进行，同时采用自动化操作系统，可以进行大规模的筛选，因而称为高通量药物筛选。高通量筛选依赖数量庞大的样品库，实现了药物筛选的规模化，较大限度地利用了药用物质资源，提高了药物发现的概率，同时提高了发现新药的质量，充分利用了药用资源。高通量筛选采用的是细胞、分子水平的筛选模型，筛选实验是在微量筛选系统中完成的，样品用量一般在微克级(g)，节省了样品资源，奠定了“一药多筛”的物质基础，同时节省了实验材料，降低了单药筛选成本。而且高通量药物筛选为高度自动化操作，不但减少了操作误差的发生，降低了劳动强度，而且提高了药物筛选的效率和结果的准确性。但是，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；用于高通量筛选的模型总是有限的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。

高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性的一种药物筛选方法。从技术层面而言，高内涵筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术，旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息；从筛选载体上看，高内涵药物筛选与高通量药物筛选并没有显著的区别，也是在微孔板上进行的，目前使用较多的是96孔微板。高内涵药物筛选的检测体积并未因检测指标增加而增高，操作步骤同样简单可行、自动化。虽然高通量药物筛选的结果较为准确，易于评价，但其检测模型均建立在单个药物作用靶分子的基础上，无法全面反映被筛样品的生物活性特征。

以现代分子和细胞生物学为基础建立的快速、微量、定向的体外筛选模型和测试方法，以及结合自动化技术发展起来的高通量筛选技术是目前创新药物的研究重要手段。药物的药理作用是通过肌体细胞或病原体的药物靶点而发挥，内用药物无论是经过口服、注射等任何一种给药途径，都需经过吸收、代谢、分布和排泄的过程，这些过程都影响药物的效果，如代谢通过氧化、分解、结合等影响药物的分子结构和作用效果，过程相当复杂，有的使药效降低或消失，如氯丙嗪、磺胺药等；有的使药效增强，如无活性的抗癌药物硫唑嘌呤经过代谢变成具有药理活性的6-硫基嘌呤。常规体外细胞或病原体培养药物筛选模型，因药物未经过体内吸收、分布、代谢等过程，而是直接作用于细胞或病原体；因此不能真正的反映药物的作用，存在不确定性和不对应性，有些在体外实验有效的药物或药物成分，在临床实验上却无效。通常体外药物筛选的结果与临床效果存在很大的偏差；同时常规体外细胞培养药物筛选模型需先对每种药物进行培养细胞的安全用量测定，工作量大，操作复杂，成本高等缺陷。

发明内容

针对普通体外高通量筛选的不确定性和不对应性等缺陷，本发明提供了一种新型的高通量筛选模型的建立方法，最大限度的模拟动物体内生理生化环境与过程，提高了药物筛选的准确性。

本发明的技术方案包括如下步骤：

(1)给每只试验动物灌服最大耐受剂量药物，分离制备含药血清或血浆备用；

(2)按常规方法制备正常试验动物血清或血浆，测试其血清或血浆对细胞的影响，得出动物血清或血浆对细胞系培养的最大安全浓度；

(3)以动物血清的最大安全浓度量为标，将含药血清或血浆加入细胞培养液或细胞维持液中培养，作CPE测定和MTT法测定，评价药物效果，筛选出有效药物。

本发明中所说的最大耐受剂量是指给某一种动物一次灌服药物最多，但不致动物死亡的剂量。最大耐受剂量：(maximal tolerance dose，MTD或LD0或LC0)：指某实验总体的一组受试动物中不引起动物死亡的最大剂量。

毒理学中，最大耐受剂量：(maximal tolerance dose，MTD或LD0或LC0)：指某实验总体的一组受试动物中不引起动物死亡的最大剂量。

本方法的原理是：测定某一试验动物(小鼠、大鼠、豚鼠、犬、猫、猪、兔、禽等)血清(血浆)对培养细胞系的安全使用浓度，并建立细胞系微量培养方法；将药物经试验动物服用，进行吸收、分布与代谢，提取动物含药血清(血浆)，以安全浓度替代正常试验动物血清(血浆)，按微量细胞培养法，作细胞培养，测定细胞病变(CPE)程度和MTT法计算细胞活性，判断药效。

