CN101954021B - 一种治疗乳腺增生的中药组合物质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种由山楂、炒麦芽、鸡血藤和通草制成的治疗乳腺增生的中药颗粒质量检测方法，该方法包括鉴别和含量测定两部分，其中鉴别包括采用薄层色谱法，分别用芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品进行的鉴别；含量测定以含表儿茶素确定，以表儿茶素计，不得少于0.70mg/g。本发明选择以芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品来进行对照，直接比较斑点的大小和位置，操作简便、直观；含量测定以含表儿茶素确定，质量更加有保障，药效更为确切。

Description

一种治疗乳腺增生的中药组合物质量检测方法

技术领域

本发明涉及中成药的质量检测方法，具体地说，本发明涉及一种治疗乳腺增生的中药组合物质量检测方法。

背景技术

乳腺增生病约占乳腺疾病的70～80％，是育龄妇女最常见的乳腺疾病，其发病率约为40％，伴有明显的乳房疼痛，常形成乳房结节或肿块，部分患者有发展为乳腺癌的危险。因此，对乳腺增生进行有效治疗对于维护广大妇女的健康，提高生活质量，预防乳腺癌具有极其重要的意义。长期以来国外多用激素类、维生素类药物或手术治疗乳腺增生。80年代以来，采用三苯氧胺治疗乳腺增生，有报道对雌激素受体阳性的患者，有效率可达86％，但长期服用可发生阴道出血、血小板减少、恶心、呕吐、水肿及血钙增加等副作用。

鉴于乳腺增生的发病与神经内分泌失衡有关，治疗上需长期用药的特点，传统中医药较之于化学药品更具优势。国内采用中医药治疗乳腺增生取得了一定的进展，中国药典2005年版收载了三个治疗乳腺增生的方剂：乳块消片、乳疾灵颗粒和乳癖消片。

然而，由于此类方剂的组方复杂，药味大多在10味左右，甚至更多。这为探讨治疗乳腺增生病的中药药理作用机制、以及药品的质量检测增添了一定的难度。由本申请人申请的“一种治疗乳腺增生的中药组合物、制剂及其制备方法”，公开号CN101219192A，其由山楂、炒麦芽、鸡血藤和通草四味中药原料组成，该中药组合物具有明确的疗效，长期有效率达99.6％。但目前尚无相关产品的质量检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗乳腺增生的中药组合物质量检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种由山楂、炒麦芽、鸡血藤和通草制成的治疗乳腺增生的中药颗粒质量检测方法，该方法包括鉴别和含量测定两部分，其中鉴别包括采用薄层色谱法，分别用芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品进行的鉴别；含量测定以含表儿茶素确定，以表儿茶素计，不得少于0.70mg/g。

本发明所述治疗乳腺增生的中药颗粒，其采用如下方法制备：

取山楂6份、炒麦芽10份、鸡血藤10份、通草3.3份，然后加8～10倍量的水煎煮三次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.12(70℃)的稠膏，加入3份糊精，流化床制粒，干燥，整粒，制成颗粒，即得。

本发明的质量检测方法，其中所述鉴别包括如下鉴别中的一种或多种：

1)鸡血藤的鉴别：取所述中药颗粒8-15g，加水50ml使溶解，加乙醚100ml超声处理(功率320W，频率40kHz)20-40min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取芒柄花素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；取对照品溶液1-3μl，供试品溶液15-25μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-氯仿(20∶12∶3)为展开剂，展开，展距约12cm，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有鸡血藤；

本发明曾参考文献(中国现代药物应用，2008，2(7)：16-17；时珍国医国药，2005，16(11)：1125-26；广东药学，2004，14(5)：7-8；中国药业，2000，9(12)：12)进行检测，结果表明，上述文献中的薄层色谱展开条件对鸡血藤提取效率过低，且无法排除阴性干扰，不能作为本发明所述颗粒剂的质量检测方法。经反复实验摸索，意外发现仅按本发明的上述方法操作，可实现对鸡血藤的鉴别，且没有阴性干扰。由此可见，本发明的方法专属性强且操作方便。

