CN101951765B - 植物成长调节剂组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供植物成长调节剂组合物。所述植物成长调节剂组合物含有苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐。
Description
技术领域
本发明涉及植物成长调节剂组合物。
背景技术
在农业领域中，控制植物的成长是用于提高生产率的重要技术。目前，以抑制植物的成长为目的的种类繁多的植物成长调节剂被实用化，对作物的产量、生产物的品质提高作着贡献。
但是，促进根须发达的植物成长调节剂，其数量少，效果也不充分，进而具有不适宜作用的情况多。例如，目前作为生根剂被广泛使用的植物生长素(Auxin)类化合物，由于根据植物的种类、状态、施用的浓度有时会引起叶的偏上成长、茎的扭转、茎断裂、根瘤的诱发、进而枯死等不适宜的作用，因此使用方法、使用量等受到限制，而且促进根须发达的作用也不能得到充分满足。
此外，小麦、稻等禾本科植物即使开花、受精正常进行，若因受到此后的气象条件等的影响而不能充分成熟，则会导致产量的降低，因此成为问题，改善这种现象的植物成长调节剂的数量少，效果也不充分。
虽然已知苯乳酸具有促进植物生根的作用(非专利文献1)，但由于其作用弱，所以单独作为植物成长调节剂尚未达到实用化。而且，报道了乳酸菌(Enterococcus faecalis)所产生的苯乳酸具有抗菌性(专利文献1)。
此外，报道了色氨酸在特定植物的特定组织中，作为植物荷尔蒙—吲哚乙酸的前体起作用(非专利文献2)，但一般看不到这样的效果，作为植物成长调节剂尚未被实用化。
专利文献1：日本特开2000-300284号公报
非专利文献1：Mikami et al.1970.Several synthetic hydroxy-acids as plantgrowth regulators.Agricultural and BiologicalChemistry 34：977-979.
非专利文献2：Law 1987.Gibberellin-enhanced indole-3-aceticacid biosynthesis：D-Tryptophan as the precursor of indole-3-aceticacid.Physiol.Plant.70：626-632.
发明内容
因此，本发明的目的是提供具有促进植物生根的作用、促进禾本科植物成熟的作用的植物成长调节剂。
本发明人等为了解决所述问题，潜心研究后，结果意外地发现：通过并用苯乳酸与色氨酸，促进植物生根的效果、促进禾本科植物成熟的效果被大幅增强，从而完成了本发明。
因此，本发明提供含有苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐的植物成长调节剂组合物。
此外，本发明提供一种植物成长调节方法，其特征在于，将苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐施用于植物。
本发明的植物成长调节剂组合物，由于促进植物生根的活性高，且叶的偏上成长促进作用这样的副作用极弱，因而可以作为植物的成长调节剂、特别是生根促进剂在整个生长期间使用。作为育苗期、移植时的生根促进剂尤其有用。此外，还可用作促进禾本科植物的子实发育的成熟促进剂。另外，促进植物生根的活性高，因而可用作农药、肥料添加剂，而且其本身也可用作肥料。
具体实施方式
本发明的植物成长调节剂组合物的有效成分(以下称为“植物成长调节物质”)为苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐。
本发明中使用的植物成长调节物质中，色氨酸可以是D型、L型、或两者的混合物，但优选L型。
该色氨酸可以是市售品，也可以使用通过有机合成、微生物发酵而制造的色氨酸。另外，可以使用含有色氨酸或其盐的组合物，例如，可以列举含有色氨酸的微生物发酵培养液、以色氨酸为构成成分的蛋白质·肽(所谓的蛋白态)或其分解物等，其中，特别优选不是蛋白态，而是色氨酸或其盐、或含有色氨酸或其盐的培养液。
作为色氨酸的制造方法，例如，通过大木等人的方法以工业方式合成DL型，进而通过将其进行光学分离而得到D型和L型[大木等(编).《化学辞典》东京化学同人]。另外，通过使用了微生物的发酵法、微生物转化法、使用了来源于微生物的酶的酶法也可以得到L型[椎尾 勇1986.色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸发酵.相田等(编).《氨基酸发酵》343-360页.学会出版中心]。
本发明中使用的植物成长调节物质中，苯乳酸(3-苯基乳酸)可以是D型、L型、或两者的混合物，但优选D型。
该苯乳酸可以是市售品，也可以使用通过有机合成、微生物发酵而制造的苯乳酸。
另外，作为植物成长调节物质，也可以使用含有苯乳酸或其盐的组合物，例如可以列举食醋等，如后述实施例所记载，由于明确了苯乳酸生产性微生物的培养液、例如玉米浆中含有苯乳酸，它们也可以用作植物成长调节物质，因此也可以将它们原样使用，另外也可以将它们浓缩、稀释或悬浮后使用。此时，当然希望在制造玉米浆时预先接种苯乳酸生产能力高的乳酸菌株。