根据生物药剂学原理，通过试验动物对药物的消化、吸收、分布和代谢，药物有效成分进入动物血液中(药动学中央区)，从而分离获得含药血清或血浆，极大地摒弃药物的非活性成分；利用其含药血清或血浆，进行细胞培养，结合细胞病变(CPE)程度测定和细胞成活率测定法(MTT)，判断药物的有效性；最大程度地排除药物中非特异性成分的干扰，提高药物筛选的可靠性。

根据本发明的实施例，步骤(1)中对未知药动力学参数的药物给每只试验动物连续1-5次灌服最大耐受剂量药物，间隔时间为0.5-2h，最后一次灌服后10-60min采血；对已知药动力学参数的药物在血液的药峰时间采血。

本发明与现有技术相比，具有如下优势：

a)提高了药物的有效筛选率。本发明模型使药物经过动物体内的吸收、分布、代谢过程后，取含药血清(血浆)用体外细胞培养法进行药效测定；其模型结合了体内生理生化过程和体外细胞与病原体的直观效果测定的两大特点，其药效结果能真实反映药物的作用，使体外筛选的结果与临床药效的吻合度大大增加；因此该高通量药物筛选模型提高了药物筛选的可靠性，有效的提高了药物的筛选率；

b)简化了筛选程序。常规的体外细胞培养法高通量筛选模型，要检测每一种待筛药物对细胞的安全浓度，这对于成千上万药物的初筛是一项巨大的工作。该发明将含药动物血清或血浆添加到细胞培养液中，虽然各种动物血清对细胞的毒害作用存在差异，但试验动物血清和药物相比，与细胞培养的犊牛血清较接近，能适于细胞培养，加入之前只需测试动物血清对细胞的安全浓度，无须检测每一种待筛药物对细胞的安全浓度，简化了筛选程序，可大批量的快速测定，节约了大量的人力物力；

c)大大降低或消除药物理化因素对常规模型的不良作用。常规的体外细胞培养法筛选模型大都将药物直接加到细胞培养液中去，一方面药物可能对病原体产生非药理性抑灭作用，造成筛选的假阳性结果；另一方面药物对细胞产生诸多不利的理化作用，造成假阴性结果。如细胞培养的最适PH值为7.2～7.4之间，大于8或者小于5细胞状态不良或死亡，而很多药物的PH值不在体外细胞培养的最适范围内；又如药物，尤其是中草药含有大量的非药效成分，对细胞有毒害作用，因此造成有效药物漏筛的情况非常普遍。本发明是通过动物服用对药物进行筛选式的吸收，滤过大量非药理成分；再经肝脏代谢进入血液(药代动力学的中央区)，其血液所含药物大多为功能性成分；因此，大大消除常规模型的非特异性结果，提高药物筛选的有效性。

d)操作方便，节约成本。所有药物的筛选最终都需要做动物和人体给药试验，但动物尤其是大型动物如猿、猴等试验费用昂贵，且试验规模和效率也受到影响。本发明的血药细胞培养法采取试验小动物的血清进行试验，即使是大动物亦可反复试验，来源广泛，成本低廉，操作方便，效果真实，大大降低了药物筛选的成本，提高了工作效率，可用于大规模药物初步筛选，尤其适合中草药有效成分和前体药物的筛选，因为中草药成分复杂，有效成分不易确定，本发明是体内与体外相结合的高通量筛选，易于寻找和发现中草药的有效部位，进而借助药物分离方法，分离确定药物或动物血清中的有效药物成分。

具体实施方式

比较试验发现将粗提的中草药药液直接加入到长满细胞的96孔培养板中，大部分细胞死亡，可能与中草药液对细胞的非生理性作用有关。综合以上因素，试验通过本发明模型进行抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)中草药的筛选，筛选出有效抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的中草药1种，水煎制剂，进行猪的攻毒防治试验；在此基础上组方进行临床防治试验和扩大临时治疗试验(在四川成都市、河南商丘、北京大兴和湖南岳阳县、宁乡县、望城县的发病猪群进行临床实验)，攻毒防治试验和临床试验的效果与通过该发明筛选的药效非常吻合。