2)山楂的鉴别：取所述中药颗粒8-15g，加甲醇20ml，超声处理10-20min，滤过，滤液作为供试品溶液；另取山楂对照药材0.1g，加甲醇10ml，超声处理(功率320W，频率40kHz)15-20min，滤过，滤液作为对照药材溶液；另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；取对照药材溶液及对照品溶液1-3μl，供试品溶液4-10μl，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶4∶1)为展开剂，展开，展距约6cm，取出，吹干，喷以0.1％溴甲酚绿乙醇液；供试品色谱中在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有山楂；

本发明曾参考文献(时珍国医国药，2007，18(3)：641-42；国际医药卫生导报，2007，13(14)：91-93；时珍国医国药，2006，17(7)：1261-62；中国中医药信息杂志，2005，12(8)：38-39；华西药学杂志，2003，18(6)：480-81)进行检测，结果表明，上述文献中薄层色谱的展开条件均不能有效地将枸橼酸与其它物质有效分离，且枸橼酸提取效率过低，不能作为本发明所述颗粒剂的质量检测方法。经反复实验摸索，意外发现样品处理仅以甲醇直接超声提取，过滤，即可，样品处理步骤少，操作简单。并且实验表明在以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶4∶1)为展开剂的条件下，枸橼酸可与其它物质有效分离，且枸橼酸斑点明显，无阴性干扰，适合本发明颗粒剂的质量鉴别。

所述含量测定方法包括如下步骤：

1)对照品溶液的制备

精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

2)标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.5ml、1ml至50ml量瓶中，另精密量取对照品溶液0.5ml、1ml、2ml、3ml至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取5μl注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，其中色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.01mol/L柠檬酸(28-35∶65-72)为流动相；检测波长为280nm；柱温25-35℃；理论板数按表儿茶素峰计算应不低于2000；

3)测定法

取所述中药颗粒，研细，取约0.5-1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇40-100ml，摇匀，超声处理(功率320W，频率40kHz)30-40min，滤过，滤液浓缩至约2ml，拌入2-3g的聚酰胺(过100～200目筛)，拌匀，加到聚酰胺干柱(100～200目，4-6g，内径2cm)上，依次用水100ml、20％甲醇100ml、70％甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用100ml量瓶收集至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5μl注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲线上读出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。

本发明的中药颗粒以表儿茶素计，不得少于0.70mg/g。

本发明的上述色谱条件对表儿茶素的分离度好，色谱峰形对称，没有阴性干扰。

综上所述，本发明的质量检测方法的鉴别法选择以芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品来进行对照，直接比较斑点的大小和位置，操作简便、直观；含量测定以含表儿茶素确定，专属性强，且均未出现阴性干扰，可使所述中药颗粒的质量更加有保障，药效更为确切，为探讨治疗乳腺增生病的中药药理作用机制、以及药品的质量检测提供可靠的依据。

附图说明

图1为本发明鸡血藤薄层色谱图；

其中，1.鸡血藤阴性对照液；2.供试品溶液；3.芒柄花素对照液；

图2为本发明山楂薄层色谱图；

其中，1.山楂阴性对照液；2.供试品溶液；3.山楂对照药材；4.枸橼酸对照液；

图3-A、图3-B、图3-C为本发明表儿茶素高效液相色谱图；

其中，A：阴性对照B：表儿茶素对照品C：样品。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

一、处方：山楂1200g，炒麦芽2000g，鸡血藤2000g，通草660g。

二、制备方法：以上四味药材，加水煎煮三次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.12(70℃)的稠膏，加入适量糊精，流化床制粒，干燥，整粒，制成颗粒，即得本发明的中药颗粒。

三、鉴别与含量测定方法如下：

1.鉴别方法包括如下步骤：

(1)鸡血藤鉴别专属性试验

供试品溶液的制备：取中药颗粒样品10g，加水50ml使溶解，加乙醚100ml超声处理30min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。