苯乳酸可以通过使重氮盐在酸性水溶液中进行热分解而得到，所述重氮盐是通过将苯丙氨酸重氮化而得到的[Kimura and Tamura 1973.Isolation ofL-β-phenyllactic acid and tyrosol as plant growthregulators from Gloeosporium laeticolor.Agricultural andBiological Chemistry 37：2925]。另外，也可以通过将苯丙氨酸溶解于硫酸中，并添加亚硝酸钠的所谓van Slyke法而得到[Koga et al.1971.Examinations on the neighboring aryl group participation in nitrousacid deaminations of L-phenylalanine and its p-nitro and p-methoxyderivatives.Tetrahedron Lett.25：2287-2290.]。
另外，苯乳酸也可以通过在通常使用的培养基中培养苯乳酸生产性的微生物而得到。此时，作为培养基，除了可以使用通常使用的培养基(MRS培养基、GYP培养基等)之外，还可以使用玉米提取液。另外，如果在培养基中增加作为苯乳酸底物的苯丙氨酸[日本化学会(编)1997.《细胞机能与代谢图(I)》东京化学同人]的添加量，则也可以使苯乳酸的量增大。
作为该微生物，例如可以列举乳酸菌属菌、肠球菌属菌等的乳酸菌等，优选为乳酸菌属菌。具体而言，作为乳酸菌属菌，可以列举例如鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)[Valerio et al.2004.Production of phenyllactic acidby lactic acid bacteria：an approach to the selection of strainscontributing to food quality and preservation.FEMS Microbiol.Lett.233：289-295.]，作为肠球菌属菌，可以列举粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)[日本特开2000-300284号公报]，其中，优选鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌，特别优选鼠李糖乳杆菌(FERM P-13245)株、植物乳杆菌(FERMP-18930)株、以及植物乳杆菌N株，在这些菌株中，前2株分别于平成4(1992)年11月6日及平成14(2002)年7月9日保藏在产业技术综合研究所 专利生物保藏中心(地址：茨城县筑波市东1-1-1中央第6)。
另外，玉米浆是制造玉米淀粉时的副产物之一，是在制造工序中进行乳酸发酵而得到的(三轮泰造1979.玉米加工工业副产物.《配合饲料讲座(下卷)》265-269页.畜产出版社.)。
另外，已知食醋中含有苯乳酸，因此可以利用食醋。
另外，还可以通过离子交换树脂、多孔合成吸附剂、溶剂萃取等从上述含有苯乳酸的培养液中将苯乳酸部分纯化或纯化分离后使用。
例如，玉米浆的部分纯化物可以通过如下方式得到：将玉米浆水溶液的pH调节到中性区域(pH5～8)后，使其吸附于强碱性离子交换树脂或弱碱性离子交换树脂后，用含酸的醇水溶液洗脱而得到。此时，优选将吸附前的离子交换树脂置换为甲酸型或乙酸型等。
作为该溶液的酸浓度，优选为0.01～4N，更优选1～3N。作为该酸，可以列举甲酸、乙酸、盐酸、硫酸等。
作为该溶液的醇浓度，优选为0～80容量％，更优选10～30容量％。作为该醇，可以列举甲醇、乙醇、丁醇、异丙醇等。
另外，例如，玉米浆的部分纯化物可以通过如下方式得到：将玉米浆水溶液的pH调节到酸性区域(pH1～4)后，使其吸附于聚苯乙烯系合成吸附剂、苯乙烯-二乙烯基苯系吸附剂或甲基丙烯酸系合成吸附剂后，用醇水溶液或酮水溶液洗脱而得到。
作为该溶液的醇或酮浓度，优选为0～99容量％，更优选10～30容量％。作为该醇，可以列举甲醇、乙醇、丁醇、异丙醇等。作为该酮，可以列举丙酮等。
另外，当苯乳酸生产性微生物的培养液中含有色氨酸或其盐时，可以将该培养液直接作为本发明的植物成长调节剂组合物使用。但是，当培养液中色氨酸或其盐的含量少时，可以进一步添加色氨酸或其盐。
另外，作为苯乳酸或色氨酸的盐，没有特别限定，可以列举钠、钾等碱金属类；钙、镁等碱土金属类；氨；柠檬酸、酒石酸、草酸、乳酸、乙酸等的有机酸盐；磷酸、碳酸、硝酸、硫酸、盐酸等的无机酸盐等。
本发明的植物成长调节剂组合物中的苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐的含有比，从通过并用这2种成分而得到的植物成长调节效果、增强效果的方面看，按质量比计，优选为1∶700～99∶1，更优选1∶600～99∶1，进一步优选1∶500～99∶1，格外优选1∶200～9∶1，特别优选1∶50～9∶1。此时，制成溶液时，苯乳酸或其盐优选含有0.1ppm以上，另外色氨酸或其盐优选含有1ppm以上。
本发明的植物成长调节剂组合物可以通过将上述植物成长调节物质和其他的任意成分按照常规方法混合、搅拌等而制造。
本发明的植物成长调节剂组合物可以是上述植物成长调节物质的混合物本身，也可以用通常的植物成长调节剂中使用的载体制剂化成可湿性粉剂、乳剂、粒剂、粉剂等。
制剂的形状也没有限制，可以成型为粉剂、颗粒剂、粒剂、可湿性粉剂、流动剂(flowable agent)、乳剂和贴剂等所有制剂形态。
