CN101948497A - 人参皂苷r10及其提取方法和其药物用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人参皂苷R10及其提取方法和其药物用途，属于新化合物及其药物用途。取西洋参茎叶加3-5倍量的水，提取2-5次，每次3-6小时，合并提取液，减压浓缩，加CHCl3萃取2-5次，取水层，继续加n-BuOH萃取2-5次，合并n-BuOH层，减压浓缩，至干，溶于10倍体积的丙二醇中，于180度，15％碱性条件下水解12小时，水解液加等体积的水稀释，中和至pH 7；再加于D101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加70-95％EtOH洗脱，收集EtOH洗脱液，回收溶剂，至干，将该部分进行反复硅胶柱层析，洗脱剂：CHCl3-MeOH(100-120∶1)，洗脱液进行RP-HPLC，流动相为MeOH-H2O(55-75∶20-45)，留取保留时间为28-45min化合物，为人参皂苷R10。人参皂苷R10在制备抗脑中风药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及人参皂苷R10及其提取方法，和其在制备抗脑中风药物中的应用。
背景技术
脑血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)是指由于各种脑血管病变所引起的脑部病变。是导致人类死亡的三大疾病之一，在全球范围内，每年使460万人死亡，其中1/3在工业化国家，其余发生在发展中国家，患病和死亡主要在65岁以上的人群。日本是脑卒中发病率、死亡率最高的国家之一，脑血管病死亡率一直居死因之首。我国也是脑卒中死亡率高发地区，据估计居民现患脑血管病600万，每年新发生脑血管病130万人、死亡近100万人，在幸存者中约3/4的人留下偏瘫等后遗症状，部分病人丧失劳动能力和生活能力。目前脑血管病已成为危害我国中老年人身体健康和生命的主要疾病。城市居民脑血管病死亡已上升至第一、二位，农村地区在20世纪90年代初脑血管病死亡列第三位，90年代后期升至第二位。全国每年新发脑卒中约200万人；每年死于脑血管病约150万人；存活的患者数(包括已痊愈者)600-700万。目前，全国每年因本病支出接近200亿元人民币，给国家和众多家庭造成沉重的经济负担。
脑血管病的发病率，病死率和病残率均较高，故应加强防治。当今用于临床的治疗的药物可粗分为两大类，一类为中草药提取有效成份而制成的药物如：脑心通、丹参滴丸等，这类药物有效成份不能定性定量化，作用机理不确切，疗效因而不确定。而另一类即是以具有溶栓功能的生物活性酶为有效成份制成的药物，目前有链激酶(Streptokinase，简称SK)、尿激酶(Urokinase，简称UK)组织血纤溶酶原激活剂(tPA)、单链尿激酶型血纤溶酶源程序活剂(SCUPA)，化学修饰的血纤溶酶-链激酶激剂复合物(APSAC)、蚯蚓蛋白酶、水蛭素(hirudin)葡萄球菌激酶等。这些药物均为激活血液中的血纤溶酶原，从而降解纤维蛋白而间接地起作用。在实际应用上，它们都是注射用药物，有可能引起病人产生全身性内出血，且体内半衰期短、生产成本高。因此，开发新型治疗脑血管病的药物成为当前重要研究课题之一。
发明内容
本发明提供一种人参皂苷R10及其提取方法和其药物用途。
一种如下式的人参皂苷R10：
分子式：C30H50O8，分子量：538.4
化学名：3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22，23，24，25，26，27-去六碳达玛-20-酮-3β，12β-二醇。
本发明人参皂苷R10的其提取方法是：
取西洋参茎叶加3-5倍量的水，提取2-5次，每次3-6小时，合并提取液，减压浓缩，加CHCl3萃取2-5次，取水层，继续加n-BuOH萃取2-5次，合并n-BuOH层，减压浓缩，至干，溶于10倍体积的丙二醇中，于180度，15％碱性条件下水解12小时，水解液加等体积的水稀释，中和至pH 7；再加于D101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加70-95％EtOH洗脱，收集EtOH洗脱液，回收溶剂，至干，将该部分进行反复硅胶柱层析，洗脱剂：CHCl3-MeOH(100-120∶1)，洗脱液进行RP-HPLC，流动相为MeOH-H2O(55-75∶20-45)，留取保留时间为28-45min化合物，为人参皂苷R10。