阴性溶液的制备：按处方比例称取除鸡血藤以外的药材，同法制备缺鸡血藤的中药颗粒，照上述供试品溶液制备方法处理，即得阴性对照液。

对照品溶液的制备：取芒柄花素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

照《中国药典》2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，取对照品溶液2μl，供试品溶液与阴性对照溶液各20μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-氯仿(20∶12∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视。供试品色谱中，在与芒柄花素对照品相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。结果见图1。

(2)山楂鉴别专属性试验

供试品溶液的制备：取中药颗粒样品10g，加甲醇20ml，超声处理15min，滤过，滤液作为供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除山楂以外的药材，同法制备缺山楂的中药颗粒，照上述供试品溶液制备方法处理，即得阴性对照液。

对照药材溶液制备：取山楂对照药材0.1g，加甲醇10ml，超声处理15min，滤过，滤液作为对照药材溶液。

对照品溶液制备：取枸橼酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照药材溶液及对照品溶液2μl，供试品溶液和阴性对照液各8μl，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶4∶1)为展开剂，展开，展距约6cm，取出，吹干，喷以0.1％溴甲酚绿乙醇液。供试品色谱中，在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无此斑点，无干扰，结果见图2。

2.含量测定方法专属性试验

照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.01mol/L柠檬酸(33∶67)为流动相；检测波长为280nm；柱温30℃。理论板数按表儿茶素峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备：精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1ml至50ml量瓶中，另精密量取对照品溶液0.5ml、1ml、2ml、3ml至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取5μl注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定法：取重量差异项下的中药颗粒样品，研细，取约0.75g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇50ml，摇匀，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至约2ml，拌入2g的聚酰胺(过100～200目筛)，拌匀，加到聚酰胺干柱(100～200目，5g，内径2cm)上，依次用水100ml、20％甲醇100ml、70％甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用100ml量瓶收集至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5μl注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲线上读出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。

本品每g含表儿茶素(C₁₅H₁₄O₆)计为0.91mg。

阴性对照溶液的制备：按处方比例称取麦芽及通草按制备方法制备后按测定法项下处理，得阴性对照溶液。

按上述色谱条件分别测定阴性对照、表儿茶素对照品、中药颗粒样品，结果见图3。在此色谱条件下，表儿茶素能够较好的分离，且峰形良好，保留时间适中。阴性对照液在表儿茶素保留时间处无色谱峰出现，无干扰。

实施例2

取实施例1的中药颗粒，鉴别方法包括如下步骤：

(1)鸡血藤的鉴别：取样品15g，加水50ml使溶解，加乙醚100ml超声处理(功率320W，频率40kHz)20min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。另取芒柄花素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照品溶液1μl，供试品溶液16μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-氯仿(20∶12∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视。供试品色谱中，在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点。

(2)山楂的鉴别：取本品15g，加甲醇20ml，超声处理10min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取山楂对照药材0.1g，加甲醇10ml，超声处理(功率320W，频率40kHz)20min，滤过，滤液作为对照药材溶液。另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照药材溶液及对照品溶液1μl，供试品溶液4μl，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶4∶1)为展开剂，展开，取出，吹干，喷以0.1％溴甲酚绿乙醇液。供试品色谱中，在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。

含量测定方法包括如下步骤：

照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.01mol/L柠檬酸(28∶72)为流动相；检测波长为280nm；柱温35℃。理论板数按表儿茶素峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备：精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1ml至50ml量瓶中，另精密量取对照品溶液0.5ml、1ml、2ml、3ml至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取5μl注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定法：取重量差异项下的本品，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇100ml，摇匀，超声处理(功率320W，频率40kHz)40min，滤过，滤液浓缩至约2ml，拌入3g的聚酰胺(过100～200目筛)，拌匀，加到聚酰胺干柱(100～200目，4g，内径2cm)上，依次用水100ml、20％甲醇100ml、70％甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用100ml量瓶收集至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5μl注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲线上读出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。