作为固体载体，例如，可以使用矿物粉末(高岭土、膨润土、粘土、蒙脱石、滑石、硅藻土、云母、蛭石、石膏、碳酸钙、磷石灰等)、植物粉末(大豆粉、小麦粉、木粉、烟草粉、淀粉、结晶纤维素等)、高分子化合物(石油树脂、聚乙烯醇树脂、聚乙酸乙烯酯树脂、聚氯乙烯、酮树脂等)、以及氧化铝、蜡类等。另外，作为液体载体，例如，可以使用醇类(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、苄醇等)、芳香烃类(甲苯、苯、二甲苯等)、氯化烃类(氯仿、四氯化碳、单氯苯等)、醚类(二
烷、四氢呋喃等)、酮类(丙酮、甲基乙基酮、环己烷等)、酯类(乙酸乙酯、乙酸丁酯等)、酸酰胺类(N，N-二甲基乙酰胺等)、醚醇类(乙二醇乙基醚等)、或水等。
作为以乳化、分散、扩散等为目的而使用的表面活性剂，可以使用非离子性、阴离子性、阳离子性和两离子性中的任一种。若列举可以在本发明中使用的表面活性剂的例子，则有聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、氧化乙烯聚合物、氧化丙烯聚合物、聚氧乙烯烷基磷酸酯、脂肪酸盐、烷基硫酸酯盐、烷基磺酸盐、烷基芳基磺酸盐、烷基磷酸盐、烷基磷酸酯盐、聚氧乙烯烷基硫酸酯、季铵盐、氧烷基胺(oxyalkyl amine)、卵磷脂、皂角苷等。另外，根据需要可以将明胶、酪蛋白、藻酸钠、淀粉、琼脂、聚乙烯醇等作为辅助剂使用。
将本发明的植物成长调节剂组合物制成水溶液或悬浮液时的pH(25℃)，优选为2～8，作为调节该pH的缓冲剂，可以列举乙酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、乳酸、葡糖酸、酒石酸等的有机酸盐、磷酸、盐酸、硫酸等的无机盐、氢氧化钠等氢氧化物、氨或氨水等，也可以将这些物质单独使用或组合2种以上使用，进而也可以与其他的pH调节剂适当地组合。
本发明的植物成长调节剂组合物具有使根的量增加的作用、促进整个生长过程的作用等，但特别优选作为生根促进剂、禾本科植物的成熟促进剂使用。
另外，由于本发明的植物成长调节剂组合物含有氨基酸，因而也可以将其直接用作肥料。
将本发明的植物成长调节剂组合物施用于植物时，可以直接原样使用，或者也可以用水稀释或悬浮到规定浓度后使用。
另外，也可以将苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐制备成各个不同的制剂，将它们同时用于植物。
施用于植物时，可以作为土壤处理剂、茎叶处理剂、播种前的种子处理剂、移植前植物的处理剂和对移植时的植物的处理剂等使用。另外，在水耕栽培中，可以混合在水耕液中来使用，在组织培养中，可以使其悬浮或溶解在培养基中来使用。
将本发明的植物成长调节剂组合物用作撒播用途时的使用浓度，以苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐的合计浓度计，可以优选为0.01～100000ppm，更优选为1～10000ppm，特别优选为5～1000ppm的范围。特别是用于育苗期的苗时，优选每1L培养土撒播50～200mL上述浓度的稀释液。另外，作为禾本科植物的成熟促进剂使用时，优选每1ha土地面积撒播200～2000L。在这些情况下，可以使用扩展剂(spreading agent)，对于所用的扩展剂的种类和使用量没有特别限制。
作为包括与肥料混合时的、直接施用于土壤时的使用量，以苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐的合计浓度计，优选为每1公顷使用100～10000g，特别优选使用500～5000g。特别是用于育苗期的苗时，优选每1L培养土使用0.001～10g。这种情况下，可以在播种前的培养土里预先混合，也可以在育苗期间撒播。
作为播种前的种子处理用途而使用时，也可以以在水、醇类(甲醇、乙醇等)、酮类(丙酮等)、醚类(二乙基醚等)、酯类(乙酸乙酯等)等液体载体中苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐的合计浓度为0.01～100000ppm的方式进行稀释或悬浮，然后对干燥种子喷雾，或将干燥种子浸渍于稀释液中使种子吸收。作为浸渍时间，没有特别限制，优选为1秒～30分钟。另外，处理后的种子也可以通过风干、减压干燥、加热干燥、真空干燥等使液体载体蒸发。另外，也可以使使用粘土等矿物粉末的固体载体制剂化而成的物质附着于种子表面来使用。另外，也可以混合到通常使用的种衣剂、种子包衣膜中而包覆种子。
在用于组织培养、细胞培养时的情况下，作为在通常使用的植物组织培养用的培养基(MS培养基、White培养基、Gamborg的B5培养基等)中的浓度，可以溶解或悬浮到以苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐的合计浓度计优选为0.01～10000ppm、特别优选0.1～1000ppm的范围来使用。这种情况下，如通常所进行的那样，可以适当添加作为碳源的糖类(蔗糖、葡萄糖等)、作为各种植物荷尔蒙的细胞分裂素(苄基腺嘌呤、激动素等)、植物生长素(吲哚乙酸、萘乙酸等)、赤霉素(GA3、GA4等)、脱落酸等。
使移植前的植物直接吸收时，可以将植物的根部或整体浸渍在稀释或悬浮到以苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐的合计浓度计为0.1～1000ppm的液体中而使用。另外，只要是插穗、插芽、插条等，则可以将基部或整体浸渍后使用。此时的浸渍时间为1秒～1周，特别优选1分钟～3天。另外，可以使使用矿物粉末的固体载体制剂化而成的物质附着于根部，或者在插穗、插芽、插条等时使其附着于茎基部。