优选为：
取西洋参茎叶加4倍量的水，提取4次，每次4小时，合并提取液，减压浓缩，加CHCl3萃取4次，取水层，继续加n-BuOH萃取3次，合并n-BuOH层，减压浓缩，至干，溶于10倍体积的丙二醇中，于180度，15％碱性条件下水解12小时，水解液加等体积的水稀释，中和至pH 7；再加于D101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加85％EtOH洗脱，收集EtOH洗脱液，回收溶剂，至干，将该部分进行反复硅胶柱层析，洗脱剂：CHCl3-MeOH(110∶1)，洗脱液进行RP-HPLC，流动相为MeOH-H2O(65∶30)，留取保留时间为35min化合物，为人参皂苷R10。
本发明人参皂苷R10在制备抗脑中风药物中的应用。
当本发明用于制备抗脑中风的药物时，其口服或胃肠外给药，均是安全的，在口服情况下，其可以任何常规形式给药，如散剂、粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片等；当该药物肠胃外给药时，可采取任何常规形式，例如静脉内注射剂、软膏剂、栓剂、和吸入剂等。
本发明制备抗脑中风的药物是由有效成分单体或有效成分与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体的赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个具体例子，散剂是内服的粉末剂，它的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氧化镁、硬脂酸镁，碳酸氢钠、干燥酵母等；溶液剂的赋形剂有水、甘油、1，2-丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等；软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂腊、木腊、液体石腊、树脂、高级腊等组合成的疏水剂或亲水剂。
本发明的有益效果在于，为一种新型的抗脑中风药物。实验结果表明人参皂苷R10能够防治局部及全脑缺血所致的脑组织损伤，减轻脑坏死面积，并能保护脑组织，减少MDA的生成，减缓能量代谢，提高脑组织的耐缺氧能力
有效物质的剂量可以根据服用方式，病人的年龄和体重及病情严重程度和其它类似的因素而改变，口服量为：50mg～200mg，每日2-3次服用；注射，10mg～100mg，每日一次。
附图说明
图1是本发明化合物的1HNMR谱图；
图2是本发明化合物的13C NMR谱图；
图3是本发明化合物的HMQC谱图；
图4是本发明化合物的化合物的HMBC谱图。
具体实施方式
实施例1
取西洋参茎叶加3倍量的水，提取5次，每次6小时，合并提取液，减压浓缩，加CHCl3萃取5次，取水层，继续加n-BuOH萃取5次，合并n-BuOH层，减压浓缩，至干，，溶于10倍体积的丙二醇中，于180度，15％碱性条件下水解12小时，水解液加等体积的水稀释，中和至pH 7；再加于D101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加70％EtOH洗脱，收集EtOH洗脱液，回收溶剂，至干，将该部分进行反复硅胶柱层析，洗脱剂：CHCl3-MeOH(100∶1)，洗脱液进行RP-HPLC，流动相为MeOH-H2O(55∶45)，留取保留时间为45min化合物，为人参皂苷R10。
采用波谱学方法进行结构鉴定。
1H-NMR谱(500MHz，C5D5N)中未给出烯氢质子信号；高场给出6个甲基信号：δ2.40(3H，s)，1.31(3H，s)，0.98(3H，s)，0.95(3H，s)，0.92(3H，s)，0.76(3H，s)；与原人参二醇比较，少了两个甲基质子信号。中场给出一组葡萄糖的7个质子信号，其中包括糖的端基质子信号δ4.94及葡萄糖的其他质子信号；根据葡萄糖的端基质子信号的偶合常数结合端基碳的化学位移，可知葡萄糖为β-构型；δ3.37(1H，dd，J＝11.5，4.5Hz)为H-3信号，δ2.37为H-13信号，δ3.08(1H，m)为H-17信号；1H-NMR谱中还给出其它质子信号。