本品每g含表儿茶素(C₁₅H₁₄O₆)计为0.90mg。

实施例3

取实施例1中的药物组合物，鉴别方法包括如下步骤：

(1)鸡血藤的鉴别：取样品8g，加水50ml使溶解，加乙醚100ml超声处理(功率320W，频率40kHz)40min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。另取芒柄花素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照品溶液3μl，供试品溶液25μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-氯仿(20∶12∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视。供试品色谱中，在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点。

(2)山楂的鉴别：取本品8g，加甲醇20ml，超声处理20min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取山楂对照药材0.1g，加甲醇10ml，超声处理(功率320W，频率40kHz)15min，滤过，滤液作为对照药材溶液。另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照药材溶液及对照品溶液3μl，供试品溶液10μl，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶4∶1)为展开剂，展开，展距约6cm，取出，吹干，喷以0.1％溴甲酚绿乙醇液。供试品色谱中，在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。

含量测定方法包括如下步骤：

照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.01mol/L柠檬酸(35∶65)为流动相；检测波长为280nm；柱温25℃。理论板数按表儿茶素峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备：精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1ml至50ml量瓶中，另精密量取对照品溶液0.5ml、1ml、2ml、3ml至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取5μl注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定法：取重量差异项下的本品，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇40ml，摇匀，超声处理(功率320W，频率40kHz)30min，滤过，滤液浓缩至约2ml，拌入1.5g的聚酰胺(过100～200目筛)，拌匀，加到聚酰胺干柱(100～200目，6g，内径2cm)上，依次用水100ml、20％甲醇100ml、70％甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用100ml量瓶收集至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5μl注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲线上读出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。

本品每g含表儿茶素(C₁₅H₁₄O₆)计为0.92mg。

实施例4本发明含量测定方法的精密度试验

取低中高三种浓度的对照品溶液各3份，按实施例1中色谱条件测定，记录峰面积，结果见表1。

表1精密度考察结果

结果表明：本发明含量测定方法精密度良好。

实施例5本发明含量测定方法的线性试验

配制不同浓度的对照品溶液，按实施例1中色谱条件测定，记录峰面积，以浓度C为横坐标，以峰面积A为纵坐标，计算回归方程为A＝3.808C+3.182×10-3(R＝0.9999，n＝6)。在1.1～33μg/ml的浓度范围内线性关系良好，结果如表2。

表2HPLC法测定不同浓度表儿茶素的结果

结果表明：本发明含量测定方法线性良好。

实施例6本发明含量测定方法的加样回收率试验

分别精密称取约0.1875、0.375、0.75g的样品各3份作为低、中、高浓度的样品，另精密加入不同量的表儿茶素对照品，按实施例1中“含量测定”方法测定，结果如表3。

表3回收率考察结果

结果表明，本发明含量测定方法的加收率较好。

实施例7本发明含量测定方法的重复性试验

精密称取同一批样品6份，分别按实施例1中“含量测定”方法测定，结果如表4。

表4重复性试验考察结果

结果表明：本发明含量测定方法重复性好。

实施例8本发明含量测定方法的稳定性试验

按实施例1中“含量测定”方法测定，对相同的低中高对照品溶液与样品溶液分别在0、2、4、8、12、24h进行测定，结果见表5。

表5稳定性考察结果

结果表明：本发明含量测定方法在24小时内稳定。

综上所述，本发明质量检测方法的稳定性好、重复性好，因此，本发明的技术方案具有可行性。利用本发明质量检测方法监控获得的本发明的中药颗粒剂，药效确切，作用稳定。以下利用实验例具体说明。

实验例1：大鼠乳腺增生模型试验

1药物

本发明颗粒剂，每g颗粒含生药29.3g，由第三军医大学第一附属医院提供；乳癖消(对照药物)由沈阳中药制药有限公司生产；他莫昔芬(对照药物)由扬子江药业集团有限公司生产。