实施例1：

中草药提取物对培养细胞的毒性作用测定

为了了解和比较常规方法药物直接添加对细胞的毒性作用，测定了试验用的21种中草药的水提取液对Marc-145细胞的毒性作用及安全浓度。方法是将21种中草药分别用水进行粗提，每种中草药的水提液灭菌后用细胞维持液稀释，分别加入到长满细胞的96孔培养板中，每浓度8孔，每孔100ul，37℃5％CO₂培养箱中培养72h，每天观察CPE。结果显示各种提取液对细胞产生不同程度的毒性作用，其作用随浓度的增加而增加，且不同的中草药的副作用大小不同，分别在细胞培养液中添加0.625-1.25％(V/V)以上的中草药水提液(含生药0.5g/ml)，即每毫升培养液中含生药1.95-3.90mg，细胞开始出现细胞病变(CPE)。可见中草药成分直接对细胞其毒性作用比较大，这可能一方面由于中草药作为非细胞营养物对细胞产生的毒副作用；另一方面由于中草药液中的生物碱等成分影响细胞培养PH值(细胞的最适PH值为7.2～7.4之间，大于8或者小于5细胞状态不良或死亡)所致。因此，每种中草药添加的安全浓度应在此浓度以下(0.625-1.25％)。

实施例2：

小鼠血清对Marc145细胞的安全浓度测定

小鼠血清56℃灭活30min，用维持液稀释成80％，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，用维持液倍比稀释稀释成不同的浓度，小鼠血清的稀释浓度分别为80％、40％、20％、10％、5％、2.5％、1.25％、0.625％、0.312％，从高浓度到低浓度分别加入到长成良好的单层细胞中，每孔100μl，每个浓度重复8孔，设细胞对照组，置37℃培养箱中培养72h，每天用倒置显微镜观察CPE并记录结果，以最后的记录结果为最终结果。同时用MTT法测得的OD值计算细胞存活率。具体操作如下：经过72h处理后，吸出细胞孔中残余的小鼠血清，用预热至37℃的PBS溶液漂洗2次，每孔加入10μl的MTT(5mg/ml溶于PBS)，37℃继续培养4h，4h后加入100μlDMSO，在微量振荡器上振荡10min，以溶解细胞中的紫色结晶物，然后在酶标仪上570nm处测定其光吸收值。据细胞病变(CPE)程度和MTT法测得的细胞成活率为依据，以能长成或维持良好单层细胞的药物的最高浓度作为药物的安全浓度。抗病毒实验采用最高安全浓度的含药血清进行。

小鼠血清对Marc-145细胞比较小牛血清(常用量5-10％)，有一定的毒副作用，5％以上开始出现细胞病变，高浓度的小鼠血清导致细胞全部病变，细胞圆缩、堆积、脱落；随着血清浓度的降低，这种病变程度下降，测得细胞的OD值增大，血清对细胞增殖的抑制率越来越小，即小鼠血清毒性与其浓度呈正相关；血清浓度降低到5％，细胞基本不发生病变，其最大的无毒浓度为2.5％。其最大安全浓度大于中草药提取液2-4倍。

实施例3：

含中草药小鼠血清对Marc-145细胞感染PRRSV病毒的保护与抗病毒药物的筛选

1试验材料

Marc-145细胞(非洲恒河猴肾细胞)：由湖南农业大学动物医学院惠赠；

美洲型猪繁殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)：由湖南农业大学动物医学院惠赠；

中草药：21种中草药(贯众、重楼、槟榔、八角莲、杜仲、板蓝根、黄柏、天南星、半夏、大青叶、紫花地丁、玄胡、半枝莲、山茱萸、连翘、香薷、牛至、马鞭草、喜树果、蛇床子、马钱子等进行编号)购自湖南养天和大药房，用传统的煎煮法提取三次，合并浓缩，过滤4℃保存；