作为本发明的植物成长调节剂组合物的给药时期，虽然在生长期中的任一时期都可以使用，但特别是作为生根促进剂应用的时候，是在播种前、播种时、苗培育时，移植等伴随耕种断根的作业的前后、由于气象原因等导致根发育受阻或根产生障碍等情况下特别有效。另外，作为禾本科植物的成熟促进剂使用时，开花期以后至黄熟期的期间为有效。
如果将本发明的植物成长调节剂组合物作为生根促进剂应用于植物，则通过侧根数、不定根数等根数的增加而使根的量、根密度增加，因此可以得到苗移植时的存活率提高、壮苗育成、生长促进、吸水力提高、吸肥力提高、肥料成分利用率提高、绿色的保持、光合成能力提高、缺水耐受力提高、倒伏的防止、产量增加等效果。另外，如果作为禾本科植物的成熟促进剂使用时，由于每一粒子实的重量增加，因而可以得到产量增加等效果。
作为成为本发明的植物成长调节剂组合物的应用对象的植物，没有特别限定，例如可以列举西红柿、青椒、辣椒、茄子等茄果类；黄瓜、南瓜、白兰瓜、西瓜等瓜类；芹菜、欧芹、莴苣等生菜-香辛菜类；大葱、洋葱、大蒜等葱类；大豆、花生、菜豆、豌豆、小豆等豆类；草莓等其他果菜类；萝卜、芜菁、胡萝卜、牛蒡等直根类；芋头、木薯、马铃薯、甘薯、家山芋等薯芋类；芦笋、菠菜、鸭儿芹等叶菜(柔菜)类；土耳其桔梗、紫罗兰、康乃馨、菊等花卉类；稻、小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物类；剪股颖、沟叶结缕草等草类；菜籽、向日葵等油料作物类；甘蔗、甜菜等糖料作物类；棉、灯心草等纤维料作物类；三叶草、高粱、臼齿形(顶陷)玉米等饲料作物类；苹果、梨、葡萄、桃等落叶性果树类；温州蜜柑、柠檬、葡萄柚等柑橘类；杜鹃、映山红、杉等木本类。
其中，用作生根促进剂时，对西红柿、青椒、辣椒、茄子、黄瓜、南瓜、白兰瓜、西瓜、芹菜、欧芹、莴苣、大葱、洋葱、芦笋、土耳其桔梗、紫罗兰、稻、剪股颖、沟叶结缕草、甜菜、灯心草等在栽培中进行移植的植物、对菊、康乃馨、杜鹃、映山红、葡萄等通过折枝、插穗而使之发根从而进行增殖的植物特别有效。另外，作为禾本科植物的成熟促进剂使用时，对小麦、稻、大麦、燕麦等子实未被包皮覆盖的植物特别有效。
另外，以提高本发明的效果为目的，可以与其他的植物成长调节剂并用，根据情况也能期待协同效果。例如，作为生根促进剂使用时，在高栽植密度、高湿度、日照不足等极易徒长的条件下的育苗时，以地上部分和地下部分的重量比小的优质苗的育成为目的，也可以与具有强的茎伸长抑制作用的赤霉素抑制剂(多效唑、烯效唑、环丙嘧啶醇等)、成长抑制剂(丁酰肼等)、乙烯产生剂(乙烯利等)并用。另外，在插穗、插芽、插条、组织培养时，以增强生根促进效果为目的，也可以与植物生长素类化合物(吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘基乙酰胺、萘乙酸等)并用。另外，在播种前的种子处理时，也可以与具有发芽促进作用的赤霉素剂并用。另外，作为禾本科植物的成熟促进剂使用时，也可以与土菌消、稻瘟灵等其他成熟比例提高剂并用。这些仅仅是例示，可以与本发明的植物成长调节剂并用的其他植物成长调节剂并不限于这些。
另外，本发明的植物成长调节剂组合物，也可以与各种杀虫剂、杀菌剂、微生物农药、肥料等混用或并用。特别是，作为生根促进剂使用时，与报道除具有杀菌作用以外还具有生根促进作用的土菌消、磺菌威、甲霜灵等并用是有效的。另外，与育苗期使用的杀虫杀菌剂混用是特别有效的。另外，与肥料并用时，在与以壮苗育成为目的的育苗用肥料并用、与以促进存活为目的的即将移植前施用肥料并用是特别有效的。另外，在与以使本发明的植物成长调节剂组合物的效力长期持续、提高肥料成分利用率为目的的缓效性肥料混用也特别有效。
另外，作为禾本科植物的成熟促进剂使用时，与尿素、磷酸铵、氨基酸等其他叶面撒播用肥料混用也是有效的。
实施例
下面，示出实施例，更详细地说明本发明，但本发明并不限于以下的实施例。
制造例1
<采用使用了合成培养基的乳酸菌培养的制造法>
将乳酸菌-鼠李糖乳杆菌FERM P-13245株和植物乳杆菌FERM P-18930株接种到在Morishita等设计的培养基[Morishita et al.1981.Multiplenutritional requirements of Lactobacilli：genetic lesionsaffecting amino acid biosynthetic pathways.J.Bacteriol.148：64-71.]中加入了若干改变而成的合成培养基(将葡萄糖10g、乙酸钠6g、柠檬酸铵1g、磷酸一钾3g、磷酸二钾3g、硫酸镁七水合物0.5g、硫酸铁七水合物0.02g、硫酸锰七水合物0.05g、Tween-80(注册商标)1g、吡哆醛2mg、泛酸钙1mg、核黄素1mg、烟酸1mg、对氨基苯甲酸0.2mg、生物素0.01mg、叶酸0.1mg、L-精氨酸0.1g、L-天冬氨酸0.2g、L-半胱氨酸0.2g、L-谷氨酸0.2g、L-异亮氨酸0.1g、L-亮氨酸0.1g、L-赖氨酸0.1g、L-蛋氨酸0.1g、L-丝氨酸0.1g、L-苏氨酸0.1g、L-色氨酸0.1g、L-酪氨酸0.1g、L-缬氨酸0.1g和L-苯丙氨酸5g溶解于1L蒸馏水中，在121℃采用高压釜进行10分钟灭菌而调制)上，在27℃培养3天。