2实验动物

SD大鼠，80只，雌性，SPF级动物。

3方法及结果

80只大鼠随机分为7组，每组10～12只，除正常对照组外，其余各组sc给予苯甲酸雌二醇0.5mg/kg，每日一次，连续25天，正常对照组sc给予等容量生理盐水；从第26天改为肌注黄体酮4mg/kg，连续5天，复制大鼠乳腺增生模型。造模第31天，各组按表6～10灌胃给予相应药物，正常对照组和模型组给予等容量生理盐水，每日一次，连续给药30天。造模及给药期间每周称1次体重，根据体重调整激素用量及给药量。末次给药后24小时戊巴比妥钠45mg/kg麻醉大鼠，取血分离血清，化学发光法测定雌二醇、黄体酮水平，放血处死大鼠，取子宫、卵巢称重并计算脏器指数，取乳腺用10％中性福尔马林溶液充分固定后，按常规取材，石蜡制片，HE染色，树胶封固，光镜下观察乳腺的病理形态学变化，结果见表6～10：

表6本发明对乳腺增生大鼠子宫、卵巢指数的影响

(各组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01)

表7本发明对乳腺增生大鼠血清激素水平的影响

(各组与模型组比较**P＜0.01)

表8本发明对乳腺增生模型大鼠乳腺组织导管的影响

(各组与模型组比较*P＜0.05)

表9本发明对乳腺增生模型大鼠乳腺组织腺泡的影响

(各组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01)

表10本发明对乳腺增生模型大鼠乳腺组织腺泡数、导管数的影响

(各组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01)

由表6～10可见：与正常组相比，模型组大鼠卵巢指数明显减小，乳腺组织导管口径明显增大、腺泡明显扩张，乳腺组织中导管数也明显增多，表明乳腺增生模型造模成功。

本发明30g/kg剂量组有降低乳腺增生大鼠血清雌二醇水平的趋势，对子宫指数、卵巢指数及黄体酮水平无明显影响。病理组织学检查结果显示：本发明30g/kg和20g/kg剂量组大鼠乳腺增生病变程度较模型组有明显改善，其中30g/kg剂量组能明显抑制乳腺增生模型大鼠乳腺导管和腺泡的扩张，并减少乳腺腺泡数量；20g/kg剂量组大鼠乳腺导管和腺泡周长；10g/kg剂量组大鼠乳腺腺泡面积、周长也较模型组明显减小。以上结果表明，本发明对激素所致乳腺增生大鼠模型有较好的治疗作用。

实验例2豚鼠乳腺增生模型试验

1药物

本发明颗粒剂，每g颗粒含生药29.3g，由第三军医大学第一附属医院提供；乳癖消(对照药物)由沈阳中药制药有限公司生产；他莫昔芬(对照药物)由扬子江药业集团有限公司生产。

2Hartely豚鼠，91只，雌性，普通级动物。

3方法及结果

91只豚鼠随机分为7组，每组13只，除正常对照组外，其余各组sc给予苯甲酸雌二醇0.5mg/kg，每日一次，连续25天，正常对照组sc给予等容量生理盐水；从第26天改为im给予黄体酮4mg/kg，连续5天，复制豚鼠乳腺增生模型。造模第31天，各组按表11～17灌胃给予相应药物，正常对照组和模型组给予等容量生理盐水，每日一次，连续给药28天。造模及给药期间每周称1次体重，根据体重调整激素用量及给药量。造模第30天、给药第14天和第28天测定豚鼠乳头高度及直径；末次给药后戊巴比妥钠45mg/kg麻醉豚鼠，取血分离血清，化学发光法测定雌二醇、黄体酮水平，放血处死豚鼠，取子宫、卵巢称重并计算脏器指数，仔细剥离两侧乳腺，1个称重，另1个用10％中性福尔马林溶液充分固定后，按常规取材，石蜡制片，HE染色，树胶封固，光镜下观察乳腺的病理形态学变化，结果见表11～17：