2试验方法

通过细胞培养，对猪繁殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)TCID50进行测定，根据小鼠血清对Marc145细胞的安全浓度，制备中草药药液，采集含药小鼠血清：20g左右的小鼠用中药药液进行最大耐受剂量的灌胃，每种中药灌两只，每只小鼠连续灌服4次，每次灌5ml，灌药时间间隔为1小时，灌第三次半个小时后，即刻摘眼球取血(旨在使小鼠血中药物浓度最高)，离心取血清，56℃灭活30min。在细胞已基本长成单层的96孔中，吸出各孔旧的培养液，加入稀释到安全浓度的含药血清。试验根据抗病毒药物的三种作用方式设计药血清的添加方式：抗病毒吸附(先加药后加病毒)、抗病毒复制(先接毒后加药)、直接灭活病毒作用(药物与病毒体外作用一段时间后加入)；同时设正常细胞对照组、小鼠血清对照组和病毒对照组；置37℃5％CO₂培养箱中培养4h后加入100个TCID₅₀的病毒液100μl，置37℃5％CO₂培养箱中培养72h，每天用倒置显微镜观察细胞病变(CPE)情况并记录，以最后的记录结果为最终的结果，筛选抗病毒中草药。

3结果

试验的三种作用方式投药表明：不同药物(含药血清)对抗病毒的效果和作用方式不同，所筛选的药物中，3、7、8、9具有抗病毒吸附的作用(表1)；2和8有抗病毒复制的作用(表2)；2、8、5能够直接灭活病毒(表3)。综合三种作用方式考虑，2、8能够抑制病毒，对细胞的保护率较高，将筛选为具抗病毒作用的中草药进行后面的临床试验。

表1  先加药后加病毒72h测得细胞CPE情况与MTT法的OD值及药物对细胞的保护率

注：细胞72h时的CPE情况中，数字0-4代表细胞病变程度

表2  先加病毒后加药72h测得细胞CPE情况与MTT法的OD值及药物对细胞的保护率

注：细胞72h时的CPE情况中，数字0-4代表细胞病变程度

表3  药物和病毒同时加入72h测得细胞CPE情况与MTT法的OD值及药物对细胞的保护率

注：细胞72h时的CPE情况中，数字0-4代表细胞病变程度

实施例4：

抗病毒中草药的人工感染治疗试验

1材料与方法

1.1试验动物与分组：从非疫区购买未免疫注射的16-19公斤杂交仔猪42头，置一深山闲置2年的猪舍内饲养，随机分为7组，试验组与对照组并排穿插分栏，处理如下：

第1组：感染蓝耳病毒

第2组：感染蓝耳病毒并给8号药，

第3组：感染蓝耳病毒并给10号药

第4组：感染圆环病毒+蓝耳病毒

第5组：感染圆环病毒+蓝耳病毒并8号药，

第6组：感染圆环病毒+蓝耳病毒并10号药，

第7组：不感染不给药的空白对照组

试验期间保持圈舍干燥、清洁、通风，饲喂、饮水和饲养管理按常规方法进行，做到优良饲养管理。

1.2药物与给药方法：将筛选出的8号中草药，按常规方法用水煎成含生药0.5g/ml的药液，分装，15磅消毒15分钟，备用；感染发病猪用药液灌服或加入饮水中喂服治疗，每次每头猪2ml/kg，每天2次，给药时间至体温体征正常为止，最长14d。同时，用血药细胞模型筛选效果不太好的10号药作对照。

1.3观察方法：自投药之日起连续观察30d，每天上午、下午各观察1次及时做好观察记录。

2试验结果

感染后第2天，除空白对照组外，全部体温升高达42℃；第4天达43-44℃，并伴有呼吸困难等症状出现，皮发红色。

第1组：感染蓝耳病毒，猪的体温持续在40度以上，从第六天开始，至第12天，全部死亡。

第2组：感染蓝耳病毒并给8号药，第五天开始下降，第九天恢复正常，仅1头猪因体弱于第12天死亡。

第3组：感染蓝耳病毒并给10号药，体温持续在40度以上，全部死亡。

第4组：感染圆环病毒+蓝耳病毒，持续高体温，到12天全部死亡。

第5组：感染圆环病毒+蓝耳病毒并8号药，第六天体温下降，第十天基本恢复正常体温，死亡2头。

第6组：感染圆环病毒+蓝耳病毒并10号药，体温40度以上，猪全部死亡。

第7组：不感染不给药的空白对照组，第七天开始体温持续上升，死亡5头。

本试验结果显示：给8号药后病猪死亡率均有大幅下降，对高致病性蓝耳病治愈率较高，达83.3％，对高致病性猪蓝耳病及圆环病毒病混合感染治愈率66.6％，表明筛选出的中草药对猪蓝耳病有确切疗效。