13C-NMR谱(125.8MHz，C5D5N)中共给出30个碳信号；包括一组葡萄糖碳信号分别为δ107.1、75.9、78.9、72.0、78.5、63.2；δ88.8为人参二醇组皂苷C-3位的特征信号；δ56.5为人参二醇组皂苷C-5位的特征信号；将该化合物的13C-NMR数据与三七皂苷R10 13C-NMR数据相比较，结果表明二者的侧链部分基本一致，即该结构中也含有一个羰基碳信号，同时原人参二醇的侧链中C-22、C-23、C-24、C-25、C-26、C-27碳信号消失。
根据该化合物的HMBC谱归属了甲基质子的信号：化学位移为δ0.92的甲基质子与C-15(δ33.0)，C-13(δ55.0)，C-8(δ40.3)和C-14(δ51.6)有远程相关，指定为H-30位甲基；化学位移为δ0.95的甲基质子与C-7(δ35.6)、C-8(δ40.3)和C-14(δ51.6)有远程相关，归属为H-18位甲基；化学位移为δ0.98的甲基质子与C-28(δ28.2)，C-4(δ39.8)，C-3(δ88.8)和C-5(δ56.5)有远程相关，归属为H-29位甲基；化学位移为δ2.4的甲基质子与C-17(δ52.9)，C-20(δ213.5)有远程相关，指定为H-21位甲基；化学位移为δ0.76的甲基质子与C-5(δ56.5)，C-10(δ37.2)和C-9(δ51.1)有远程相关，归属为H-19位甲基；化学位移为δ1.31的甲基质子与C-3(δ88.8)，C-4(δ39.8)，C-5(δ56.5)和C-29(δ16.8)有远程相关，指定为H-28位甲基。在HMBC谱可见葡萄糖的端基氢与C-3存在远程相关，可见成苷位置在C-3位。
另应用HMQC谱，通过葡萄糖的端基碳信号(δ107.1)归属出糖端基质子信号δ4.94，从端基质子信号的偶合常数结合端基碳信号的化学位移，可知葡萄糖为β-构型，结合1H-NMR、13C-NMR，通过HMQC、HMBC、1H-1HCOSY谱归属了葡萄糖其他氢和碳的信号。又根据该化合物的HMBC、HMQC谱归属了其他碳、氢信号。数据见表1。
实施例2
取西洋参茎叶加4倍量的水，提取5次，每次4小时，合并提取液，减压浓缩，加CHCl3萃取4次，取水层，继续加n-BuOH萃取3次，合并n-BuOH层，减压浓缩，至干，，溶于10倍体积的丙二醇中，于180度，15％碱性条件下水解12小时，水解液加等体积的水稀释，中和至Ph7。再加于D101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加85％EtOH洗脱，收集EtOH洗脱液，回收溶剂，至干，将该部分进行反复硅胶柱层析，洗脱剂：CHCl3-MeOH 110∶1，洗脱液进行RP-HPLC，流动相为MeOH-H2O(65∶30)，留取保留时间为35min化合物，为人参皂苷R10。
实施例3
取西洋参茎叶加5倍量的水，提取2次，每次3小时，合并提取液，减压浓缩，加CHCl3萃取2次，取水层，继续加n-BuOH萃取2次，合并n-BuOH层，减压浓缩，至干，，溶于10倍体积的丙二醇中，于180度，15％碱性条件下水解12小时，水解液加等体积的水稀释，中和至pH7。再加于D101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加95％EtOH洗脱，收集EtOH洗脱液，回收溶剂，至干，将该部分进行反复硅胶柱层析，洗脱剂：CHCl3-MeOH 120∶1，洗脱液进行RP-HPLC，流动相为MeOH-H2O(75∶20)，留取保留时间为28min化合物，为人参皂苷R10。
表1人参皂苷R10(C5D5N)的NMR数据和HMBC相关
实验例：下面结合药效学实验进一步说明本发明。
受试药物
人参皂苷R10由吉林圣亚医药科技有限公司提供，批号：080901，试验时用氯化钠注射液配制成所需浓度。
阴性对照药：氯化钠注射液，长春天诚药业有限公司生产，批号：20080404。
阳性对照药：尼莫地平片，天津中央药业有限公司生产，批号：080105。
动物
Wistar大鼠，体重288.9±28.8g，吉林大学基础医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(吉)2003-0001；昆明小鼠，体重29.34±3.09g，由中国人解放军农牧大学实验动物中心提供，动物合格证号：10-5113。