表11本发明对乳腺增生豚鼠乳头直径的影响

(各组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01)

表12本发明对乳腺增生豚鼠乳头高度的影响

(各组与模型组比较**P＜0.01)

表13本发明对乳腺增生豚鼠乳腺重量、子宫、卵巢指数的影响

(各组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01)

表14本发明对乳腺增生豚鼠血清激素水平的影响

(各组与模型组比较**P＜0.01)

表15乳腺增生模型豚鼠乳腺组织病理改变情况表

表16本发明对乳腺增生豚鼠乳腺腺泡及小叶增生的影响

表17本发明对乳腺增生豚鼠乳腺腺泡及导管内分泌物的影响

由表11～17可见：与正常组相比，模型组豚鼠乳头直径、高度、乳腺重量、子宫指数和卵巢指数均明显增大，血清中黄体酮水平明显降低，病理改变主要为乳腺腺泡及小叶呈弥漫性增生或极度弥漫性增生，腺泡及导管内分泌物明显增多，表明乳腺增生模型造模成功。

与模型组相比，本发明30g/kg剂量组豚鼠乳头直径明显缩小、乳腺重量明显减轻，并有升高黄体酮水平的趋势；20g/kg剂量组也能明显降低豚鼠乳腺重量。病理组织学检查结果显示：本发明30g/kg对乳腺增生模型豚鼠乳腺腺泡及小叶增生、腺泡及导管内分泌物形成有明显的抑制作用。以上结果表明，本发明对激素致豚鼠乳腺增生模型有较好的治疗作用。

实验例3：抗炎作用

1对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

1.1药物

本发明颗粒剂，每g颗粒含生药29.3g，由第三军医大学第一附属医院提供；地塞米松(对照药物)由浙江仙居制药股份有限公司生产。

1.2动物

昆明种小鼠，60只，雌雄各半，SPF级动物。

1.3方法及结果

取小鼠60只随机分为6组，每组10只，按表13灌胃给药，每日一次，连续3天，对照组给予同等体积的生理盐水。末次给药后1小时，于小鼠右耳涂抹二甲苯0.03ml/只，20分钟后脱颈椎处死动物，打孔器分别打下动物左、右耳，精密称取耳片重量，计算耳肿胀度(右耳重量-左耳重量)及肿胀率(肿胀度/左耳重量×100％)，结果见表18：

表18本发明对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

(各给药组与对照组比较*P＜0.05)

由表18可见：与对照组比较，本发明45g/kg和30g/kg剂量组对二甲苯所致小鼠耳肿胀均有明显的抑制作用。提示在该剂量下本发明有明显的抗急性炎症的作用。

2对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响

2.1药物

本发明颗粒剂，每g颗粒含生药29.3g，由第三军医大学第一附属医院提供；地塞米松(对照药物)由浙江仙居制药股份有限公司生产。

2.2动物

SD大鼠，54只，雄性，SPF级动物。

2.3方法及结果

取大鼠54只随机分为5组，每组10～11只，按表14灌胃给药，每日一次，连续5天，对照组给予同等体积的生理盐水。第4次给药后测定大鼠左足正常足容积(两次，取均值作为正常值)，末次给药后30分钟，于大鼠左足部皮下注射1％的角叉菜胶0.05ml致炎，分别测定致炎后1、3、6、8小时的大鼠左足容积，计算足肿胀率＝(致炎后左足容积-致炎前左足容积)/致炎前左足容积*100％)，结果见表19：

表19本发明对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响

(各给药组与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01)

由表19可见：与对照组比较，本发明30g/kg剂量组能明显降低注射角叉菜胶后3h、6h的大鼠足肿胀率，20g/kg剂量组对注射角叉菜胶后6h的大鼠足肿胀也有明显的抑制作用，并有一定的量效关系。以上结果表明，本发明对角叉菜胶所致大鼠急性炎症有明显的抗炎作用。