粗纯化如下进行。SepPak PS-2(Waters公司制)预先用99％甲醇清洗，接着用pH3.0乙酸水进行环境适应(順化)。将培养液各30mL用稀盐酸调节到pH 3.0，以6500rpm进行离心分离30分钟，使上清液10mL通过进行了调整的柱子，将苯乳酸吸附。接着，用5mL的1N乙酸水清洗柱子后，用40％甲醇20mL进行洗脱。将洗脱液用蒸发器浓缩至约500mL，用氢氧化钠水溶液调节到pH8.0，用乙酸乙酯进行3次萃取，废弃乙酸乙酯层。将剩余的水相用盐酸调成pH2.5，进行3次乙酸乙酯萃取。将得到的乙酸乙酯层用无水硫酸镁进行脱水后，在减压下除去溶剂。将残渣用少量的10％甲醇溶解，使其通过以流过10％甲醇而进行了调整的SepPak C18柱子(Waters公司制)，进而，用20mL的10％甲醇进行洗脱。将洗脱液在减压下进行干燥固化。
该样品用HPLC(柱、Puresil C18内径4.6mm×长度250mm(Waters公司制)；柱温为40℃；流动相为含1％乙酸的40％甲醇；流速为0.8mL/分钟)进行分析。在10.22分钟看到峰，这与试剂苯乳酸(Sigma-Aldrich Japan)大体一致。测定该峰的紫外线吸收光谱，结果在259nm看到最大吸光，与试剂苯乳酸一致。将在260nm处测定的峰面积与用试剂苯乳酸制成的标准曲线进行比较，结果算出培养液中的苯乳酸浓度在乳酸菌-鼠李糖乳杆菌FERM P-13245株接种区为78mg/L、在植物乳杆菌FERM P-18930株接种区为147mg/L。
于是，将这些培养液制成乳酸菌培养液本身，在该乳酸菌培养液本身中加入L-色氨酸(和光纯药(株))并使其浓度为苯乳酸浓度的10分之1，将如此调制成的物质作为乳酸菌培养液和L-色氨酸的混合物。
制造例2
<采用使用了玉米提取液的乳酸菌培养的制造法>
将玉米粉(Sigma-Aldrich Japan)50g加入1L蒸馏水中，将在85℃进行1小时提取而得的物质以6500rpm进行离心分离30分钟，得到上清液。将该上清液用高压釜进行灭菌，接种植物乳杆菌FERM P-18930株，在27℃培养4天。将培养液与制造例1同样地进行分析，结果苯乳酸浓度为0.25mg/L。
于是，将这些培养液制成玉米乳酸菌培养液本身，在每1L该培养液中加入0.025mg的L-色氨酸(和光纯药(株))，将如此调制成的物质作为玉米乳酸菌培养液和L-色氨酸的混合物。
制造例3
<使用玉米浆的制造法>
在玉米浆(和光纯药)1.5L中加入等量的蒸馏水，用氢氧化钠调成pH7。使其流过调整为甲酸型的强碱性阴离子交换树脂Diaion(注册商标)PA418柱(内径45mm×长度550mm)，从而将苯乳酸和色氨酸吸附，用蒸馏水1L清洗后，用含有2N甲酸30％的异丙醇溶液2L进行洗脱。洗脱液通过减压浓缩馏去异丙醇，使用氢氧化钠调节为pH3.0。另外，将苯乙烯-二乙烯基苯系合成吸附树脂Diaion(注册商标)HP-20用甲醇清洗后，填充于柱(内径45mm×长度550mm)中，流过pH3.0乙酸水进行调整。通过使上述的浓缩液流过该柱，将苯乳酸吸附。将柱用pH3.0乙酸水1L清洗后，用20％异丙醇2L洗脱苯乳酸。将洗脱液用蒸发器浓缩至约500mL，用氢氧化钠水溶液调节为pH8.0，用乙酸乙酯进行3次萃取，将乙酸乙酯层废弃。将剩余的水相用盐酸调成pH2.5，进行3次乙酸乙酯萃取。将得到的乙酸乙酯层用无水硫酸镁脱水后，进行减压干燥固化。将该样品供于硅胶柱(内径20mm×长度250mm)，用正己烷∶乙酸＝99∶1的混合液清洗后，用正己烷∶乙酸乙酯∶乙酸＝39∶60∶1的混合液进行洗脱。将洗脱液减压浓缩，将残渣用少量的10％甲醇溶解，使其通过以流过10％甲醇而进行了调整的SepPak C18柱子(Waters公司制)，进而，用20mL的10％甲醇进行洗脱。将洗脱液在减压下进行干燥固化。
该样品用HPLC(柱、YMC C8内径20mm×长度250mm(YMC公司制)；柱温为室温；流动相为含有1％乙酸50％的甲醇；流速为6mL/分钟)进行纯化，分离取出相当于苯乳酸的部份(保留时间20～25分钟)。进而将分离取出的部份用HPLC(柱、YMC ODS-A内径10mm×长度250mm(YMC公司制)；柱温为室温；流动相为含有1％乙酸45％的甲醇；流速为2mL/分钟)进行纯化，分离取出相当于苯乳酸的部份(保留时间19～22分钟)。进而将分离取出的部份用HPLC(柱、YMC Phe内径10mm×长度250mm(YMC公司制)；柱温为室温；流动相为含有1％乙酸40％的甲醇；流速为2mL/分钟)进行纯化，分离取出相当于苯乳酸的部份(保留时间17～20分钟)。进而将分离取出的部份用HPLC(柱、YMC ODS-A内径10mm×长度250mm(YMC公司制)；柱温为室温；流动相为含有1％乙酸40％的乙腈；流速为2mL/分钟)进行纯化，分离取出作为单峰的相当于苯乳酸的部份(保留时间10～12分钟)。测定该峰的紫外线吸收光谱，结果在259nm看到最大吸光，与试剂苯乳酸一致。将得到的部份在减压下浓缩后，在五氧化二磷存在的条件下，在干燥器内进行减压干燥，结果得到44.4mg苯乳酸的结晶。对该结晶用甘油进行质量分析(MS-FAB)，结果检测出(M+H)+为167.0、添加NaCl的(M+Na)+为188.9，与试剂苯乳酸一致。由该结果算出该玉米浆中苯乳酸浓度为29.6mg/L。
于是，将该玉米浆制成玉米浆本身，添加L-色氨酸(和光纯药(株))并使其浓度为15g/L，将如此调制成的物质作为玉米浆和L-色氨酸的混合物。
制造例4
<采用用离子交换树脂对玉米浆进行部分纯化的制造法>