实验情况记录

实施例5：

自然感染猪蓝耳病猪的临床治疗试验

1材料与方法

1.1试验动物与分组及管理

在湖南境内某地发生猪蓝耳病，经湖南省动物疫病检测中心取病料样送中国农科院哈尔滨兽医研究所诊断为高致病性猪蓝耳病；试验选择两个相近的猪场，一个为未发病猪场供作药物预防试验，一个为高致病性猪蓝耳病疫情场供作药物治疗试验。两猪场各有大小猪200头左右，分别取一部分作试验，另一部分作不给药空白对照和清瘟败毒散药物对照。试验期间保持圈舍干燥、清洁、通风，饲喂、饮水和饲养管理按常规方法进行，尽可能保持优良。

1.2药物及给药方法

依以上试验筛选出的抗蓝耳病病毒药物与非抗病毒性的调理药物(如石膏等)组方，配制成散剂或汤剂，用于猪蓝耳病的预防和治疗。预防效果试验给药方法为2kg/1000kg饲料，拌料喂服；治疗效果试验给药方法为按每头每次1ml/kg体重，煎水(三次煎水，合并，浓缩至含生药0.5g/ml水)灌服，每天2次，待病情稳定后，药液兑饮水或拌料喂服，直至康复。自投药之日起连续观察20d，每天上午、下午各观察1次及时做好观察记录。

2.试验结果

2.1预防试验：

药物预防组80头猪无一头猪死亡，仅有4头30kg左右的小猪表现出较轻的蓝耳病症状，体温升高，呼吸加快，食欲下降等，约1周后康复；清瘟败毒散组60头猪有39头猪发病，18头死亡，发病率65％，死亡率达30％；不给药对照组65头猪有54头发病，死亡30头，发病率达83％，死亡率达46％。

2.2治疗试验

将确诊为高致病性猪蓝耳病病毒感染的病猪群集中到隔离舍，随机选取大小和病况基本一致的病猪80头，分成4个组，每组20头，1--2组为本药物治疗组，3组为清瘟败毒散治疗对照组，4组为不给药空白对照组。两本药物治疗组35头完全治愈，3头呈慢性经过，缓慢康复，仅2头猪死亡；清瘟败毒散治疗组6头治愈，7头呈慢性经过，7头死亡；而不给药组16头死亡，4头呈慢性经过，死亡率达80％。本试验结果表明，本筛选药物对防治高致病性猪蓝耳病具有确切的疗效。

对高致病性猪蓝耳病的临床治疗试验效果  (头，％)

药物名称	试验猪	有效	康复	死亡	有效率	治愈率	死亡率
								药物试验1组	20	19	18	1	95	90	5
药物试验2组	20	19	17	1	95	85	5
								清瘟败毒散组	20	7	6	7	45	30	35
不给药组	20	0	0	16	0	0	80

在此基础上，在四川成都市，河南商丘，北京大兴，湖南岳阳县、宁乡县和望城县进行扩大治疗试验，其效果基本与上一致。

Claims (1)

1.一种快速高通量药物筛选模型，其特征在于包括如下步骤：

(1)给每只试验动物灌服最大安全剂量药物，分离制备含药血浆或血清备用；

(2)按常规方法制备正常试验动物血清或血浆，测试其血清或血浆对细胞的影响，得出动物血清或血浆对细胞系培养的最大安全浓度；

(3)以动物血清的最大安全浓度量为标，将含药血清或血浆加入细胞培养液或细胞维持液中培养，作细胞病变程度测定和细胞成活率测定法测定，评价药物效果，筛选出有效药物；

其中步骤(1)中对不知药动力学参数的药物给每只试验动物连续1-5次灌服最大安全剂量药物，间隔时间为0.5-2h，最后一次灌服后10-60min采血；对已知药动力学参数的药物以最大安全剂量给药后药物进入血液达到药峰时采血。