CN101974580B

CN101974580B - 一种制备色素的方法

Info

Publication number: CN101974580B
Application number: CN 201010273764
Authority: CN
Inventors: 邢新会; 蒋培霞; 杨程
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2010-09-06
Filing date: 2010-09-06
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2030-09-06
Also published as: CN101974580A

Abstract

本发明公开了一种制备色素的方法。该方法是在基因工程菌株C.freundii/pComvio发酵过程中，向发酵液中添加表面活性剂十二烷基磺酸钠；所述色素由紫色杆菌素与脱氧紫色杆菌素组成。所述方法中，向发酵液中添加表面活性剂十二烷基磺酸钠之后，再向发酵液中补加反应底物。本发明在基因工程菌C.freundii/pComvio发酵过程中添加了表面活性剂后，该菌株生长快、易培养，色素生物合成稳定性好、产量提高，发酵周期缩短。在最佳处理条件下，菌体的色素产量可达2.1±0.1896g·L^-1发酵液。

Description

一种制备色素的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中利用发酵的手段制备色素的方法。

背景技术

紫色杆菌素(violacein)、脱氧紫色杆菌素是微生物自身产生的一种次级代谢产物，属于吲哚衍生物，由两个色氨酸分子氧化缩合而成。自从19世纪末紫色杆菌素被发现以来，人们对其生物功能进行了大量的探索，因其具有广谱抗菌性，抗原生动物活动，抗病毒性，抗肿瘤细胞活性以及独特的蓝紫色着色能力等功能特性和在医药、卫生、食品、印染等领域潜在的应用前景而受到越来越多的关注。

目前，野生型菌株合成紫色杆菌素产量低，培养难度较大，菌种资源也有限；基因工程菌株虽然容易培养，并且紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素的产量得到了大幅度提高，但是这个产量仍然难以满足工业化生产需求，限制了紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素的生产和应用的发展。

在发酵工程中，表面活性剂具有广阔的应用前景。表面活性剂作用于细胞后，可以有效的提高物质(底物、产物和氧)的传递速率，从而提高产物的产量。已有研究结果表明，表面活性剂提高发酵效率的机理是多方面的：首先，表面活性剂可以提高细胞膜的通透性，改变细胞的聚集状态，减少细胞聚集体的形成；细胞膜在经过特定的表面活性剂处理后会加快细胞的衰亡，释放胞内产物。另外，表面活性剂还可以改变酶的三维结构，经特定表面活性剂修饰后的某些酶的活性、稳定性和特异性均增强，因此可以用于酶工程的开发。然而表面活性剂的种类较多，应用于不同菌株的发酵过程会产生不同的效果，所以选择合适的表面活性剂应用于特定菌株的发酵过程，对提高发酵产物的产量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备色素的方法。

本发明所提供的制备色素的方法，是在发酵基因工程菌株Citrobacterfreundii/pComvio的过程中，向发酵液中添加表面活性剂十二烷基磺酸钠；所述色素由紫色杆菌素与脱氧紫色杆菌素组成。

所述表面活性剂十二烷基磺酸钠是在发酵过程开始0小时-12小时时添加到发酵液中。

所述表面活性剂十二烷基磺酸钠是在发酵过程开始0小时、3小时、7小时或12小时时添加到发酵液中。

所述表面活性剂十二烷基磺酸钠的添加量为1升发酵液中添加0.1g-2.0g十二烷基磺酸钠。

所述表面活性剂十二烷基磺酸钠的添加量为1升发酵液中添加0.1g、0.2g、0.5g或2.0g十二烷基磺酸钠。

所述方法中，向发酵液中添加表面活性剂之后，再向发酵液中补加反应底物。

所述反应底物为L-色氨酸。

所述反应底物L-色氨酸是在发酵过程开始8小时-20小时时添加到发酵液中，具体为8小时或18小时或20小时。

所述反应底物L-色氨酸的补加量为1升发酵液中补加0.1g-2.0g L-色氨酸，具体为0.1g或0.7g或2.0g L-色氨酸。

本发明在C.freundii/pComvio基因工程菌发酵过程中添加了表面活性剂后，该菌株生长快、易培养，色素生物合成稳定性好、产量提高。在最佳处理条件下，菌体的色素产量可达2.1±0.1896g·L^-1发酵液。

附图说明

图1为发酵0小时时向发酵液中添加不同浓度的SDS后，菌体的色素产量、菌体干重和发酵上清液中色素的含量柱状图。

其中，Vio代表菌体的紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素混合物的产量；DCW代表菌体干重；supernatant vio代表发酵上清液中紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素混合物的含量。