在玉米浆(Oji Cornstarch Co.，Ltd.制)1L中加入1L蒸馏水，用氢氧化钠调成pH7。使其流过调整为甲酸型的强碱性阴离子交换树脂PA418柱(Diaion(注册商标)、内径45mm×长度550mm)，从而将苯乳酸吸附，用蒸馏水1L清洗后，用含有2N甲酸30％的异丙醇溶液2L进行洗脱。将洗脱液浓缩为100mL后，加入氢氧化钠调节为pH3。
将该浓缩液与制造例1同样地进行纯化、分析，结果苯乳酸浓度为747mg/L。
于是，将该玉米浆制成玉米浆部分纯化浓缩液(浓缩液)，添加L-色氨酸(和光纯药(株))并使其浓度为75mg/L，将如此调制成的物质作为玉米浆部分纯化浓缩液和L-色氨酸的混合物。
制造例5
<粉剂的制造法>
用与制造例4同样的方法调制玉米浆部分纯化浓缩液和L-色氨酸的混合物5L，将膨润土粉末Kunigeru VA(クニゲルVA)(KUNIMINE INDUSTRIES制)5kg作为载体，使用连续流动涂布机FBS-0.5(大川原制作所制)进行吹送干燥，得到粉剂。
此时，器内温度为50℃，添加速度为每分钟40mL。
实施例1
<采用小豆切口浸渍处理进行的苯乳酸和色氨酸混合物的生根促进作用>
调制DL-苯乳酸(Sigma-Aldrich Japan)和L-色氨酸(和光纯药)的合计浓度为400ppm的水溶液，用盐酸调成pH7，供于小豆生根促进测试分析(Itagaki et al.2003.Biological activities and structure-activityrelationship of substitution compounds of N-[2-(3-indolyl)ethyl]succinamic acid and N-[2-(1-naphthyl)ethyl]succinamic acid、derived from a new category of root-promoting substance、N-(phenethyl)succinamic acid analogs.Plant Soil 255：67-75.)。将小豆切片的基部在被检液中浸渍72小时，计数7日后产生的不定根数。重复数为5棵。
试验以不同浓度进行2次，将其结果示于表1和表2。
另外，如表3所示地调整DL-苯乳酸(0，20ppm)和L-色氨酸(0，400，1200ppm)，与上述同样地进行试验，将其结果示于表3。
从表1可以明确，即使是单独的DL-苯乳酸，也可看到若干发根促进作用，但以DL-苯乳酸∶L-色氨酸＝9∶1～1∶9的方式混合L-色氨酸时，生根促进作用得到大幅增强。
另外，从表2可以明确，即使L-色氨酸相对于DL-苯乳酸的混合比率降低至1∶99，也显示出大幅的协同作用。
另外，从表3可以明确，即使L-色氨酸相对于DL-苯乳酸的混合比率增加到600∶1，也显示出协同作用。
[表1]
[表2]
[表3]
实施例2
<采用小豆切口浸渍处理进行的苯乳酸和氨基酸混合物的生根促进作用的比较>
为了研究除苯乳酸和L-色氨酸以外的芳香族氨基酸的协同作用，调制分别加入DL-苯乳酸(Sigma-Aldrich Japan)与L-色氨酸(和光纯药)、L-苯丙氨酸(和光纯药)、L-酪氨酸(和光纯药)1mM的水溶液，与实施例1同样地供于小豆生根促进测试分析。
将其结果示于表4。
在混合有DL-苯乳酸和L-色氨酸的区域生根促进效果明显增加，与DL-苯乳酸单独处理区进行比较时，仅L-色氨酸看到协同作用。
[表4]
实施例3
<采用小豆切口浸渍处理进行的苯乳酸和色氨酸镜像异构体混合物的生根促进作用>
为了将色氨酸、苯乳酸各自的镜像异构体的组合效果进行比较，调制L-色氨酸、D-色氨酸(和光纯药)、L-苯乳酸(Sigma-Aldrich Japan)、D-苯乳酸(Sigma-Aldrich Japan)的400ppm水溶液，另一方面，调制含有各异构体的色氨酸和苯丙氨酸各200ppm的水溶液，与实施例1同样地供于小豆生根测试分析。
将其结果示于表5。
无论在哪个镜像异构体的组合中，通过混用色氨酸和苯乳酸，都看到了生根促进活性的大幅增强作用。
[表5]
实施例4
<采用小豆切口浸渍处理进行的乳酸菌培养液和L-色氨酸混合物的生根促进作用>
分别将制造例1中得到的乳酸菌培养液本身、以及乳酸菌培养液和L-色氨酸混合物稀释100倍，与实施例1同样地供于小豆生根测试分析。
将其结果示于表6。
即使乳酸菌培养液本身也看到生根促进作用，但显然乳酸菌培养液和L-色氨酸混合物的效果高。
[表6]
实施例5
采用小豆切口浸渍处理进行的玉米乳酸菌培养液和色氨酸混合物的生根促进作用
将制造例2中得到的玉米粉提取液的乳酸菌培养液本身、以及玉米乳酸菌培养液和L-色氨酸混合物稀释100倍，与实施例1同样地供于小豆生根测试分析。
将其结果示于表7。
即使玉米乳酸菌培养液本身也看到生根促进作用，但显然玉米乳酸菌培养液和L-色氨酸混合物的效果高。
[表7]
实施例6
<采用小豆切口浸渍处理进行的玉米浆和L-色氨酸混合物的生根促进作用>
将制造例3的玉米浆本身、以及玉米浆和L-色氨酸混合物与实施例1同样地供于小豆生根测试分析。
将其结果示于表8。
即使玉米浆本身也看到生根促进作用，但显然玉米浆和L-色氨酸混合物的效果高。
[表8]
实施例7
(CSL纯化物+Trp配合物小豆测试分析)
<采用小豆切口浸渍处理进行的玉米浆部分纯化物和色氨酸混合物的生根促进作用>
将制造例4中得到的玉米浆部分纯化浓缩液本身、以及玉米浆部分纯化浓缩液和L-色氨酸混合物，与实施例1同样地供于小豆生根测试分析。将其结果示于表9。即使部分纯化物浓缩液本身也看到生根促进作用，但显然玉米浆部分纯化浓缩液和L-色氨酸混合物的效果高。
[表9]
实施例8
<莴苣的小格成型苗育苗中的效果>