实验例4活血化瘀作用

1对肾上腺素加冰水所致急性大鼠血瘀模型的影响

1.1药物

本发明颗粒剂，每g颗粒含生药29.3g，由第三军医大学第一附属医院提供；复方丹参片(对照药物)由广东一力药业集团有限公司生产。

1.2动物

SD大鼠，60只，雄性，SPF级动物。

1.3方法及结果

取大鼠60只，随机分为6组，每组10只，按表15～16给药，每日一次，连续7天，模型组和正常对照组给予生理盐水。末次给药后1小时，除正常对照组外，其余各组均按0.08ml/100g皮下注射0.1％的肾上腺素，2h后将动物于4℃冰水中浸泡5分钟，于首次注射后4小时再次注射同等剂量的肾上腺素，禁食不禁水18小时。次日戊巴比妥钠45mg/kg麻醉后腹主动脉取血，0.5ml注入EDTA(乙二胺四乙酸)采血管中抗凝后测定HCT(血球压积)，4m1注入肝素抗凝试管中，测定全血粘度，再将血离心，测定血浆粘度，并计算出聚集指数、刚性指数、变形指数等，结果见表20～21：

表20本发明对血瘀模型大鼠血液粘度的影响

(各组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01)

表21本发明对血瘀模型大鼠红细胞指数的影响

(各组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01)

由表20～21可见：与正常组相比，模型组大鼠全血粘度(高切、低切)、血浆粘度及HCT均明显升高，表明血瘀模型造模成功；本发明30g/kg和20g/kg剂量组能明显降低急性血瘀模型大鼠的全血粘度(高切、低切)，还能明显降低急性血瘀模型大鼠的红细胞聚集指数、刚性指数和变形指数，但对血浆粘度的升高无明显影响。表明本发明对急性血瘀模型大鼠有明显的活血化瘀作用。

2对角叉菜胶所致小鼠血栓模型的影响

2.1药物

本发明颗粒剂，每g颗粒含生药29.3g，由第三军医大学第一附属医院提供；复方丹参片(对照药物)由广东一力药业集团有限公司生产。

2.2动物

昆明种小鼠，51只，雄性，SPF级动物。

2.3方法及结果

51只小鼠随机分为5组，每组10～11只，按表22灌胃给药，每日一次，连续8天，对照组给予同等体积的生理盐水。第5次给药后，每只小鼠皮下注射给予角叉菜胶100mg/kg(0.1ml/10g体重)，并将动物置于14±1℃空调房间内，分别于造模后48、72小时量取小鼠尾部黑尾长度，结果见表22：

表22本发明对角叉菜胶所致小鼠血栓模型的影响

(各给药组与对照组比较*P＜0.05)

由表22可见：与对照组比较，本发明30g/kg剂量组能明显缩短角叉菜胶造模48小时后小鼠尾部黑尾长度，45g/kg剂量组也有一定作用趋势。提示本发明对角叉菜胶血栓模型小鼠有一定的活血化瘀作用。

实验例5镇痛作用(对醋酸所致小鼠扭体反应的影响)

1药物

本发明颗粒剂，每g颗粒含生药29.3g，由第三军医大学第一附属医院提供；阿司匹林(对照药物)由石家庄康力药业有限公司生产。

2试验动物

昆明种小鼠，50只，雌雄各半，SPF级动物。

3方法及结果

取小鼠50只随机分为5组，每组10只，按表23灌胃给药，每日一次，连续3天，对照组给予同等体积的生理盐水液。末次给药后1小时，腹腔注射0.7％的冰醋酸液0.2ml/只，记录20分钟内小鼠扭体次数和潜伏期T，并计算1/T，结果见表23：

表23本发明对小鼠扭体潜伏期和次数的影响

(各给药组与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01)