图2为发酵3小时时向发酵液中添加不同浓度的SDS后，菌体的色素产量、菌体干重和发酵上清液中色素的含量柱状图。

图3为发酵7小时时向发酵液中添加不同浓度的SDS后，菌体的色素产量、菌体干重和发酵上清液中色素的含量柱状图。

图4为发酵10小时时向发酵液中添加不同浓度的SDS后，菌体的色素产量、菌体干重和发酵上清液中色素的含量柱状图。

图5为最佳处理条件下的发酵动力学曲线。

其中，Vio代表菌体的紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素混合物的产量；DCW代表菌体干重；supernatant vio代表发酵上清液中紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素混合物的含量；L-tryptophan代表发酵液中L-色氨酸的含量；glycerol代表发酵液中甘油的含量。

图6为最佳处理条件与对照条件下的发酵动力学曲线的对比情况。

其中，SDS代表最佳处理条件；control代表对照条件。

图7为在最佳处理条件下补加L-色氨酸后菌体的色素产量、菌体干重以及L-色氨酸含量变化曲线图。

其中，adding L-tryptophan代表在最佳处理条件下补加L-色氨酸；control代表对照条件。

图8为不添加SDS的条件下补加L-色氨酸后菌体的色素产量、菌体干重以及L-色氨酸含量柱状图。

其中，adding L-tryptophan代表不添加SDS的条件下补加L-色氨酸；control代表对照条件。

图9为色素浓度标准曲线图。

图10为菌体干重(DCW)与菌体A₆₆₀的关系图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、制备色素

一、利用表面活性剂提高色素的产量

1、菌种的选择

本发明所用的菌种为基因工程菌株Citrobacter freundii/pComvio(公众可从清华大学获得，记载过该材料的非专利文献是Jiang，P.X.，Wang H.S.，Zhang C.，et al.，Reconstruction of the violacein biosynthetic pathway from Duganella sp.B2 in differentheterologous hosts.Appl Microbiol Biotechn0l.86(4)：p.1077-88)。

2、种子培养

1L种子培养基的组成为：NaH₂PO₄·2H₂O 1.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.6g，NH₄Cl 1.18g，K₂HPO₄.3H₂O 6.0g，100mM MgSO₄·7H₂O 8mL，酵母提取物1.28g，甘油5mL，L-色氨酸0.7g，MT1(Fe)1.2mL，MT2(Fe^-)0.8mL，正辛烷0.6mL，卡那霉素15mL，其余为水，PH值为7.4。

MT1(Fe)贮备液(1L)：FeSO₄·7H₂O 2.78g，溶于1L 1mol/L HCl。

MT2(Fe^-)贮备液(1L)：MnCl₂·4H₂O 1.98g，CoSO₄·7H₂O 2.81g，CaCl₂·2H₂O 1.47g，CuCl₂·2H₂O 0.17g，ZnSO₄·7H₂O 0.29g，溶于1L 1mol/L HCl。

种子培养条件为：直接从平板中挑取单个C.freundii/pComvio菌落或取-80℃甘油管保存的C.freundii/pComvio菌种接入发酵培养基的三角瓶，37℃，200r·min^-1振荡培养至细胞A₆₆₀＝1.5-4.1。

3、发酵

发酵培养基的组成与上述种子培养基的组成相同。

发酵培养的条件为：将种子液按2％(体积百分比)接种量接种于含发酵培养基的三角瓶中，37℃，200r·min^-1振荡培养5小时(细胞A₆₆₀＝1.0-1.4)，加入诱导剂正辛烷0.1％(体积百分比)，转入20℃，在转速150r·min^-1下振荡发酵20h。发酵结束后，打匀发酵液，取3.0mL发酵液测定色素的产量，样品设三个重复。

分别在上述样品发酵过程开始0h、3h、7h、12h时向发酵液中添加不同量的十二烷基磺酸钠(SDS)，添加量分别为：1升发酵液中添加0g SDS(以下表示为0g·L^-1SDS)(对照)、1升发酵液中添加0.1g SDS(以下表示为0.1g·L^-1SDS)、1升发酵液中添加0.2g SDS(以下表示为0.2g·L^-1 SDS)、1升发酵液中添加0.5g SDS(以下表示为0.5g·L^-1SDS)和1升发酵液中添加2.0g SDS(以下表示为2.0g·L^-1 SDS)。