使用1孔尺寸为4cm×4cm、128孔的硬质塑料制格盘，填充以泥炭为主成分的专用培养土(Scotts、Scotts-Sierra Horticultural Products公司)，在玻璃屋内播种卷心菜(品种カルマ一MR、日东农产种苗)，边进行适当追肥边栽培。在播种后第10天和第18天与实施例1同样地撒播稀释到所定浓度的L-色氨酸和DL-苯乳酸的混合液500mL。另外，作为对照使用去离子水。在播种后第28天进行8个体×2反复的取样，将根部充分水洗后，用根扫描仪(ROOT SCANNER，Comair公司制)测定总根长后，对根部和地上部在制成干物后进行测定。进行作物生长高度、根部干物重的测定。
将结果示于表10。应予说明，表中的括号内的数值是将对照区设为100时的相对值，用％表示。
在所有的处理区中，确认了总根长、根部干物重的增加，在100ppm以上的浓度下确认了总干物重的增加。由此可以确认，在使用培养土的实用的育苗方法中生根促进作用也高。
[表10]
实施例9
<玉米浆和色氨酸混合物对花茎甘蓝的小格成型苗育苗的效果>
植物为花茎甘蓝(品种绿岭、Sakata Seed Corporation)，其他以与实施例8同样的方法进行栽培。在播种后第9天和第18天将制造例3中调制的玉米浆和L-色氨酸混合物稀释到规定浓度，每盘撒播500mL。另外，作为对照使用去离子水。在播种后第27天进行8个体×2反复的取样，用与实施例8同样的方法进行测定。
将结果示于表11。
在所有的处理区，总根长、根部干物重都增加，由此确认生根促进作用高。
[表11]
实施例10
<玉米浆部分纯化物和L-色氨酸混合物对莴苣的小格成型苗育苗的效果>
在播种后第9天和第16天将制造例4中调制的玉米浆部分纯化浓缩液和L-色氨酸混合物稀释1000倍，对用与实施例8同样的方法进行栽培的莴苣每盘撒播500mL。另外，作为对照使用去离子水。在播种后第20天进行8个体×2反复的取样，用与实施例8同样的方法进行测定。将结果示于表12。
在处理区，总根长、根部干物重增加，由此确认生根促进作用高。
[表12]
| 总根长(m) | 根部干物重(mg) | 总干物重(mg) | |
| 对照区 | 4.21(100) | 5.8(100) | 82.2(100) |
| 处理区 | 6.10(145) | 9.9(171) | 136.5(166) |
实施例11
<玉米浆部分纯化物和色氨酸混合物对白兰瓜的钵育苗的效果>
在直径9cm的聚乙烯制钵(ポリポツト)中填充培养土“すくすく俱乐部60”(雪印种苗)，播种白兰瓜(台木专用品种バ一ネツト、东海种子(株))，在玻璃屋内边进行适当追肥边栽培。在播种后第11天和第21天将制造例4中调制的玉米浆部分纯化浓缩液和L-色氨酸混合物稀释到规定的浓度，每钵撒播30mL。另外，作为对照使用去离子水。在播种后第42天进行4个体×2反复的取样，用与实施例8同样的方法进行测定。
将结果示于表13。应予说明，表中的括号内的数值是将对照区设为100时的相对值，用％表示。
在处理区，总根长、根部干物重增加，由此确认即使在使用微生物层丰富的通常的培养土的育苗中，生根促进作用也高。
[表13]
| 总根长(m) | 根部干物重(mg) | 总干物重(mg) | |
| 对照区 | 25.2(100) | 87.5(100) | 767.4(100) |
| 1,000倍稀释液区 | 28.9(115) | 105.0(120) | 1104.8(144) |
| 500倍稀释液区 | 26.9(107 | 97.5(111) | 1134.9(148) |
实施例12
<玉米浆部分纯化物和色氨酸混合物对水稻的即将移植前处理的效果>
在北海道江别市的田地里于4月20日在填充了稻育苗用培养土(共立)的育苗钵中播种稻(品种七つ星)，在塑料大棚内进行栽培。于5月23日(移植前3天)，将制造例4中调制的玉米浆部分纯化浓缩液和L-色氨酸混合物稀释500倍，每盘撒播500mL。
5月26日用种田机(安东产业制)移植到相邻的水田中。在移植14天后进行5株×1反复的取样，用与实施例8同样的方法进行测定。
将结果示于表14。应予说明，表中的括号内的数值是将对照区设为100时的相对值，用％表示。
在处理区，总根长、根部干物重增加，由此确认通过即将移植前处理而促进移植后生根的作用高。
[表14]
| 总根长(m) | 根部干物重(mg) | 总干物重(mg) | |
| 对照区 | 7.65(100) | 47(100) | 225(100) |
| 处理区 | 9.01(117) | 58(123) | 301(134) |
实施例13
<玉米浆部分纯化物和色氨酸混合物粉剂对种子的效果>
在北海道长沼町雪印种苗(株)北海道研究农场内的试验田地中，栽培饲料用玉米(品种ニユ一デント95日DKC34-20、雪印种苗(株))。基肥按照《北海道施肥指导》(北海道农政部编2002、社团法人北海道农业改良普及协会)的青贮饲料用玉米的施肥基准进行。以相对于种子重为0.3％和0.5％的比例对种子包衣由制造例5制造的粉剂，对照为无处理，于5月6日以畦间66cm×株间22cm进行播种。于6月23日进行4个体×3反复的取样，用与实施例8同样的方法进行测定。
将结果示于表15。应予说明，表中的括号内的数值是将对照区设为100时的相对值，用％表示。
[表15]
| 总根长(m) | 根部干物重(mg) | 总干物重(mg) | |
| 对照区 | 210.1(100) | 370.0(100) | 2132.1(100) |
| 0.3％包衣处理区 | 230.1(110) | 395.1(107) | 2267.3(106) |