试验方法
1、大脑中动脉结扎致大鼠局部脑缺血试验：预先给大鼠口服不同剂量的药物3天，于第3天给药后1小时，乌拉坦(1.5g/kg)麻醉后，固定，手术，结扎大脑中动脉。术后6、24小时评价大鼠行为活动积分。24小时，处死大鼠，取脑，将脑分切五片，4％红四氮唑染色，10％福尔马林固定24小时，取出称重坏死组织。
2、小鼠断头法耗能耐受试验：预先给小鼠口服不同剂量的药物7天，于第7天给药后1小时，将小鼠断头，测定张口到停止张口时间。取鼠脑匀浆，-30℃保存，备测乳酸(LA)，乳酸脱氢酶(LDH)、ATP、ATPase、肌酸激酶(CK)、MDA。
ATP测定用钼酸铵法，LDH、CK用试剂盒测定，MDA用硫代巴比妥酸法测定。
试验结果
1、大鼠大脑中动脉结扎致局部脑缺血作用
表2局部脑缺血大鼠不同时间行为积分值(x±s)
*与空白组相比，P＜0.05，n＝10。
表3.局部脑缺血大鼠坏死组织重量(x±s)
*与空白组相比，P＜0.05，n＝10。
2、小鼠断头法试验
表4.对小鼠断头后延长张口时间的影响(x±s)
*，**与空白组相比，P＜0.05，0.01，n＝12。
表5.对缺血小鼠脑组织LA、LDH、CK的影响(x±s)
*，**与空白组相比，P＜0.05，0.01，n＝12。
表6.对缺血小鼠脑组织ATPase、ATP、MDA的影响(x±s)
*，**与空白组相比，P＜0.05，0.01，n＝12。
试验结论
人参皂苷R10能够防治局部及全脑缺血所致的脑组织损伤，减轻脑坏死面积，并能保护脑组织，减少MDA的生成，减缓能量代谢，提高脑组织的耐缺氧能力。
制备药剂的实施例1
人参皂苷R10 20.0g以1-2丙二醇1000ml溶解，过滤后分装于1000支安瓶中，每1ml，含人参皂苷R10 20mg。
制备药剂的实施例1
人参皂苷R10 200.0g，药用淀粉适量，两者充分混合，装胶囊，制成1000粒胶囊，每粒重0.25g，含人参皂苷R10 200mg。
Claims (4)
1.一种如下式的人参皂苷R10：
分子式：C30H50O8，分子量：538.4，
化学名：3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22，23，24，25，26，27-去六碳达玛-20-酮-3β，12β-二醇。
2.一种如权利要求1所述的人参皂苷R10的提取方法：其特征在于包括下列步骤：
取西洋参茎叶加3-5倍量的水，提取2-5次，每次3-6小时，合并提取液，减压浓缩，加CHCl3萃取2-5次，取水层，继续加n-BuOH萃取2-5次，合并n-BuOH层，减压浓缩，至干，溶于10倍体积的丙二醇中，于180度，15％碱性条件下水解12小时，水解液加等体积的水稀释，中和至pH 7；再加于D101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加70-95％EtOH洗脱，收集EtOH洗脱液，回收溶剂，至干，将该部分进行反复硅胶柱层析，洗脱剂：CHCl3-MeOH(100-120∶1)，洗脱液进行RP-HPLC，流动相为MeOH-H2O(55-75∶20-45)，留取保留时间为28-45min化合物，为人参皂苷R10。
3.根据如权利要求2所述的人参皂苷R10的提取方法：其特征在于包括下列步骤：
取西洋参茎叶加4倍量的水，提取4次，每次4小时，合并提取液，减压浓缩，加CHCl3萃取4次，取水层，继续加n-BuOH萃取3次，合并n-BuOH层，减压浓缩，至干，溶于10倍体积的丙二醇中，于180度，15％碱性条件下水解12小时，水解液加等体积的水稀释，中和至pH7；再加于D101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加85％EtOH洗脱，收集EtOH洗脱液，回收溶剂，至干，将该部分进行反复硅胶柱层析，洗脱剂：CHCl3-MeOH 110∶1，洗脱液进行RP-HPLC，流动相为MeOH-H2O(65∶30)，留取保留时间为35min化合物，为人参皂苷R10。
4.如权利要求1所述的人参皂苷R10在制备抗脑中风药物中的应用。
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