4、分离测定色素的产量

(1)分离测定菌体的色素产量

取发酵20小时的发酵液，10℃、10000r·min^-1离心10min，弃上清液，用去离子水重悬沉淀物，再离心，弃上清，重复该步骤3次，之后在沉淀物中加入适量无水乙醇，反复洗涤、离心，直到不能再提取出色素为止。按照如下方法鉴定提取得到的色素：将含有色素的乙醇溶液减压蒸馏得到色素，将该色素分别溶于甲醇溶液中，进行高效液相色谱分析，使用Agilent-1100高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent EclipseXDB-C18，150mm×4mm，5μm；柱温30℃；洗脱剂为70ml/100ml的甲醇水溶液；流速1.0mL/min；检测波长：570nm。

高效液相色谱检测结果表明，该色素由紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素组成，它们的保留时间分别为3.0min和4.9min。

色素浓度的测定是通过测定色素的乙醇溶液在最大吸收波长的吸光度值来衡量，C.freundii/pComvio重组菌所产色素测定波长为570nm，以无水乙醇作空白对照，并通过吸光度值——色素浓度标准曲线(图9)得到相对应的色素浓度值，标准品Violacein(V9389)购自Sigma-Aldrich。每个实验重复3次，结果取平均值。

基因工程菌株C.freundii/pComvio在上述发酵条件下的菌体的色素产量测定结果见表1。

表1不同处理条件下菌体的色素产量(g/L发酵液)

(2)测定菌体干重

取发酵20小时的发酵液，10,000r·min^-1离心10min，用无水乙醇提取至菌体中无色素残留为止，菌体用去离子水洗涤3次，重悬于去离子水中，测定不同稀释倍数下的A₆₆₀。同时，将菌体置于烘箱中80℃恒温24h至恒重，然后置于干燥器中冷却至室温，称重，设三个重复。绘制A₆₆₀-菌体干重(DCW，g·L^-1)曲线(图10)。根据曲线由菌体的吸收值计算菌体的干重。每个实验重复3次，结果取平均值。

菌体干重(DCW)的测定结果见表2。

表2不同处理条件下的菌体干重(g/L发酵液)

(3)测定发酵上清液中色素的含量

取发酵20小时的发酵液，10,000r·min^-1离心10min，收集上清液，用乙酸乙酯萃取，置于通风橱风干，再将风干的色素溶于无水乙醇，测其A570。每个实验重复3次，结果取平均值。

发酵上清液中色素的浓度(supernatant violacein)测定结果见表3。

表3不同处理条件下发酵上清液中色素的含量(g/L发酵液)

图1-图4分别为发酵过程开始0h、3h、7h、12h时向发酵液中添加不同量的SDS后，菌体的色素产量、菌体干重和发酵上清液中色素的含量。

实验结果表明，发酵过程开始不同时间向发酵液中添加不同量的SDS后，菌体的色素产量、菌体干重和发酵上清液中色素的含量均比对照有所增加。添加SDS的时间越早，菌体的色素产量及菌体干重增加的越多，在发酵过程开始0h时向发酵液中加入0.2g·L^-1SDS，可以最大程度的提高菌体的色素产量及菌体干重：未添加SDS(对照)处理条件下，菌体的色素产量为1.35g·L^-1发酵液、菌体干重为1.31g·L^-1发酵液；添加了0.2g·L^-1SDS处理条件下，菌体的色素产量为1.71g·L^-1发酵液，比对照提高了26.7％；菌体干重为1.55g·L^-1发酵液，比对照提高了18.3％。添加SDS不仅增加了菌体的色素产量而且也增加了菌体干重。

将在发酵过程开始0h时向发酵液中加入0.2g·L^-1SDS的处理条件设为最佳处理条件，将未向发酵液中添加SDS的处理条件设为对照。从最佳处理条件下的发酵动力学曲线(图5)得知，色素可以快速合成，在发酵24h时菌体的色素产量已达最高；细胞生长与色素合成相偶联，同样在发酵24h时停止生长；上清色素产量随着发酵时间的延长而增加。从最佳处理条件与对照条件下的发酵动力学曲线的对比情况(图6)可知，最佳处理条件的发酵时间比对照缩短了12h；最佳处理条件下发酵24h时菌体的色素产量比对照提高了41.7％，发酵36h时菌体的色素产量比对照提高了26.7％(图6中a)，菌体干重增加了18.3％(图6中b)；最佳处理条件下底物色氨酸在发酵8-24h之间(色素大量合成期间)大量消耗，发酵24h之后，色氨酸几乎无残留(图6中d)；图6中c为发酵0h到发酵48h发酵液中PH值的变化。