由表23可见：与对照组相比，本发明30g/kg、45g/kg剂量组对醋酸所致小鼠扭体反应有明显的抑制作用，能明显减少醋酸刺激引起的小鼠扭体次数，30g/kg剂量组还能明显延长其潜伏期。表明本发明对化学性刺激引起的外周疼痛有一定的镇痛作用。

实验例6对移植性S180实体瘤生长的影响

1药物

本发明颗粒剂，每g颗粒含生药29.3g，由第三军医大学第一附属医院提供；环磷酰胺(对照药物)由江苏恒瑞医药股份有限公司生产。

2动物

昆明种小鼠，63只，雌性，SPF级动物。

3方法及结果

取小鼠63只，无菌条件下，取接种7天的S180腹水瘤细胞，按比例稀释计数、调整瘤细胞数为10⁷个/ml，接种于小鼠右腋皮下，0.2ml/只(即每只小鼠接种瘤细胞数约为2×10⁶个)，次日称重后随机分为5组，除对照组为23只外，其余每组10只，按表19给药，每日一次，连续10天，对照组给予同等体积的蒸馏水。末次给药后24小时，脱颈椎处死动物、称体重、剖瘤称重。计算肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重-药物组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100，结果见表24：

表24本发明对荷S180小鼠实体瘤生长的影响

(各给药组与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01)

由表24可见：与对照组比较，本发明45g/kg剂量组能抑制S180瘤的生长，提示本发明对荷S180小鼠有一定的抗肿瘤作用。

通过以上药理药效试验证明，利用本发明质量检测方法监控获得的本发明的中药颗粒剂，药效确切、作用稳定、疗效好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种由山楂、炒麦芽、鸡血藤和通草制成的治疗乳腺增生的中药颗粒质量检测方法，其特征在于，该方法包括鉴别和含量测定两部分，其中鉴别包括采用薄层色谱法，分别用芒柄花素对照品、山楂对照药材或枸橼酸对照品进行的鉴别；含量测定以含表儿茶素确定，以表儿茶素计，不得少于0.70mg/g；

其中，所述治疗乳腺增生的中药颗粒采用如下方法制备：取山楂6份、炒麦芽10份、鸡血藤10份、通草3.3份，然后加8～10倍量的水煎煮三次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至70℃的相对密度为1.10～1.12的稠膏，加入3份糊精，流化床制粒，干燥，整粒，制成颗粒，即得；

所述鉴别包括如下鉴别中的一种或多种：

1)鸡血藤的鉴别：取所述中药颗粒8-15g，加水50ml使溶解，加乙醚 100ml超声处理20-40min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取芒柄花素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，取对照品溶液1-3μl，供试品溶液15-25μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以比例为20∶12∶3的环己烷-乙酸乙酯-氯仿为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有鸡血藤；

2)山楂的鉴别：取所述中药颗粒8-15g，加甲醇20ml，超声处理10-20min，滤过，滤液作为供试品溶液；另取山楂对照药材0.1g，加甲醇10ml，超声处理15-20min，滤过，滤液作为对照药材溶液；另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，取对照药材溶液及对照品溶液1-3μl，供试品溶液4-10μl，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以比例为10∶4∶1的乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，吹干，喷以0.1％溴甲酚绿乙醇 液；供试品色谱中在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有山楂；

所述含量测定方法包括如下步骤：

1)对照品溶液的制备

精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

2)标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.5ml、1ml至50ml量瓶中，另精密量取对照品溶液0.5ml、1ml、2ml、3ml至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取5μl注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，其中色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.01mol/L柠檬酸为流动相，比例为28-35∶65-72；检测波长为280nm；柱温25-35℃；理论板数按表儿茶素峰计算应不低于2000；

3)测定法

取所述中药颗粒，研细，取约0.5-1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇40-100ml，摇匀，超声处理30-40min，滤过，滤液浓缩至约2ml，拌入2-3g的聚酰胺，拌匀，加到聚酰胺干柱上，依次用水100ml、20％甲醇100ml、70％甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用100ml量瓶收集至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5μl注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲线上读出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。 

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