| 0.5％包衣处理区 | 260.5(124) | 425.6(115) | 2378.9(112) |
实施例14
<玉米浆和色氨酸混合物对小麦的效果>
在北海道幕别町的田地中，栽培小麦(品种北辰(ホクシン))。基肥按照《北海道施肥指导》(北海道农政部编2002、社团法人 北海道农业改良普及协会)的秋播小麦的施肥基准进行。播种于9月21日以钻机播种(畦间30cm)进行，播种量为80kg/ha。在出穗期以后，在下一年的6月16日、6月23日、7月2日，将制造例3中调制的玉米浆和L-色氨酸混合物稀释到规定的浓度、进而将加有0.1％含有聚氧乙烯己糖醇酐脂肪酸酯的扩展剂Approach BI(アプロ一チBI)(花王(株)公司制)的液体以100mL/m2的比例以穗为中心进行叶面撒播。试验是将各处理反复2次。取样是在收获期的8月5日对各区割取5m2来进行的，将植物体风干后，用脱谷机分离米粒。对得到的米粒测定重量，算出每单位面积的产量。
将结果示于表16。应予说明，表中的括号内的数值是将对照区设为100时的相对值，用％表示。
[表16]
| 产量(kg/ha) | |
| 对照区 | 4186(100) |
| 1,000倍稀释液处理区 | 4353(104) |
| 500倍稀释液处理区 | 4688(112) |
制造例6
<采用使用了GYP培养基的乳酸菌培养的制造法>
将乳酸菌-鼠李糖乳杆菌FERM P-13245株和植物乳杆菌N株接种于葡萄糖-酵母-胨培养基(以下称为GYP培养基，是将葡萄糖20g、酵母提取物10g、胨10g、硫酸镁7水合物0.2g、硫酸锰5水合物0.01g、硫酸亚铁7水合物0.01g溶解于1L蒸馏水中，在121℃用高压釜灭菌15分钟而调制的)和在GYP培养基中添加了苯丙氨酸9.91g/1L而成的培养基(以下称为GYP+Phe培养基)，在37℃培养24小时。将培养液与制造例1同样地分析，结果培养液中的苯乳酸浓度在GYP培养基中，在乳酸菌-鼠李糖乳杆菌FERM P-13245株接种区为20.8mg/L，在植物乳杆菌N株接种区为14.4mg/L。在GYP+Phe培养基中，在乳酸菌-鼠李糖乳杆菌FERM P-13245株接种区为173.3mg/L。
于是，将使用GYP培养基培养乳酸菌的液体作为乳酸菌培养液1，将使用GYP+Phe培养基培养乳酸菌的液体作为乳酸菌培养液2。另外，对1L乳酸菌培养液1和2加入10g/L的L-色氨酸(和光纯药(株))并充分悬浮，将所得液体作为乳酸菌培养液和L-色氨酸混合物。
实施例15
<采用小豆切口浸渍处理进行的乳酸菌GYP培养液和L-色氨酸混合物的生根促进作用>
将制造例6中得到的乳酸菌培养液1、乳酸菌培养液2、和它们的L-色氨酸混合物稀释100倍，与实施例1同样地供于小豆生根测试分析。
将其结果示于表17。即使乳酸菌培养液本身(培养液1或2)也看到了生根促进作用，但显然乳酸菌培养液和L-色氨酸混合物的效果高。
[表17]
| 发根数 | 相对值(％) | |
| 对照(水) | 15.0 | 100 |
| FERM P-13245株培养液1 | 23.6 | 157 |
| FERM P-13245株培养液1+色氨酸混合物 | 33.4 | 223 |
| FERM P-13245株培养液2 | 25.2 | 168 |
| FERM P-13245株培养液2+色氨酸混合物 | 32.0 | 213 |
| N株培养液1 | 23.2 | 155 |
| N株培养液1+色氨酸混合物 | 27.4 | 183 |
Claims (10)
1.一种以含有质量比为1∶600～99∶1的方式含有苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐的组合物作为植物成长调节剂的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中，植物成长调节是促进植物生根。
3.如权利要求1所述的应用，其中，植物成长调节是在开花期以后、黄熟期为止实施的促进禾本科植物成熟。
4.如权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，所述组合物以苯乳酸或其盐与色氨酸或其盐的含有质量比为1∶600～99∶1的方式含有苯乳酸生产性微生物的培养液、和色氨酸或其盐。
5.如权利要求4所述的应用，其中，苯乳酸生产性微生物为乳酸菌。
6.如权利要求4所述的应用，其中，苯乳酸生产性微生物的培养液为玉米浆。
7.一种植物成长调节方法，其特征在于，将苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐以含有质量比为1∶600～99∶1的方式施用于植物。
8.一种植物成长调节方法，其特征在于，以苯乳酸或其盐与色氨酸或其盐的含有质量比为1∶600～99∶1的方式将苯乳酸生产性微生物的培养液、和色氨酸或其盐施用于植物。
9.一种以含有质量比为1∶600～99∶1的方式含有苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐的组合物作为禾本科植物的成熟促进剂的应用，所述组合物是在开花期以后、黄熟期为止施用的。
10.一种禾本科植物的成熟促进方法，在开花期以后、黄熟期为止以含有质量比为1∶600～99∶1的方式施用苯乳酸或其盐、和色氨酸或其盐。
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