二、通过补加反应底物L-色氨酸提高色素的产量

方法I

1、在添加SDS的条件下补加反应底物L-色氨酸

由步骤一的最佳处理条件下的发酵动力学曲线(图5)得知，发酵24h时，色素产量达最高值，底物L-色氨酸几乎无残留，推测可能是底物的浓度太低限制了色素的继续合成。因此，在步骤一的最佳处理条件(在发酵过程开始0h时向发酵液中加入0.2g·L^-1SDS)的基础上，在发酵18小时时向发酵液中补加底物L-色氨酸，补加量为1升发酵液中补加0.7g L-色氨酸。同时，将在步骤一的最佳处理条件下未补加底物L-色氨酸设为对照。结果表明，补加了L-色氨酸之后，在最佳处理条件下色素在发酵24h之后还能继续合成，菌体的色素产量在发酵31h时达最高值(2.1±0.1896g·L^-1发酵液)，比对照条件下增加了0.4g·L^-1发酵液(图7中a)；细胞也继续生长，在发酵31h时菌体干重达最高值(1.71±0.0132g·L^-1发酵液)，比对照条件下增加了0.15±0.1037g·L^-1发酵液(图7中b)；L-色氨酸在补加之后大量消耗，在发酵31h时比对照组多消耗了0.42g·L^-1发酵液(图7中c)，基本全部转化为色素。

2、未添加SDS的条件下补加反应底物L-色氨酸

在步骤一未添加SDS的条件下，在发酵开始18小时时，补加反应底物L-色氨酸，同时，将在步骤一未添加SDS的条件下未补加反应底物L-色氨酸设为对照。发酵结果显示(图8)，此处理条件与对照相比，菌体的色素产量和菌体干重没有变化，但L-色氨酸多消耗了0.32g·L^-1发酵液。

方法II

1、在添加SDS的条件下补加反应底物L-色氨酸

除在发酵8小时时向发酵液中补加底物L-色氨酸，补加量为1升发酵液中补加0.1gL-色氨酸外，其他方法均与方法I中步骤1相同。结果表明，菌体的色素产量和菌体干重的产量与方法I中步骤1无显著差异。

2、未添加SDS的条件下补加反应底物L-色氨酸

除在发酵8小时时向发酵液中补加底物L-色氨酸，补加量为1升发酵液中补加0.1gL-色氨酸外，其他方法均与方法I中步骤2相同。结果表明，菌体的色素产量和菌体干重的产量与方法I中步骤2无显著差异。

方法III

1、在添加SDS的条件下补加反应底物L-色氨酸

除在发酵20小时时向发酵液中补加底物L-色氨酸，补加量为1升发酵液中补加2.0g L-色氨酸外，其他方法均与方法I中步骤1相同。结果表明，菌体的色素产量和菌体干重的产量与方法I中步骤1无显著差异。

2、未添加SDS的条件下补加反应底物L-色氨酸

除在发酵20小时时向发酵液中补加底物L-色氨酸，补加量为1升发酵液中补加2.0g L-色氨酸外，其他方法均与方法I中步骤2相同。结果表明，菌体的色素产量和菌体干重的产量与方法I中步骤2无显著差异。

Claims

1.一种制备色素的方法，是在发酵基因工程菌株Citrobacter freundii/pComvio的过程中，向发酵液中添加表面活性剂十二烷基磺酸钠；所述色素由紫色杆菌素与脱氧紫色杆菌素组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂十二烷基磺酸钠是在发酵过程开始0小时-12小时时添加到发酵液中。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂十二烷基磺酸钠是在发酵过程开始0小时、3小时、7小时或12小时时添加到发酵液中。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂十二烷基磺酸钠的添加量为1升发酵液中添加0.1g-2.0g十二烷基磺酸钠。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂十二烷基磺酸钠的添加量为1升发酵液中添加0.1g、0.2g、0.5g或2.0g十二烷基磺酸钠。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，向发酵液中添加表面活性剂之后，再向发酵液中补加反应底物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述反应底物为L-色氨酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述反应底物L-色氨酸是在发酵过程开始8小时-20小时时添加到发酵液中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述反应底物L-色氨酸的补加量为1升发酵液中补加0.1g-2.0g L-色氨酸。